Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)Nghiên cứu sản xuất, tinh sạch Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escherichia coli (LV thạc sĩ)
Trang 1VIEN SINH THAI VA TAI NGUYEN SINH VAT
NGUYEN HA XUYEN
Nghiên cứu sản xuất, tinh sach Pfu DNA polymerase
tai to hop ttr Escherichia coli
Trang 2
LOI CAM DOAN
Tơi xin cam đoan đây là cơng trình nghiên cứu của riêng tơi
Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn là trung thực và chưa từng được ai cơng bố trong bất kỳ cơng trình nào khác
Tác giả
Trang 3
LOI CAM ON
Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc và chân thành tới TS Lê Quang
Hịa, trưởng phịng Kỹ thuật Gen, Viện Cơng nghệ Sinh học và Cơng nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, người thầy đã luơn hướng dẫn, định hướng và giúp đỡ tơi thực hiện thành cơng luận văn này
Tơi xin gửi lời cảm ơn tới các thầy cơ giáo trường Đại học Thái Nguyên cũng như các thầy cơ thuộc Viện Sinh thái và Tài nguyên Sinh vật, các thầy cơ Viện Cơng nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Cơng nghệ Việt Nam đã tận tình giảng dạy
và truyền thụ cho tơi kiến thức chuyên mơn để thực hiện luận văn này
Tơi cũng xin chân thành cảm ơn các cơ chị, các bạn đồng nghiệp và các em sinh viên phịng Kỹ thuật Gen đã nhiệt tình hướng dẫn và giúp đỡ tơi trong qua trình làm việc tại phịng thí nghiệm
Xin gửi lời cảm ơn tới gia đình, bố mẹ những người sinh thành, nuơi dưỡng tơi là chỗ dựa tinh thần vững chắc cho tơi suốt thời gian qua Cuối cùng tơi xin gửi lời cam on tới anh chị, bạn bè tơi đã cổ vũ động viên, giúp đỡ tơi hồn thành luận văn này
Một lần nữa tơi vơ cùng cảm ơn
Hà Nội ngày tháng năm 2015
Học viên
Nguyễn Hà Xuyên
CAC CHU VIET TAT
Trang 4Tên viết tat
a.a APS Bp CBB DNA Pol Dntp E coli EDTA EtBr EtOH IPTG Kb KDa KLPT LB OD PCR PLysS PMSF RNA SDS SDS-PAGE ssDNA TAE TEMED
LOI CAM DOAN
Tên đầy đủ
Amino acid
Amonium persulphate Base pair
Coomassie brilliant blue
Deoxyribonucleic acid Polymerase Deoxynucleoside triphosphate Escherichia coli Ethylenediaminetetraacetic acid Ethidium bromide Ethanol Isopropyl-thio-B-D-galactoside Kilo base Kilo Dalton
Khéi luong phan tir
Luria — Bertani
Mat d6 quang hoc (optical density) Polymerase chain reaction
plasmid plysS ma hdéa cho T7 lysozyme Phenyl methyl! sulphony] fluoride Ribonucleic acid
Sodium dodecyl sulphate
Sodium dodecyl sulphate polyacrylamide gel electrophoresis Soi don DNA (single stranded DNA)
Tris-acetate-EDTA
N, N, N’, N’-tetramethyl ethylendiamine
Trang 5
CAC CHU VIET TAT wcscssscseescssesscassesscsetincsiersesneesssnessasetsseitendesnesdeinasasensditaniesnseedsnasasntsidetasaesdaesdsnassasnti iii
10/00 0055554 iv
DANH MUC CAC BANG SU DỤNG TRONG LUẬN VĂN s<sssecveseevsseerxeserrsserrsssrke vi DANH MỤC CÁC HÌNH SỬ DỤNG TRONG LUẬN VĂN .-ces<c+rreseerrrxserrrkesrrrrke vii
MG DAU TC ốc ố Ơ 1
PHAN 1: TONG QUAN TALI ni 777 ^^ 2
L.1 — Téng quan vé DNA polymerase .sccsssssessssesssssessssessssesssseessssessssessssesssssesessesssecssseesssvecesseessseceane 2 1.1.1 | DNA polymerase 6 sinh vat nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn ¿ z+c5s++ 3 1.1.2 Téng quan vé DNA polymerase bén mhiét sccccsccsssssssssecssssssessscesssssesssessssiueececsssnineeeseees 4 1:2, Tổng quan về Pu DNA POVMESE croncamma AERO ADORE 6 1221 Cấu trúc của HD NÀTpỌNTTETBSLiccceovicnosisbnikiEngAS10181151560565383061165660055355866156160805659//55 6
1.2.2 Cơ chế hoạt động sửa sai cia Pfu DNA polymerase 1/73, Một số tính chất của Pfu DNA polymerase 1.2.4 Ứng dụng của P# DNA polymerase
1.2.5 _ Tình hình nghiên cứu P/¿ DNA polymerase tái tổ hợp
PHAN 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 18
2.1 _ Vật liệu, hĩa chất, thiết bị - + +k2+k£S k2 EEEEXEEE1127112111 111.11 T1 T11 T11 11 11g11 1y gyey 18
Qld, - YậEHÊUszzzssosarprnrrnrstotgiitotiddDDIAOOIOGIOLHHIGEORSDIGUDGEIIHHSNVGĐEGUAtaatitrasasg 18 2.1.2 Hĩa chất và thiết bị -+-5222+2+222E112222211222711122711122211112211111 1111 E1 cere 20
22 PHưGHE ĐHẨU sassssuuoaiaosdaddrddiditaildibitdlAlGA045ĐAEBARISGGINABIGSHISSHANLONHSHGSAASHSSGSHBNS.NWGiAAAlCHS 21 2.2.1 _ Tách chiết plasmid 22-©2< 2E++2EEEE2EX22271127112711122711 27112111 21 2.2.2 Nhân đoạn gen mã hĩa cho Pu DNA pol bằng phản ứng PCR :-c5s+ 21 20.3; Điện:di.DNA.trến:geÏ ggaFOSE: :s;sssessootybrrgsRoiatodtiogiltosDlGiGGAGS043300032038 002x008 23 2.2.4 Tỉnh sach bang kit Wizard SV Gel cccssssssessssssesssssssescosssescsssssecessssesesssesscssseeeessseceesssseseeass 23
2.2.5 Gh6p Oi get iececcccccssesssssessssesssseessssessssessssesesssessssecessesessecessssssvecsssesesseeesssesesteesssesesseeesssesess 23
2.2.6 Bién nap plasmid vao E coli bang phương pháp sốc nhiệt -¿©25sscc+2 24 227, ,VI0 HH HÌHfWĐNẨ:ziiatdgtiog0i00000000L 6 G0G0X0G0SE0VUWGGIENGSGINUWRNOaGM 25
2.2.8 Thiết kế vector biểu hiện gen mã hĩa cho Pu DNA pol -2:©25c2252222sevczxeezrrs 26
2.2.9 Biểu hiện gen mã hĩa cho P/ DA poI 22-222£22222E+2EEEEvEEEEvEEEEreErxrrrrxrrrrrerrres 26
2.2.10 Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE -©222c¿2222vcccccvvrrerrres 26 2.2.11 Sde ky ai luc qua cOt amylose scssscsssssssesssseessseessssesssseessssessssessssesesseeesssesssseessseeesseeeessesees 27 2.2.12 Tinh sạch protein đuơi Histag bang Ni-charged Magbeads cc.sssssssssessssessssesesseeesseeeess 28
2.2.13 Kiểm tra hoạt độ tong hop DNA ctia Pfu DNA pol tai t6 hop ssesssseesssecssseessseessseesessesess 28
Trang 6
PHAN 3: KET QUA VA THAO LUAN wisssssssssscsossssssssssssssssssssansssesssssesstssvssanvbasansasassstsessatanusniasisconinstiins 29
3.1 Xác định trình tự gen mã hĩa cho Ѓ; DNA pol từ tế bào mang vector pET 1la 29 3.2 Thiết kế vector biểu hiện gen mã hĩa cho ?ƒ DNA pol c¿¿£2222522czz+t2cvvvecceeerr 36 3.3 Xây dựng quy trình tạo vector biểu hiện .-2¿2¿++£+2E+++2EEE2SEEEEEEEEECEEEEtEEEErrrkkrrrrkrree 38 3.4 _ Lựa chọn chủng biểu hiện gen mã hĩa cho Ѓ¿ DA pOÌ 6c tt sekrkeerrrerrvek 42 3.5 Tinh sạch protein Pu DNA pol tái tỔ hợp -2¿22+++2E++t2E+EeeEExeeErxeerrkrrrrrrrrrrrrrrrrcree 44
3.6 Thử hoạt tính Ѓz DNA pol tái tỔ hợp 2+22++222++22E++t2EExSEEEEEEEEtEEkxrrrrrrrrrkrrrrrrcee 47
PHAN 4: KET LUAN VA KIEN NGH sssccsssscsssscssseccsssccsnscssnsccsssccessecessecssnsccsnsccsnscsssecsenssesnsccesscesssees 49
PHU LY Cossessssesessasanswssncoese sevecenssusiasesensegessesvsvesse seveveresossasevaussgeswuseaverse saxcwenseorseweuee 51
IV )00/20690.79 64.7007 55
Bảng Bang 1.1
DANH MUC CAC BANG SU DUNG TRONG LUAN VAN
Tiêu đề Trang
Trang 7Bang 2.1 Bang 2.2 Bang 2.3 Bang 2.4 Bang 2.5 Bang 2.6 Hinh Hình1.I
Trình tự các cặp mỗi sử dụng trong luận văn
Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen mã hĩa P/¿ DNA pol
Thành phần phản ứng nối ghép
Thành phần mơi trường nuơi cấy vi sinh vật Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE
Thanh phan phan img PCR thir hoat tinh Pfu DNA pol tai tổ hợp
DANH MUC CAC HiNH SU DUNG TRONG LUAN VAN
Tiéu dé
Cấu trúc tổng thé cua Pfu DNA polymerase Nguyễn Hà Xuyên - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật
19
Trang 8Hinh 1.2 Hinh 1.3 Hinh 3.1 Hinh 3.2 Hinh 3.3 Hinh 3.4 Hinh 3.5 Hinh 3.6 Hinh 3.7 Hinh 3.8 Hinh 3.9 Hinh 3.10 Hinh 3.11
So sánh trình tự acid amin và cấu trúc của motif B —hairpin (ving exonulcease) va motIf Y-GG/A (vùng ngĩn tay cái)
Cơ chế hoạt động và sửa sai cua Pfu DNA polymerase Kết quả điện đi kiểm tra DNA plasmid mang doan gen Pfu
Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự cĩ mặt của đoạn gen mã hĩa cho Pfu DNA pol trong vector pET1 La trén gel agarose 1%
Kết quả điện di sản phâm PCR kiểm tra sự cĩ mặt của gen mã hĩa Pƒu
DNA pol bang 2 cap méi T7- F/ Pfu - R1 và P/¿— F1/ T7- R
11 32 31 32 Kết qua giai trinh tu doan gen ma hoa Pfu DNA pol tir vector pET11a tai 36 tổ hợp
Sơ đồ thiết kế vector biéu hién gen ma hoa Pfu DNA pol
Kết quả điện di sản phẩm cắt Pfu va vector pMAL - c5X bang enzyme giới hạn trên gel agarose 1%
Kết quả PCR sàng lọc và tách chiết plasmid các dịng khuẩn lạc mang plasmid pMAL c5X —Pfu dién di trén gel agarose 1%
Kết quả biểu hiện protein Pfu DNA pol trong té bao E coli BL21(DE3)
va E coli BL21(DE3) pLysS dién di trén gel polyacrylamide 8%
Kết qua tinh sach protein MBP — Pfu bang xir ly nhiét điện di trên gel
polyacrylamide 8%
Kết quả tinh sach Pfu DNA pol tai tổ hợp điện di trên gel polycrylamide
Kết quả điện di sản phẩm PCR thử hoạt tinh Pfu DNA pol tai t6 hop trén
gel agarose 1%
38 39
Trang 9
MO DAU
Hiện nay PCR là một kỹ thuật phơ bién trong sinh hoc phan tir nhằm nhân bản một đoạn
DNA trong ống nghiệm lên hàng triệu bản sao Kỹ thuật này cĩ ứng dụng rất nhiều trong
các nghiên cứu sinh học và y học phục vụ nhiều mục đích khác nhau như: chân đốn bệnh
di truyền, bệnh nhiễm trùng, tách địng gen và xác định huyết thống Do tính chất lặp lại nhiều chu kỳ phản ứng ở các nhiệt độ khác nhau, đặc biệt là sự bién tinh DNA 6 95°C nén
PCR địi hỏi phải cĩ các enzyme DNA polymerase bền nhiệt để đảm bảo việc xúc tác quá
trình nhân bản DNA được thực hiện dễ dàng và đặc hiệu
Pfu DNA polymerase dugc tach từ vi khuan cé siéu wa nhiét Pyrococcus furiosus sinh trưởng tối ưu @ 100°C Pfu DNA polymerase cực kỳ bền nhiệt, vẫn giữ được hơn 95% hoạt d6 ban dau 6 95°C trong mét gid Ngoai hoat tinh tong hop mach Pfu DNA polymerase cịn cĩ hoạt tính đọc sửa 3ˆ- 5” exonuclease làm tăng độ chính xác của quá trình tổng hợp DNA Hién nay Pfu DNA polymerase thuong mại cĩ xác suất gắn sai một nucleotide khoảng 1,3.105 Độ chính xác trong quá trình tổng hợp DNA cua Pfu DNA polymerase cao hơn nhiều so với Tag DNA polymerase va duoc xem là một trong số ít enzyme cĩ tốc độ tổng hợp ít lỗi nhất trong tất cả các DNA polymerase bền nhiệt đã được nghiên cứu Chính vi vay, Pfu DNA polymerase dugc sit dung phé bién dé khuyéch dai cdc san pham ding cho mục đích nhân dịng, biểu hiện hay nghiên cứu các đột biến cũng như tổng hợp gen [25]
Pfu DNA polymerase dong vai trị quan trọng trong phản ứng PCR nên việc thu nhận
enzyme này từ vi khuẩn ưa nhiệt trở thành một nhu cầu cấp thiết Tuy vậy, việc thu nhận
chế phâm enzyme trực tiếp từ các vi khuẩn ưa nhiệt là khơng đơn giản vì các vi khuân này thường yêu cầu mơi trường sinh trưởng đặc biệt, nhiệt độ sinh trưởng cao và enzyme quan tâm chỉ được sản xuất ở một lượng rất thấp Trên thế giới đã cĩ nhiều các cơng trình khoa hoc nghién ciru va tinh sach Pfu DNA polymerase tai tổ hợp nhưng vẫn gặp khĩ khăn do sử dụng các biện pháp tỉnh sạch chưa tối ưu như Heparin cĩ giá thành đắt [22], cột P11 phosphocellulose và cột mono Q qui trình sử đụng phức tạp [12] Ở Việt Nam cho đến nay chỉ cĩ cơng trình nghiên cứu sản xuất Pƒ DNA pol từ E coli của Giáo sư Phan Tuấn
Trang 10
Nghĩa được thực hiện vào năm 2005 với qui trình tinh sạch qua sắc ký ái lực với Ni? và
Heparin Sepharose [1, 2] Tuy nhién Ѓ¿ DNA pol tạo ra lại ở dạng dung hợp với 20 a.a của vector nên cĩ thể ảnh hưởng đến khả năng kéo dài DNA trong phản ứng PCR và hơn nữa qui tình tỉnh sạch bằng Heparin khá tốn kém mà lại khơng đặc hiệu Trước những nhược điểm và khĩ khăn trong việc tinh sach dé thu due Pfu DNA pol tinh khiết, hiện nay cĩ rất nhiều cơng trình nghiên cứu nhằm cải thiện khả năng hịa tan của protein tái tổ hợp
trong tế bào E coli, cũng như khả năng tính sạch cao khi sử dụng hệ biểu hiện tạo
hexahistidine-tagged maltose-binding protein qua việc sử dụng hệ vector biểu hiện pMAL [5, 39] PMAL là hệ vector biêu hiện cho phép protein tạo ra ở trạng thái tan do được dung hợp với maltose - binding proein (MBP) Ngồi khả năng tạo dạng tan của protein, MBP cĩ ái lực với amylose nên cĩ thể dễ dàng tỉnh sạch protein dung hợp qua viêc sử dụng cột amylose Điểm cắt của Factor Xa ngay trước Pfu DNA pol gitip hoan nguyén Pfu DNA
pol Bên cạnh đĩ việc sử dụng Histag để tinh sạch bằng NÉ? ở đầu N lại khơng ảnh hưởng
đến hoạt tính cia Pfu DNA tái tơ hợp [15] Với những ưu điểm trên, chúng tơi sử dụng hệ vector biểu hiện pMAL kết hợp đuơi His đề thực hiện đề tài: “Nghiên cứu sản xuất, tinh
sach Pfu DNA polymerase tái tổ hợp từ Escberichia coli?? với mục tiêu sản xuất Pu DNA polymerase chất lượng cao gĩp phần tích cực trong việc phục vụ các nghiên cứu về sinh học phân tử trong nước
PHAN 1: TONG QUAN TAI LIEU
Trang 11
DNA polymerase la nhĩm enzyme xúc tác cho sự tổng hợp chuỗi polydeoxyribonucleotide từ các cơ chất là DNA sợi đơn làm khuơn, cặp mơi, các deoxyribonucleoside triphosphat (dNTPs) và trong mơi trường cĩ ion Mg?*' Mỗi là một
doan oligonucleotide dai ttr 5 đến vài chục nucleotide cĩ bản chất DNA hoặc RNA Trong
điều kiện nhiệt độ và pH thích hợp, DNA polymerase kéo dài mơi theo hướng 5°—› 3° bằng cách nối các nucleotide qua liên kết phosphodiester theo trình tự bổ sung với sợi làm khuơn tạo nên chuỗi DNA mạch kép Ngồi hoạt tính kéo dài chuỗi oligonucleotide hay cịn được gọi là hoạt tính DNA polymerase, một số DNA polymerase cịn cĩ hoạt tính của nuclease với vai trị sửa chữa hoặc giúp cho quá trình tổng hợp DNA được thực hiện chính xác Trên thực tế để đảm bảo tính chuẩn xác cho quá trình sao chép DNA tế bào phải sử dụng
khơng chỉ một loại DNĐA polymerase [8, 20, 25]
1.1.1 DNA polymerase ở sinh vật nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn
Cho đến nay, rất nhiều loại DNA polymerase (DNA pol) khác nhau ở cả sinh vật
nhân sơ và sinh vật nhân chuẩn đã được phát hiện và nghiên cứu kỹ về tính chất, cấu trúc
cũng như chức năng Ở sinh vật nhân sơ điển hình là E cofi cĩ tới 5 DNA pol khác nhau và được ký hiệu là DNA pol I, II, II, IV và V Ở sinh vật nhân chuẩn các DNA pol được phát
hiện sớm nhất là DNA pol ơ, B, ư, e và y Trong những năm gần đây, một loạt các DNA pol mới cũng được phát hiện ở sinh vật nhân chuẩn, đĩ là các DNA pol cĩ khả năng sửa chữa các vị trí hỏng như DNA pol š, DNA pol n, DNA pol t, DNA pol k, Revl và một nhĩm các DNA pol khác được gọi là DNA pol 9, DNA pol 4, DNA pol np, DNA pol o, DNA pol ® thực hiện các chức năng khác Việc phát hiện và nghiên cứu tính chất của các DNA pol khác nhau đã khẳng định rằng một loại DNA pol cĩ thể khơng chỉ cĩ một chức năng và quá trình tổng hợp DNA trong các cơ thể cĩ thể cần đến khơng chỉ một DNA pol, mà tế bào cĩ
thể sử dụng đồng thời một số DNA pol khác nhau cùng thực hiện một chức năng [ 14]
Phần lớn các DNA pol ở dạng phức hệ gồm nhiều chuỗi polypeptide chứa các tiểu đơn vị chức năng khác nhau, trong đĩ khơng thể thiếu tiểu đơn vị polymer hố Các tiểu đơn vị khác chịu trách nhiệm cho hoạt tính xúc tác khác ví dụ hoat tính đọc sửa 3 ’-5’ exonuclease, 5-3” exonuclease, hoạt tính tổng hợp các mỗi RNA (primase) hay tương tác với yếu tố sao chép, phối hợp với kháng nguyên nhân tế bào đang phân hĩa (proliferating
Trang 12
cell nuclear antigen - PCNA) v6i muc dich cudi cing 1a làm cho quá trình tổng hợp DNA
dién ra nhanh chong va chinh xac [20]
Dựa vào tính tương đồng về trình tự và sự giống nhau về cấu trúc, các DNA pol
được chia thành 7 họ khác nhau là: A, B, C, D, X, Y và RT [40] Mặc dù các DNA pol ở
các họ khác nhau cĩ sự sai khác về mặt cấu trúc nhưng chúng cũng cĩ một vài đặc điểm chung, chúng cuộn gấp thành hình dạng giống với bàn tay phải của người bao gồm 3 vùng khác biệt: “lịng bàn tay” (palm), “ngĩn tay cái” (thumb) và “các ngĩn tay” (fingers)
Trên cơ sở trình tự của DNA pol ơ, người ta đã phát hiện cĩ 6 trình tự (I-VI) mang
tính bảo thủ cao trên các DNA pol ở cả sinh vật nhân chuẩn, sinh vật nhân sơ và virus với
trật tự trên chuỗi polypeptide là IV-II-VI-IHI-I-V, cịn khoảng cách giữa các trình tự bảo thủ
là khác nhau ở các lồi khác nhau Trình tự I nằm ở vùng “lịng bàn tay” gần với vùng
“ngĩn tay cái” và chứa một trong các gốc axit aspartic bảo thủ tạo thành trung tâm xúc tác
của tất cả các DNA pol họ B đã biết (với motf YGDTDS) Axit aspartic khác thuộc trình
tự II cĩ dạng DxxSLYPS nằm ở đầu của lá gấp cũng thuộc vùng “lịng bàn tay” Thuộc vùng này cịn cĩ SLYP-II mang tính bảo thủ cao, giữ vai trị quan trọng cho quá trình liên
kết đNTP Mặc dù các motif này là tuyệt đối bảo thủ ở các dưới họ DNA pol œ và DNA pol
ư nhưng ở DNA pol e lại cĩ sự khác nhau đáng kể, motif trình tự I của DNA pol z là
ELDTDG cịn trình tự II là DxxAMYPN Các gốc khác cĩ vai trị trong quá trình liên kết
dNTP nằm ở trình tự III và chúng cuộn gấp thành xoắn ơ nằm ở dưới vùng “các ngĩn tay”
Trình tự IV nằm ở đầu N thuộc vùng cĩ hoat tinh 3’- 5’ exonuclease Hai trinh tu bao thủ
khác V và VI tương ứng nằm ở các đưới vùng “ngĩn tay cái” và “các ngĩn tay” [20, 24] Mức độ bảo thủ cao về trình tự và cấu trúc của các vùng giữa các DNA pol sinh vật nhân chuân, sinh vật nhân sơ và virus chứng tỏ các DNA pol này xuất phát từ một gen tổ tiên chung Cấu trúc của chúng đã được tối ưu hố qua quá trình tiến hố để thích hợp với các chức năng chuyên hố mà mỗi DNA pol thực hiện trong tế bào Các vùng bảo thủ nhất
chịu trách nhiệm cho các chức năng xúc tác cơ bản và cần thiết, trái lại các phần khác nhau
giữa các DNA pol tiễn hĩa một cách độc lập để thực hiện các vai trị chuyên biệt [14,20]
Trang 13
Việc ra đời và ứng dụng của kỹ thuật PCR để nhân bản gen in vitro đã tạo ra sự quan tâm đặc biệt của các nhà nghiên cứu đến các DNA pol bền nhiệt Hàng loạt DNA pol
bền nhiệt từ các vi khuẩn ưa nhiệt đã được phát hiện, nghiên cứu và sử dụng cho PCR cũng
như các nghiên cứu khác của sinh học phân tử Hầu hết các DNA pol này đều hoạt động tốt ở nhiệt độ cao và bền với nhiệt Chúng cĩ khả năng xúc tác cho quá trình tổng hợp DNA ở
nhiệt độ thậm chí trên 70°C, cần thiết cho sự nhân bản đặc hiệu các đoạn DNA, cũng như chịu được nhiệt độ thậm chí trên 90°C, thích hợp cho việc biến tính DNA (tách các chuỗi
DNA thành các sợi đơn)
Các loại DNA polymerase bền nhiệt
* Ven: DNA pol được phân lập đầu tiên từ vi khuẩn cổ ưa nhiệt Thermococcus litoralis được tìm thấy ở đáy đại dương với nhiệt độ khoảng 98°C Vèr DNA pol là một DNA pol thuộc họ B, cĩ trình tự giống với DNA pol ơ của người và DNA pol II của E coli hon la DNA polymerase I cua E coli [9] Enzyme nay là một protein cĩ KLPT 90 - 93 kDa, enzyme kéo dài mỗi với tốc độ 67 nucleotide/giay Vent™ DNA polymerase bén nhiệt hơn so với Taq DNA polymerase va co kha nang kéo dai méi để thu được các sản
phẩm cĩ độ dài 8-13 kb VenrTM DNA pol cĩ hoạt tính 3°-5” exonuclease đảm bảo độ chính
xac cao hon 5-15 lan so véi Tag DNA polymerase Vent™ DNA polymerase ciing tao ra trên 90% các đoạn DNA đầu bằng nhờ đĩ làm đơn giản hĩa quá trình nhân dịng trực tiếp các sản phâm PCR
Tma DNA polymerase 1a m6t protein cĩ 893 a.a với KLPT 103 kDa, được tách ra từ khuẩn Gram âm Thermotoga maritima siêu ưa nhiệt, sống ky khí ở suối nước nĩng, sinh truong 6 nhiét d6 trén 90°C Tma DNA polymerase giéng DNA polymerase I 6 E coli ở chỗ cĩ cả hoat tinh 3’- 5’ exonuclease va 5’- 3’exonuclease Khi Tma DNA polymerase bi cắt đi một phần đầu thì tạo thành dạng enzyme thiéu hoat tinh 5’- 3’ exonuclease, giéng như mảnh Klenow và Stoffel, protein này vẫn cịn hoạt tính polymerase cũng như hoạt tính 3’- 5° exonuclease Các nghiên cứu bước đầu cho thấy độ chính xác trong PCR của enzyme
này gần như 100% nhờ cĩ hoạt tính đọc sửa [6]
«+ Pfu DNA polymerase được tách từ vi khuan c6 siéu wa nhiét Pyrococcus furiosus (Pfu) chiém ưu thế trong các chất lắng đọng của biển nĩng ở Italia, sinh trưởng tối ưu ở
Trang 14
100°C Pfu DNA pol thuộc họ B, là một protein cĩ 775 a.a với KLPT khoảng 91 kDa Trình tự a.a của Pfu DNA pol tuong déng voi DNA pol a DNA polymerase nay cuc ky
bén nhiét, van giữ được hơn 95% hoạt độ ban đầu ở 95°C trong một giờ Hoạt tính đọc sửa
3°- 5” exonuclease của P#¿ DNA pol làm tăng độ chính xác của qua trinh tong hop DNA Xác suất gắn sai một nucleotide của P#¿ DNA pol khoảng 1,3.105 Độ chính xác trong quá trình tổng hợp DNA cua Pfu DNA pol cao hon 8 lan so voi Tag DNA pol va duge xem 1a enzyme cĩ tốc độ tơng hợp ít lỗi nhất trong tat cả các DNA polymerase bền nhiệt đã được nghiên cứu Chính vì vậy, P#¿ DNA pol được sử dụng phổ biến để khuyếch đại các sản
phẩm dùng cho mục đích nhân dịng biểu hiện hay nghiên cứu các đột bién Pfu DNA pol
cũng cĩ thể phối hợp cùng với 7øq DNA pol để khuyếch đại các đoạn DNA cĩ kích thước
lớn với độ chính xác lớn hơn nhiều so với khi sử dung Taq DNA pol don le [1,38]
1.2 Téng quan vé Pfu DNA polymerase
1.2.1 Cau tric ciia Pfu DNA polymerase
Pfu DNA pol 1a mt phan tit cé hinh donut v6i téng kich thuéc khoảng 50A'x 80A°x100 A’ Cau tric cia Pfu DNA pol ciing gan giéng voi cau tric kinh dién của các DNA pol ho B Pfu pol là một chuỗi đơn polypeptide của 775 a.a được phân thành 5 vùng cấu trúc riêng biệt: vùng N - terminal (1 - 130, 327 - 368), vùng 3’- 5’ exonuclease (131 - 326), vùng lịng bàn tay (369 - 450 và 501 - 588), vùng các ngĩn tay (451 - 500) và vùng ngĩn tay cái (589 - 775) (Hình 1.1) Vùng các ngĩn tay và ngĩn tay cái được xoay ra ngồi
33° va 24°, vi vay cau hinh téng thé cua Pfu DNA pol tuong tự như cấu trúc của KODI
Trang 15
Hình1.1: Cấu trúc tổng thé ctia Pfu DNA polymerase [41]
Trong đĩ cĩ 5 vùng riêng biệt: màu xanh da trời - vùng exonuclease, mau tim - ving N - terminal, mau cam - ving long ban tay, mau xanh 14 cay - vùng ngĩn tay, màu đỏ - vùng ngĩn tay cái
Mặc dù cấu trúc của một vài DNA pol cổ đã được xác định nhưng những tìm hiểu chỉ tiết về độ trung thực và hoạt tính tổng hợp vẫn chưa được biết đến một cách đầy đủ Gần đây nghiên cứu về cấu trúc và đột biến của Pƒ DNA pol đã chỉ ra rằng cơ chế phối hợp giữa hoạt tính đọc sửa và hoạt tính tổng hợp liên quan đến sự tương tác giữa vùng loop của miền exonuclease và phần gờ tích điện dương của vùng ngĩn tay cái Tuy nhiên sự phá vỡ liên kết giữa hai ving nay cho phép Pfu DNA pol cé mét cấu hình mở phù hợp với chức năng sửa chữa hơn là chức năng tổng hợp Phần gờ của miền các ngĩn tay cĩ vị trí tương đương với phần loop của exonuclease trong cấu tric tinh thé cia Pfu DNA pol Nhưng trong cấu hình mở tự nhiên lại khơng cĩ bất kỳ sự tương tác trực tiếp nào giữa các vùng này
Cu tric cia Pfu DNA pol khi liên kết với DNA
Cấu hình đĩng (khi liên kết với DNA) của P# DNA pol được mơ hình hĩa dựa trên
cấu trúc của protein Gp43 cĩ hoạt tính gắn DNA [7]
Trang 16
Từ mơ hình cấu tạo đĩng, vịng loop của miền exonuclease và phần gờ của miền ngĩn tay cái nằm trong khoảng cách liên kết hydro Trong mơ hình cấu tạo đĩng, motif - hairpin (phần dư 243-248) của miền exonuclease được cho là nằm gần và cho phép tiếp xúc trực tiếp với miền ngĩn tay cái [37] Trình tự a.a của các motIf -hairpin cũng là duy nhất được tìm thấy trong DNA polymerase cơ (Hình 1.2) Các motif -hairpin nằm ở khe nối của vùng liên kết DNA khuơn và vùng chỉnh sửa đĩng một vai trị quan trọng trong chuyển đổi đầu kết thúc 3° của sợi mồi giữa vị trí trùng hợp và chỉnh sửa đang hoạt động để việc nhân bản được nhanh chĩng và chính xác [L7]
240 250 380 390 › ý ov % PFU PKMWRIGDMTAVE SEEEYORRLRESYTGGFVK KOD1 PKIORMGDRFAVE DEKELARR ROSYEGGYVK D.TOK PKIQRMGDRFAVE DERELARR TESYAGGYVK TGO PKIORMGDRFAVE DERELARR RESYAGGYVK 9N? PKIORMGDRFAVE DERELARR RGGYAGGYVK
The Ê-hairpin motif The Y-GG/A motif
Hình 1.2: So sánh trình tự a.a và cấu trúc của motif B -hairpin (vùng exonulcease) va motif Y-GG/A (vung ngon tay cai) Trong do: KOD, Thermococcus kodakaraensis DNA polymerase; D TOK, Desulfurococcus tok DNA _ polymerase; TGO, Thermococcusgorgonarious DNA polymerase; 9°N-7, Thermococcus sp.DNA polymerase; PFU, Pyrococcusfuriosus DNA polymerase [41]
Hầu hết các loop của DNA polymerase trong từng vùng từ cơ khuẩn ưa nhiệt được rút ngắn so với các lồi khác sống ở nhiệt độ thấp hơn hoặc trong mơi trường ấm hơn (ví dụ sinh vật nhân chuẩn), nhưng phần gờ của miền ngĩn tay cái trong vi khuẩn cơ vẫn giữ
lại một đoạn của vịng loop dài mặc dù gặp phải áp lực tiến hĩa về khả năng chịu nhiệt như
thế nào Các gờ được bảo tồn của miền ngĩn tay cái cho phép tương tác chặt chẽ với các khu vực khác nhau của miền exonuclease, hỗ trợ vai trị điều phối quan trọng của việc đọc
sửa và trùng hop [41]
Trang 17
Mỗi DNA polymerase cé thé duge phân vào lớp cĩ chức năng nhân bản hay sửa chữa, cũng như là cĩ lỗi hay dễ bị lỗi dựa trên đặc điểm riêng của từng DNA pol Các chức năng khác nhau của DNA pol trong sự tái bản DNA gồm việc polymerase gắn vào khuơn, vận chuyển nucleotide, đảm bảo độ chính xác và kéo dải chuỗi đã được đề xuất dựa vào cấu trúc bậc 2/ bậc 3 của DNA pol trong phức hợp với các khuơn DNA khác nhau [11] Vùng các ngĩn tay và vùng ngĩn tay cái thay đổi vị trí phụ thuộc vào việc polymerase được liên kết với DNA khuơn hay khơng [30] Những DNA pol khơng bị ràng buộc tạo thành những cấu trúc mở của vùng các ngĩn tay và vùng ngĩn tay cái, khi khuơn được gắn
vào 2 vùng này di chuyển xuơi về phía lịng bàn tay để giữ sợi khuơn/ mồi chặt hơn
Sự tổn tại của những vùng bồ sung ví dụ như vùng exonuclease là thay đơi giữa các DNA pol Trong trường hợp các DNA pol từ vi khuẩn cổ ưa nhiệt bao gồm Pf DNA pol, cĩ 5 vùng gồm: vùng các ngĩn tay, vùng lịng bàn tay, vùng ngĩn tay cái, exonuclease va vùng N - terminal [17, 19] Vùng exonuclease thay đổi cấu trúc của nĩ tùy thuộc vào trạng
thái của việc DNA pol đang thực hiện tái bản hay sửa chữa DNA Khi một nucleotide bắt
cặp sai được liên kết vào sợi DNA tổng hợp mới, sợi khuén/méi gan vao polymerase yéu
hơn hoặc bị lệch với vị trí hoạt động của polymerase Cuối cùng chuỗi xoắn kép tháo ra và
nucleotide đã bắt cặp nhằm được di chuyển tới vị trí hoạt động của vùng exonuclease và
được cắt bỏ (Hình I.3) [36]
s3
ionamin nt activity 745" onnnneen activity
TỦ: “HN mi? SI 5!
polymerases extends complemetary If Polymerase add: Synthesis continues from 5
strands from primers nucleotide, Mis pe
removed by proof to 3' direction,
oe : : : DNA template TIT vine : Ị : Mis-psired nucleotide
Hình 1.3: Cơ chế hoạt động và sửa sai của Pƒ DNA polymerase [27, 41]
Trang 18
Tai DNA pol bi rang buộc, cấu trúc đĩng của vùng ngĩn tay cái làm cho đầu 3° của sợi mỗi khơng thê gắn vào vùng exonuclease do trở ngại về khơng gian chủ yếu gây ra bởi phần gờ của vùng ngĩn tay cái Chỉ cĩ cấu trúc mở của vùng ngĩn tay cái mới cho phép
VIỆC gắn soi don DNA moi (ssDNA) vào vị trí hoạt động cua exonuclease Vi vay cấu trúc
tổng thể của mỗi vùng là sự kết hợp chặt chẽ với các vùng khác để thực hiện quá trình sao chép DNA
Cấu trúc vịng (loop) của vùng exonuclease là vùng bảo tồn mà chỉ cĩ trong DNA pol của vi khuẩn cổ ưa nhiệt [27] Khi gây đột biến điểm vùng exonuclease làm cho vị trí của vùng này gần hơn với vùng ngĩn tay cái, sẽ ngăn cản sự liên kết đầu 3” của ssDNA với
vị trí hoạt động của vùng exonulcease, do vậy làm giảm hoat tinh 3’- 5’ exonuclease Vi
vậy cấu trúc mở tự nhiên của vùng ngĩn tay cái là cần thiết cho chức năng sửa chữa của polymerase [41]
1.2.3 Một số tinh chat ciia Pfu DNA polymerase
s* Độ chính xác và khả năng kéo dài chudi cla Pfu DNA pol
Pfu DNA polymerase được cho là hữu ích trong việc khuyếch đại gen với độ chính xác
cao những mục tiêu DNA lên đến 2,5 kb [22] Nghiên cứu tối ưu héa b6 dém véi Pfu DNA
pol để đánh giá xem sự chính xác của Pƒ¿ DNA pol cĩ thể được tăng cường hơn nữa đã được nghiên cứu qua tý lệ gây lỗi trong PCR được so sánh khi thay đổi nồng độ MgSO¿, dNTP va giá trị pH khác nhau Kết quả cho thay rằng, Pƒ¿ DNA pol tạo lỗi ít nhất khi phan
ứng PCR được thực hiện với sự cĩ mặt của 2 - 3 mM MgSOa, 100 — 300 uM mỗi loại
dNTP va khoảng pH từ 8,5 — 9,1 ở 25°C (tương ứng với pH 7,1 — 7,7 ở 72°C) Những điều kiện trên cũng là tối ưu đề thu được lượng sản phẩm PCR cao Trong khi đĩ, với cùng điều
kiện về nồng độ dNTP 1a 800 uM, su co mat cua 1 mM MgSO¿ lại tạo ra tỷ lệ lỗi cao hơn 3 lần so voi 2 — 10 mM MgSO, [21]
Pfu la DNA pol cé d6 trung thuc cao thong duge str dung cho PCR và cĩ tỷ lệ lỗi trung bình là 1,3.105 đột biến/bp/phản ứng, chính xác hơn 7z DNA pol 8 lần [21] Độ
trung thực cao này là do Pfu pol cé hoat tinh doc stra 3’—5’ exonuclease Khi loại bỏ hoạt
Trang 19
DNA pol 40 lần trong cùng điều kiện phản ứng Cũng trong điều kiện phản ứng trên nhưng khi thay đơi pH của đệm từ 8,§ xuống 8,0 thì tỷ lệ lỗi của exo — Pu DNA pol chi cao hon Pfu DNA pol 7 lan Nhiing kết quả trên cho thấy rằng, khi cĩ hoạt tính 3’- 5’ exonuclease
và thực hiện PCR trong những điều kiện thích hợp P/# DNA pol là một trong số ít các
enzyme DNA pol bén nhiét cho tỷ lệ lỗi thấp nhất (Bảng 1.1)
Bảng 1.1: So sánh độ chính xác của các DNA polymerase bén nhiệt trong PCR [21.38]
Các DNA Tỷ lệ sao chép lỗi Tỷ lệ sản phẩm
polymerase bền nhiệt (x10°) PCR bị đột biến (%)
UlTma 55 +2° 110 Taq 8+3,9 16 Vent 2,8 +0,9 5,6 Deep Vent 2,7 + 0,2 5,4 Pfu 1,3 + 0,2 2,6
Khả năng nhân bản các đoạn DNA cĩ kích thước khác nhau là một điểm đáng lưu ý đối với các DNA polymerase Mặc dù 7g DNA pol là enzyme được sử dụng rộng rãi nhất
trong PCR nhưng lại bị hạn chế bởi thiếu hoạt tính đọc sửa Pfu DNA pol co hoat tinh đọc
stra 3°—5’ exonuclease nhung lai cé hiéu qua thap trong viéc khuéch dai DNA do kha nang
kéo dài thấp Khi sử dụng P#¿ DNA pol lẻ để nhân đoạn gen 5 kb khơng cho kết quả đương
tinh Taq DNA pol cé kha nang tổng hợp đoạn 5 kb nhưng lại khơng tổng hợp được đoạn 7,4 kb Khi kết hợp hai enzyme trên với tỷ lệ 4 Tag: 1 Pƒ¿ cho phép tổng hợp được cả 2
đoạn 5 và 7,4 kb [2] Hiện tượng này liên quan đến hoạt tính 3'- 5° exonuclease của Pfu
DNA pol, khi cĩ mặt cling voi Tag DNA pol trong phan ứng th Pfu DNA pol da giup loai bỏ những nuecleotide bị đưa nhằm vào và làm cho quá trình kéo đài chuỗi được tiếp tục, nhờ đĩ nâng cao khả năng kéo dài chuỗi Tuy nhiên khi kết hợp 7aa DNA pol va Pfu DNA pol theo tỷ lệ 16 Taq: 1 Pfu dé khuéch đại đoạn 30 kb, hỗn hợp 2 enzyme này cho tỷ lệ lỗi
5,6.10°° (sir dung Tag PCR buffer) Ty 16 16i trén cao hon ty 16 cua Pfu pol 6 lần nhưng lại thấp hơn tỷ lệ lỗi của 7a DNA pol đơn lẻ 30% trong cùng một điều kiện PCR [21]
Trang 20
+* Ảnh hưởng của một số chất khác nhau lên hoạt động tổng hợp DNA của P¿ DNA pol
Sự cĩ mặt của các chất cĩ trong phản ứng PCR cĩ ảnh hưởng rất quan trọng đến hoạt tính tổng hợp của Pu DNA pol
Nơồng độ đNTP thường được sử dụng trong phản ứng PCR là 20 — 200 iM Nong do
cao hơn dễ dẫn đến sự khuếch đại khơng đặc hiệu Bên cạnh đĩ, sự cân bằng trong thành phần các đNTP cũng ảnh hưởng đến phản ứng PCR Sự mắt cân bằng trong thành phần các
dNTP sé lam tang cdc 16i sao chép cua DNA polymerase Tuy nhién Pfu DNA pol hoat
động tốt khi cĩ mặt của 100 — 250 uM mỗi loại đNTP [26]
Nồng độ MgCh là một nhân tố ảnh hưởng mạnh đến phản ứng PCR Mg”* rất cần cho quá trình liên kết các dNTP, xtic tac cho enzyme Pfu DNA pol, lam tang Tm cia DNA
mạch kép Mg?* 1a Co — factor cua Pfu DNA pol nén néu long Mg?* qua thap thi Pu
DNA pol sẽ khơng thể hoạt động bình thường trong giai đoạn kéo dài, hạn chế quá trình kéo dài Ngược lại nồng độ Mg?” cao sẽ giúp ổn định sợi đơi DNA và ngăn ngừa sự biến tính hồn tồn của sản phâm trong mỗi chu kỳ, làm cho sản phẩm PCR ít đi; đồng thời, nồng độ Mg?* cao cĩ thể làm cho hiện tượng bat cặp giả xảy ra nhiều hơn và cho ra những sản phẩm mong muốn với số lượng quá lớn nhưng mức độ chuyên biét thap Pfu DNA pol hoạt động tối ưu trong mơi trường cĩ 2 mM Mg”* [33, 44]
NaN: từ lâu được biết đến là một chất kháng khuẩn tốt với nồng độ hiệu quả là 0,02%
(w/v) tức 3 mM, trong khi đĩ với phản ứng PCR cĩ 0,1 - 3 mM NaN: khơng làm ức chế hoạt động của P# DNA pol Điều này cho phép bổ sung NaNa ở nồng độ 3 mM vào chế phẩm P/#¿ DNA pol để chống nhiễm khuẩn khi cần thiết mà khơng làm ảnh hưởng đến hoạt
tính xúc tác của enzyme [1,3]
Tương tự như vậy thì NaF ở nồng độ 1-50 mM, monocaprin ở nồng độ 2-50 mM, heptyl paraben ở nồng độ 10- 80 mM đều khơng ảnh hưởng đến khả năng tổng hợp DNA cia Pfu DNA pol Ngugc lai, kém sunphat (ZnSOx) ở nồng độ 0,5 mM và EDTA ở nồng
độ 2 mM trở lên đã ức chế mạnh hoạt động của P#¿ DNA pol Tác dụng ức chế của EDTA
Trang 21
s* Độ bền nhiét cua Pfu DNA pol
Pfu DNA pol duoc phan lap từ vi khuẩn cổ ưa nhiệt cĩ độ bền nhiệt rất cao vì vậy khi san xuat Pfu DNA pol tái tổ hợp, độ bền nhiệt là một chỉ tiêu vơ cùng quan trọng để Pƒu DNA pol cĩ thể ứng dụng được trong PCR với các điều kiện gia nhiệt biến tính DNA ở
nhiệt độ cao cũng như thời gian kéo dai Vi mét Pfu DNA pol tai tổ hợp cĩ gắn thêm đuơi 6His ở đầu N - terminal van giữ được hoạt tính tổng hợp sau 1 giờ để ở nhiệt độ phịng (25 - 30°C) hay xử lý nhiệt ở 100°C Tương tự, việc giữ enzyme ở nhiệt độ phịng trong vịng 4 ngày sau đĩ thử hoạt độ qua khả năng nhân bản DNA bang PCR cho thay Pfu DNA pol tai
tổ hợp vẫn duy trì hoạt tính nhân bản tốt như giữ ở -20°C [2]
s* Một số tính chất khác của Pu pol
Nhu da biét, Tag DNA pol cé hoat tinh terminal transferase cho phép gan thém gốc
adenosine monophosphat (A) vao đầu 3° của đoạn DNA sợi kép [13] Chính vì đặc điểm
này mà các sản phâm nhân bản PCR dùng 7øa DNA pol cĩ thê được đưa vào vector hở cĩ gốc T ở hai dau 3’, dựa trên sự ghép cặp đặc hiệu gữa A và T Trong khi đĩ sản phâm nhân ban bang PCR ding Pfu DNA pol lai c6 dau bang Viéc tao ra sản phẩm cĩ đầu bằng tạo thuận lợi cho việc nối gen vào những vector cũng cĩ đầu tù mà khơng cần phải dùng đến
một loại enzyme cắt giới hạn nào cả
1.2.4 Ung dung ciia Pfu DNA polymerase
Chức năng chủ yếu của các DNA pol 1a téng hop chudi polynucleotide va sửa lỗi bằng cách loại bỏ các nucleotide khơng bổ sung với sợi khuơn, đảm bảo cho quá trình tự nhân đơi của DNA được diễn ra một cách chính xác Phần lớn các DNA pol dùng DNA để làm khuơn cho sự tổng hợp Tuy vậy, cũng cĩ DNA pol đặc biệt cĩ khả năng phiên mã ngược sử dụng khuơn là ARN để tổng hợp DNA (7h DNA polymerase) [12] Ngồi ra, cũng phải kể đến một hoạt tính terminal transferase của một số DNA pol cho phép gắn nuleotide vào đầu phân tử DNA cĩ sẵn Nhờ những tính chất này mà các DNA pol được ứng dụng rộng rãi trong sinh học phân tử
Ứng dụng phổ biến nhất của DNA polymerase chính là dùng trong việc xác định
trình tự nucleotide các gen Bằng việc dựa trên DNA khuơn để tổng hợp các đoạn sợi
DNA mới chỉ khác nhau một nucleotide mà người ta cĩ thé dé dang giải được trình tự của
Trang 22
DNA Điều này chỉ đảm bảo chính xác khi DNA pol dùng để tổng hợp các đoạn DNA mới tuân thủ nguyên tắc bơ sung một cách nghiêm ngặt
Nhân bản các gen hay DNA bằng kỹ thuật PCR là ứng dụng phổ biến thứ hai của
các DNA pol Cho đến nay, kỹ thuật PCR trở thành một phương pháp thường ngày và khơng thể thiếu trong các phịng thí nghiệm sinh học phân tử hay kỹ thuật gen Điều này
cũng nĩi lên rằng, các DNA pol, mà cụ thể là các DNA pol bền nhiệt luơn luơn được cần
đến
Ung dung Pfu DNA pol trong PCR cần độ chính xác cao: Trong nhiều ứng dụng sinh học phân tử bao gồm nhân bản, các đột biến cĩ hướng và dịch mã DNA là rất quan
trọng để bảo tổn các chuỗi DNA chính xác trong việc nhân bản PCR Một nucleotide kết
hợp khơng chính xác cĩ thé thay đổi codon tương ứng và kết quả là việc bổ sung các a.a sai trong quá trình dịch mã Điều này cĩ thể ảnh hưởng đến tính gấp và chức năng của protein Ngồi ra, việc xĩa một nucleotide cĩ thê phá hủy các khung đọc đúng Pu DNA pol cĩ độ trung thực cao nhất trong các polymerase chịu nhiệt Tỷ lệ lỗi cua Pfu DNA pol thap hon khoảng 8 lần so với polymerase 7aq DNA pol Vì vậy P/¿ DNA polymerase cĩ ứng dụng quan trọng trong PCR cần độ chính xác cao [38]
Sử dụng P# DNA pol trong PCR tạo các gen tơng hợp: sử dụng phương pháp PCR 2 giai đoạn (two step — PCR) để tạo nhanh các đoạn gen tổng hợp dựa trên cơ sở những nucleotide chồng lên nhau (overlapping) cĩ thể tạo ra đoạn cần tổng hợp thơng qua nhiều chu kỳ khuếch đại PCR [29] Người ta cĩ thể thiết kế một gen tổng hợp cĩ chứa codon tối ưu được dung dé biểu hiện protein trong cơ thể sinh vật hoặc gen tơng hợp được thiết kế để
thêm vị trí cắt hạn chế tạo điều kiện thuận lợi cho các thí nghiệm vé sau Nguyên tắc của
Trang 23
Việc sử dụng PCR trong phân tích các mau DNA chat lượng kém và nhiễm bẩn ví dụ như mẫu máu được di truyền pháp y ứng dụng triệt để Trong phản ứng với nồng độ Mg”' cao, Pƒu¿ DNA pol cĩ khả năng nhân một đoạn gen từ DNA genome trong mơi trường
chứa đến 14% máu Với khả năng khuếch đại cao và hoạt động tốt trong điều kiện mẫu
máu khác nhau, Pfu DNA pol dugc img dung trong các phịng thí nghiệm lâm sàng đề phân
tích tính đa hình của các sợi đơn DNA (SNP§) trong các mẫu máu [19, 32]
Nhân đoạn gen cĩ % GC cao: đối với các gen mục tiêu cĩ tỷ lệ GC cao việc thiết kế
chương trình nhiệt để khuếch đại các đoạn gen này cũng phải được chú ý để khơng xảy ra
hiện tượng bắt cặp khơng đặc hiệu khi nhiệt độ gắn moi thap Do Pfu DNA pol van giữ được 94 — 95% hoạt tính sau 1 giờ ở 100°C nên việc nhân các đoạn gen trên ở nhiệt độ cao
trở nên vơ cùng dễ dàng mà khơng phải lo việc enzyme cĩ bị mất hoạt tính hay khơng [32] 1.2.5 Tinh hinh nghién ctru Pfu DNA polymerase tai t6 hop
Pfu DNA polymerase dong vai tro quan trong trong phan tmg PCR nén viéc thu nhận
enzyme nay ttr vi khuẩn ưa nhiệt trở thành một nhu cầu cấp thiết Tuy vậy, việc thu nhận
chế phẩm enzyme trực tiếp từ các vi khuẩn ưa nhiệt là khơng đơn giản vì các vi khuẩn này
thường yêu cầu mơi trường sinh trường đặc biệt, nhiệt độ sinh trưởng cao và enzyme quan
tâm chỉ được sản xuất ở một lượng rất thấp Vì vậy sản xuất enzyme này bằng cơng nghệ protein tái tổ hợp hiện đang là giải pháp ưu việt nhất và đã cĩ nhiều cơng trình khoa học nghién ciru san xuat Pfu DNA pol
“ Trên thế giới
Cĩ rất nhiều các nghiên cứu với mục đích tạo ra các DNA pol bền nhiệt cĩ hoạt tính
cao đề ứng dụng trong PCR Cho đến năm 1991, Marthur và cộng sự đã nhân dịng gen mã hoa Pfu DNA polymerase tir Pyrococcus furiosus
Đến năm 1997, Lu va Erickson da biéu hién thanh céng Pf DNA pol trén té bao E coli BL21 DE3 (pLysS) Trong nghién ctru cuia Lu va Erickson da str dung vector pET11 dé tao
Pfu tai t6 hop va tién hanh tinh sach bang cach gia nhiét ở 70 °C tiếp đĩ sử dụng cột P11
phosphocellulose va cột mono Q Với phương pháp trên nhĩm tác giả đã thu được 3,7 mg
Pfu DNA pol tinh sach tir 1 lit dịch nuơi tế bảo cùng độ tính sạch là 97% và hoạt độ 22.500 unit/mg Mot don vi hoat d6 cua enzyme (unit) dugc tinh bang lượng enzyme xúc tác cho
Trang 24
sự kết hợp của 10 nmol đeoxyribonucleotides vào một đoạn polynucleotide trong 30 phút
ở 72 °C Kết quả tuy thấp hơn việc thu P/z DNA pol trực tiếp từ chủng Pyrococcus
uriosus (31.713 unit/mg) và biểu hiện qua baculovirus (26.000 unit/mg) nhưng tốc độ kéo dai chuéi cua Pfu DNA pol tai t6 hợp lại cao hơn so với Pfu DNA pol cé nguồn gốc từ tự nhiên [31, 33] Ưu điểm của phương pháp này là protein tạo ra mang đúng trình tự a.a mã hĩa cho P#¿ DNA pol mà khơng chứa thêm bất kỳ một a.a nào của vector biểu hiện, điều này tạo ra Pu DNA pol cuộn xoắn theo đúng cấu trúc tự nhiên và khơng ảnh hưởng đến
hoạt tính xúc tác của Pƒ#¿ DNA pol tai tổ hop Tuy nhién viée tinh sach Pfu DNA pol tai tổ
hợp gặp khĩ khăn và đất tiền do phải sử dụng hệ thống tự động để thu các phân đoạn khi tinh sạch bằng PII phosphocellulose và cột mono Q và lam mat mat một lượng lớn
enzyme trong quá trình thực hiện các bước tinh sạch [13]
Để đơn giản hĩa quá trinh tinh sach Pfu DNA pol tai t6 hop, nim 1998 Dabrowski va
Kur da nghién ctru biéu hién 6Histag — Pfu trong té bao E coli qua vector biểu hiện pET30LIC Vi protein tao ra cé 6His 6 dau N- terminal nên việc tỉnh sạch chỉ tiến hành qua bước gia nhiệt và sử dụng duy nhất cột Ni?* - TED Sepharose Kết quả sau biểu hiện và tinh sạch theo phương pháp này cho phép thu được một lượng P/¿ DNA pol nhiều hơn 6 lần (24 mg/ 1 lít dịch nuơi) so với nghiên cứu của Lu và cộng sự ở trên và hoạt độ enzyme thu được tương đương với Pƒ#¿ DNA pol từ P furiosus (31.000 unit/mg) Các kết quả cũng
cho thấy rằng khi cĩ thêm đuơi 6His ở đầu N - terminal, P#z DNA pol vẫn cĩ hoạt tính
tổng hợp chuỗi như Pƒ¿ DNA pol tự nhiên và vẫn giữ được hoạt tính tơng hợp sau 8 giờ gia nhiệt ở 98°C [15,38] Bên cạnh những nghiên cứu về P#¿ DNA pol, nhĩm tác giả cũng đã chứng minh phương pháp trên cho kết quả tương tự khi áp dụng với Pwo — một DNA pol
cĩ độ tương đồng về nucleotide gần như 100% với Pƒ#¿ DNA pol [4, 15] Qui trình tinh
sạch thu được lượng protein nhiều, tuy nhiên việc chỉ tinh sạch bằng gia nhiệt và ái lực với
Ni??? vẫn chưa đủ tinh khiết dé phục vụ các thí nghiệm về sinh học phân tử
Năm 2013, Ji Hye Heo va céng su da su dung semi — nested PCR dé nhan doan gen ma
héa cho Pfu DNA pol tir chinh DNA cé 1an trong hén hop Pfu DNA pol thuong mai va
biểu hiện thành cơng trên E coil BL21 DE3 voi hé vector pET21(b) Pfu DNA pol tai té
Trang 25
cua E.coli sau đĩ tỉnh sạch bằng sắc ký qua cột heparin Ưu điểm của phương pháp này là
chỉ cần 1 - 2 giờ để cĩ thể tinh sạch Pfu DNA pol khi su dung một loại đệm, nhưng hĩa
chat Heparin str dung cho tinh sạch cĩ giá thành cao mà lại liên kết đặc hiệu khơng chỉ với voi Pfu DNA pol ma con DNA pol cua tế bào vi khuẩn, do vậy enzyme thu được vẫn cịn lẫn tạp đo chỉ sủ đụng một bước sắc ký ái lực [23]
s* Tại Việt Nam
Mặc dù trên thế giới đã cĩ rất nhiều các cơng trình khoa học nghiên cứu sản xuất Pu DNA pol tái tổ hợp nhưng tại Việt Nam cho đến nay mới chỉ cĩ 1 cơng trình nghiên cứu
san xuat Pfu DNA pol tái tổ hợp trên Escherichia coli của Giáo sư Phan Tuấn Nghĩa và
cộng sự được thực hiện vào năm 2005
Trong nghiên cứu của nhĩm tác giả đã sử dụng vector pET28a để biểu hiện và kết hợp
trình tự 6His vào đầu N của Pfu DNA pol, tao diéu kiện cho viéc tinh sach enzym qua cột
sắc ký ái lực Ni - Agarose Việc phát hiện ra kha nang bam ctl Pfu DNA pol vao gel Heparin -Sepharose và bố sung thêm bước sắc ký ái lực qua cột này một lần nữa loại trừ khả năng lẫn các protein khơng mong muốn trong chế phẩm Pfu DNA pol Qui trinh tinh
sạch được thiết lập đã thu duge 25-26 mg Pfu DNA pol tinh khiết từ 1 lit dịch tế bào E coli
nuơi cấy VỚI tổng hoạt độ khoảng 40.000 unit, tương tự như hiệu suất mà Dabrowski và Kur (1998) thu được khi dùng với hệ thống vector pET30LIC Mặc dù qui trình thu được
lượng lớn Pu DNA pol trên nhưng thực hiện qua giai đoạn tính sạch sử dụng Heparin
Sepharose cĩ giá thành cao mà lại khơng đặc hiệu do Heparin cĩ thể liên kết voi cac DNA
pol của tế bào vi khuẩn chủ [1, 2] Ngoai ra Pfu DNA pol tao ra lại mang thêm một đoạn khoảng 20 a.a của vector pET28a ở đầu N, đoạn a.a này cĩ thể làm ảnh hưởng đến khả năng cuộn xoắn, tổng hợp chuỗi DNA của enzyme
Vì vậy các nghiên cứu sản xuất Pƒ#¿ DNA pol trên thế giới và ở Việt Nam vẫn tồn tại
nhiều nhược điểm và khĩ khăn trong việc tinh sạch dé thu dugc Pfu DNA pol dam bao tinh
khiết Hiện nay, trên thế giới đã cĩ rất nhiều nghiên cứu với mục đích làm tăng khả năng
hịa tan và tinh sạch protein tái tổ hợp cho hiệu suất cao và tinh khiết từ tế bào E coli với
hexahistidine-tagged maltose-binding protein (HistagMBP) khi su dung hé vector pMAL
[5, 39] Hé vector biéu hién pMAL cĩ những ưu điểm như: protein tạo ra ở trạng thái tan
Trang 26
hồn tồn khi được dung hợp với maltose - binding protein, cĩ thể dễ dàng tỉnh sạch qua
việc sử dụng sắc ký ái lực qua cột amylose với chi phí rẻ, protein đích được hồn nguyên
bằng Factor Xa nằm ở ngay trước đầu N của protein tái tổ hợp Bên cạnh đĩ việc sử dụng
Histag dé tinh sạch bằng Ni”? ở đầu N lại khơng ảnh hưởng đến hoạt tính của Pu DNA tái
tổ hợp Do vậy chúng tơi đã kết hợp sử dụng hệ vector pMAL gắn thêm đuơi (His)s để nghiên cứu sản xuất và tinh sach Pfu DNA polymerase chất lượng cao sẽ gĩp phần tích cực trong việc phục vụ các nghiên cứu về sinh học phân tử trong nước
PHAN 2: VAT LIEU VA PHUONG PHAP NGHIEN CUU 2.1 Vật liệu, hĩa chất, thiết bi
2.1.1 Vật liệu
s* Nguyên liéu: chung £ coli mang plasmid pET 11a chira gen ma hda cho Pfu dugc cung cấp bởi Viện Cơng nghệ Sinh học và Cơng nghệ Thực phẩm, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội; DNA genome chủng Lisferia monocyfogenes EGD-e dùng làm khuơn cho
Trang 27
Chung vi sinh vật: chủng E coli Top 10 duoc str dung dé tach dong gen mã hĩa cho Pu, chủng E coli BL21 (DE3) và chủng E coli BL21 (DE3) pLysS được sử dụng để biểu
hiện protein Pƒ; DNA pol đều của hãng Thermofisher (Hoa Kỳ)
s* Các vector: vector biểu hiện pMAL-e5X (5677 bp) của hãng New England Biolabs (ĐEB) (Anh)
s*Các cặp mơi: các mơi thiết kế đều được đặt tổng hợp từ hãng Macrogen (Hàn Quốc), và PHUSA Biochem (Việt Nam)
+Cap mi Pfu F-His/ Pfc R ding dé nhan gen, chon déng va biéu hiện gen Trình tự
mỗi được thiết kế dura vao trinh tu gen ma hoa cho Pfu DNA pol đã được xác định trình tự
DNA
+Hai cip méi T7-F/T7-R va Pfu-F1/Pfu-R1 ding dé chọn dịng và giải trình tự gen được thiết kế dựa trên trình tự của vector pET11a và trinh ty gen ma héa cho Pfu DNA pol +Cặp mỗi pMAL — F/ pMAL — R dùng để chọn dịng tế bào biểu hiện được thiết kế
dựa trên trình tự của vector pMAL - c5X
+ Cặp mỗi LmA/LmB dùng trong phản ứng thử hoạt tinh Pfu DNA pol tái tổ hợp cho kích thước đoạn gen 234 bp
Bang 2.1: Trình tự các cặp mỗi sử dụng trong luận văn
STT | Tên mơi Trinh tu (5’-3’)
Trang 289 LmA CGGAGGTTCCGCAAAAGATG 10 LmB CCTCCAGAGTGATCGATGTT 2.1.2 Hĩa chất và thiết bi * Hĩa chất và enzyme
- Hĩa chất: hĩa chất nuơi cấy vi sinh (Merck, Đức): NaCl, cao nắm men, tryptone, agar, ampiciline, chloramphenicol; hĩa chất điện di (Sigma, Mỹ): Tris — base, EDTA, acid
acetic, acrylamide, bis-acrylamide, TEMED, APS, SDS; hoa chat cam ung: IPTG (Sigma,
Mỹ); kit tỉnh sạch sản phẩm PCR trén gel: Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega, MY), kit tinh sach sin phim PCR: GeneJET Genomic DNA Purification (Thermofisher, Hoa Kỳ), thang chuẩn DNA (Fermentas, Mỹ), thang chuẩn protein
- Enzyme:Q5 Hot Start High-Fidelity DNA polymerase (NEB),Taq DNA polymerase, enzyme gidi han NcoI va XmnI (NEB, Anh), T4 Ligase (Fermentas, My), RNase
s* Thiết bi
Các máy, thiết bị đều đang trong thời gian được kiểm định chuẩn, bao gồm: - Máy chu kỳ nhiệt 96 mẫu (Eppendorf, Đức);
- May soi chup anh gel (BioRad, My);
- B6 dién di DNA Horrizontal mini (CBS Scientific, MY);
- Máy đồng hĩa bằng siêu âm Sonics Vibra cell (VCX130, MIDSCD; - Bộ điện di protein (Bio-rad, Mỹ);
- Máy cơ đặc mẫu (Thermo Fisher, Mỹ);
- May quang phé NanoDrop 2000 (Thermo Fisher, My); - Nồi khử trùng (Harayama, Nhật Ban);
- Cân phân tích CPA 324S (Satorius, Đức);
- Tủ cấy vơ trùng Class II Type Az(ESCO);
- Máy lắc đảo ngược Mini laboroller (Labnet);
Trang 29
- Máy lắc 6n nhiét (eppendorf, Mỹ);
- May li tam lanh Eppendorf Legend XIR (Thermo Fisher, Mỹ); - May ly tam (Eppendorf, CHLB Duc);
- Lồ vi sĩng (Samsung);
~Tủ lạnh (0-4°C) (Toshiba, Nhật);
- Tu lanh Biomedical Freezer (Thermo Fisher, My);
- May vortex (Rotolab, OSD; May do pH (HI 8424, HANNA Instruments); - Micropipette cac loai Gilson (Phap) va Biohit (Phan Lan)
2.2 Phuong phap
2.2.1 Tach chiét plasmid
Quy trình tach chiét DNA plasmid nhu sau: Cay chuyển 1 khuẩn lạc mang plasmid cần tách vào trong éng falcon 50ml chtra 5 ml méi trường LB cĩ bồ sung Amp+ (100 tig/ml), nuơi lắc qua đêm ở 37°C, 120 vịng/phút Chuyên 1,5 ml dich nuơi cấy vào ống Eppendorf loại 1,5
ml, ly tam 3 phút tốc độ 12000 vịng/phút Loại bỏ dịch nồi thu tế bảo Lặp lại bước thu tế bào một lần nữa Rửa cặn tế bảo bằng 1 ml H20 deion, ly tam thu can Hoa đều tế bào thu được với
100 pl dung dich Sol A (50mM Tris-HCI pH 7.5; 10 mM EDTA) bang cach vortex nhanh.Bé
sung 100 pl dung dich Sol B (0.2 M NaOH; | % (w/v) SDS), dao đầu ống Eppendorf nhanh, nhẹ
nhàng để tránh đứt gẫy DNA, ủ nhiệt độ phịng 2 phút Bồ sung tiếp 100 pl dung dich Sol C
(1.32 M potassium acetate (CHzCOOK pH 4,8) và đảo nhẹ 5 lần, trong hỗn hợp sẽ xuất hiện kết
tủa trắng Ly tâm 5 phút với tốc độ 14000 vịng/phút Thu dịch nổi và chuyên sang ống Eppendorf mới Cho 1 ul RNAse, ủ 37 °C 30 phút đề loại bỏ hết RNA trong mẫu Bồ sung 125
ul dung dich 5M guanidine thiocyanate, trộn thật đều và đưa lên cột Ly tâm cột 14000 vịng/phút, I phút, loại dịch ở tube phía bên dưới Đặt lại cột lên tube, rửa cột bằng 500 pl Sol E
(10 mM Tris pH 7,5; 100 mM NaCl; 1 mM EDTA; 50% EtOH), ly tam 14000 vong/phit đề loại
dich Lap lai bước rửa cột 2-3 lần Ly tâm khơ màng ở 14000 vịng/phút, chuyển cột sang ống
Eppendorf 1,5 ml mới, ủ cột ở 65%C cho cồn bay hơi hết Cho 50 Iul H2O vào giữa cột, ủ 2 phút, ly tâm thu dịch chứa DNA plasmid và đo nồng độ DNA bằng máy Nanodrop Kiểm tra bằng cách điện di 8 ul trén gel agarose 1%
2.2.2 Nhân đoạn gen mã hĩa cho P# DNA pol bằng phản ứng PCR
Trang 30
PCR (Polymerase chain reaction) dugc phat minh boi Kary Mullis (Mulliset al., 1986), là phương pháp tổng hợp lượng lớn DNA dựatrên mẫu khuơn (một trình tự DNA đích ban đầu) Thơng thường, một phản ứng PCR gồm một chuỗi từ 20-40 chu kỳ, mỗi chu
kỳ cĩ ba bước: biến tính, gắn mỗi và kéo đài chuỗi Sau một khoảng thời gian xác định
lượng DNA sẽ được khuếch đại lên hàng triệu lần
Một phản ứng PCR được tiến hành trong tổng thể tích 50 u1 với các thành phần theo Bảng 2.2
Bảng 2.2 Thành phần phản ứng PCR khuếch đại gen mã hĩa P/ DNA pol
Thành phần Thể tích (wl) 5x Q5 Reaction Buffer 10 dNTP (10mM) 1 Pfu-F His(10uM) 1,25 Pfu R (10uM) 1,25 DNA khuơn (0,1 ng/H]) 4
Q5 Hot-Start High Fidelity 0,5
H20 32
Chu trinh nhiét cua phan tng PCR:
98°C _' 985C
2phút : 30 giây
5 phút
Trang 31
2.2.3 Dién di DNA trén gel agarose
Kỹ thuật điện di trên gel agarose được thực hiện để kiểm tra sự phan tach cua DNA theo Sambrook va Russel (Sambrook and Russel, 2001) Vì DNA là các đại phân tử tích điện âm nên khi chịu tác động của một điện trường đều cĩ hiệu điện thế và cường độ dịng
điện thích hợp, chúng sẽ đi chuyên từ cực âm về cực dương của điện trường với tốc độ tỷ lệ
nghịch với kích thước đoạn DNA Từ đĩ mà DNA được tách thành các vạch khác nhau
trên bản gel Sự lựa chọn nồng độ gel tùy thuộc vào kích thước trung bình của các đoạn DNA cần phân tách Đoạn DNA cĩ kích thước lớn hơn 0,5 kb cĩ thể được phân tách trên gel agarose nồng độ 0,8-1% (w/v) và nhỏ hơn 0,5 kb cĩ thê phân tách trên gel nồng độ 1,7-
2% (w/v) DNA được điện di trong hệ dung dịch đệm chứa 40 mM Tris-HCI, 20 mM acetic acid, 2 mM EDTA, pH 8,3 với hiệu điện thế đao động từ 100-120 V Bản gel sau đĩ được
nhuộm bang ethidium bromide (EtBr) 0,5 ug/ml va céc bing DNA được quan sát dưới tia UV
2.2.4 Tinh sach DNA bang kit Wizard SV Gel
Mẫu DNA sau khi được xác định trên bản gel điện di sẽ được tách chiết ra khỏi gel
agarose bằng cách sử dụng kit thơi gel Wizard SV Gel Quy trình như sau: dién di DNA trên gel agarose 1%, cat mảnh gel chứa DNA cho vào ống Eppendorf và cân để xác định khối lượng gel B6 sung Binding Buffer theo tỷ lệ 1g gel:1ml Binding buffer, ủ 60 °C cho
đến khi gel tan hồn tồn Cho tồn bộ hỗn hợp trên lên cột Wizard, ủ nhiệt độ phịng 2
phút, sau đĩ ly tâm 14000 rpm trong 1 phút, loại dich bén dudi Bé sung 500 pl Washing
Buffer, u 2 phut, ly tim 14000 rpm trong 1 phút, loại dịch; lặp lại bước rửa một lần nữa Ly
tâm khơ màng ở 14000 rpm, 1 phút sau đĩ đặt cột lên ống tube 1,5 ml mới, ủ cột ở 65°C 10
phút để cồn bay hơi hết Bổ sung 50 H1 H:O vào giữa cột, ủ nhiệt độ phịng 2 phút, ly tâm
14000 rpm trong 1 phút Thu dịch bên dưới, đo OD và kiểm tra DNA thu được bằng cách điện di trên gel agarose 1%
2.2.5 Ghép nối gen
Vector biểu hiện pMAL — c5X của hang New England Biolabs (Anh) được sử dụng để biểu hiện gen mã hĩa P#¡ DNA pol Ưu điểm của vector này là cĩ promotor mạnh cho phép biểu hiện protein tái tổ hợp ở dạng tan hồn tồn và chiếm tỉ lệ 20 — 40% protein tổng
Trang 32
sé cua té bao Vector duge xit ly voi enzyme Xmnl cat dau bang va Ncol cat dau dinh dé dễ dang néi doan gen ma hda Pfu DNA đã được cắt bằng Ncol Phản ứng nối sản phâm PCR vao vector co su xtc tac cua enzyme T4 DNA ligase
Phan img ndi ghép cé téng thé tich 14 20 ul véi cdc thành phần được liệt kê theo Bang 2.3 Bảng 2.3: Thành phần phản ứng nối ghép Thành phần Thê tích (nl) Buffer 2X 10 Vector pMAL- c5X 1 Sản phâm PCR (140ng) 5 T4 DNA Ligase 1 H20 3
Hỗn hợp phản ứng được ủ ở 22 °C trong | gid va 16 °C trong S5gid, sau đĩ được biến
nạp vào tế bào khả biến chủng E coli Top10
2.2.6 Bién nap plasmid vao E coli bang phương pháp sốc nhiệt
¢ Quy trình tạo tế bào khả biến:
Cay chuyén mét khuan lac E coli (Top10 , BL21 (DE3), BL21 (DE3) pLysS) trong 5 ml mơi trường LB lỏng, lac 200 vong/phut & 37°C qua dém.Chuyén 0.5 ml dich nudi tế
bào qua đêm sang 50 ml mơi trường LB lỏng (pha lỗng 100 lần dung dịch tế bào ban đầu),
tiếp tục nuơi lắc ở 200 vịng/phút, 37°C đến khi ODøoo am đạt 0,4 — 0,6 Dịch nuơi cấy sau
khi chuyển sang ống ly tâm được để trong đá 20 phút Ly tâm 1600 vịng/phút ở 4°C trong
10 phút, loại bỏ dịch, thu cặn tế bào Tế bào sau khi ly tam dugc hoa trong 10 ml CaCl 0,1
M lạnh Ủ trong đá 5 phút, ly tâm 1200 vịng/phút ở 4°C trong 5 phút dé thu tế bào Hịa tan
tế bào vào 10 ml CaCls 0,1 M lạnh Ủ trong đá 30 phút, ly tâm 1200 vịng/phút ở 4°C trong 5 phút đề thu tủa tế bào Hịa tế bào vào 2 ml dung dịch CaCls 0,1 M chứa 20%glycerol
Chia 100 pl dich té bao vao cdc éng Eppendorf 1,5 ml và bảo quản ở -80°C
Trang 33
Tế bào khả biến sau khi lấy ra từ -80°C được làm tan trên đá trong 30 phút (tránh sốc
nhiệt) Bổ sung vào mỗi ống tế bao kha biến 5 wl mẫu sản phẩm ligation (DNA + Vector + Ts DNA ligase), 2 Hl vector pUC19 đã đĩng vịng làm mẫu chứng dương, đảo nhẹ nhàng
dé DNA phân bố đều trong dịch tế bào khả biến Sau đĩ, đặt tồn bộ trên đá trong thời gian
30 phút
Sốc nhiệt: mẫu đang đặt trên đá được chuyên ngay sang bê ơn nhiệt cĩ nhiệt độ 37°C trong 1 phút Sau đĩ mẫu được lấy ra và đặt ngay lên đá lạnh trong thời gian 5 phút Bổ
sung 900 ul LB lỏng, lắc hỗn hợp tế bao 6 37°C trong 60 phút Hút 200 k1 dịch tế bao va
cấy trải trên đĩa mơi trường LB đặc cĩ chứa kháng sinh Ampicilin (Amp*) 100 ug/ml đối với E.coli Top 10 va E.coli BL21(DE3); 100 ug/ml Amp va 50 ug/ml chloramphenicol
(Cam*) d6i với E.coli BL21(DE3) pLysS Ủ đĩa ở 37°C qua đêm
Bảng 2.4 Thành phần mơi trường nuơi cấy vi sinh vật
Mơi trường Thành phần Tham khảo
1% (w/v) bacto-tryptone, 0.5% cao nâm men, 1%
LB lỏng Luria va cs 1960
(w/v) NaCl, pH 7,0
, 1% (w/v) bacto-tryptone, 0.5% cao nam men, 1%
LB ran Luria va cs 1960
(w/v) NaCl, 2% (w/v) agar, pH 7,0
2.2.7 Xác định trình tự DNA
Trinh tw nucleotide cua gen ma héa cho Pfu DNA polymerase được xác định theo phuong phap cua Sanger Dac trung cla phuong phap nay 1a ngoai nhitng dNTP théng thường cịn sử dụng thêm 4 loại dideoxynucleotide (ddNTPs) trong đĩ nhĩm 3'- OH đã biloai oxy chỉ cịn là 3'- H, mỗi loại được đánh dấu bằng chất phát huỳnh quang đặc trưng
khác nhau Sự cĩ mặt của các ddNTP sẽ làm mất khả năng hình thành các cầu nối
phosphodieste với các nucleotide tiếp theo dẫn đến làm ngừng quá trình tổng hợp DNA
Các đoạn DNA cĩ kích thước khác nhau một nucleotide được phân tách bằng diện di mao
quản và phát hiện bằng hệ thống phân tích tự động nhờ máy giải trình tự ABI 3700 của
hãng Macrogen, Hàn Quốc
Trang 34
2.2.8 Thiét ké vector biéu hién gen ma héa cho Pfu DNA pol
Gen ma hoa cho Pf DNA pol nam trong vector pET 11a sau khi duoc xac định đúng trình tự thiết kế được chuyển vào vector pMAL- c5X để biểu hiện Xử lý vector pMAL-c5X voi hai enzyme giới hạn là NcoI va XmnI, doan gen ma hoa Pfu sau khi nhan lên bằng PCR được xử lý với enzyme Ncol dé tao dau dinh tuong hop gitra doan gen can
chèn và vector Sau khi được làm sạch bằng kit tinh sach GeneJET, gen Pfu va vector
pMAI - c5X được nối ghép với nhau nhờ enzyme T4 DNA ligase và ủ ở 16°C qua dém Sau đĩ, sản phẩm được biến nap vao ching E coli Top 10 dé chọn dịng những vector pMAL - c5X cĩ chứa gen P/¿ Vector tái tổ hợp này được ký hiệu là pMAL-c5X-His- Pƒu, sau đĩ
được biến nạp vào chủng E coli BL21 (DE3) và E coli BL21 (DE3) pLysS để kiểm tra
khả năng biểu hiện trong 2 loại tế bào
2.2.9 Biểu hiện gen mã hĩa cho P# DNA pol
Sau khi biến nạp vector tái tổ hợp pMAL-c5X-His- Pfu vao chung E coli BL21
(DE23) và E coli BL21 (DE3) pLysS, các khuẩn lạc phát triển tốt nhất trên đĩa mơi trường
chọn lọc LB (mơi trường LB cĩ bổ sung Amp* nồng độ cuối cùng là 100 ug/ml đồi với E
coli BL21 (DE3) và bố sung thêm Cam" nồng độ cuối cùng 50 ug/ml đối với E coli BL21
(DE23) pLysS) sẽ được chọn và nuơi cấy lắc qua đêm ở 37°C, 200 vịng/phút Hịa dịch nuơi cấy qua đêm vào mơi trường LB cĩ bổ sung Amp* và Cam" tương ứng với loại tế bào
E.coli theo tỷ lệ 1 — 1,5% và nuơi cấy ở cùng điều kiện trên trong khoảng thời gian 2h Khi OD600 nm của dịch tế bào đạt 0,6 — 0,8 thì bổ sung IPTG vào mơi trường nuơi cấy đến nồng
độ cuối cùng là 0,5 mM và tiếp tục nuơi tế bào ở cùng điều kiện như trên Mẫu tế bào được
thu ở các thời điểm 0h và 5h sau cảm ứng, tế bào được thu bằng cách ly tâm 4000G trong
thời gian 20 phút ở 4°C Cặn tế bào được hịa tan trong dung dịch đệm C (20 mM Tris -
HCl; 200 mM NaCl; 2 mM B - mecaptoethanol; pH 7,5), siéu âm trên đá 2 phút sau đĩ ly tâm 6000G, 15 phút ở 4°C thu dịch nỗi và điện di trên gel polyacrylamide
2.2.10 Phân tích protein bằng kỹ thuật điện di SDS-PAGE
Trang 35
chúng ta sử dụng gel ở nồng độ 8% và 10% SDS-PAGE được tiến hành trên gel 8% và 10% như ở Bảng 2.5
Bảng 2.5 Thành phần và các dung dịch đệm SDS-PAGE
Tên Thành phần
Gel cơ 4.5% 2 ml: 0,5 ml 0,5 M Tris-HCl pH 6,8; 20 pl 20% (w/v) SDS; 0,3 ml 30% (w/v) acrylamide; 1,2 ml H20; 10 pl 10% (w/v) APS; 4 ul
TEMED
Gel phan 5 ml: 1,3 ml 1,5 M Tris-HCl pH 8,8; 25 ul 20% (w/v) SDS; 1,3 ml tach 8% 30% (w/v) acrylamide; 2,33 ml H2O; 50 ul 10% (w/v) APS; 5 ul
TEMED
Gel — phan 5 ml: 1,25 ml 1,5 M Tris-HCl pH 8,8; 25 il 20% (w/v) SDS; 1,67 ml
30% (w/v) acrylamide; 2,08 ml H20; 25 ul 10% (w/v) APS; 2,5 ul
TEMED
Dém mau 20% (v/v) glycerol; 2% B-mercaptoethanol; 4% (w/v) SDS; 0,01 (w/v) 2x bromophenol blue; 125 mM Tris-HCl pH 6,8
Đệm điệndi 25 mM Tris-HCl; 192 mM glycine; 0.1% (w/v) SDS; pH 8,3
Dé phan tích mức độ biêu hiện của protein, các bản gel được nhuộm bằng Coomassie brilliant blue (CBB) Sau khi ủ với dung dịch nhuộm (0,1% (w/v) CBB, 30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) trong 30 phut, ban gel được tay bang dung dich tay
(30% (v/v) methanol, 10% (v/v) axit acetic) cho đến khi cĩ thể quan sát thấy các băng protein
2.2.11 Sắc ký ái lực qua cột amylose
Tinh sạch protein bằng sắc ký qua cột amylose được thực hiện theo quy trình của hãng NEB như sau:
Nhỏi cột: sử dụng cột cĩ kích thước 2 cmx10 em đã được lĩt một lớp màng ở bên
dưới cột, sau đĩ rửa cột bằng cách dùng pipet hút dung dịch đệm C tráng xung quanh cột và kiểm tra dé hé thống cột khơng bị rd ri dung dịch Dùng phễu đưa amylose resin lên cột
với tỷ lệ 15 ml resin/ Ilit dịch nuơi cấy, và rửa cột với 5 lần thể tích resin của dung dịch
Trang 36
dém C Loai dung dich C ra khoi cot bang khĩa bên dưới được thơng ra từ cột, chỉ bớt lại l
lớp mỏng dung dịch trên bề mặt resin tránh tinh trang resin bị khơ
Tỉnh sạch protein dung hợp qua cột: bắt đầu đưa dịch chiết tế bảo biểu hiện đã được pha lỗng tỷ lệ 1 dịch chiết : 6 đệm C lên cột resin đã rửa, loại dịch sau gắn ra khỏi cột với
tốc độ 3,3 ml/phút, dịch sau gắn được giữ lại để kiểm tra bằng điện đi SDS-PAGE Rửa cột để loại hết các protein khơng gắn với 12 lần thể tích resin của dung dịch đệm C, tốc độ dịch
rửa cột đi ra là 6,6 ml/phút, dịch rửa được giữ lại để điện di kiểm tra Tiến hành thu protein
đích bằng dung dịch đệm C cé bé sung 10 mM maltose, tiến hành thu 10 phân đoạn mỗi phân đoạn thu bằng 1/5 thể tích resin (3 ml) Protein đích thường chứa trong 5 phân đoạn đầu tiên Các phân đoạn được giữ riêng và điện đi kiểm tra trên gel polyacrylamide
Chú ý rằng tồn bộ quy trình trên được thực hiện trong điều kiện lạnh để ức chế sự
phá hủy của các protease
2.2.12 Tỉnh sạch protein đuơi Histag bằng Ni-charged Magbeads
Dựa vào liên kết giữa đuơi His và Ni?*, sử dụng bi từ cĩ gắn các hạt Ni?" trên bề mặt đề thu được các phân tử protein cĩ gắn đuơi His Để rửa giải sử dụng imidazol với nồng độ
cao đề đây các protein đích ra khỏi bi từ
Quy trình thực hiện như sau: lắc đều bi từ cho đồng đều trước khi lấy, lay 100 ul bi
đã lắc đều vào ống Eppendorf mới, đặt ống lên giá từ để bi từ tập trung lại rồi hút loại bỏ
dịch nổi Bổ sung 1 ml LE buffer (50 mM NaH>POs, 300 mM NaCl, pH 8,0), đảo trộn bằng vortex, cho vào giá từ và loại bỏ dịch nỗi, lặp lại bước rửa trên 2 lần Lay 0,5 ml dich chiét
cĩ protein chứa đuơi His pha lỗng với 0,5 ml LE buffer, bổ sung dịch pha lỗng trên vào
ống bị từ đã rửa ở trên, đảo trộn nhẹ 30 - 60 phút ở 4 °C Đặt ống lên giá từ, thu lại dịch sau
gắn để kiểm tra bằng điện di Bỏ ống ra khỏi giá từ, b6 sung 1 ml WB (50 mM NaH>PO,,
300 mM NaCl, 10 mM imidazole, pH 8,0), đảo trộn đều, đặt ống vào giá từ loại dich Lap
lại bước rửa trên 3 lan Rita giai bang 100 pl EB (50 mM NaH>PO,, 300 mM NaCl, 250
mM imidazole, pH 8,0), đảo trộn và ủ 5 phút, sau đĩ đặt lên giá từ và thu dịch Lặp lại
bước rửa giải 3 lần Các dịch thu lại được điện di trên gel polyacrylamide dé kiém tra
Trang 37
Hoạt tinh cia Pfu DNA pol thu tái tổ hợp được kiểm tra qua phản ứng PCR với khả
năng kéo đài 2 đoạn DNA cĩ kích thước lần lượt là 234 bp và 2,5 kb Thành phần và chu
trình nhiệt của 2 phản ứng được thê hiện ở bảng sau:
Bảng 2.6: Thành phần phản ứng PCR thử hoạt tính P/u tái tổ hợp Thành phần Thé tich (ul) Buffer Pfu 10X 25 dNTP 2,5 mM 2 M6i xudi 10 mM 0,625 Mơi ngược I0 mM 0,625
Pfu DNA pol 1
DNA (100 phién ban) 2
H20 16,25
Chuong trinh nhiét:
95°C - 3 phút 95°C - 30 giây
60°C — 30 gidy, 72°C — 30 giây (đối với đoạn 234 bp) 30 chu ky 54°C — 30 giay, 72°C — 2.5 phút (đơi với đoạn 2,5 kb)
72°C - 5 phút
PHÀN 3: KÉT QUÁ VÀ THẢO LUẬN
3.1 Xác định trinh tu gen m4 héa cho Pfu DNA pol tir té bao E coli mang vector pET11a
s* Tách DNA plasmid cĩ mang đoạn gen mã hĩa cho Pƒu DNA pol:
Từ chủng E col? chứa vector pETlla mang gen mã hĩa Pu DNA pol chúng tơi
tiến hành tách chiết plasmid theo phương pháp ở mục 2.2.1 để làm khuơn cho phản ứng
giải trình tự đoạn gen mã hĩa Pfu DNA pol Két qua tach chiết được điện di trên gel
agarose 1% (Hình 3.1)
Trang 38
Hinh 3.1: Két qua dién di kiém tra DNA plasmid mang doan gen Pfu Đường chạy (ĐC) 1: DNA plasmid tách chiết, ĐC M: Fermentas GeneRuler Ikb Kết quả điện di cho thấy plasmid cĩ 3 băng tương ứng với 3 dạng của plasmid là siêu xoắn, vịng và thẳng Điều trên chứng tỏ rằng plasmid chúng tơi tách chiết khơng bị đứt gãy, đủ điều kiện làm khuơn cho phản ứng PCR nhân gen Pu tiếp theo
Từ nguyên liệu là plasmid vừa tách chiết ở trên, để kiểm tra xem plasmid trên cĩ chứa đoạn gen 2328 bp mã hĩa cho P#¿ DNA pol hay khơng chúng tơi tiến hành chạy phản ứng PCR với cặp mỗi T7-F/T7-R được thiết kế theo trình tự của vector pET 11a Sản phẩm của phản ứng PCR được điện di trên gel agarose 1% thể hiện ở Hình 3.2
Trang 39
6 kb 2.5 kb
1kb
Hinh 3.2: Két qua dién di san pham PCR kiém tra sự cĩ mặt của đoạn gen mã hĩa
cho Pfu DNA pol trong vector pET1 1a trén gel agarose 1% DC M: Fermentas GeneRuler
Ikb, ĐC 1: sản phâm PCR với khuơn là plasmid, ĐC 2: đối chứng âm PCR
Kết quả điện di Hình 3.2 cho thấy ở ĐC số 1 xuất hiện một băng DNA duy nhất cĩ kích
thước khoảng 2,5 kb Kích thước 2,5 kb bao gồm đoạn gen ma héa Pfu DNA pol 2328 bp và 1 phan tình tự của vector khoảng hơn 100 bp ở 2 đầu gen khi chạy bằng cặp mỗi T7- E/R Tuy kết quả PCR xuất hiện đúng băng cĩ kích thước mong muốn nhưng cũng chưa thể khẳng định đoạn gen cĩ mã hĩa cho Pƒ#z DNA pol hay khơng Chúng tơi tiếp tục tiễn hành phản ứng PCR voi 2 cip méi T7- F/ Pfu - R1 va Pfu — Fl/ T7- R voi 2 méi Pfu - Fl
nằm ở vị trí nằm ở vị trí 1053 — 1072 và Pu — RI nằm ở vị trí 1237 — 1218 của đoạn gen
mã hĩa cho Pfu DNA pol duge céng bố trên ngân hàng Gen thế giới theo mã số
KF836420.1 Trình tự 2 cặp mỗi như sau :
Pfu-F 1: 5’- CCTTGTAGAGTGGTTCTTAC - 3° nằm ở vị trí 1053 — 1072 Pfu-R1: 5’°- TCGAGGGATATAGGGCTCTA - 3’ nam 6 vi tri 1237 — 1218
San pham PCR được điện di trên gel agarose 1% va thé hién ở Hình 3.3
Trang 40
2 kb
1kb
250 bp
Hình 3.3: Kết quả điện di sản phẩm PCR kiểm tra sự cĩ mặt của gen mã hĩa Pu
DNA pol bang 2 cặp mơi T7- E/ Pfu - R1 va Pfu — F1/ T7- R Trong đĩ ĐC 1: sản phẩm
PCR chạy bằng cặp mơi T7- F/ Pu - R1, ĐC 2: sản phẩm PCR chạy bằng cặp mỗi Pƒu
—FI/T7- R, ĐC 3: âm tính PCR, ĐC M: DNA marker D
Từ hình ảnh điện di trên cho thấy ở ĐC 1 va 2 đều xuất hiện băng kích thước khoảng 1,3 — 1,4 kb Băng này tương ứng với kích thước của sản phẩm khi chạy bằng cặp
mỗi T7- E/ P¿ - R1 là gần 1,3 kb và cặp mỗi Pfu — F1/T7- R là gần 1,4 kb Điều đĩ cĩ thể
khẳng định plasmid chúng tơi tách chiết cĩ mang gen mã hĩa cho Pfu DNA pol Dé khang định plasmid cĩ mang chính xác gen mã hĩa hay khơng cũng như xác định trình tự của
đoạn gen trên, chúng tơi tiến hành xác định trình tự đoạn gen mã hĩa trên
Xác định trình tự đoạn gen mã hĩa Pu DNA pol từ vector pET11a
Từ plasmid tách chiết được ở trên chúng tơi đã tiến hành giải tình tự đoạn gen bằng
2 cặp mỗi T7-E/R và Pfu — F1/RI được thiết kế theo trình tự đoạn gen ma héa Pfu DNA
pol Két quả giải trình tự được thê hiện ở Hình 3.4