Nghiên cứu tạo kháng nguyên f1 tái tổ hợp từ vi khuẩn dịch hạch yersinia pestis

LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tự thực Tất số liệu, kết nghiên cứu trình bày luận văn hoàn toàn trung thực, chưa tác giả công bố trước Nếu lời cam đoan không thật xin chịu hoàn toàn trách nhiệm Tác giả Nguyễn Thị Thu Hà i LỜI CẢM ƠN Trong trình học tập thực luận văn, nhận nhiều giúp đỡ thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp gia đình Tôi xin trân trọng cảm ơn tất giúp đỡ quý báu Trước tiên, xin chân thành cảm ơn TS Lê Quang Hòa, trưởng phòng Kỹ thuật Gen, viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội người thầy hướng dẫn, định hướng giúp đỡ thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô giáo Viện Công nghệ sinh học Công nghệ thực phẩm; tập thể cán phòng Kỹ thuật Gen, viện Công nghệ Sinh học Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội nhiệt tình giúp đỡ suốt thời gian học tập thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tất Thủ trưởng cán phòng Sinh học, viện Hóa học - Môi trường Quân nơi công tác, đặc biệt đồng chí Nguyễn Phượng Minh, chủ nhiệm đề tài: “Nghiên cứu chế tạo test phát nhanh vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestis” cung cấp kinh phí, tạo điều kiện để hoàn thành luận văn `Cuối xin cảm ơn bạn bè gia đình, người ủng hộ suốt thời gian qua! Hà Nội, ngày 30 tháng 03 năm 2016 Học viên Nguyễn Thị Thu Hà ii MỤC LỤC Trang I Mục lục iii Các chữ viết tắt Vi Danh mục bảng Vii Danh mục sơ đồ Vii Danh mục hình vẽ, đồ thị Viii Mở đầu Chương 1: Tổng quan tài liệu I Bệnh dịch hạch nguyên nhân gây bệnh dịch hạch I.1 Bệnh dịch hạch 2 I.2 Tình hình dịch hạch giới Việt Nam 3 I.2.1 Tình hình dịch hạch giới I.2.2 Tình hình dịch hạch Việt Nam I.3 Biểu bệnh dịch hạch I.3.1 Dịch hạch thể hạch 7 I.3.2 Dịch hạch thể nhiễm trùng huyết I.3.3 Dịch hạch thể phổi 10 I.4 Cơ chế lây lan dịch hạch vi khuẩn Yersinia pestis 10 10 I.4.1 Cơ chế lây truyền bệnh dịch hạch 10 11 I.4.2 Vi khuẩn gây bệnh dịch hạch Yersinia pestis 12 I.5 Kháng nguyên lớp vỏ F1 15 II Protein tái tổ hợp phương pháp tạo protein tái tổ hợp 17 II.1 Protein tái tổ hợp 17 II.2 Phương pháp tạo protein kháng nguyên lớp vỏ F1 tái tổ hợp vi 19 I khuẩn Yersinia pestis II.2.1 Phương pháp PCR bước( “PRC-based single-step assembly”) 19 II.2.2 Phương pháp tổng hợp gen hai bước (“PCR-based two-step DNA 19 synthesis”) iii Chương 2: Nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu 23 I Nguyên vật liệu 23 I.1 Vật liệu, hóa chất 23 I.2 Thiết bị 29 II Phương pháp nghiên cứu 30 Chương 3: Kết bàn luận 34 I Tổng hợp nhân tạo gen caf1 mã hóa kháng nguyên nang F1 vi 34 khuẩn Y pestis 10 I.1 Thiết kế gen tổng hợp 34 11 I.2 Tổng hợp nhân tạo gen caf1 35 I.2.1 Tổng hợp gen caf1 phương pháp gapless PCR 35 I.2.2 Tổng hợp gen caf1 phương pháp TBIO 38 II Biểu tinh protein kháng nguyên nang F1 tái tổ hợp 41 E coli II.1 Biểu tinh protein kháng nguyên nang F1với vectơ 41 pET52b(+) II.2 Biểu tinh protein kháng nguyên nang F1với vectơ 45 pMAL-c5X 12 Kết luận kiến nghị 49 13 Kết luận 49 14 Kiến nghị 49 15 Tài liệu tham khảo 50 16 Phụ lục 1: Qui trình tinh gel agarose 53 17 Phụ lục 2: Qui trình tách chiết, tinh plasmid 54 Phụ lục 3: Kiểm tra mức độ biểu gen caf1 trước tối ưu E 57 coli tỉ lệ GC (%) gen 18 Phụ lục 4: Kết kiểm tra mức độ biểu gen caf1 sau tối ưu 58 E coli tỉ lệ GC (%) gen 19 Phụ lục 5: Kết giải trình tự gen dòng plasmid phương pháp iv 59 tổng hợp gen Gapless PCR Phục lục 6: Kết giải trình tự gen dòng plasmid phương pháp 61 tổng hợp gen TBIO 20 Phụ lục 7: Kết giải trình tự gen pET-52b(+)-F1 64 21 Phụ lục 8: Kết giải trình tự gen pMAL-c5X-F1 65 v CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ a.a Amino acid APS Amonium persulphate CBB Coomassie brilliant blue E coli Escherichia coli EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid EtOH Ethanol IPTG Isopropyl-thio-β-D-galactoside kb Kilo base kDa Kilo Dalton KLPT Khối lượng phân tử KN Kháng nguyên KT Kháng thể LB Luria - Bertani MBP Maltose binding protein OD Mật độ quang học (optical density) PCR Polymerase chain reaction PMSF Phenyl methyl sulphonyl fluoride RNA Ribonucleic acid SDS Sodium dodecyl sulphate SDS-PAGE Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis TAE Đệm Tris-acetate-EDTA TEMED N, N, N’, N’-tetramethyl ethylendiamine vi DANH MỤC CÁC BẢNG Trang Bảng 2.1: Các cặp mồi sử dụng luận văn 23 Bảng 2.2 : Các trình tự oligo thiết kế cho hai h pháp tổng hợp gen 23 Bảng 2.3: Thành phần gel tách 28 Bảng 2.4: Thành phần gel cô 28 Bảng 2.5: Thành phần hóa chất điện di SDS-PAGE 28 Bảng 3.1: Thống kê kết giải trình tự gen caf1 tổng hợp 40 gapless PCR TBIO DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Trang Sơ đồ 1.1: Qui trình tạo protein tái tổ hợp vii 18 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Trang Hình 1.1: Tình hình dịch hạch giới từ năm 1954 – 2001 Hình 1.2: Số mắc/chết dịch hạch Việt Nam từ năm 1976-2002 Hình 1.3: Số bệnh nhân dịch hạch Việt Nam so với giới, 1954- 2001 Hình1 4: Bệnh nhân mắc bệnh dịch hạch Hình 1.5: Sơ đồ lây lan bệnh dịch hạch 12 Hình1 6: Hình ảnh Yersinia pestis bắt màu đậm đầu 14 nhuộm Wayson Hình 1.7: Nguyên tắc phương pháp tổng hợp gen gapless PCR 21 với bước “overlap” PCR “full length” PCR Hình 8: Phương pháp tổng hợp gen TBIO 22 Hình 2.1: Sơ đồ cấu trúc vị trí cắ giới hạn véc tơ pET52b 25 Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc vị trí cắ giới hạn véc tơ pMAL-c5X 26 Hình 2.3: Mô hình phản ứng Western blot 32 Hình 3.1 Trình tự gen caf1 sau tối ưu hóa trình tự axit amin 35 kháng nguyên nang F1 Y pestis Hình 3.2 Kết điện di sản phẩm phản ứng “full length” PCR tổng 36 hợp gen caf1 phương pháp gapless PCR Hình 3.3 Kết biến nạpvectơ tách dòng pJET1.2 sau gắn gen 36 caf1 tổng hợp phương pháp gapless PCR Hình 3.4: Kết sàng lọc, kỹ thuật PCR khuẩn lạc, dòng 37 biến nạp gen caf1 tổng hợp phương pháp gapless PCR Hình 3.5: Kết điện di sản phẩm phản ứng PCR-2 tổng hợp gen 39 caf1 phương pháp TBIO Hình 3.6 Kết điện di sản phẩm phản ứng “full length” PCR tổng 39 hợp gen caf1 phương pháp TBIO Hình 3.7 Kết điện di gen caf1 vectơ pet52b(+) trước sau viii 43 nối với Hình 3.8 Kết điện di protein dòng tế bào E coli BL21 (DE3) 44 mang vectơ biểu pET-52b(+)-F1trên gel SDS-PAGE Hình 3.9 Kết điện di proteintổng số protein tan dòng tế 44 bào E coli BL21 (DE3) mang vectơ biểu pET-52b(+)-F1 gel SDS-PAGE Hình 3.10 Kết phân tích Western blot với kháng thể kháng 45 (His)6của dòng tế bào E coli BL21 (DE3) mang vectơ biểu pET-52b(+)-F1 Hình 3.11 Kết điện di protein tan dòng tế bào E Coli BL21 47 (DE3) mang vectơ biểu hiệnpMAL-c5X-F1-His gel SDS-PAGE Hình 3.12 Kết tinh protein dung hợp MBP-F1-His sắc 47 ký lực Ni Hình 3.13 Kết phân tích Western blot protein tinh MBP- 48 F1-(His)7với kháng thể kháng (His)6 Hình 3.14 Kết phân tích Dot blot protein MBP-F1-(His)7 với kháng thể kháng F1 ix 48 MỞ ĐẦU Dịch hạch bệnh truyền nhiễm tối nguy hiểm Yersinia pestis gây Bệnh lây truyền từ động vật sang người qua trung gian truyền bệnh bọ chét Bệnh biết từ thời xa xưa gây vụ đại dịch lớn vào kỉ XI, XIV XIX với hàng trăm triệu người tử vong Tuy phát từ lâu ổ dịch tồn hoạt động nhiều khu vực trái đất Tuy dịch hạch kiểm soát công tác điều tra giám sát dịch tễ học phải tiến hành thường xuyên Bởi bệnh dịch hạch xuất gặp điều kiện thuận lợi gây ảnh hưởng to lớn đến sống người Đặc biệt vi khuẩn dịch hạch coi tác nhân dùng để làm vũ khí sinh học Vì vậy, yêu cầu phải chuẩn đoán nhanh, xác vi khuẩn dịch hạch ổ dịch, môi trường yêu cầu cấp thiết Tuy nhiên để nghiên cứu trực tiếp vi khuẩn dịch hạch tự nhiên đòi hỏi phải có phòng thí nghiệm riêng, yêu cầu qui trình sát trùng, sát khuẩn nghiêm ngặt lại dễ gây nguy hiểm cho người nghiên cứu Vì nhà khoa học thường nghiên cứu kháng nguyên protein tái tổ hợp thay nghiên cứu trực tiếp vi khuẩn dịch hạch Tất chủng Yersinia pestis có kháng nguyên F1 Kháng nguyên F1 kháng nguyên đặc hiệu loài cao, dùng để chuẩn đoán cho vi khuẩn dịch hạch Kháng nguyên F1 tái tổ hợp có vai trò quan trong nghiên cứu để tạo kháng thể kháng F1 sản xuất vắc xin, sản xuất que thử phát vi khuẩn Yersinia pestis… Vì lí thực đề tài: “Nghiên cứu tạo kháng nguyên F1 tái tổ hơp từ vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestis” Nội dung nghiên cứu luận văn: - Xây dựng qui trình tạo kháng nguyên tái tổ hợp F1 vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestis - Kiểm định đặc tính kháng nguyên chế phẩm kháng nguyên F1 Formatted: Justified, Indent: First line: 0.49 Space After: pt, Line spacing: 1.5 lines 19 Xinxin Gao1, Peggy Yo, Andrew Keith,, Timothy J Raganand Thomas K (2003), Thermodynamically balanced inside-out (TBIO) PCR-based gene synthesis: a novel method of primer design for high-®delity assembly of longer gene sequences, Nucleic Acids Research, Vol 31, No 22 e143 20 Ai-Sheng Xiong, Ri-He Peng, Jing Zhuang, Feng Gao, YiLi, Zong-Ming Cheng & Quan-Hong Yao (2008), Chemical gene synthesis: strategies, softwares, error corrections, andapplications, FEMS Microbiol Rev 32, 522 – 540 21 Williams J.E., Gentry M.K., Broden C.A., Tyndal G.L., Altieri P.L., Berman S., Robinson D.M ,A (1988) Monoclonal antibody for the specific dianogsis of plague Bull WHO, 66, pp 77 – 82 22 Zakrevskiy, V I., and N G Plekhanova (1990), Study of protective properties of antigen-containing liposomes of varying lipid composition in plague, Vestn Akad Med Nauk SSSR 8:41–44 (In Russian.) 23 Zhou D, Han Y, Yang R (2006), Molecular and physiological insights into plague transmision, virulence and etiology, Microbes Infect 8(1):273-84 24 http://www.baoxaydung.com.vn/news/vn/suc-khoe/benh-dich-hach-trenthe-gioi-va-viet-nam.html 25.https://www.google.com.vn/url?sa=t&rct=j&q=&esrc=s&source=web&c d=1&cad=rja&uact=8&ved=0CBwQFjAAahUKEwiWqd6S16DIAhWCxqYKHUQ aAqQ&url=http%3A%2F%2Fphamvanhau.jimdo.com%2Fapp%2Fdownload%2F1 814786050%2FBenh%2Bdich%2Bhach.pdf%3Ft%3D1438830955&usg=AFQjCN GM3cL3YyzDv2Dk0eK9VCObPGl8-g&sig2=rJd0ewkZwjxq2-ClxXntw&bvm=bv.104226188,d.dGY 53 PHỤC LỤC Phụ lục 1: Qui trình tinh gel agarose Mgel + Biding buffer theo tỉ lệ Mgel : mbiding buffer = 1:1 Ủ 65oC 10 phút, lắc cho gel tan hết Bổ sung CH3COONa 3M, pH 5,2 với tỉ lệ V = 1/20 Vdịch Chuyển dịch lên cột, li tâm 12000 v/ph để loại dịch Rửa màng 600µl dung dịch Washing buffer Li tâm 12000 v/ph loại dịch Lặp lại bước rửa màng Bổ sung 70µl dung dịch Elution buffer, li tâm 12000v/ph, thu dịch Sản phẩm tinh 54 Phụ lục 2: Qui trình tách chiết, tinh plasmid 5ml tế bào nuôi 37oC, qua đêm Li tâm 12000vòng/phút, 1’, thu cặn tế bào Rửa 1ml H2O đề ion, khử trùng Li tâm 12000g/phút, 1’, thu cặn tế bào Bổ sung 200µl dung dịch A, votex nhanh Bổ sung 200µl dung dịch B, đảo trộn nhẹ nhàng, để yên nhiệt độ phòng 2’ Bổ sung 200µl dung dịch C, đảo trộn nhẹ nhàng Li tâm 12000g/phút, 5’, thu dịch Bổ sung 3µl enzyme ARNase, ủ 37oC, 30 phút Bổ sung Guanidine 5M theo tỉ lệ với thể tích dịch 1:2 55 Đảo trộn, chuyển lên cột, để yên cột 1’ Rửa lần 600µl dung dịch PE, li tâm 12000v/p, loại dịch Li tâm khô màng 14000v/p, 10’ Để bay 1’ 70oC, bổ sung 80µl Elution buffer Li tâm 12000v/phút, 1’, thu dịch plasmid tinh 56 Phụ lục 3: Kiểm tra mức độ biểu gen caf1 trước tối ưu E coli tỉ lệ GC (%) gen 57 Phụ lục 4: Kết kiểm tra mức độ biểu gen caf1 sau tối ưu E coli tỉ lệ GC (%) gen 58 Phục lục 5: Kết giải trình tự gen dòng plasmid phương pháp tổng hợp gen Gapless PCR Gapless-1 Gapless-2 59 Gapless-3 Gapless-4 60 Gapless-5 Gapless-6 61 Phụ lục 6: Kết giải trình tự gen dòng plasmid phương pháp tổng hợp gen TBIO TBIO-1 TBIO-2 62 TBO-3 TBIO-4 63 TBIO-5 TBIO-6 64 Phụ lục 7: Kết giải trình tự gen pET-52b(+)-F1 pET-52b(+)-F1-1 pET-52b(+)-F1-2 65 Phụ lục 8: Kết giải trình tự gen pMAL-c5X-F1 pMAL-c5X-F1-1 pMAL-c5X-F1-2 66 pMAL-c5X-F1-3 67 ... tài: Nghiên cứu tạo kháng nguyên F1 tái tổ hơp từ vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestis Nội dung nghiên cứu luận văn: - Xây dựng qui trình tạo kháng nguyên tái tổ hợp F1 vi khuẩn dịch hạch Yersinia. .. người nghiên cứu Vì nhà khoa học thường nghiên cứu kháng nguyên protein tái tổ hợp thay nghiên cứu trực tiếp vi khuẩn dịch hạch Tất chủng Yersinia pestis có kháng nguyên F1 Kháng nguyên F1 kháng nguyên. .. lớp vỏ F1 15 II Protein tái tổ hợp phương pháp tạo protein tái tổ hợp 17 II.1 Protein tái tổ hợp 17 II.2 Phương pháp tạo protein kháng nguyên lớp vỏ F1 tái tổ hợp vi 19 I khuẩn Yersinia pestis