Nghiên cứu tạo kháng nguyên f1 tái tổ hợp từ vi khuẩn dịch hạch yersinia pestis

Phương pháp tạo protein kháng nguyên lớp vỏ F1 tái tổ hợp của vi khuẩn Yersinia pestis II.2.1 Phương pháp PCR một bước “PRC-based single-step assembly” II.2.2 Phương pháp tổng hợp gen

Trang 1

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu là do tôi tự thực hiện

Tất cả các số liệu, kết quả nghiên cứu được trình bày trong luận văn là hoàn

toàn trung thực, chưa được bất kỳ tác giả nào công bố trước đây

Nếu lời cam đoan không đúng sự thật tôi xin chịu hoàn toàn trách nhiệm

Tác giả

Nguyễn Thị Thu Hà

Trang 2

LỜI CẢM ƠN

Trong quá trình học tập và thực hiện luận văn, tôi đã nhận được nhiều sự giúp đỡ của thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp và gia đình Tôi xin trân trọng cảm ơn tất

cả những sự giúp đỡ quý báu đó

Trước tiên, tôi xin chân thành cảm ơn TS Lê Quang Hòa, trưởng phòng Kỹ thuật Gen, viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội người thầy đã luôn hướng dẫn, định hướng và giúp đỡ tôi thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô giáo Viện Công nghệ sinh học và Công nghệ thực phẩm; tập thể cán bộ phòng Kỹ thuật Gen, viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội đã nhiệt tình giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và thực hiện luận văn

Tôi xin chân thành cảm ơn tất cả Thủ trưởng và cán bộ phòng Sinh học, viện Hóa học - Môi trường Quân sự nơi tôi công tác, đặc biệt là đồng chí Nguyễn

Phượng Minh, chủ nhiệm đề tài: “Nghiên cứu chế tạo test phát hiện nhanh vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestis” đã cung cấp kinh phí, tạo mọi điều kiện để tôi

hoàn thành luận văn của mình

`Cuối cùng tôi xin cảm ơn bạn bè và gia đình, những người đã luôn ủng hộ tôi trong suốt thời gian qua!

Hà Nội, ngày 30 tháng 03 năm 2016

Học viên

Nguyễn Thị Thu Hà

Trang 3

2 I.2 Tình hình dịch hạch trên thế giới và Việt Nam

3 I.2.1 Tình hình dịch hạch trên thế giới

4 I.2.2 Tình hình dịch hạch tại Việt Nam

2 II.2 Phương pháp tạo protein kháng nguyên lớp vỏ F1 tái tổ hợp của vi

khuẩn Yersinia pestis

II.2.1 Phương pháp PCR một bước( “PRC-based single-step assembly”)

II.2.2 Phương pháp tổng hợp gen hai bước (“PCR-based two-step DNA

synthesis”)

19

Trang 4

3 Chương 2: Nguyên vật liệu và phương pháp nghiên cứu 23

II Biểu hiện và tinh sạch protein kháng nguyên nang F1 tái tổ hợp trong

16 Phụ lục 1: Qui trình tinh sạch trên gel agarose

17 Phụ lục 2: Qui trình tách chiết, tinh sạch plasmid

Phụ lục 3: Kiểm tra mức độ biểu hiện gen caf1 trước khi tối ưu trên E

coli và tỉ lệ GC (%) trong gen

18 Phụ lục 4: Kết quả kiểm tra mức độ biểu hiện gen caf1 sau khi đã tối ưu

trên E coli và tỉ lệ GC (%) trong gen

19 Phụ lục 5: Kết quả giải trình tự gen 6 dòng plasmid của phương pháp

Trang 5

tổng hợp gen Gapless PCR

Phục lục 6: Kết quả giải trình tự gen 6 dòng plasmid của phương pháp

tổng hợp gen TBIO

20 Phụ lục 7: Kết quả giải trình tự gen pET-52b(+)-F1

21 Phụ lục 8: Kết quả giải trình tự gen pMAL-c5X-F1

61

64

65

Trang 6

CÁC CHỮ VIẾT TẮT Tên viết tắt Tên đầy đủ

LB

MBP

Luria - Bertani Maltose binding protein

PMSF

RNA

Phenyl methyl sulphonyl fluoride Ribonucleic acid

Trang 7

DANH MỤC CÁC BẢNG

Trang

Bảng 3.1: Thống kê kết quả giải trình tự gen caf1 tổng hợp bằng

Trang 8

DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ

Trang

Hình 1.1: Tình hình dịch hạch trên thế giới từ năm 1954 – 2001

Hình 1.2: Số mắc/chết dịch hạch ở Việt Nam từ năm 1976-2002

Hình 1.3: Số bệnh nhân dịch hạch ở Việt Nam so với thế giới,

Hình1 6: Hình ảnh Yersinia pestis bắt màu đậm 2 đầu khi

nhuộm Wayson

14

Hình 1.7: Nguyên tắc của phương pháp tổng hợp gen gapless PCR

với 2 bước là “overlap” PCR và “full length” PCR

21

Hình 2.1: Sơ đồ cấu trúc và vị trí cắ giới hạn của véc tơ pET52b

Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc và vị trí cắ giới hạn của véc tơ pMAL-c5X

25

26 Hình 2.3: Mô hình phản ứng Western blot

Hình 3.1 Trình tự gen caf1 sau khi tối ưu hóa và trình tự axit amin

của kháng nguyên nang F1 của Y pestis

Hình 3.2 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng “full length” PCR tổng

hợp gen caf1 bằng phương pháp gapless PCR

32

35

36

Hình 3.3 Kết quả biến nạpvectơ tách dòng pJET1.2 sau khi gắn gen

caf1 tổng hợp bằng phương pháp gapless PCR

36

Hình 3.4: Kết quả sàng lọc, bằng kỹ thuật PCR khuẩn lạc, các dòng

biến nạp gen caf1 tổng hợp bằng phương pháp gapless PCR

37

Hình 3.5: Kết quả điện di sản phẩm phản ứng PCR-2 tổng hợp gen

caf1 bằng phương pháp TBIO

39

Hình 3.6 Kết quả điện di sản phẩm phản ứng “full length” PCR tổng

hợp gen caf1 bằng phương pháp TBIO

39

Trang 9

khi nối với nhau

Hình 3.8 Kết quả điện di protein của dòng tế bào E coli BL21 (DE3)

mang vectơ biểu hiện pET-52b(+)-F1trên gel SDS-PAGE

44

Hình 3.9 Kết quả điện di proteintổng số và protein tan của dòng tế

bào E coli BL21 (DE3) mang vectơ biểu hiện pET-52b(+)-F1 trên

gel SDS-PAGE

44

Hình 3.10 Kết quả phân tích Western blot với kháng thể kháng

(His)6của dòng tế bào E coli BL21 (DE3) mang vectơ biểu hiện

pET-52b(+)-F1

45

Hình 3.11 Kết quả điện di protein tan của dòng tế bào E Coli BL21

(DE3) mang vectơ biểu hiệnpMAL-c5X-F1-His trên gel SDS-PAGE

Hình 3.12 Kết quả tinh sạch protein dung hợp MBP-F1-His bằng sắc

ký ái lực Ni

47

Hình 3.13 Kết quả phân tích Western blot protein tinh sạch MBP-

F1-(His)7với kháng thể kháng (His)6

Hình 3.14 Kết quả phân tích Dot blot protein MBP-F1-(His)7 với

kháng thể kháng F1

48

Trang 10

MỞ ĐẦU

Dịch hạch là một bệnh truyền nhiễm tối nguy hiểm do Yersinia pestis gây ra

Bệnh lây truyền từ động vật sang người qua trung gian truyền bệnh là bọ chét Bệnh

đã được biết từ thời xa xưa và đã gây ra 3 vụ đại dịch lớn vào các thế kỉ XI, XIV và

XIX với hàng trăm triệu người tử vong Tuy đã được phát hiện từ lâu nhưng hiện

nay các ổ dịch vẫn còn tồn tại và đang hoạt động trong nhiều khu vực trên trái đất

Tuy dịch hạch đã được kiểm soát nhưng công tác điều tra giám sát dịch tễ

học vẫn phải được tiến hành thường xuyên Bởi vì bệnh dịch hạch có thể xuất hiện

bất cứ khi nào nếu gặp điều kiện thuận lợi và sẽ gây ảnh hưởng to lớn đến cuộc

sống của con người Đặc biệt vi khuẩn dịch hạch vẫn được coi là một trong những

tác nhân dùng để làm vũ khí sinh học hiện nay Vì vậy, yêu cầu phải chuẩn đoán

nhanh, chính xác vi khuẩn dịch hạch trong các ổ dịch, trong môi trường là một yêu

cầu cấp thiết Tuy nhiên để nghiên cứu trực tiếp vi khuẩn dịch hạch trong tự nhiên

thì đòi hỏi phải có phòng thí nghiệm riêng, yêu cầu qui trình sát trùng, sát khuẩn rất

nghiêm ngặt lại dễ gây nguy hiểm cho người nghiên cứu Vì thế hiện nay các nhà

khoa học thường nghiên cứu trên kháng nguyên protein tái tổ hợp thay vì nghiên

cứu trực tiếp trên vi khuẩn dịch hạch

Tất cả các chủng Yersinia pestis đều có kháng nguyên F1 Kháng nguyên F1

là một kháng nguyên đặc hiệu loài cao, dùng để chuẩn đoán cho vi khuẩn dịch hạch

Kháng nguyên F1 tái tổ hợp có một vai trò rất quan trong trong các nghiên cứu để

tạo kháng thể kháng F1 trong sản xuất vắc xin, sản xuất que thử phát hiện vi khuẩn

Yersinia pestis…

Vì những lí do trên tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu tạo kháng nguyên F1

tái tổ hơp từ vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestis”

Nội dung nghiên cứu chính của luận văn:

- Xây dựng qui trình tạo kháng nguyên tái tổ hợp F1 của vi khuẩn dịch hạch

Yersinia pestis

- Kiểm định đặc tính kháng nguyên của chế phẩm kháng nguyên F1 Formatted: Justified, Indent: First line: 0.49",

Space After: 0 pt, Line spacing: 1.5 lines

Trang 11

Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

I Bệnh dịch hạch và nguyên nhân gây bệnh dịch hạch

Dịch hạch là bệnh truyền nhiễm cấp tính, tối nguy hiểm thuộc diện kiểm dịch

và khai báo quốc tế do Yersinia pestis gây nên Bệnh lưu hành trong quần thể động

vật thuộc bộ gặm nhấm (Rodentia), chủ yếu là chuột và bọ chét ký sinh trên chúng,

từ đó lây truyền sang các loại súc vật khác và sang người Lịch sử loài người đã ghi

nhận 3 vụ đại dịch vào các thế kỷ thứ XI, XIV và XIX với hàng trăm triệu người tử

vong và bệnh dịch hạch đã trở thành nỗi kinh hoàng của nhân loại

Bệnh dịch hạch được biết đến từ thời xa xưa, thời kì đầu khó có thể xác định

được những thông tin chính xác cần thiết để phân biệt hoặc chứng minh dịch hạch

do vi khuẩn hay vi rút

Trong khoảng hai ngàn năm qua, các vụ dịch hạch lớn đã lây lan rộng khắp

đến các quốc gia trên thế giới Đại dịch đầu tiên được ghi nhận vào thế kỷ thứ VI,

vào khoảng từ năm 542 đến 546 xảy ra vụ dịch lớn bắt đầu ở Đế quốc La Mã

phương Đông vào triều đại Vua Justinian 1 ở Ai Cập, lây lan sang Châu Âu, ước

tính làm chết khoảng 100 triệu người ở Châu Á, Châu Phi và Châu Âu Đại dịch

lần thứ hai nổi tiếng với tên “Bệnh chết đen - Black Death” vào thế kỷ XIV, khoảng

từ năm 1347 đến 1350 Đại dịch lần thứ 2 ước tính làm chết khoảng 50 triệu người

trên thế giới, trong đó, một nửa số nạn nhân là ở Châu Âu, chiếm một phần ba dân

số Châu Âu thời bấy giờ Tỷ lệ tử vong trong đại dịch này từ 70 - 80%

Cuối thế kỷ thứ 19, đại dịch thứ ba bắt đầu ở Canton và Hồng Kông vào năm

1894, nhanh chóng lan truyền đi khắp thế giới Trong vòng 10 năm (1894-1903),

dịch đã lan đến 77 thành phố cảng trên khắp 5 châu : Châu Á: 31, Châu Âu: 12,

Châu Phi: 8, Bắc Mỹ: 4, Nam Mỹ: 15 và Châu Úc: 7 Trong đại dịch này, dịch hạch

lây lan mạmh mẽ ở Ấn Độ, chỉ riêng ở Bombay đã làm chết khoảng 13.000.000

người.[2]

Formatted: Justified, Level 2, Space After: 0

pt, Line spacing: 1.5 lines

Formatted: Justified, Level 3, Indent: Left: 0",

Hanging: 0.49", Space After: 0 pt, Line spacing: 1.5 lines, No bullets or numbering

Formatted: Font: (Default) Times New Roman,

Formatted: Indent: First line: 0.5", Space

After: 0 pt, Line spacing: 1.5 lines

Trang 12

I.2 Tình hình dịch hạch trên thế giới và Việt Nam

I.2.1 Tình hình dịch hạch trên thế giới

Các vùng dịch hạch lưu hành không cố định mà luôn luôn thay đổi, tuỳ thuộc

vào sự thay đổi của nhiều yếu tố tự nhiên, xã hội như : khí hậu, động đất, sự di

chuyển của các quần thể gặm nhấm, di dân, Hiện nay, các ổ dịch hạch thiên nhiên

tồn tại ở Bắc và Nam Mỹ, Châu Phi, Châu Á và Đông Nam Châu Âu, từ 55 vĩ độ Bắc

đến 40 vĩ độ Nam Tuy nhiên, trong vành đai này có những vùng không có ổ dịch

hạch như các hoang mạc với một số lượng ít hoặc không có loài vật chủ gặm nhấm,

vùng chí tuyến hoặc những dãy núi cao đóng băng quanh năm

Từ 1954 - 2001, Tổ chức Y tế thế giới ghi nhận có 38 quốc gia trên thế giới

xảy ra bệnh dịch hạch gồm 89.651 trường hợp mắc và 7.715 bệnh nhân tử vong

Nhiều nhất là năm 1967 có 6014 trường hợp và thấp nhất năm 1981 có 200 trường

hợp Trong gần nửa thế kỷ qua, có 7 quốc gia trên thế giới có dịch bệnh xảy ra hàng

năm là Brazil, Cộng hoà dân chủ Công Gô, Madagascar, Myanmar, Pê Ru, Hoa Kỳ

và Việt Nam

Hình 1.1: Tình hình dịch hạch trên thế giới từ năm 1954 – 2001[2]

Formatted: Indent: First line: 0", Space After:

0 pt, Line spacing: 1.5 lines

13 pt, Bold, Italic

13 pt

Formatted: Indent: Left: -0.1", First line:

0.59", Line spacing: 1.5 lines

Formatted: Space After: 0 pt, Line spacing:

1.5 lines

Formatted: Indent: First line: 0", Space After:

0 pt, Line spacing: 1.5 lines

Trang 13

Gần đây, tính đến ngày 23 tháng 6 năm 2003 đã xảy ra dịch hạch tại Tafraoui,

ngoại ô tỉnh Oran, Angêria với 10 trường hợp mắc, 8 trường hợp thể hạch, 1 thể

phổi và 1 thể nhiễm khuẩn huyết Trong số này có 1 bệnh nhân đã tử vong Kết quả

xét nghiệm Yersinia pestis ở bệnh phẩm những bệnh nhân này dương tính

Thực tế tình hình dịch hạch trên thế giới cho đến nay vẫn diễn biến phức tạp,

không thể nói rằng sẽ loại trừ dịch hạch trong tương lai gần Cũng không thể buông

lỏng sự giám sát dịch hạch Năm 1995 ở Madagascar bắt đầu nghiên cứu phòng

chống dịch hạch toàn diện và tổ chức mạng lưới nghiên cứu vấn đề này trong các

Viện Pasteur (Acip Peste) Tại Trung Quốc mặc dù tình hình dịch hạch đã được

khống chế mạnh mẽ nhưng hệ thống giám sát phòng chống chủ động bệnh dịch này

vẫn được đẩy mạnh và giải quyết chặt chẽ Những năm gần đây Hội nghị quốc tế về

nghiên cứu và phòng chống dịch hạch vẫn được Tổ chức Y tế Thế giới tổ chức, thu

hút được nhiều nhà khoa học trên thế giới nghiên cứu về lĩnh vực này tham dự Tại

hội nghị quốc tế về giám sát và phòng chống dịch hạch tổ chức ở Bangalore, Ấn Độ

từ 15 - 17 tháng 07 năm 2002, theo Tikhomirov E, chuyên gia của Tổ chức Y tế Thế

giới thì có 6 tiêu chuẩn để đánh giá tính ưu tiên trong nghiên cứu và phòng chống

của một bệnh là: Tác động của bệnh đó (nguyên nhân gây mắc và chết), nguy cơ tác

nhân gây nên dịch, hiệu lực trong dự phòng và điều trị bệnh, tầm quan trọng đối với

quốc tế, ảnh hưởng đến kinh tế và nguy cơ sử dụng có mục đích Dịch hạch có đầy

đủ 6 yếu tố trên và như vậy nên được xem là bệnh cần ưu tiên nghiên cứu và phòng

chống.[2]

I.2.2 Tình hình dịch hạch tại Việt Nam

Hơn 1 thế kỷ bệnh dịch hạch có mặt ở Việt Nam, có khả năng từ Hồng Kông

xâm nhập đến vào năm 1898 trong bối cảnh của đại dịch lần thứ ba Bệnh bám rễ và

lưu hành có thời kỳ bùng phát xen kẽ với những thời kỳ lắng dịu nhưng thực sự

chưa bao giờ được loại trừ

Dịch hạch được ghi nhận lần đầu tiên ở Việt Nam vào năm 1898 tại Nha

Trang trong bối cảnh vụ đại dịch hạch thế giới lần thứ 3 Dịch xâm nhập chủ yếu

1.5 lines

Trang 14

khác như Bắc Ninh, Hòn Gai, Phan Thiết, Phan Rang, Sóc Trăng Dịch tại những nơi xâm nhập đều có tính chất tạm thời trừ Sài Gòn và Phan Thiết có chiều hướng trở thành vùng dịch lưu hành dai dẳng Vào năm 1911 tại Châu Đốc, Long Xuyên, Thủ Dầu Một xảy ra một vụ dịch lớn với nhiều bệnh nhân dịch hạch thể phổi có 886 người tử vong

Hình 1.2: Số mắc/chết dịch hạch ở Việt Nam từ năm 1976-2002

Từ 1961 đến 1975: dịch bùng phát lan tràn ở miền Nam Sau đó tiếp tục lây lan trên diện rộng ở các tỉnh ven biển miền Trung, Tây Nguyên, miền Đông Nam

Bộ Chính quyền miền Nam dưới sự trợ giúp của Mỹ thông qua chương trình quốc gia phòng chống dịch hạch đã khống chế được một phần, nhưng nhìn chung dịch vẫn tồn tại với quy mô lớn Trong giai đoạn này, hầu hết số bệnh nhân mắc phải dịch trên thế giới đều là Việt Nam.[24]

Trang 15

Hình 1.3: Số bệnh nhân dịch hạch ở Việt Nam so với thế giới, 1954-2001

Từ 1975 đến 1990: Sau 1975 dịch bùng phát, số mắc - chết tăng vọt tại các

vùng dịch lưu hành như ở các tỉnh ven biển miền Trung, Tây Nguyên, miền Đông

Nam Bộ Đặc biệt trong thời gian này, dịch hạch đã xuất hiện và gây ra một số vụ

dịch nhỏ tại 9 tỉnh/thành phố phía Bắc do có sự giao lưu về lương thực hàng hóa và

các phương tiện giao thông Đặc biệt chuột và tác nhân gây bệnh Yersinia pestis

theo gạo và lương thực từ miền Nam xâm nhập vào miền Bắc qua cảng biển Hải

Phòng Trong giai đoạn từ năm 1991 đến 2002 số mắc - chết có chiều hướng giảm

và phạm vi dịch thu hẹp dần, tập trung chủ yếu ở miền Trung và Tây Nguyên

Trong 4 năm (1999-2002), dịch chỉ còn ghi nhận tại một số địa phương 2 tỉnh Đắc

Lắc và Gia Lai với diện dịch tập trung dai dẳng vào một số xã thuộc 2 huyện: Đắc

Đoa, tỉnh Gia Lai và EaH’leo, tỉnh Đắk Lắk.[24]

Từ tháng 3/2003 đến nay không ghi nhận bệnh dịch hạch trên người, ca mắc

gần nhất ghi nhận vào tháng 08 năm 2002 tại tỉnh Đắk Lắk Giám sát dịch động vật

tại các trọng điểm, từ tháng 4/2004 không còn phân lập được Yersinia pestis từ vật

chủ và trung gian truyền bệnh Từ năm 2005 xét nghiệm huyết thanh động vật tìm

kháng thể kháng Yersinia pestis (kháng thể kháng F1) đều cho kết quả âm tính

Trang 16

1. I.3 Biểu hiện của bệnh dịch hạch

1.1 Tùy theo vị trí thương tổn giải phẫu bệnh lý, có thể gặp nhiều thể lâm

sàng với tỷ lệ khác nhau nhưng phổ biến nhất là thể hạch Thể nhiễm khuẩn huyết

và thể phổi tiên phát hiếm gặp hơn Các trường hợp nhiễm khuẩn huyết và viêm

phổi thứ phát có thể xem là biến chứng của thể hạch không được điều trị sớm và

tích cực Ngoài ra còn gặp các biểu hiện khác như viêm màng não mủ, việm họng,

thể xuất huyết, thể da … Tuy nhiên các biểu hiện này thường gặp trong bệnh cảnh

hoặc xảy ra thứ phát sau thể hạch.

1.2 I.3.1 Dịch hạch thể hạch

Thể lâm sàng của bệnh dịch hạch không hằng định và nhiều thể Tuỳ vào từng

vùng và vụ dịch mà tỷ lệ gặp có khác nhau, nhưng nhìn chung thể hạch vẫn phổ

biến nhất

Thống kê của một số bệnh viện ở Việt Nam như sau: Bệnh viện Chợ Quán từ

năm 1977 đến 1986 gặp 94 - 98%; Bệnh viện Đắc Lắc từ năm 1976 đến 1986 gặp

97% và Bệnh viện Phú Khánh từ 1982 đến 1986 gặp 98%

Ở New Mexico từ năm 1980 - 1984 gặp 74,7% là thể hạch

Theo qui định của Tổ chức Y tế Thế giới, thời gian ủ bệnh trong vòng 6 ngày,

thời kỳ này kéo dài hơn ở những người đã được chủng ngừa vắc xin Thời kỳ ủ bệnh

không có triệu chứng gì, sau đó bệnh thường khởi phát đột ngột với hai nhóm dấu

hiệu đặc trưng của bệnh dịch hạch là nhiễm khuẩn - nhiễm độc và viêm hạch

* Hội chứng nhiễm trùng - nhiễm độc

Sốt cao đột ngột là triệu chứng tương đối phổ biến và thường xuất hiện trước

khi viêm hạch Nếu được điều trị bằng kháng sinh đặc hiệu thì nhiệt độ hạ, trong

vòng 18 - 24 giờ có thể giảm đến 1,5 đến 2oC, ngày sau có thể hết sốt hoặc sốt nhẹ

thêm 2 - 3 ngày rồi hết hẳn

Formatted: Level 3, Indent: Left: 0",

13 pt, Bold, Italic

Formatted: Normal, Indent: First line: 0.44",

Line spacing: 1.5 lines, No bullets or numbering

1.5 lines

13 pt, Italic

1.5 lines

Trang 17

Các dấu hiệu nhiễm trùng, nhiễm độc thần kinh biểu hiện mức độ nặng nhẹ của bệnh và là yếu tố quyết định tiên lượng bệnh Cần đặc biệt quan tâm khi thấy xuất hiện sớm trong vòng 24 giờ đầu Ở thể nhẹ, bệnh nhân mệt mỏi, biếng ăn nhưng vẫn tươi tỉnh Bệnh càng nặng, biểu hiện nhiễm độc càng rõ Mặt đỏ, kết mạc mắt xung huyết, môi khô, lưỡi bẩn, đau nhức nhiều nơi Người bứt rứt khó chịu, vẻ mặt lo âu sợ hãi, hoặc hốt hoảng, vật vã, kích động, nói nhảm hoặc lừ đừ, mắt đờ đẫn, nằm yên không cử động, không ngủ Đôi khi gặp ảo giác, trả lời chậm chạp, khi đúng khi sai, tiếng nói không rõ ràng Hiếm gặp hơn là động tác bất thường, thỉnh thoảng gồng người co giật, vã nhiều mồ hôi Có trường hợp ói mửa, ỉa chảy Khó thở nhanh mà không có tổn thương bệnh lý ở phổi

* Viêm hạch

Viêm hạch thường xuất hiện đồng thời hoặc sau sốt vài giờ đến 24 giờ, một số

ít trường hợp nổi hạch trước sốt Viêm hạch dịch hạch là một loại viêm cấp tính với triệu chứng đau là tính chất nổi bật lên hàng đầu Đau là triệu chứng sớm nhất và thường xuất hiện trước khi nổi hạch (87%) Đau tăng lên khi bệnh nhân cử động hay sờ nắn và bệnh nhân thường ở tư thế nhằm làm giảm sức căng lên vùng đó Thuốc giảm đau không hoặc có tác dụng rất ít Đau tự nhiên, càng nhiều và càng sớm, đi đôi với sốt cao thường tiên lượng nặng hơn Đau giảm rõ rệt và nhanh chóng trong vòng 24 đến 48 giờ sau khi bệnh nhân được điều trị bằng kháng sinh đặc hiệu

Thường có một hạch và vị trí có liên quan đến vị trí đốt của bọ chét, phổ biến nhất là vùng đùi bẹn: 62 - 80% Kế đó là: hạch nách 14 - 20%, hạch cổ, hạch dưới hàm: 15-18% Có thể gặp hai hoặc nhiều hạch xuất hiện lần lượt hoặc cùng một lúc Biểu hiện này cũng như vị trí hạch vùng cao (cổ, nách, thượng đòn … ) thường là một biểu hiện nặng cần được chú ý

Trang 18

Hình 1.4: Bệnh nhân mắc bệnh dịch hạch

Hạch viêm tiến triển nhanh với sưng tấy, nóng, đỏ và rất đau Kích thước

hạch tuỳ vào thời điểm phát hiện Ban đầu nhỏ, di động, màu da ngoài bình thường,

trong vòng 1 hoặc 2 ngày đã sưng to có khi đến 10 cm nhưng thường dưới 3cm Tổ

chức xung quanh hạch bị viêm, phù nề và dính vào nhau thành 1 khối không di

động, màu da bên ngoài hạch đỏ tía Trong trường hợp được điều trị sớm, đúng thì

hạch giảm đau nhanh, teo nhỏ lại và “mất đi” trong vòng 2 - 3 tuần hoặc trở nên xơ

hoá để lại một khối rắn trong một thời gian dài sau khi khỏi bệnh.[2]

1.3 I.3.2 Dịch hạch thể nhiễm trùng huyết

Quan niệm về thể nhiễm khuẩn huyết có nhiều ý kiến khác nhau Theo

Pollitzer, dịch hạch thể nhiễm khuẩn huyết tiên phát là do sự xâm nhập vào máu của

một số lượng lớn vi khuẩn dịch hạch không qua giai đọan khu trú ở hạch Một số

tác giả khác (Girard, Dujardin, Beaumetz, Joltrain) cho rằng thể nhiễm khuẩn huyết

chỉ thứ phát sau thể hạch nằm trong sâu, thăm khám bên ngoài không sờ thấy được

Các tổ chức hạch này vẫn chứa nhiều vi khuẩn.[2]

Dịch hạch thể nhiễm trùng huyết tiên phát là những trường hợp nhiễm khuẩn

huyết được xét nghiệm kết luận là do Yersinia pestis mà lâm sàng không phát hiện

được triệu chứng viêm hạch Thể bệnh này không có triệu chứng viêm hạch đặc

hiệu nên rất dễ bị bỏ sót và tử vong cao

Bệnh nhân đột ngột sốt cao 40 - 410C, rét run, đau đầu dữ dội, tiêu chảy và ói

mửa nhiều lần Hốt hoảng, vật vã, kích động, nói sảng, tím tái, thở nhanh nông …

Formatted: Justified, Indent: First line: 0",

1.5 lines

13 pt, Italic

1.5 lines

Trang 19

liền sau đó đi vào sốc nhiễm trùng nhiễm độc Soi tươi các bệnh phẩm sẽ thấy vi

khuẩn dạng dịch hạch Thường bệnh nhân tử vong nhanh chóng trong vòng 1 vài

ngày nếu không được điều trị sớm và hồi sức tích cực ngay từ những giờ đầu của

bệnh

Cần lưu ý rằng cấy máu có Yesinia pestis không thể là tiêu chuẩn xác định

thể nhiễm khuẩn huyết, nếu không có biểu hiện nhiễm độc thần kinh nặng Sự hiện

diện của vi khuẩn dịch hạch trong máu có thể là nhất thời (vãng khuẩn huyết) và

không tác động đến toàn bộ thể trạng chung

1.4 I.3.3 Dịch hạch thể phổi

Bệnh dịch hạch đáng sợ nhất là thể phổi vì tiến triển nhanh và tỷ lệ tử vong

rất cao Thể tiên phát là do tác động trực tiếp của vi khuẩn trên tổ chức phổi theo

đường hô hấp trên, bệnh xuất hiện dưới dạng viêm đặc thùy phổi và diễn biến rất

cấp tính Thời gian nung bệnh của thể phổi thường ngắn hơn, chỉ trong một vài

ngày, thậm chí chỉ trong vòng vài giờ sau khi nhiễm bệnh Sau đó bệnh khởi phát

rất đột ngột với sốt cao, rét run, đau đầu, hoa mắt, chóng mặt, mạch nhanh, huyết áp

thấp, bệnh nhân bứt rứt Trong vòng 24 giờ sau, các dấu hiệu của tổn thương hô hấp

xuất hiện nhanh chóng, có rối loạn chức năng hô hấp như đau tức ngực, thở nhanh

nông, khó thở Lúc đầu ho có đờm nhầy, loãng Sau đó đờm đặc dần, có vết máu, có

khi có bọt Triệu chứng thực thể ở phổi rất nghèo nàn: Gõ bình thường hoặc đục

một vài nơi, âm phế bào và rung thanh không thay đổi Đôi khi tìm thấy dấu hiệu 3

giảm hoặc tiếng cọ màng phổi X quang phổi biểu hiện rất sớm, có thể thấy hình

ảnh đông đặc phổi thông thường hoặc nhiều bóng mờ rải rác hoặc hình ảnh bong

bóng giống viêm phổi tụ cầu.[2]

Ngoài ba thể hay gặp trên còn có các thể khác ít phổ biến hơn như: thể màng

não, thể xuất huyết, thể hầu học…

2.1 I.4.1 Cơ chế lây truyền bệnh dịch hạch

Dịch hạch là bệnh truyền nhiễm, lây truyền trong quần thể gặm nhấm Bệnh

duy trì trong các ổ dịch thiên nhiên của các loài gặm nhấm và lây truyền qua trung

Formatted: Normal, Level 4, Line spacing: 1.5

lines, No bullets or numbering

13 pt, Italic

1.5 lines

Formatted: Normal, Level 4, Line spacing: 1.5

lines, No bullets or numbering

13 pt, Italic

1.5 lines

Trang 20

gian bọ chét sống ngoại ký sinh trên chúng Phần lớn các loài động vật hoang dại đều bị nhiễm vi khuẩn dịch hạch nhưng chúng có tính đề kháng tương đối với bệnh nên không đóng vai trò quan trọng trong vật chủ bệnh dịch hạch

Trên thế giới bộ gặm nhấm (Rodentia) có khoảng 6.000 loài, trong đó họ chuột (Muridae) có 150 loài chuột Ở Việt Nam có 56 loài gặm nhấm và họ chuột

có 43 loài phân bố trên toàn lãnh thổ

Dịch hạch là bệnh của động vật, chủ yếu là các loài gặm nhấm hoang dại và chuột, người chỉ là vật chủ ngẫu nhiên, thứ yếu Có nhiều yếu tố trong cơ chế lan truyền bệnh dịch hạch, trong đó bọ chét đóng vai trò quan trọng Bọ chét phải nhiễm vi khuẩn dịch hạch khi hút máu Tiếp theo là thời gian sống phải đủ dài để quá trình nhân lên vi khuẩn đủ số lượng nhiều và sau đó lây truyền vi khuẩn dịch hạch sang vật chủ khác Bên cạnh đó, số lượng và thành phần bọ chét cũng như quần thể vật chủ cũng là yếu tố cần thiết để gây nên nhiễm trùng và lan truyền dịch bệnh Trong tự nhiên, bệnh dịch hạch lan truyền theo các con đường sau:

* Phổ biến nhất là lây truyền qua trung gian bọ chét : Theo cơ chế lây truyền này thì bệnh dịch hạch ở người thường xuất hiện sau dịch hạch ở vật chủ vài ngày đến một vài tuần Bọ chét hút máu vật chủ mắc bệnh trong đó có vi khuẩn dịch hạch, vi khuẩn nhân lên sẽ tạo thành nút nghẽn ở tiền dạ dày (proventriculus) Khi vật chủ bị bệnh chết, bọ chét bị tắc nghẽn này mất nguồn thức ăn sẽ rời bỏ vật chủ chết đi tìm ký chủ mới để hút máu nhưng vì ống tiêu hoá bị tắc nghẽn ở tiền dạ dày, máu không vào được và mỗi lần hút máu lại bị đẩy ra, vi khuẩn dịch hạch theo vết đốt vào cơ thể vật chủ này và như vậy xảy ra sự lây truyền bệnh

* Lan truyền trực tiếp từ vật chủ bệnh sang vật chủ lành không qua trung gian của bọ chét như:

- Vi khuẩn dịch hạch xâm nhập trực tiếp qua da có hoặc có thể không có tổn thương khi tiếp xúc trực tiếp vào động vật bị bệnh, nhân viên các phòng xét nghiệm

về vi khuẩn dịch hạch hoặc do động vật nuôi trong nhà cắn hoặc cào

- Hít vào trực tiếp vi khuẩn dịch hạch tồn tại trong không khí do tiếp xúc trực tiếp với vật chủ bị bệnh hoặc chết vì dịch hạch, nhất là dịch hạch thể phổi Đây là

Trang 21

một phương thức lây truyền cực kỳ nguy hiểm vì xảy ra rất nhanh cho người tiếp

xúc

Vi khuẩn dịch hạch xâm nhập qua da, ở nơi bọ chét đốt và theo đường bạch

huyết đến hạch khu vực, sinh sản phát triển mạnh tại đó gây nên dịch hạch thể hạch

Sau đó, nếu không được điều trị thích hợp vi khuẩn dịch hạch xâm nhập vào máu

gây nên thể nhiễm khuẩn thứ phát Đối với thể nhiễm khuẩn huyết tiên phát hoặc

thứ phát, ngoài vai trò truyền bệnh của bọ chét còn có thêm yếu tố độc lực của mầm

bệnh và sức đề kháng của cơ thể vật chủ [2]

Hình 1.5: Sơ đồ lây lan bệnh dịch hạch

2.2 I.4 2 Vi khuẩn gây bệnh dịch hạch Yersinia pestis

Dịch hạch là bệnh truyền nhiễm cấp tính, tối nguy hiểm thuộc diện kiểm dịch

và khai báo quốc tế do Yersinia pestis gây nên Bệnh lưu hành trong quần thể động

Formatted: Indent: Hanging: 0.59", Space

1.5 lines

Formatted: Normal, Justified, Level 4, Line

spacing: 1.5 lines, No bullets or numbering

1.5 lines

Trang 22

vật thuộc bộ gặm nhấm (Rodentia), chủ yếu là chuột và bọ chét ký sinh trên chúng,

từ đó lây truyền sang các loại súc vật khác và sang người

Vi khuẩn dịch hạch trải qua nhiều danh pháp khác nhau, đầu tiên khi mới

được phát hiện có tên là Bacterium pestis, đến năm 1900 gọi là Bacillus pestis, sau năm 1923 đổi thành Pasteurella pestis và tại Hội nghị Sinh vật học Quốc tế lần thứ

10 vào năm 1970 mới có danh pháp như hiện nay là Yersinia pestis

Yersinia pestis do Alexandre Yersin phát hiện ra tại Hồng Kông vào ngày 20

tháng 6 năm 1894, trong thời gian đại địch lần thứ 3 đang hoành hành ở đây

Yersinia pestis trước đây được xếp vào họ Pasteurellaceae, nhưng dựa trên

cơ sở so sánh mã di truyền bằng lai tạo DNA-DNA và RNA ribosom 16S/5S thì

tương tự như Escherichia coli nên giống Yersinia được xếp lại vào họ

Enterobacteriaceae Giống Yersinia có 11 loài nhưng chỉ có 3 loài được quan tâm

vì có khả năng gây bệnh cho người là Yersinia pestis, Yersinia pseudotuberculosis

và Yersinia enterocolitica

Yersinia pestis có hình dạng cầu trực khuẩn (0,5 x 1- 2 µm), bắt màu Gram

âm, nhuộm Wayson có màu xanh tím bắt màu ở 2 đầu, ở giữa trống nên gọi là “bắt màu lưỡng cực” Vi khuẩn không di động, không hình thành nha bào và không sinh

axít Yersinia pestis là vi khuẩn hiếu khí, dễ mọc trên các môi trường nuôi cấy thông

thường, mọc tốt nhất ở nhiệt độ 28 - 300C và độ pH từ 7,2 đến 7,6 Trên môi trường canh thang, khuẩn lạc mọc không làm đục môi trường Trên môi trường thạch, khuẩn lạc dạng R điển hình (lồi ở giữa, xung quanh sáng và có mép viền không đều kiểu đăng ten) Vi khuẩn lên men đường glucose và mannitol, không lên men đường rhamnose, lactose và sucrose

Trang 23

Hình 1.6: Hình ảnh Yersinia pestis bắt màu đậm 2 đầu khi nhuộm Wayson

Dựa vào khả năng khử hóa nitrat thành acid nitric và lên men glycerin,

Yersinia pestis được chia thành 3 type sinh học là Orientalis, Antiqua và

Medievalis Ba type này không có sự khác nhau về độc lực cũng như bệnh học đối

với người và động vật, nhưng chúng có phân bố địa lý cũng như tính chọn lọc vật

chủ rất khác nhau nên có vai trò quan trọng về mặt dịch tễ học

Yersinia pestis thuộc nhóm vi khuẩn có sức đề kháng yếu với môi trường bên

ngoài Ánh sáng, nhiệt độ cao, làm sấy khô có thể phá hủy vi khuẩn Các chất sát

trùng, tẩy uế như lysol và các chế phẩm chứa Chlorin diệt vi khuẩn trong vòng 10

phút

Yersinia pestis có cấu trúc kháng nguyên phức tạp và khả năng gây bệnh phụ

thuộc vào nhiều yếu tố, những chủng có độc lực cao có đến 16 - 18 kháng nguyên,

các quan trọng thường được chú ý là F1, V, W, yếu tố P, yếu tố Pu Trong đó có 3

loại kháng nguyên đã được nghiên cứu nhiều hơn, bao gồm: kháng nguyên nang

(capsular antigen): có độc lực cao và mang tính kháng nguyên mạnh, có tác dụng

bảo vệ vi khuẩn sinh trưởng chống lại thực bào; kháng nguyên thân: là một phần

của nội độc tố; và kháng nguyên V và W: là yếu tố độc lực liên quan đến khả năng

chống lại hiện tượng thực bào

Formatted: Justified, Space After: 0 pt, Line

Trang 24

Burrows và Bacon đã xác định tính kháng thực bào của Y Pestis nhờ kháng

nguyên gọi là V và W có thể hoạt động liên kết hay độc lập với KN F1 Những

chủng không độc thiếu KN F1 có thể kháng thực bào nhờ các kháng nguyên này

Y pestis sản sinh kháng nguyên V và W đồng thời chứ không tách biệt Kháng

nguyên W được tiết tự do vào môi trường xung quanh, kháng nguyên V liên kết

chặt chẽ với tế bào vi khuẩn Lawton và cs lần đầu tiên đã tách được kháng nguyên

này dưới dạng tinh khiết và chỉ ra rằng KN V là protein có trọng lượng phân tử

90.000 Da và KN W là lipoprotein với trọng lượng phân tử 145.000 Da.[5]

Yersinia pestis tạo ra cả nội độc tố và ngoại độc tố Các độc tố dịch hạch có

tác động làm tan hồng cầu, tan tơ huyết và làm đông huyết tương, là những yếu tố

giúp vi khuẩn xâm nhập vào cơ thể vật chủ Nội độc tố có tính chất ái thần kinh, gây

nên bệnh cảm li bì, u ám, thâm nhiễm xuất huyết ở các nội mạc tĩnh mạch và những

tổn thương thoái hóa của phủ tạng Vi khuẩn dịch hạch có thể lây truyền qua cả 4

con đường: đường máu (là chủ yếu), đường tiêu hóa, đường hô hấp và đường da,

niêm mạc

Để phục vụ nhiệm vụ trinh sát trong quân đội, song song với việc phát triển

và hiện đại hóa các hệ thống trinh sát thì yêu cầu có thiết bị chẩn đoán các loại độc

tố nhanh, dễ dàng và an toàn là các yếu tố được đặt lên hàng đầu Hiện nay có một

dạng test thuận tiện và hiệu quả để xác định nhanh vi khuẩn, virus, hóa chất, hóa

dược và các loại độc tố, đó là que thử nhanh dựa trên nguyên lí sắc kí miễn dịch

(immunochromatographic assay) Ứng dụng nguyên lý của kỹ thuật này, một số

nhóm nghiên cứu trên thế giới đã nghiên cứu tạo được que thử nhanh phát hiện

kháng nguyên F1 của Y pestis từ mẫu người bệnh hoặc động vật gặm nhấm [15]

Kháng nguyên F1 có tính đặc hiệu loài cao, chỉ có Y pestis mới có kháng

nguyên F1 Các vi khuẩn nhóm khác không có kháng nguyên này William và cộng

sự đã nghiên cứu trên 300 chủng Y pestis độc và không độc (EV76) cho thấy tất cả

các chủng đều có kháng nguyên F1, bởi vậy kháng nguyên F1 được dùng cho chuẩn

Formatted: Line spacing: 1.5 lines

Trang 25

đoán dịch hạch [21] Ở Y pestis, quá trình tổng hợp và tiết kháng nguyên F1 được

mã hóa bởi operon F1 bao gồm 4 gen caf1, caf1M, caf1A và caf1R nằm trên plasmid

pMT1, trong đó caf1 mã hóa kháng nguyên F1, caf1M và caf1A đóng vai trò trong

việc tạo cấu trúc và tiết protein ra bên ngoài tế bào, caf1R đóng vai trò trong điều

hòa quá trình phiên mã các gen trên operon Về mặt cấu trúc, kháng nguyên F1 là

chuỗi polypeptide, kích thước 17 - 17,6 kDa, điểm đẳng điện 4,1 - 4,4 F1 là protein

kị nước với cấu trúc bậc hai gấp nếp β [12] Kháng nguyên nang F1 là một dấu hiệu

cụ thể để có thể xác định vi khuẩn Yersinia pestis Khi nuôi cấy ở 370C thì kháng

nhguyên F1 được hình thành nhiều nhất trên bề mặt tế bào, dễ dàng hòa tan trong

môi trường nuôi cấy

Protein F1 có cấu trúc bậc 4, tương tác kị nước, có cấu trúc bên trong kiểu

hàng rào không gian 3 nhịp với các lỗ thấm có tác dụng như một màng sinh học hỗ

trợ cho thành phần tế bào KN F1 có thành phần hóa học và cấu trúc đặc biệt nên ít

chịu tác động của các nhân tố hóa lí: bền với nhiệt, đun nóng 80-100oC trong 15

phút mới làm biến đổi một phần tính kháng nguyên và chỉ bị phân hủy hoàn toàn

khi nung nóng 100oC/1 giờ KN F1 có tính sinh miễn dịch, có khả năng chống lại

thực bào của các bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân và có thể kích thích tạo

ra kháng thể chống lại nhiễm trùng ở động vật Một tính chất quan trọng khác nữa

đã được Janssen và Sunrgalla nhấn mạnh là KN F1 trợ giúp cho Y pestis trốn được

thực bào.[11]

Các nghiên cứu sơ bộ đã chứng minh kháng nguyên F1 tồn tại trong mô động

vật và huyết thanh của bệnh nhân dương tính dịch hạch Sử dụng kĩ thuật miễn dịch

để phát hiện kháng nguyên F1 trên bệnh nhân nghi ngờ mắc dịch hạch thông qua

mẫu hạch, huyết thanh, nước tiểu cho kết quả xác định được 100% các ca nhiễm

bệnh[8] Do đó kháng nguyên F1 đã được sử dụng rộng rãi trong chẩn đoán huyết

thanh bệnh dịch hạch [10] Kháng nguyên nang F1 là một dấu hiệu cụ thể để có thể

xác định vi khuẩn Yersinia pestis Do đó việc phát hiện F1 là quan trọng cho việc

khẳng định có mặt Y pestis Việc nuôi cấy Y pestis để tách DNA, tách kháng

nguyên F1 có nguy cơ gây độc, gây nguy hiểm trực tiếp rất cao cho người phân tích,

Trang 26

đồng thời khi tiến hành đòi hỏi các biện pháp phòng vệ phức tạp nên hiện kháng

nguyên F1 thường được thu nhận bằng con đường tái tổ hợp

Trên thế giới đã có các nhà khoa học tạo thành công kháng nguyên F1 tái tổ

hợp và ứng dụng chúng cho kết quả đáng tin cậy như Tsui và cộng sự đã nghiên cứu

thành công phương pháp phát hiện Y pestis thông qua phát hiện kháng nguyên F1

tái tổ hợp [17] Nhằm tạo kháng nguyên F1 làm nguyên liệu để chẩn đoán bệnh dịch

hạch, nhiều nghiên cứu đã biểu hiện protein kháng nguyên này trong tế bào E Coli

[5, 10, 17] Cách tiếp cận được sử dụng phổ biến là biểu hiện toàn bộ operon trong

E coli để tạo kháng nguyên F1 ở dạng ngoại bào tương tự như ở Y pestis [5, 17]

Bên cạnh đó, Erova và đồng tác giả (2013) đã biểu hiện trực tiếp gen caf1 trong nội

bào của E coli với việc sử dụng vector biểu hiện pET-20b(+) [10] Khi được biểu

hiện ở dạng dung hợp với đuôi ái lực (His)6 ở đầu cacboxyl, kháng nguyên F1 có

thể được tạo ra ở trạng thái hòa tan Trong nghiên cứu này, để tránh các vấn đề liên

quan đến an toàn sinh học, đề tài đã tiến hành tổng hợp nhân tạo gen caf1 và đưa

gen này vào vector pET-52b(+) để biểu hiện kháng nguyên F1 ở dạng dung hợp với

đuôi ái lực (His)10 ở đầu cacboxyl tương tự như nghiên cứu của Erova và đồng tác

giả

Tại Việt Nam, chưa có công trình công bố về tổng hợp gen nhân tạo caf1, tuy

nhiên đã cố những công trình về phát hiện kháng nguyên F1 của vi khuẩn Yersinia

pestis Năm 2004, Nguyễn Thị Ngọc Dao và cộng sự đã chế tạo thành công kít phát

hiện vi khuẩn Y pestis bằng phương pháp sinh học phân tử [1] Năm 2015, Đinh

Thị Thu Hằng và cộng sự đã bằng kĩ thuật multiplex PCR đã phát hiện được Y

pestis gây bệnh tại Việt Nam [3]

II Protein tái tổ hợp và phương pháp tạo protein tái tổ hợp

Protein tái tổ hợp được hiểu theo nghĩa thông dụng là protein được tạo ra bởi tế bào

mà vật liệu di truyền (DNA) đã được biến đổi bằng kĩ thuật di truyền in vitro

Qui trình chung để sản xuất protein tái tổ hợp gồm các bước:

Formatted: Level 2, Line spacing: 1.5 lines Formatted: Level 3, Indent: Left: 0",

Hanging: 0.49", Line spacing: 1.5 lines, No bullets or numbering

Trang 27

Sơ đồ 1.1: Qui trình tạo protein tái tổ hợp

Gen đặc tính có thể được phân lập từ tế bào gốc ban đầu hoặc được tạo ra

bằng cách tổng hợp gen sau đó sẽ tiến hành biểu hiện vào trong tế bào vật chủ Vật

chủ có thể là vi khuẩn, nấm men, thực vật… tùy vào mục đích, loại protein cần sản

xuất sẽ được biến nạp lên vật chủ thích hợp Vật chủ có thể là vi khuẩn, nấm men,

thực vật hay động vật… Vi khuẩn Escherichia coli: là một tế bào chủ dễ nuôi cấy

và dễ nhân giống, dễ dàng chấp nhận nhiều loại véc tơ Vi khuẩn E coli đáp ứng

được các điều này và được sử dụng rất nhiều làm tế bào chủ trong sản xuất protein

tái tổ hợp Trong E coli, sau khi mRNA được tổng hợp sẽ được sử dụng ngay để

dịch mã mà không qua các bước sửa đổi hậu phiên mã vì gen của chúng không có

các intron Vì vậy E coli được coi là một trong những tế bào vật chủ đơn giản nhất

Ngoài E coli, các vi khuẩn khác được dùng để làm vật chủ như: Bacillus,

Phân lập gen đặc tính Lựa chọn vật chủ Lựa chọn vectơ biểu hiện

Đƣa gen đặc tính vào vectơ

Trang 28

Pseudomomas, Streptomyces… Tuy nhiên các tế bào chủ này đòi hỏi phải có những

véc tơ thích hợp nên việc đưa DNA tái tổ hợp vào chúng gặp nhiều khó khăn

Sau khi biến nạp vào tế bào vật chủ thì tế bào này sẽ được nuôi trong môi

trường tuyển chọn để phát triển và biểu hiện protein đích Tùy thuộc vào loại

protein, véc tơ sử dụng và tế bào vật chủ mà protein đích có thể ở dạng tan, không

tan, ở ngoài môi trường hay trong tế bào Với mỗi đặc điểm protein khác nhau ta có

thể lựa chọn một hay kết hợp hai, nhiều phương pháp tinh sạch khác nhau như tinh

sạch bằng sắc ký ái lực, sắc ký trao đổi ion, sắc ký lọc gel

II.2 Phương pháp tạo protein kháng nguyên lớp vỏ F1 tái tổ hợp của vi khuẩn

Yersinia pestis

Kĩ thuật tổng hợp oligonucleotides được thực hiện đầu tiên vào những năm

1960 và đầu những năm 1970 khi thực hiện thành công với gen của enzyme tRNA

Vào những năm 1970 và đầu những năm 1980, một loạt các gen mã hóa cho protein

được tổng hợp bằng phương pháp hóa học và biểu hiện trong vi khuẩn E coli Từ

sau năm 1990, kĩ thuật PCR đã cải thiện phương pháp tổng hợp hóa học và gắn các

phân tử DNA Bằng kĩ thuật PCR có rất nhiều các phương pháp tổng hợp gen được

ứng dụng.[20]

II.2.1 Phương pháp PCR một bước( “PRC-based single-step assembly”)

Một gen được tổng hợp bằng cách sử dụng các đoạn oligonucleotide có chiều

dài 30 - 60 nu và có 6 - 9 nu xếp chồng với oligonucleotide bên cạnh; các

oligonucleotide này được nối bằng một bước PCR Phươnng pháp này được sử

dụng đầu tiên để tổng hợp gen mã hóa enzyme horseradish peroxidase, dài 924bp

Các oligonucleotide đầu tiên được gắn với nhau, sau đó sản phẩm sẽ được khuếch

đại bằng sử dụng một mồi ngoài 5’, một mồi ngoài 3’.[20]

II.2.2 Phương pháp tổng hợp gen hai bước (“PCR-based two-step DNA synthesis”)

Phương pháp tổng hợp DNA hai bước PCR được sử dụng để tổng hợp gen có

kích thước lớn Các oligonucleotide được thiết kế bao trùm toàn bộ chiều dài hai

chuỗi của gen, gen hoàn chỉnh được tổng hợp bằng phản ứng PCR với hai mồi

ngoài cùng

Formatted: Indent: First line: 0.49", Line

spacing: 1.5 lines

Trang 29

Hai phương pháp tổng hợp gen hai bước đang được phát triển là phương pháp “thermodynamically balanced inside-out” (TBIO) của Xinxin Gao và cộng sự[19] và phương pháp tổng hợp “gapless PCR” của Lei Young và Qihan Dong[14]

Phương pháp tổng hợp gen “gapless PCR”: là sự kết hợp của phương pháp

“dual asymmetrical PCR” (DA-PCR) và “overlap extension PCR” (OE-PCR) Phương pháp này giúp giảm giá thành bởi không yêu cầu quá trình phosphoryl và tinh sạch trên gel Tuy nhiên cần tối ưu điều kiện cho từng gen nên khó áp dụng cho mọi trình tự Phương pháp “gapless PCR” đã tổng hợp thành công với gen có kích thước từ 470bp đến 1,2Kbp; thời gian thực hiện phương pháp chỉ khoảng 1 tuần[14]

Phương pháp “gapless PCR” dựa trên thiết kế các oligo có chiều dài khoảng

30 - 50 nu, phủ kín toàn bộ gen, những đoạn oligo này có khoảng xếp trồng bắt cặp trùng khít lên nhau theo cả chiều xuôi và chiều ngược Tổng hợp gen được thực hiện đơn giản, gồm có hai bước (hai chuỗi phản ứng PCR) [14]

- “overlap” PCR với khuôn là các oligonucleotide được thiết kế có độ dài từ

30 - 50 Nu phủ kín toàn bộ chiều dài của đoạn gen cần tổng hợp theo cả chiều xuôi lẫn chiều ngược và giữa các oligonucleotide theo chiều xuôi và chiều ngược có các vùng chồng lấp có độ dài từ 15-25 Nu; Phản ứng thứ nhất là phản ứng PCR tự mồi tạo đoạn DNA từ các đoạn oligo đã thiết kế trước, chuỗi DNA được kéo dài từ oligonucleotide đầu tiên đến oligonucleotiede cuối dựa vào các đoạn Nu xếp chồng lên nhau của hai oligo liền kề

- “full length PCR” với khuôn là sản phẩm của “overlap” PCR và mồi là 2 oligonucleotide ngoài cùng ở 2 đầu đoạn gen Phản ứng PCR thứ hai giúp tạo một sản phẩm duy nhất là đoạn gen mong muốn

Với phương pháp tổng hợp gen hai bước này, sản phẩm cuối cùng có thể thu được bằng cách tinh sạch trực tiếp không cần phải tinh sạch trên gel

Trang 30

Hình 1.7: Nguyên tắc của phương pháp tổng hợp gen gapless PCR với 2 bước là

“overlap” PCR và “full length” PCR

Phương pháp TBIO: sử dụng các đoạn oligonucleotide có kích thước khoảng

60Nu, dài hơn phương pháp “Gapless PCR” Trình tự gen được tổng hợp từ các

oligo ở giữa rồi kéo dài đoạn DNA ra hai đầu bằng phương pháp PCR [19] Khuân

của phản ứng PCR chính là hỗn hợp các oligo đã đặt tổng hợp sẵn Nồng độ các cặp

oligonucleotide đối xứng tăng dần từ oligo ở giữa ra bên ngoài, mỗi phản ứng PCR

nối dài gen chỉ nên có khoảng 4 -6 cặp mồi (4 - 6 cặp oligonucleotide đối xứng

nhau tính từ cặp oligonucleotide ở giữa kéo dài sang hai bên) Sản phẩm của phản

ứng PCR cần phải được tinh sạch trên gel trước khi tiến hành phản ứng tiếp theo

Sản phẩm phản ứng PCR nối các đoạn gen bên trong được sử dụng làm khuôn để

tiếp tục kéo dài mạch DNA cho phản ứng PCR tiếp theo Khi kết thúc chuỗi phản

ứng PCR, để tạo đoạn gen hoàn chỉnh sản phẩm PCR sau cùng vẫn cần phải tiến

hành tinh sạch trên gel Phương pháp TBIO có tỉ lệ tạo gen sai thấp, khoảng 0 -

0,3%

Trang 31

Hình 1.8: Phương pháp tổng hợp gen TBIO[19]

Ngoài các phương pháp tổng hợp gen trên, còn rất nhiều các phương pháp

tổng hợp gen khác mà các nhà khoa học sử dụng, nhưng vẫn trên cơ sở là từ các

oligonucleotide được thiết kế từ trình tự gen, sau đó bằng kĩ thuật PCR để gép nối

lại như: phương pháp “PCR-base accurate synthesis” (PAS), phương pháp

“thermodynamically balanced conventional” (TBC), phương pháp PTDS… Phương

pháp PTDS, các oligonucleotide dài khoảng 60 Nu, một nhóm gồm 12

oligonucleotide tạo đoạn DNA có chiều dài 400 - 500 bp Các sản phẩm của phản

ứng PCR được gộp lại, làm khuôn cho phản ứng PCR thứ hai với cặp mồi là hai cặp

mồi ngoài cùng.[20]

Formatted: Justified, Line spacing: 1.5 lines

Formatted: Indent: Left: 0.5", Line spacing:

1.5 lines

Trang 32

Chương 2 : NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

I Nguyên vật liệu

I.1 Vật liệu, hóa chất

mrr-hsdRMS-mcrBC) Φ80lacZΔM15 Δ lacX74 recA1 araD139 Δ(araleu)7697 galU galK rpsL

(StrR) endA1 nupG] (Thermosciencetific) được sử dụng để nhân dòng gen Chủng

E coli BL21 (DE3) [F- ompT hsddSB (rBmB-) gal dcm (DE3)]

(Thermosciencetific) được sử dụng để biểu hiện

Bảng2 1: Các cặp mồi sử dụng trong luận văn

Formatted: Level 2, Indent: Hanging: 0.44",

spacing: 1.5 lines

1.5 lines

Formatted: Centered, Space Before: 0 pt,

Formatted: Justified, Space Before: 0 pt,

Trang 33

Trang 34

Vector pJET 1.2 (Thermosciencetific) được sử dụng để nhân dòng gen

Vector pET52b(+) (Merck), pMAL-c5x (NED) được sử dụng cho mục

đích biểu hiện gen

Hình 2.1: Sơ đồ cấu trúc và vị trí cắt giới hạn của véc tơ pET-52b(+)

Trang 35

Véc tơ pET-52b có kích thước khoảng 5,2kb, có vị trí gắn của T7

promoter, vùng Lac Operator là vị trí nhận biết và gắn các protein điều hoà

giúp cho quá trình điều hoà hoạt động của gen C ó điểm cắt của NcoI, SacI Trên

véc tơ có trình tự 10 His nên có thể giúp quá trình tinh sạch sản phẩm sau biểu hiện

dễ dàng nhờ vào sắc ký ái lực với đuôi His

Hình 2.2: Sơ đồ cấu trúc và vị trí cắt giới hạn của véc tơ pMAL-c5X

Véc tơ pMAL-c5X có trình tự MBP, có yếu tố dẫn đường MalE giúp cho protein khi

được biểu hiện sẽ ở dạng tan Đồng thời với trình tự MBP ta có thể sử dụng phương

pháp tinh sạch sắc ký ái lực cột Amyloresin Véc tơ trước khi nối với gen được cắt

bằng enzyme EcoRI, XmnI

- Hóa chất cho tách và tinh sạch plasmid: dung dịch A (Tris HCl 50mM, pH

7,5); dung dịch B (NaOH 0,2M; SDS 1%); dung dịch C (KOAC 1,32M; pH 4,8);

After: 0 pt, Line spacing: 1.5 lines, Tab stops: 0.49", Left

Trang 36

dung dịch E ( EtOH 50%; tris HCl 10mM pH 7,5; NaCl 100mM; EDTA 1mM);

Guanidine 5M; phosphate buffer; elution buffer

- Môi trường LB (Luria Broth):

Đệm LE: phosphate buffer pH 7,4: 50 mM; NaCl 5M

Wash buffer (WB): phosphate buffer pH 7,4: 0,2M, NaCl 300mM, Imidazole

100mM

Elution buffer (EB): phosphate buffer pH 7,4: 0,2M, NaCl 300mM,

Imidazole 250mM

Tinh sạch bằng cột Amylo resin:

Colum buffer: 200mM Tris-HCl, pH 8,0; 200mM NaCl; 100 mM EDTA;

1mM β-mecaptone

Elution buffer (EB): 20 mM Tris-HCl, pH 8,0; 200mM NaCl; 1 mM EDTA;

Tinh sạch protein không tan:

Denaturing Binding Buffer: Ure 8M, NaCl: 500mM, NaHPO4: 20mM,

Formatted: Justified Formatted: Justified

1.5 lines

Trang 37

Coomasive Brilliant Blue 0,25%

Thành

phần

Tris base :15,14 g Glycine : 72,1 g

SDS 20% : 25 ml

H2O khử ion:

500 ml

Methanol: 500 ml Acid acetic:

100 ml

H2O khử ion:

400 ml

Coomasive Brilliant Blue : 0,25 g Dung dịch tẩy màu:

100 ml

- Kít tinh sạch sản phẩm PCR: Gen JET PCR purification kit

(Themeoscientific)

1.5 lines, Bulleted + Level: 1 + Aligned at: 0.44" + Indent at: 0.69"

Trang 38

- Hóa chất cho phương pháp Western blot, Dot blot:

Transfer buffer: 48mM Tris, 39% methanol, 39mM glycine

1x TBST: 20mM Tris, 150mM NaCl, 0,1% Tween 20

Blocking buffer: 5% sữa không béo trong TBST 1x

Các máy, thiết bị đều đang trong thời gian được kiểm định chuẩn, bao gồm:

- Máy chu kỳ nhiệt 96 mẫu (Eppendorf, Đức);

- Máy soi chụp ảnh gel (BioRad, Mỹ);

- Bộ điện di DNA Horrizontal mini (CBS Scientific, Mỹ);

- Máy đồng hóa bằng siêu âm Sonics Vibra cell (VCX130, MIDSCI);

- Bộ điện di protein (Bio-rad, Mỹ);

- Bộ chuyển màng lai mini dry (Bio-rad, Mỹ);

- Máy cô đặc mẫu (Thermo Fisher, Mỹ);

- Máy quang phổ NanoDrop 2000 (Thermo Fisher, Mỹ);

- Nồi khử trùng (Harayama, Nhật Bản);

- Cân phân tích CPA 324S (Satorius, Đức);

- Tủ cấy vô trùng Class II Type A2 (ESCO);

- Máy lắc đảo ngược Mini laboroller (Labnet);

- Máy lắc ổn nhiệt DTU-2C (Taitec, Nhật Bản);

- Máy lắc ổn nhiệt (eppendorf , Mỹ);

- Máy li tâm lạnh Eppendorf Legend X1R (Thermo Fisher, Mỹ);

- Máy ly tâm (Eppendorf, CHLB Đức);

- Lò vi sóng (Samsung);

-Tủ lạnh (0 - 4oC) (Toshiba, Nhật);

- Tủ lạnh Biomedical Freezer (Thermo Fisher, Mỹ);

- Máy vortex (Rotolab, OSI); Máy đo pH (HI 8424, HANNA Instruments);

- Micropipette các loai; Máy đo pH (HI 8424, HANNA Instruments)

Formatted: Normal, Indent: Left: 0",

Hanging: 0.44", Line spacing: 1.5 lines, No bullets or numbering

Formatted: 3, Left, Indent: First line: 0.44",

Tab stops: Not at 0"

Tiêu đề	Nghiên cứu tạo kháng nguyên F1 tái tổ hợp từ vi khuẩn dịch hạch Yersinia pestis
Tác giả	Nguyễn Thị Thu Hà
Người hướng dẫn	TS. Lê Quang Hòa, Trưởng phòng Kỹ thuật Gen, Viện Công nghệ Sinh học và Công nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội
Trường học	Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội
Chuyên ngành	Công nghệ sinh học
Thể loại	Luận văn
Năm xuất bản	2016
Thành phố	Hà Nội

Định dạng
Số trang	76
Dung lượng	2,07 MB