Phát triển kỹ thuật MSP nhằm phát hiện methyl hóa bất thường gen rassf1a hướng đến hỗ trợ chẩn đoán ung thư vòm họng

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC MỞ TP.HCM BÁO CÁO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tên đề tài: PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MSP NHẰM PHÁT HIỆN SỰ METHYL HÓA BẤT THƯỜNG GEN RASSF1A HƯỚNG ĐẾN HỖ TRỢ CHẨN ĐOÁN SỚM UNG THƯ VÒM HỌNG KHOA CÔNG NGHỆ SINH HỌC CHUYÊN NGÀNH: VI SINH-SINH HỌC PHÂN TỬ CBHD: PGS TS LÊ HUYỀN ÁI THÚY ThS LAO ĐỨC THUẬN SVTH: NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT MSSV: 1153010962 Khóa: 2011-2015 Tp Hồ Chí Minh, tháng 05 năm 2015 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP LỜI CẢM ƠN Em xin bày tỏ lòng kính trọng biết ơn chân thành PGS TS Lê Huyền Ái Thúy, người đầy nhiệt huyết với khoa học truyền cho em lửa đam mê nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn ThS Lao Đức Thuận, người thầy tận tình hướng dẫn, động viên giúp đỡ em suốt trình thực đề tài Em chân thành cảm ơn ThS.Trương Kim Phượng truyền đạt cho em nhiều kinh nghiệm đáng quý suốt thời gian vừa qua Tôi xin cảm ơn thành viên phòng Thí Nghiệm Sinh Học Phân Tử Trường ĐH Mở TP.HCM hỗ trợ, giúp đỡ suốt thời gian thực đề tài Cuối xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ba Mẹ yêu thương, chăm sóc, động viên tạo điều kiện tốt cho TP Hồ Chí Minh, tháng 5, năm 2015 Nguyễn Thị Yến Tuyết NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang ii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cơ chế epigenetics bao gồm tượng methyl hóa DNA, biến đổi histone micro-RNA Hình 1.2 Cơ chế biến đổi epgenetics gây im lặng gen Hình 1.3 Cơ chế methyl hóa DNA Hình 1.4 Sự methyl hóa DNA ung thư Hình 1.5 Mô hình methyl hóa DNA Hình 1.6 Tỷ lệ mắc bệnh tử vong loại ung thư Việt Nam Hình 1.7 Giải phẫu vùng hầu họng-cổ Hình 1.8 Vị trí gen RASSF1A nhiễm sắc thể số Hình 1.9 Bản đồ gen RASSF1A (A) protein RASSF1A (B ) Hình 1.10 Tóm tắt vai trò sinh học protein RASSF1A Hình 1.11 APC-Cdc20 bị ức chế suốt trình nguyên phân Hình 1.12 Protein RASSF1A điều hòa chu trình chết thông qua Bax Hình 1.13 Xử lý sodium bisulfite chuyển đổi cytosine thành uracil Hình 1.14 Nguyên tắc kỹ thuật MSP Hình 2.1 Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR Hình 3.1 Tần số methyl hóa gen RASSF1A tế bào ung thư vòm họng tế bào bình thường Hình 3.2 Tần số methyl hóa gen RASSF1A tế bào ung thư vòm họng theo loại mẫu sử dụng Hình 3.3 Tần số methyl hóa gen RASSF1A tế bào ung thư vòm họng tế bào bình thường Hình 3.3 Định vị gen RASSF1A nhiễm sắc thể số Hình 3.4 Hình A Sơ đồ hình ảnh vùng đảo CpG trình gen khảo sát; Hình B Vùng promoter mồi unmethyl mồi methyl bắt cặp nhấn tố phiên mã Hình 3.5 Mồi methyl bắt cặp với trình tự RASSF1A biến đổi bisulfite Hình 3.6 Mồi unmethyl bắt cặp với trình tự RASSF1A biến đổi bisulfite Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm MSP Hình 3.8 Kết sản phẩm PCR giải trình tự NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang iii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 Bảng mồi gen RASSF1A tham khảo Bảng 2.2 Các bước tách chiết DNA Bảng 2.3 Chuẩn bị ME Wash buffer 1X Bảng 2.4 Chuẩn bị mẫu Bảng 2.5 Các bước thực biến đổi bisulfite Tiến hành đặt phản ứng PCR với hai cặp mồi sau Bảng 2.6 Mồi methyl unmethyl cho gen RASSF1A Bảng 2.7 Thành phần phản ứng PCR Bảng 3.1 Phương pháp sử dụng 10 công trình nghiên cứu Bảng 3.2 Loại mẫu sử dụng 10 nghiên cứu Bảng 3.3 Bảng tần số methyl hóa trung bình có trọng số số gen RASSF1A, DAPK, p16 bệnh ung thư vòm họng Bảng 3.4 Bảng tần số methyl hóa trung bình có trọng số gen RASSF1A bệnh ung thư vòm họng phân theo loại mẫu Bảng 3.5 Bảng tần số methyl hóa trung bình có trọng số gen RASSF1A tế bào ung thư vòm họng tế bào bình thường Bảng 3.6 Trình tự mồi thông số vật lý đánh giá phần mềm trực tuyến IDT Bảng 3.7 Bảng nồng độ chất lượng DNA tách chiết từ mẫu giữ PBS formallin Bảng 3.8 Bảng kết sơ phương pháp MSP NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang iv KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 5mC 5-methylcytosine APC Anaphase-promoting complex BSP Bisulftte sequencing C Cytosine CDK1 Cyclin-depentdent kinase CpG Cystosine phosphate Guanine ddH2O Double-distilled H2O DNA Deoxyribo Nucleic Acid DNMT DNA methyltransferase EBV Epstein-barr virus EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid G Guanidine JNK Jun-NH2-Kinase Kb Kilo base pair MDB methyl-binding protein MMSP Multiplex Methylation Specific PCR MOAP1 Modulator of apoptosis MSP Methylation-Specific Polymerase chain reaction NST Nhiễm sắc thể OD Optical Density NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang v KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PCR Polymerase Chain Reaction Pha G Pha GAP Pha S Pha Synthesis RASSF1A RAS association domain family member RT-PCR Real time PCR SAM S-adenosyl-L-methionine SDS Sodium dodecyl sulfat Ta Nhiệt độ bắt cặp TBBT Tế bào bình thường TBE Tris-Borate-EDTA TBTS Trung bình có trọng số TBUT Tế bào ung thư Tm Nhiệt độ nóng chảy UTVH Ung thư vòm họng WHO World Health Organization NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang vi KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ 1.TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan ung thư sinh học phân tử ung thư 1.1.1 Tổng quan ung thư .1 1.1.2 Sinh học phân tử ung thư 1.1.3 Epigenetics 1.2 Tổng quan ung thư vòm họng 10 1.2.1 Tình trạng ung thư vòm họng thới giới Việt Nam .10 1.2.2 Khái quát ung thư vòm họng 11 1.2.3 Tình hình nghiên cứu nước 14 1.2.4 Tìm hiểu gen RASSF1A methyl hóa gen RASSF1A dẫn đến ung thư vòm họng 15 1.2.5 Phương pháp phát methyl hóa 22 1.2.6 Phương pháp cố định mô ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi DNA 24 2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 27 2.1 Vật liệu 27 2.1.1 Mẫu mô sinh thiết vòm họng 27 2.1.2 Dung cụ – thiết bị – hóa chất 27 2.1.3 Danh mục phần mềm sử dụng 28 2.2 Phương pháp tiến hành 29 2.2.1 Khai khác dữ liệu 29 2.2.2 Khảo sát in silico 29 2.2.3 Khảo sát thực nghiệm 31 3.KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN .36 3.1 Khai thác dữ liệu 36 3.2 Kết khảo sát in silico 41 3.2.1 Khảo sát in silico gen RASSF1A 41 3.2.2 Khảo sát vị trí cấu trúc đảo CpG thuộc vùng promoter gen RASSF1A .41 3.2.3 Đánh giá mồi 44 NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang vii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 3.3 Kết thực nghiệm 47 3.3.1 Kết tách chiết DNA 47 3.3.2 Kết phản ứng MSP mẫu mô ung thư vòm họng 48 4.KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 51 4.1 Kết luận 51 4.2 Đề nghị 51 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53 PHU LỤC 59 NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang viii KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẶT VẤN ĐỀ Theo tổ chức giới (WHO), ung thư nguyên nhân dẫn đến tử vong toàn thới giới, ước tính có khoảng 8,2 triệu ca tử vong vào năm 2012 Ung thư thuật ngữ nhóm dạng bệnh lý khác nhau, đến có 200 dạng bệnh ung thư mô tả ví dụ ung thư vú, ung thứ tuyến tiền liệt, ung thư vòm họng, ung thư phổi… Trong đó, ung thư vòm họng biết ung thư phổ biến , tập trung chủ yếu Trung Quốc, Đông Nam Á Bắc Phi Theo thống kê Globocan 2012 ung thư vòm họng có khoảng 60.896 triệu ca mắc bệnh tỷ lệ tử vong 35.756 triệu ca năm toàn giới, theo ước tính đến 2017 tỷ lệ số nhiễm ung thư vòm họng tăng 161.899 ca toàn giới Tại Việt Nam ung thư vòm họng chiếm 4,7% tổng số ung thư Đồng thời, số lượng tử vong cao chiếm 3,3% (theo Globocan 2012) Trong năm gần đây, bệnh ung thư vòm họng bắt nguồn từ tượng biến đổi di truyền cụ thể epigenetics ngày nhà khoa học quan tâm Một biến đổi di truyền liên quan đến epigenetics methyl hóa vượt mức (hypermethylation) đảo CpG vùng promoter thuộc gen ức chế khối u, biến đổi bất thường làm bất hoạt chức gen ức chế khối u, kết dẫn đến tăng sinh vượt mức tế bào dẫn đến sinh u Sự methyl hóa vùng promoter gen RASSF1A biết chiếm tỷ lệ cao bệnh ung thư vòm họng dao động từ 66,7%-83% tổ hợp gen methyl liên quan đến ung thư Gen RASSF1A nằm vị trí 3p21.3 NST, bình thường đóng vai trò gen ức chế ung thư bị methyl hóa cách bất thường dẫn đến hình thành khối u Trên giới có công trình nghiên cứu Lo K W cộng (2001), Kwong J cộng (2002), Wang T cộng (2009),… cho thấy hay giảm biểu gen RASSF1A methyl hóa vượt mức vùng promoter gen tạo u dẫn đến ung thư vòm họng Gen RASSF1A gen ức chế khối u, có khả giảm thiểu số lượng ức chế phát triển protein sinh u tế bào Đồng thời, gen RASSF1A mã hóa cho protein RASSF1A thuộc thành viên họ protein RASSF có chức ức NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang ix KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP chế khối u RASSF1A ức chế chu trình phát triển tế bào cách ngăn cản tích lũy cyclin D1 kìm hãm tăng sinh tế bào vượt mức, chết theo chu trình chết, liên kết với Cdc20 Cdc20 không kích hoạt APC chu trình tế bào bị chặn lại thời điểm trước kì nguyên phân Một gen RASSF1A bị methyl hóa dẫn đến im lặng gen, tế bào tăng sinh kiểm soát dẫn đến hình thành u Chính methyl hóa gen RASSF1A ứng dụng dấu ấn phân tử việc chuẩn đoán tiên lượng phát sớm ung thư Các phương pháp sinh học phân tử ứng dụng để phát methyl hóa gen RASSF1A ứng dụng số công trình nghiên cứu giới RT-PCR Zhou L cộng (2005), Multiplex MMSP Zang Z cộng (2012), MSP Lo K.W cộng (2001),…Trong phương pháp MSP sử dụng phổ biến đồng thời phân tích nhanh tình trạng methyl hóa đảo CpG, ứng dụng nhiều nghiên nhóm nghiên cứu thới giới Tong J H cộng (2002), Kwong J cộng (2002), Chang H cộng (2003), Zhou L cộng (2005),… Tứ sở trên, tối thấy phát triển dấu chứng sinh học phân tử (Biomarker), cần thiết việc phát sớm tiền ung thư cần thiết cho việc hỗ trợ chẩn đoán lâm sàng.Từ đó, tiến hành hường đề tài ‘PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MSP NHẰM PHÁT HIỆN SỰ METHYL HÓA BẤT THƯỜNG GEN RASSF1A HƯỚNG ĐẾN HỖ TRỢ CHẨN ĐOÁN SỚM UNG THƯ VÒM HỌNG.’ với mong muốn xây dựng sở lý thuyết khoa học nhằm khẳng định methyl hóa RASSF1A xem dấu chứng sinh học hỗ trợ cho việc chẩn đoán sớm bệnh ung thư vòm họng NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang x KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP bắt cặp (Self-Dimer) mồi xuôi bắt cặp với mồi ngược (Hetero Dimer) có mức lượng delta G không đạt yêu cầu, làm ảnh hưởng đến trình PCR kiểm soát cách chỉnh nhiệt độ bắt cặp để hạn chế hình thành cấu trúc thứ cấp Nhận xét cặp mồi unmethyl: Các thông số vật lý chiều dài chiều dài mồi xuôi mồi 23 nucleotide nằm khoảng cho phép yêu cầu thông số vật lý từ 18-25 nucleotide, Tm mồi xuôi mồi ngược 53,8 oC 52,5oC nằm khoảng nhiệt độ quy định (50-65oC) nhiệt độ hai cặp mồi không chênh lệch lớn (sự chênh lệch nhiệt độ hai cặp mồi không 5oC), kẹp tóc (Hairpin), tự bắt cặp (Self-Dimer) mồi xuôi bắt cặp với mồi ngược (Hetero Dimer) nằm khoảng quy định đánh giá thông số vật lý cho mồi delta G lớn -9 kcal/mole, riêng mồi ngược cấu trúc kẹp tóc Tuy nhiên %GC thấp khoảng quy định làm ảnh hưởng đến việc hình thành cấu trúc thứ cấp cho trình PCR, nhiên kiểm soát Kiểm tra khả bắt cặp mồi Trình tự promoter tiến hành biến đổi bisulfite thông qua phần mềm methprimer (http://www.urogene.org/cgi-bin/methprimer/methprimer.cgi/ ) Hình 3.5 Mồi methyl bắt cặp với trình tự RASSF1A biến đổi bisulfite Chú thích: vùng màu đỏ mồi xuôi, màu xanh mồi ngược NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang 45 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Sau sử dụng phần mềm annhyb để kiểm tra khả bắt cặp mồi methyl mồi unmethyl, thu kết hình 3.7 Nhận xét: Mồi methyl gen RASSF1A khuyếch đại đoạn gen có kích thước 94bp gần với kích thướt sản phẩm công trình nghiên cứu Lo K W (2001) Với kết Annhyb cho thấy mồi methyl bắt cặt đặc hiệu 100% với trình tự biến đổi bisulfite mismatch Mồi xuôi bắt cặp từ vị trí nu 85-104 mồi ngược bắt cặp từ nu 158-178 Hình 3.6 Mồi unmethyl bắt cặp với trình tự RASSF1A biến đổi bisulfite Chú thích: vùng màu đỏ mồi xuôi, màu xanh mồi ngược Nhận xét: Với kết Annhyb cho thấy mồi xuôi bắt cặp từ vị trí nu 73-95 mồi ngược bắt cặp từ nu 158-180 Sản phẩm khuếch đại có chiều dài 108bp Mồi unmethyl bắt cặp 100% với trình tự không bị methyl mismacth Kết luận: Từ kết đánh giá mồi trang web trực tuyến IDT cho thấy mồi methyl unmethyl có khoảng thông số vật lý chấp nhận so với khoảng quy định đánh giá mồi Bên cạnh đó, hai cặp mồi methyl unmethyl bắt cặp đặc hiệu với trình tự bị methyl hóa trình tự không bị methyl hóa thông qua việc đánh giá phần mềm Annhyb Đồng thời hai cặp mồi methyl unmethyl bắt cặp vào vùng promoter cần khảo sát thông qua kết khảo sát gen RASSF1A hình 3.4 Từ kết trên, mặt sử dụng hai cặp mồi methyl unmethyl cho phản ứng MSP NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang 46 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 3.3 Kết thực nghiệm 3.3.1 Kết tách chiết DNA DNA tách chiết từ mẫu mô ung thư vòm họng tách chiết từ mẫu cố định formallin PBS, kết tách chiết kiểm tra thông qua việc đo mật độ quang học bước sóng 230 nm, 260 nm, 280 nm Kết thể bảng 3.7 Bảng 3.7 Bảng nồng độ chất lượng DNA tách chiết từ mẫu giữ PBS formallin HSPL OD230 OD260 OD280 OD260/280 Nồng độ (ng/µl) A1 50 0,017 0,020 0,010 2,0 50,0 A2 50 0,003 0,008 0,004 2,0 50,0 A3 50 0,095 0,170 0,104 1,634 20,0 A4 50 0,097 0,183 0,107 1,710 457,5 A5 50 0,047 0,012 0,006 2,0 30,0 Chú thích: HSPL hệ số pha loãng Mẫu A1, A2, A3, A4 giữ PBS Mẫu A5 giữ formallin Nhận xét: Giá trị tỉ số OD260/280 đạt giá trị khoảng 1,8-2,0 cho thấy độ tinh DNA đạt yêu cầu, giá trị thấp cao khoảng giá trị có nghĩa sản phẩm bị nhiễm protein RNA Với kết trên, mẫu A1, A2, A5 có giá trị OD260/280 tương ứng 2, cho thấy DNA thu hồi tương đối tốt, tinh Bên cạnh mẫu A4 có giá trị OD260/280 = 1,710, giá trị nằm gần 1,8 cho thấy mẫu tách chiết có độ tinh tương đối chấp nhận Tuy nhiên mẫu A3 có trị OD260/280 = 1,643 với giá trị cho thấy mẫu nhiễm protein Đồng thời, tỷ lệ OD260/230 tất cà mẫu (bảng 3.7) có tỷ số thấp nhiều so với khoảng từ 2,0-2,2, từ nhận thấy sản phẩm tách chiết dư phenol carbonhydrate, thao tác thực chưa tốt NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang 47 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Tuy nhiên, mẫu DNA tách chiết sử dụng biến đổi bisufite để khảo sát với cặp mồi gen RASSF1A dù độ tinh số mẫu đạt yêu cầu số mẫu không đạt yêu cầu, mẫu tách chiết có chứa DNA thông qua thông số nồng độ DNA tính bảng 3.3.2 Kết phản ứng MSP mẫu mô ung thư vòm họng Sau tách chiết biến đổi sodium bisulfite, tiến hành thực phản ứng PCR để khảo sát mức độ methyl hóa mẫu DNA bệnh phẩm với cặp mồi đặc hiệu, khuếch đại cho vùng khảo sát gen Đặt phản ứng PCR với mồi methyl đặc hiệu cho gen RASSF1A mẫu bệnh phẩm ung thư vòm họng sản phẩm khuếch đại từ cặp mồi methyl có kích thước mong đợi 94bp bên phía unmethyl không cho vạch sản phẩm (hình 3.7) 94bp Hình 3.7 Kết điện di sản phẩm MSP Chú thích: L thang, có kích thướt 1000bp M1, M2, M3, M4, M5: mẫu methyl U1, U2, U3, U4, U5: mẫu unmethyl Nhẫn xét: Kết mẫu đặt phản ứng PCR ghi nhận nhiệt độ bắt cặp cho hai mồi methyl cho unmethyl khảo sát tương đối tốt, băng sản phẩm kích thướt phần khảo sát in silico mẫu M1, M2, M3, M4, nhiên kết băng sản phẩm bị mờ Từ kết điện di cho thấy kích thướt sản phẩm khảo sát gần NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang 48 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP với kích thướt từ báo tham khảo nhóm nghiên cứu Lo K W cộng (2001) Tuy nhiên, mẫu số không methyl unmethyl nguyên nhân chất cố định mô làm ảnh hưởng đến kết khảo sát bệnh phẩm (mẫu 1,2,3,4 mẫu mô tươi giữ dung dịch đệm ổn định tế bào PBS mẫu số bảo formallin) đề cập phần tổng quan Dung dịch cố định mẫu formallin thường ảnh hưởng đến chất lượng tách DNA phản ứng PCR hóa chất bảo quản thời gian dài làm biến tình DNA, làm DNA tự phân cắt làm hạn chế chiều dài sản phẩm khuếch gen mong muốn, mẫu mô tươi sau tách chiết cho kết PCR tốt Từ kết hình điện di sản phẩm PCR, tiến hành ghi nhận kết phương pháp MSP mẫu bệnh phẩm giữ formallin PBS (bảng 3.8) Bảng 3.8 Bảng kết sơ phương pháp MSP Ký hiệu Methyl Unmethyl mẫu Mẫu giữ + - PBS + - + - + - - - (-) - - Mẫu cố định formallin Chứng âm Chú thích: (-): mẫu đối chứng âm, +: xuất vạch, -: vạch Tổng kết phần kết thực nghiệm MSP thực mẫu PBS ghi nhận: 100% (4/4) mẫu bị methyl hóa, nhiên mẫu bảo quản formallin (mẫu số 5) không cho kết methyl hay unmethyl cần tiến hành thực khảo sát lại mẫu số NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang 49 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Sau thu nhận kết đặt phản ứng PCR từ mẫu bệnh phẩm, tiến hành PCR lại hai mẫu kết methyl để tiến hành PCR giải trình tự (hình 3.8) 94bp Hình 3.8 Kết sản phẩm PCR giải trình tự Chú thích: L thang chuẩn, kích thướt 1000bp; M1, M2: tương ứng với mẫu methyl 2; U1, U2: mẫu unmethyl Nhận xét: Hình cho thấy sản phẩm tạo thành có kích thước mong đợi (94 bp) Cặp mồi methyl bắt cặp đặc hiệu mạch khuôn Vạch sản phẩm mong đợi xuất mẫu chứng dương (+) Mẫu chứng âm (-) không xuất vạch sản phẩm lạ Ở mẫu bệnh M1, M2 xuất vạch sản phẩm chứng tỏ chúng bị methyl hóa Ngoài ra, gel có xuất vạch vạch sản phẩm, vạch cấu trúc dimer mồi không làm ảnh hưởng đến việc đọc kết phản ứng MSP Bên cạnh gel có vệt sáng thao tác thực chưa tốt Mẫu số chọn để giải trình tự Hiện tại, kết giải trình tự chưa có điều kiện thời gian NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang 50 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Khai thác liệu: Thống kê tần số methyl hóa gen RASSF1A mẫu ung thư vòm họng chiếm khoảng 82% tổng số 10 công trình nghiên cứu công bố giới Kỹ thuật MSP mô sinh thiết sử dụng phổ biến 10 công trình tham khảo In silico: Thu thập thông tin, xác định vị trí mô tả cấu trúc vùng promoter đảo CpG thuộc gen RASSF1A Sau trình đánh giá mồi, cặp mồi tham khảo có chiều sản phẩm 94 bp, 108 bp tương ứng với mồi methyl unmethyl Thực nghiệm: Kỹ thuật MSP ứng dụng thành công việc phát methyl gen RASSF1A mẫu bệnh Đánh giá tần số methyl hóa gen RASS1A mẫu mô sinh thiết Việt Nam, tần số methyl hóa mẫu mô bệnh giữ PBS 100% 4.2 Đề nghị Từ kết trên, em đề nghị nên tiến hành PCR giải trình tự lại để đánh giá tốt tình trạng methyl hóa RASSF1A ung thư vòm họng Tiếp tục khảo sát methyl hóa gen RASSF1A với cỡ mẫu lớn (ước tính 81 mẫu) nhằm khảo sát tình trạng methyl hóa mẫu ung thư vòm họng Việt Nam Tiếp tục tiến hành khảo sát tần số methyl hóa gen RASSF1A nhiều loại mẫu mẫu dịch phết, mẫu máu, mẫu đúc paraffin bệnh ung thư vòm họng NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang 51 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Khảo sát tần số methyl hóa kết hợp thêm vài gen methyl khác bệnh ung thư vòm họng NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang 52 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Đinh Đoàn Long , Đỗ Lê Thăng (2009) , ‘Cơ sở di truyền học phâ n tử và tế bào’, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội, trang 246-247 Nguyễn Bá Đức (2009), Ung thư đại cương, NXB Giáo Dục, Hà Nội Nguyễn Đình Phúc, Lê Thanh Hòa (2008), ‘Virus Epstein-barr ung thư vòm mũi họng số phương pháp đại ứng dụng chẩn đoán’, Tạp chí Công Nghệ sinh học, Số 6(1), trang 1-18 Tiếng Anh: Baylin.S B (2005), ‘DNA methylation and gene silencing in cancer’, Nature Clinical Practice, Vol 2(1), P 4-11 Berg D., Malinowsky K., Reischauer B., Wolff C., Becker K F (2011), ‘Use of formalin-fixed and paraffin-embedded tissues for diagnosis and therapy in routine clinical settings’, Method Mol Biol, Vol 785, p.109-122 Bonin S., Stanta G (2013), ‘Nucleic acid extraction methods from fixed and paraffin-embedded tissues in cancer diagnostics’, Expert Rev Mol Diagn., Vol 13(3), p 271-282 Breada E., Catarino R J F., Azevedo I., Lobão M., Monteiro E.,Medeiros R (2010), ‘Epstein-barr virus detection in nasopharyngeal carcinomaimplications in a low-risk area’, Brazilian Journal of Otorhinolaryngolory, Vol 76(3), p 310-315 Campos P F., Gilbert T M P (2012), ‘DNA extraction from formalin-fix material’, Method in Molecular Biology, Vol 840, p 81-84 Chang H., Chan A., Kwong D., Wei W , Sham J., Yuen A (2003), ‘Evaluation of hypermethylated tumor suppressor genes as tumor markers in mouth and throat rinsing fluid, nasopharyngeal swab and peripheral blood of nasopharygeal carcinoma patient’, Int J Cancer, Vol 105, p 851-855 NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang 53 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 10 Chou J., Lin Y C., Kim J., You L., Xu Z., He B., Jablons D M (2008), ‘Nasopharyngeal carcinoma-review of the molecular mechanisms of tumorigenesis’, Head Neck, Vol 30(7), p 946-963 11 Chow S-N L., Lo K W , Kwong J., To K F., Tsang K S., Lam C W., Dammann R., Hang P D (2004), ‘RASSF1A is a Target tumor suppresor from 3p21.3 in nasopharyngeal carcinoma”, Int J Cancer, Vol 109, p 839847 12 Chu E A., (2008), ‘Nasopharyngeal carcinoma: The role of the Epstein-barr virus’, The Medscape Journal of Madicine, Vol 10(7), p 1-7 13 Delpu Y C P , Cho W C , Torrisani J 2013 ‘DNA Methylation and Cancer Diagnosis’, Int J Mol Sci , Vol 14 14 Dieffenbach C W., Lowe T M., Dveksler G S (1993), ‘General Concepts for PCR Primer Design’, Spring Harbor Laboratory Press, p 630-536 15 Do N V (2007), ‘EBV gene variation and epigenetic alterations in Asian nasopharyngeal carcinoma and potential clinical applications’, Karolinska Institutet, p 1-58 16 Donninger H., Vor M D., Clark G J (2007),‘The RASSF1A tumor suppressor‘, Journal of Cell Science, Vol 120, p 3163-3172 17 Duan C., Liu M., Zhang J X.,’Ma R (2013), ‘RASSF1A: a potential novel therapeutic target against cardiac hypertrophy.’, Prog Biophys Mol Biol, Vol 133, p 284-288 18 Ehrlich M (2009), ‘DNA hypomethylation in cancer cells’, Epigenomics, Vol 1, p 239 -259 19 Fangyun T (2012), ‘A study on the hypermethylation of tumor suppressor gens in Nasopharyngeal Carcinoma’, The Hong Kong Polytachnic University, p 1-176 20 Fendri A., Masmoudi A., Khabir A.,Sellami-Boudawara T , Daoud J., Frikha M., Ghorbel A., Gargouri A., Mokdad-Gargouri R (2009), ‘Inactivation of RASSF1A, RARβ2 and DAP-kinase by promoter NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang 54 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP methylation correlates with lymph node metastasis in nasopharyngeal carcinoma’, Vol 8, p 1-8 21 Feng B J (2013), ‘Descriptive, environmental and genetic epidemiology of nasopharyngeal carcinoma’, Landes Bioscience and Springer Science + Business Media, p 23-41 22 Gilbert M T., Haselkorn T., Bunce M., Sanchez J J., Lucas S B., Jewell L D., Van M E., Worobey M (2007), ‘The Isolation of Nucleic Acids from Fixed, Paraffin-Embedded Tissues–Which Methods Are Useful When?’, Plos One, Vol 537(6), p 1-12 23 Gordon M , Baksh S 2011, ‘RASSF1A’, Landes Bioscience, Vol 2(3), p 148-157 24 Guo X., Zeng Y., Deng H., Liao J., Zheng Y., Li J., Kessing B., O'Brien S J (2010), ‘Genetic Polymorphisms of CYP2E1, GSTP1, NQO1 and MPO and the Risk of Nasopharyngeal Carcinoma in a Han Chinese Population of Southern China’, BMC Research Notes, Vol 3(212), p 2-7 25 Hibi K (2001), ‘Mitochondrial DNA alteration in esophageal cancer’, International Journal of Cancer, Vol 92(3), p 319-321 26 Hutajulu S H., Indrasari S R., Indrawati L P., Harijadi A., Duin S., Haryana S M., Steenbergen R D., Greijer A E., Middeldorp J M (2011), ‘Epigenetic markers for early detection of nasopharyngeal carcinoma in a high risk population.’, Mol Cancer, Vol 10, p 1-9 27 Jennifer B (2009), ‘Promoter methylation and the detection of breast cancer’, Cancer causes control, 20(9), p 1539 - 1550 28 Joshi B., Mishra S., Singh S., Goyal S (2013), ‘An effective method for extraction and polymerase chain reaction (PCR) amplification of DNA from formalin preserved tissue samples of snow leopard’, African Journal of Biotechnology, Vol 12(22), p 3399-3404 29 Khoo A S B., Pua K C (2013), ‘Diagnosis and clinical evalution of nasopharyngeal carcinoma’, Landes Bioscence and Springer Science+Business Media, p 1-9 NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang 55 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 30 Kwong J., Lo K W., To K F., Teo P., Johnson P., Huang D (2002) ,’Promoter Hypermethylation of Multiple Genes in Nasopharyngeal Carcinoma’, Clin Cancer Res, Vol 8(1), p 131-137 31 Li L L., Shu X S., Wang Z H., Cao Y., Tao Q (2011), ‘Epigenetic disruption of cell signaling in nasopharyngeal carcinoma.’, Chin J Cancer, Vol 30(4), p 231-239 32 Lo K W., Kwong J., Hui B Y A., Chan S., To K F, Chan A (2001), ‘High Frequency of Promoter Hypermethylation of RASSF1A in Nasopharyngeal Carcinoma, Cancer Research, Vol 61, p 3877-3881 33 Lo K W., To K F., Huang D P (2004), ‘Focus on nasopharyngeal carcinoma.’, Cancer Cell, Vol 5(5), p 423-4228 34 Lo W K., Chung G., To F K (2013), ‘Acquired genetic and epigenetic alterations in nasopharyngeal carcinoma.’, Landes Bioscience and Springer Science + Business Media, p 61-76 35 Manel E (2007), ‘Epigenetic gene silencing in cancer: the DNA hypermethylome’, Human Molecular Genetics, Vol 16(1), p 50-59 36 Molofsky A V 2006, ‘Increasing p16INK4α expression decrease forebrain progenitors and neurogenesis during aging’, Nature, Vol 443(7110), p 448452 37 Nephew K P (2002), ‘Epigenetic gene silencing in cancer initiation and progression’, Cancer Letters, Vol 190(2), p 125-133 38 Nie J., Mahato S., Zelhof A (2015), ‘Imaging the Drosophila retina: zwitterionic buffers PIPES and HEPES induce morphological artifacts in tissue fixation’, BMC Developmental Biology, Vol 15(10), p.1-10 39 Pfeifer G P., Dammann R (2005),‘Methylation of the Tumor Suppressor Gene RASSF1A in Human Tumor‘, Biochemistry,Vol 70, p 576-583 40 Reuter, G., Horsthemke B., 'Characterization of the epigenetical inactivation of the tumor suppressor gene RASSF1A in human mammary epithelial cells.’, ULB Sachsen-Anhlt, p 1-103 NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang 56 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP 41 Sherr C J (1999), ‘CDK inhibitors: positive and negative regulators of G1 phase progression’, Genes Dev.,Vol 13(12), p 1501-1512 42 Shivakumar L., Minna J., Sakamaki T., Pestell R., White M A (2002), ‘The RASSF1A tumor suppressor blocks cell cycle progression and inhibits cyclin D1 accumulation.’, Mol Cell Biol,Vol 22(12), p 4309-4318 43 Song S M., Lim S D (2004), ‘Control of APC-Cdc20 by the tumor suppressor RASSF1A’, Landes Bioscience, Vol 3, p 574-576 44 Srinivasan M., Sedmak D., Jewell S (2002), ‘Effect of Fixatives and Tissue Processing on the Content and Integrity of Nucleic Acids’, American Journal of Pathology, Vol 161, p 1961-1971 45 Stadler R., Couch M E., Hayes D N (2008), ‘Molecular Biology of Head and Neck Cancer: Risks and Pathways’, Hematol Oncol Clin N Am, Vol 22, p 1099-1124 46 Szyf M., (2008), ‘The role of DNA hypermethylation and demethylation in cancer and cancer therapy’, Current Oncology, Vol 15(2), p 72-75 47 Tong J H., Tsang R K., Lo K W., Woo J K., Kwong J., Chan M W., Chang A R., Hasselt C A., Huang D P., To K F (2002), ‘Quantitative Epstein-Barr virus DNA analysis and detection of gene promoter hypermethylation in nasopharyngeal (NP) brushing samples from patients with NP carcinoma.’, Vol 8(8), p 2612-2619 48 Wang T., Liu H., Chen Y., Liu W., Yu J., Wu G (2009), ‘Methylation associated inactivation of RASSF1A and its synergistic effect with activated K-Ras in nasopharyngeal carcinoma’, Clinical Cancer Research, Vol 28, p 1-11 49 Weyden, L V D., Adams D J (2007), ‘The Ras-association domain family (RASSF) members and their role in human tumourigenesis.‘, Biochim Biophys Acta, p 4-9 50 Zhang Z S D., Hutajulu S H., Nawaz I., Nguyen V D (2012), ‘Development of a Non-Invasive Method, Multiplex Methylation Specific NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang 57 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PCR (MMSP), for Early Diagnosis of Nasopharyngeal Carcinoma’, PLoS ONE , Vol 7(11), p 1-6 51 Zhou L., Jiang W., Ren C., Yin Z., Feng X., Liu W., Tao Q., Yao K (2005), ‘Frequent Hypermethylation of RASSF1A and TSLC1, and High Viral Load of Epstein-Barr Virus DNA in Nasopharyngeal Carcinoma and Matched Tumor-Adjacent Tissues’, Neoplasia, Vol 7(9), p 809-815 Tài liệu Internet: 52 http://globocan.iarc.fr/Pages/Map.aspx, Globocan 2012: Estimated Cancer Incidence, Mortality and Prevalence Worldwide in 2012 53 http://www.nanodrop.com/ , Assessment of Nucleic Acid Purity 54 http://www.queensu.ca/biology/facilities/eebcore/protocols/dna_extractios_e tc.pdf/ 55 http://www.who.int/cancer/en/ , World Health Organization (2012) 56 https://sg.idtdna.com/analyzer/Applications/OligoAnalyzer/ ,IDT- Intergrated DNA Technologies NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang 58 KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP PHU LỤC Bảng thống kê mẫu bệnh phẩm ung thư vòm họng STT Họ tên bệnh nhân Chẩn đoán Ký hiệu mẫu Trần Mai N U vòm A1 Nguyễn Văn T U vòm A2 Tạ Đình C U vòm A3 Lương Văn Q U vòm A4 Nguyễn Văn T U vòm A5 NGUYỄN THỊ YẾN TUYẾT Trang 59 ... việc phát sớm tiền ung thư cần thiết cho việc hỗ trợ chẩn đoán lâm sàng.Từ đó, tiến hành hường đề tài ‘PHÁT TRIỂN KỸ THUẬT MSP NHẰM PHÁT HIỆN SỰ METHYL HÓA BẤT THƯỜNG GEN RASSF1A HƯỚNG ĐẾN HỖ TRỢ... học cho việc phát hiện, chẩn đoán sớm bệnh ung thư vòm họng 1.2.4 Tìm hiểu gen RASSF1A methyl hóa gen RASSF1A dẫn đến ung thư vòm họng 1.2.4.1 Vị trí, tên gọi cấu trúc gen RASS1A NST RASSF1A (Ras... nhau, đến có 200 dạng bệnh ung thư mô tả ví dụ ung thư vú, ung thứ tuyến tiền liệt, ung thư vòm họng, ung thư phổi… Trong đó, ung thư vòm họng biết ung thư phổ biến , tập trung chủ yếu Trung