Ung thƣ đạitrực tràng, theo Tổ chức Y tế Thế giới (WHO), là loại ung thƣ phổ biến thứ ba, sau ung thƣ vú và ung thƣ phổi. Ở Việt Nam, theo báo cáo của Bệnh viện Ung bƣớu TPHCM tại Hội thảo Phòng chống Ung thƣ lần 15 ngày 6 và 7 tháng 12 năm 2012 tại TPHCM, ung thƣ đạitrực tràng trở thành một trong ba loại ung thƣ hàng đầu ở cả nam giới và nữ giới 3. Đặc biệt ở nữ giới, tỉ lệ bệnh ung thƣ đạitrực tràng gia tăng rõ rệt. Dự đoán trong vài năm tới, số ngƣời mắc căn bệnh này ở Việt nam tiếp tục tăng nhanh, trung bình 5,4% 1 năm. Có nhiều nguyên nhân, chủ yếu là chế độ ăn uống quá nhiều thịt và chất béo, ít chất xơ, thức uống có chứa màu công nghiệp...
ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ THỊ KIM NGỌC SỬ DỤNG KỸ THUẬT CỘNG HƯỞNG TỪ HẠT NHÂN PHÂN TÍCH NƯỚC TIỂU HỖ TRỢ CHẨN ĐOÁN UNG THƯ ĐẠI-TRỰC TRÀNG LUẬN ÁN TIẾN SĨ HĨA HỌC Tp Hồ Chí Minh - năm 2017 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ THỊ KIM NGỌC SỬ DỤNG KỸ THUẬT CỘNG HƯỞNG TỪ HẠT NHÂN PHÂN TÍCH NƯỚC TIỂU HỖ TRỢ CHẨN ĐOÁN UNG THƯ ĐẠI-TRỰC TRÀNG Chuyên ngành: HÓA LÝ THUYẾT VÀ HÓA LÝ Mã số chuyên ngành: 62 44 31 01 Phản biện 1: GS.TS Nguyễn Sào Trung Phản biện 2: PGS.TS Nguyễn Tiến Tài Phản biện 3: TS Trần thị Như Trang Phản biện độc lập 1: PGS.TS Nguyễn Tiến Tài Phản biện độc lập 2: PGS.TS Hà Thúc Huy NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS CHU PHẠM NGỌC SƠN PGS.TS TRẦN LÊ QUAN Tp Hồ Chí Minh - năm 2017 LỜI CẢM ƠN Với lịng kính trọng sâu sắc, tơi xin chân thành cảm ơn GS.TS Chu Phạm Ngọc Sơn, PGS.TS Trần Lê Quan ngƣời thầy trực tiếp hƣớng dẫn tơi hồn thành luận án Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn ý kiến đóng góp q báu GS.TS.BS Nguyễn Sào Trung, BS Phan Thanh Hải, TS Nguyễn Tiến Tài giúp tơi hồn chỉnh luận án Tơi xin cảm ơn Phịng Sau Đại học, Khoa Hóa học-Bộ mơn Hóa Lý, Phịng Thí nghiệm Phân tích Trung tâm trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên TPHCM, Phòng Xét nghiệm Bệnh viện Hòa Hảo-Medic, Sở Khoa học& Cơng nghệ TPHCM, Trung tâm Dịch vụ Phân tích Thí nghiệm TPHCM tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập nghiên cứu Tơi xin cảm ơn động viên, chia sẻ kinh nghiệm quý báu anh chị bác sĩ, đồng nghiệp bạn bè suốt trình thực luận án Tôi xin ghi khắc công ơn cha mẹ, ngƣời thân gia đình ln đồng hành tơi, động viên vật chất tinh thần cho sống, học tập công tác TP HCM, tháng năm 2017 VŨ THỊ KIM NGỌC LỜI CAM ĐOAN Tơi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nêu luận án trung thực chƣa đƣợc cơng bố cơng trình khác Tác giả VŨ THỊ KIM NGỌC MỤC LỤC Trang phụ bìa Lời cảm ơn Lời cam đoan Danh mục chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình ảnh MỞ ĐẦU Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 UNG THƢ ĐẠI-TRỰC TRÀNG 1.2 SINH HÓA NƢỚC TIỂU 1.3 PHÂN TÍCH TỔNG THỂ CHẤT CHUYỂN HĨA (METABOLOMICS) 13 1.4 KỸ THUẬT CỘNG HƢỞNG TỪ HẠT NHÂN (NMR) 17 1.5 PHÂN TÍCH DỮ LIỆU ĐA BIẾN (MVA) 19 Chƣơng ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 VẤN ĐỀ Y ĐỨC CỦA NGHIÊN CỨU: 28 2.2 ĐỊA ĐIỂM VÀ THỜI GIAN NGHIÊN CỨU 28 2.3 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.4 CHUẨN HĨA QUY TRÌNH 31 Chƣơng KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 44 3.1 GHI PHỔ NMR 46 3.2 NHẬN DANH PHỔ NMR 48 3.3 MƠ HÌNH PCA THỂ HIỆN XU HƢỚNG PHÂN NHÓM CỦA TẬP HỢP MẪU………… 52 3.4 MƠ HÌNH PLS DÙNG CHẨN ĐỐN UNG THƢ ĐẠI-TRỰC TRÀNG 54 3.5 XÁC ĐỊNH CHẤT ĐÁNH DẤU SINH HỌC UNG THƢ ĐẠI-TRỰC TRÀNG 57 3.6 XÁC NHẬN GIÁ TRỊ PHƢƠNG PHÁP NMR TRONG CHẨN ĐOÁN UNG THƢ ĐẠI-TRỰC TRÀNG 644 3.7 KIỂM CHỨNG LÂM SÀNG MƠ HÌNH CHẨN ĐỐN THEO PHƢƠNG PHÁP NMR 66 Chƣơng BÀN LUẬN 69 4.1 KIỂM SỐT Q TRÌNH 69 4.2 MƠ HÌNH CHẨN ĐỐN SÀNG LỌC PLS 72 4.3 SO SÁNH ĐỘ NHẠY, ĐỘ ĐẶC HIỆU CỦA PHƢƠNG PHÁP NMR VỚI CÁC NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI 766 4.4 SO SÁNH KẾT QUẢ XÁC ĐỊNH CHẤT ĐÁNH DẤU SINH HỌC VỚI CÁC NGHIÊN CỨU TRÊN THẾ GIỚI 777 4.5 SỰ BIẾN ĐỔI CHẤT CHUYỂN HÓA VÀ CƠ CHẾ SINH UNG THƢ 80 4.6 GIỚI HẠN CỦA NGHIÊN CỨU 81 KẾT LUẬN 83 PHƢƠNG HƢỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO 85 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CỦA TÁC GIẢ 86 TÀI LIỆU THAM KHẢO 868 PHỤ LỤC PHỤ LỤC 2A, 2B PHỤ LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Viết tắt từ tiếng Việt: ĐTT Đại-trực tràng Viết tắt từ tiếng Anh: AAS Atomic Absorption Spectrometric Quang phổ hấp thu nguyên tử CE-MS Capillary Electrophoresis Mass Spectrometry DSS D4,4-dimethyl-4-silapentane-1-sulfonic acid FT-IR Fourier Tranform Infrared Radiation Hồng ngoại biến đổi Fourier HR-MAS-NMR High Resolution-Magic Angle Spinning-Nuclear Magnetic Resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân góc quay kỳ diệu độ phân giải cao ICP Inductively Coupled Plasma Quang phổ phát xạ plasma GC-MS Gas Chromatography Mass Spectrometry Sắc k khí gh p khối phổ LC-MS Liquid Chromatography Coupled Mass Spectrometry Sắc k lỏng gh p khối phổ MS Mass Spectrometry Khối phổ MVA Multi-variate analysis Phân tích liệu đa biến NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân PC Principal Component Cấu tử PCA Principal Component Analysis Phân tích cấu tử PLS Partial Least Square Bình phƣơng cực tiểu riêng phần TMSP Trimetylsilyl Propionic acid UV Ultra Violet Cực tím 1D-NMR One Dimension-Nuclear Magnetic Resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân chiều 2D-NMR Two Dimension-Nuclear Magnetic Resonance Cộng hƣởng từ hạt nhân hai chiều DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Mƣời dạng ung thƣ thƣờng gặp Hà Nội [4] Bảng 1.2: Mƣời dạng ung thƣ thƣờng gặp TP Hồ Chí Minh [4] Bảng 1.3 Đánh giá giai đoạn ung thƣ đại trực tràng UICC [2] Bảng 1.4: Nồng độ chất chuyển hóa nƣớc tiểu ngƣời bình thƣờng [32] 11 Bảng 1.5: Chất chuyển hóa vai trị chức bệnh ung thƣ liên quan [31] 16 Bảng 2.1: Tổng hợp số liệu thực nghiệm để đánh giá phƣơng pháp 42 Bảng 3.1: Các yếu tố nhân khẩu-xã hội học nhóm bệnh nhân tham gia nghiên cứu 44 Bảng 3.2: Các chất chuyển hóa phổ 1H-NMR mẫu nƣớc tiểu 50 Bảng 3.3: Thông số Biểu đồ điểm số PCA theo PC1, PC2 tập hợp mẫu 52 Bảng 3.4: Thông số Biểu đồ điểm số PLS theo PLS1, PLS2 tập hợp mẫu 55 Bảng 3.5: Xu hƣớng biến đổi chất chuyển hóa bệnh ung thƣ đại-trực tràng 63 Bảng 3.6: Kết chẩn đoán ung thƣ đại trực tràng 65 Bảng 3.7: Kết nội soi kết giải phẫu bệnh số trƣờng hợp 67 Bảng 4.1: Thông tin 13 mẫu dƣơng tính giả 72 Bảng 4.2: Thông tin mẫu âm tính giả 73 Bảng 4.3: So sánh độ nhạy, độ đặc hiệu nghiên cứu phân tích tổng thể chất chuyển hóa ung thƣ 76 Bảng 4.4: So sánh kết biến đổi chất chuyển hóa cơng trình nghiên cứu giới 78 [29] Dwivedi P et al (2010), “Metabolic profiling of human blood by highresolution ion mobility mass spectrometry (IM-MS)”, International Journal of Mass Spectrometry 298, p 78 [30] Elion G.B et al (1954), “Antagonists of nucleic acid derivatives: Viii Synergism in combinations of biochemically related antimetabolomics”, Journal of Biological Chemistry 208, pp 477–488 [31] Engelke UFH, Oostendorp M, Wevers RA (2007), “ NMR spectroscopy of body fluids as a metabolomics approach to inborn errors of metabolism”, The Handbook of Metabonomics and Metabolomics, pp 375–412 [32] Erik J.Saude et al (2007), “Variation of metabolites in normal human urine”, Metabolomics (4), pp 439-451 [33] Frickenschmidt A et al (2008), “Metabonomics in cancer diagnosis: mass spectrometry-based profiling of urinary nucleosides from breast cancer patients”, Biomarkers 13 (4), pp 435–449 [34] Gatenby R A et al (2004), “Why cancers have high aerobic glycolysis”, Nature Reviews Cancer 4, pp 891–899 [35] Granger J H et al (2004), “Ultra performance liquid chromatography-MS (TOF): New separations technology for high throughput metabonomics”, Drug Metabolism Reviews 36, pp 252–252 [36] Hannah T Medford (2006), “Colon Cancer Diagnosis Using NMR Spectra of Urine”, A thesis submitted to the faculty of the University of North Carolina at Chapel Hill [37] He Wen et al (2010), “A new NMR-based metabolomics approach for the diagnosis of biliary tract cancer”, Journal of Hepatology 52, pp 228–233 [38] Hodson MP et al (2007), “A gender-specific discriminator in Sprague– Dawley rat urine: the deployment of a metabolic profiling strategy for biomarker discovery and identification”, Analytical Biochemistry 362, pp 182–192 91 [39] Holmes E et al (2008), “Metabolic phenotyping in health and disease”, Cell 134, pp 714–717 [40] Huong PV (1989) Metallo-organic complexes and Carcinogenesis in Molecules in Physics, Chemistry and Biology Springer, Netherlands, pp 87-109 [41] I Eriksson et al (2001), Multi- and Megavariate Data Analysis Principles and Applications, Umetrics Academy, pp 533 [42] Irene Messana et al (1998), “Proton nuclear magnetic resonance spectral profiles of urine in type II diabetic patients”, Clinical Chemistry 44(7), pp 1529–1534 [43] Israel M., Schwartz L (2011), “The metabolic advantage of tumor cells”, Molecular Cancer 10, p 70 [44] J Carrola et al (2011), “ Metabolic signatures of lung cancer in biofluids: NMR-based metabonomics of urine”, Proteome Research Journal 10, pp 221–230 [45] Jin-Lian Chen et al (2012), “Urine Metabolite Profiling of Human Colorectal Cancer by Capillary ElectrophoresisMass Spectrometry Based on MRB”, Gastroenterology Research and Practice, Article ID 125890 http://dx.doi.org/10.1155/2012/125890 [46] Jukarainen N M et al (2008), “Quantification of 1H NMR spectra of human cerebrospinal fluid: a protocol based on constrained totalline- shape analysis”, Metabolomics (2), pp 150-160 [47] Jun Yang et al (2004), “Diagnosis of liver cancer using HPLC-based metabonomics avoiding false-positive result from hepatitis and hepatocirrhosis diseases”, Journal of Chromatography 813, pp 59–65 [48] Kaddurah-Daouk R et al (2008), “Metabolomics: A global biochemical approach to drug response and disease”, of Pharmacology and Toxicology 48, pp 653–683 92 Annual Review [49] Keun H C et al (2002), “Cryogenic probe 13C NMR spectroscopy of urine for metabonomic studies”, Analytical Chemistry 74, pp 4588–4593 [50] Kuller L et al (2002), “Nuclear magnetic resonance spectroscopy of lipoproteins and risk of coronary heart disease in the cardiovascular health study”, Arteriosclerosis, Thrombosis, and Vascular Biology 22, pp 1175– 1180 [51] Lane N L et al (2009), “Prospects for clinical cancer metabolomics using stable isotope tracers”, Experimental and Molecular Pathology 86, pp 165– 173 [52] Lei Z et al (2011), “Mass spectrometry strategies in metabolomics”, Journal of Biological Chemistry 286, pp 25435-25442 [53] Li H et al (2012), “Resolving structural isomers of monosaccharide methyl glycosides using drift tube and traveling wave ion mobility mass spectrometry”, Analytical Chemistry 84 (7), pp 3231–3239 [54] Moolenaar S H et al (2007), “Handbook of 1H-NMR spectroscopy in inborn errors of metabolism: body fluid NMR spectrum and in vivo MR spectroscopy”, Fully revised 2nd edition, SPS publications [55] Nagana Gowda G A et al (2008), “Metabolomics based methods for early disease diagnostics: a review”, Expert review of molecular diagnostics 8, pp 627–633 [56] Narasimhamurthy Shanaiah et al (2012), “NMR-Based Metabolomics for Biomarker Discovery”, Protocol Biomarker Methods in Drug Discovery and Development, Part of the series Methods in Pharmacology and Toxicology, pp 341-368 [57] Olaf Beckonert et al (2007), “Metabolic profiling, metabolomic and metabonomic procedures for NMR spectroscopy of urine, plasma,serum and tissue extracts”, Nature Protocons 11 (2), pp 2692-2703 [58] Paglia G et al (2011), “Monitoring consumption and secretion in cultured cells using ultraperformance liquid chromatography quadrupole–time of 93 flight mass spectrometry (UPLC–Q–ToF-MS)”, Analytical and Bioanalytical Chemistry 402, p 1183 [59] Qian Bu et al (2012), “ Metabolomics: A Revolution for Novel Cancer Marker Identification”, Combinatorial Chemistry & High Throughput Screening 15, pp 266–275 [60] Qiu et al (2010), “Urinary Metabonomic Study on Colorectal Cancer”, Journal of Proteome Research (3), pp 1627–1634 [61] Robert Powers and Teklab Gebregiworgis (2012), “Application of NMR Metabolomics to Search for Human Disease Biomarkers”, Combinatorial Chemistry and High Throughput Screening 15, pp.595-610 [62] Salek R M et al (2007), “A metabolomic comparison of urinary changes in type diabetes in mouse, rat and human”, Physiol Genomics 29, pp.99-108 [63] Sandusky P, Raftery D (2005), “Use of selective TOCSY NMR experiments for quantifying minor components in complex mixtures: application to the metabonomics of amino acids in honey”, Analytical Chemistry 77, pp 2455–2463 [64] Seyfried T., Shelton L (2010), “Cancer as a metabolic disease”, Nutrition and Metabolism 7, p [65] Shanaiah N et al (2007), “Class selection of amino acid chất chuyển hóa in body fluids using chemical derivatization and their enhanced 13C NMR”, National Academy Science USA 104, pp 11540–11544 [66] Souhaila Bouatra et al (2013), “The Human Urine Metabolome”, Plos One 8(9), http:// www.plosone.org [67] Tang H et al (2004), “Use of relaxation-edited one-dimensional and twodimensional nuclear magnetic resonance spectroscopy to improve detection of small metabolomics in blood plasma”, Analytical Biochemistry 325, pp 260–272 [68] Tennant D A et al (2010), “Targeting metabolic transformation for cancer therapy”, Nature Reviews Cancer 10, pp 262 –277 94 [69] Tobias Kind et al (2007), “A comprehensive urinary metabolomic approach for identifying kidney cancer”, Analytical Biochemistry 363, pp 185–195 [70] Ulrich E L et al (2008), “BioMagResBank”, Nucleic Acids Research 36, pp 402-408 [71] Vander Heiden M G (2011), “Targeting cancer metabolism: A therapeutic window opens”, Nature Reviews Drug Discovery 10, pp 671–684 [72] Vander Heiden M G et al (2009), “Understanding the warburg effect: The metabolic requirements of cell proliferation”, Science 324, pp 1029–1033 [73] Vizán P et al (2009), “Characterization of the metabolic changes underlying growth factor angiogenic activation: Identification of new potential therapeutic targets”, Carcinogenesis 30, pp 946–952 [74] Wang Haili et al (2014), “Development and Validation of a Highly Sensitive Urine-Based Test to Identify Patients with Colonic Adenomatous Polyps”, Clinical and Translational Gastroenterology (3), p e 54 [75] Wang J et al (2010), “1H-NMR-based metabolomics of tumor tissue for the metabolic characterization of rat hepatocellular carcinoma formation and metastasis”, Tumor Biology 32(1), pp 223-231 [76] Warburg O (1956), “On the origin of cancer cells”, Science 123, pp 309– 314 [77] Weljie A M., Jirik F R (2011), “Hypoxia-induced metabolic shifts in cancer cells: Moving beyond the Warburg effect”, International Journal of Biochemistry & Cell Biology 43, pp 981–989 [78] Wencheng Ge (2014), “NMR-Based Metabolic Profiling: Methods and Application in Cancer Biomarker Discovery”, A dissertation submitted in partial fulfillment of the requirements for the degree of Doctor of Philosophy (Chemistry) in the University of Michigan [79] Wishart D S et al (2007), “HMDB: the human metabolome database”, Nucleic Acids Research 35, pp 521-526 95 [80] Wishart D S et al (2007), “A knowledgebase for the human metabolome”, Nucleic Acids Research 37, pp D603–D610 [81] Xi Y et al (2006), “Automated screening for metabolomics in complex mixtures using 2D COSY NMR spectroscopy”, Metabolomics 2, pp 221– 233 [82] Yan Ni et al (2014), “Metabonomics of Human Colorectal Cancer: New Approaches for Early Diagnosis and Biomarker Discovery”, Journal of Proteome Research 13, pp 3857−3870 [83] Yauch R L., Settleman J (2012), “Recent advances in pathway-targeted cancer drug therapies emerging from cancer genome analysis”, Current Opinion in Genetics & Development 22, pp 45–49 [84] Young Kee Chae et al (2010), “Metabolic Profiling of Urine Samples from Colorectal Cancer Patients Before and After Surgical Treatments”, Journal of the Korean Magnetic Resonance Society 14, pp 28-33 [85] Zhang G F et al (2011), “Metabolomics, pathway regulation, and pathway discovery”, Journal of Biological Chemistry 286, pp 23631–23635 [86] Zheng P et al (2013), “A novel urinary metabolite signature for diagnosing major depressive disorder”, Journal of Proteome Research 12 (12), pp 5904–5911 96 PHỤ LỤC PHỔ 1H-NMR ( 500MHz / pH = 6-8 ) CỦA CÁC CHẤT CHUYỂN HĨA CHÍNH TRONG NƯỚC TIỂU (Nguồn: Chenomx NMR Suite 8.1 - http://www.chenomx.com) Số ký hiệu Chất chuyển hóa Cơng thức phân tử Creatinine C4H7N3O / Creatine C4H9N3O2 Hippurate C9H9NO3 Số ký hiệu Chất chuyển hóa Cơng thức phân tử Glycine C2H5NO2 Citrate C6H8O7 Trimethylamine N-Oxide C3H9NO Lactate C3H6O3 Số ký hiệu Chất chuyển hóa Cơng thức phân tử Alanine C3H7NO2 Dimethylamine C2H7N Taurine C2H7NO3S 10 Methylsuccinate C5H8O4 Số ký hiệu 11 Chất chuyển hóa Công thức phân tử Leucine C6H13NO2 / Isoleucine 12 Valine C5H11NO2 13 Phenylacetate C8H8O2 Số ký hiệu Chất chuyển hóa Công thức phân tử 14 Acetate C2H4O2 15 Phenylacetylglutamine C13H16N2O4 16 Threonine C4H9NO3 Số ký hiệu Chất chuyển hóa Cơng thức phân tử 17 p.Cresol C7H8O 18 Acetoacetate C4H6O3 19 Succinate C4H6O4 20 Pyruvate C3H4O3 Số ký hiệu Chất chuyển hóa Cơng thức phân tử 21 Isocitrate C6H8O7 22 Aspartate C4H7NO4 23 Trimethylamine C3H9N 24 Tyrosine 7.18(m), 6.89(m), 3.93(m), 3.18(m), 3.04(m) Số ký hiệu Chất chuyển hóa Cơng thức phân tử 25 Histidine C6H9N3O2 26 Glutamate C5H9NO4 27 Betaine C5H11NO2 28 Serine C3H7NO3 Số ký hiệu Chất chuyển hóa Cơng thức phân tử 29 Guanidoacetate C3H7N3O2 30 Methionine C5H11NO2S ... trên, kỹ thuật NMR mẫu nƣớc tiểu đƣợc chọn để nghiên cứu ung thƣ đại- trực tràng đề tài ? ?Sử dụng kỹ thuật Cộng hƣởng từ hạt nhân để phân tích nƣớc tiểu, hỗ trợ chẩn đoán ung thƣ đại ? ?trực tràng? ??...ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ THỊ KIM NGỌC SỬ DỤNG KỸ THUẬT CỘNG HƯỞNG TỪ HẠT NHÂN PHÂN TÍCH NƯỚC TIỂU HỖ TRỢ CHẨN ĐOÁN UNG THƯ ĐẠI-TRỰC TRÀNG Chuyên ngành: HÓA... bệnh nhân phát sớm ung thƣ đại- trực tràng yêu cầu bách xã hội Phƣơng pháp chẩn đoán ung thƣ đại- trực tràng phổ biến nội soi đại tràng sigma nội soi với sinh thiết khối u Đây cách thức chẩn đoán