Marker chọn lọc sử dụng trong công nghệ tạo cây GM và các chiến lược cải tiến

Marker chọn lọc sử dụng công nghệ tạo GM chiến lược cải tiến GVHD: Khái quát nội dung Đặt vấn đề Hệ thống thị công nghệ sinh học Các nguy gặp phải sử dụng hệ thống marker Các chiến lược cải tiến hệ thống marker Kết luận Tài liệu tham khảo Đặt vấn đề - Hiện trồng biến đổi phát triển sử dụng rộng rãi giới Để tạo chuyển gen ta phải thực chuyển đoạn gen mà mong muốn vào thực vật - Vậy làm để biết gen cần chuyển chuyển vào thực vật hay chưa? - Để giải vấn đề ta cần sử dụng hệ thống thị sinh học gọi marker - Vậy marker gì, nguy mà ta gặp phải sử dụng hệ thống marker đề phương pháp cải tiến hệ thống marker Hệ thống thị công nghệ sinh học * Khái niệm: Chỉ thị sinh học (marker) đoạn gene mã hóa cho đặc điểm dễ dàng nhận diện sử dụng để xác định xem đoạn gen mà cần chuyển vào thành công hay chưa Marker chọn lọc (hay lựa chọn - selectable marker gene) Các gen chọn lọc thường có tính trội, thường có nguồn gốc từ vi khuẩn hoạt động chúng kiểm soát promoter kiểu Eukaryote - Các gen chọn lọc bảo vệ thể khỏi nhân tố chọn lọc mà thông thường giết ngăn chặn phát triển - Thuốc kháng sinh nhân tố chọn lọc phổ biến nhất, số nhân tố chọn lọc: + Kanamycin + Manose + Hygromycin + Ampicilin + Basta + Tetracycline PBR 322 có gen kháng kháng sinh Ampiciline Tetracycline Plasmid có gốc tái hoạt động E.coli Khi nuôi cấy môi trường chọn lọc chứa ampicillin tetracycline mô hay tế bào có chứa plasmid sống mô, tế bào ko chứa plasmid chết CÁC GEN CHỌN LỌC PHỔ BIẾN Các gen kháng kháng sinh kanamycin (neomycin phosphotransferase-nptII); hygromycin (hygromycin phosphostransferase-hpt); streptomycin (streptomycin phosphotransferaza), Các gen kháng chất diệt cỏ glyphosate, bialaphos : gen bar có nguồn gốc vi khuẩn mã hoá cho enzyme làm bất hoạt BASTA phosphinothricin acetyltransferaza (PAT) Các gen khác (gen pmi–phosphate manose isomerase- chuyển hoá manose thành glucose Nhờ vậy, sống môi trường glucose (manose nhân tố chọn lọc) Một số gen thị liệt kê thông báo kiểm tra thực địa Mỹ phép phát hành năm 2001 2002 Enzyme Số lượng hồ sơ năm 2001 2002 Neomycin phosphotransferase II (NPTII) 949 Hygromycin B phosphotransferase (hpt) 65 Phosphinothricin N-acetyltransferase (PAT) 327 5-Enolpyruvylshikimate-3-phosphate synthase (EPSP) 507 Acetolactate synthase or acetohydroxyacid synthase Nitrilase Cyanamide hydratase Glucuronidase (GUS) 91 Luciferase Green fluorescent protein (GFP) 20 (Trích xuất liệu từ ISB, 2003) Các nguy gặp phải sử dụng hệ thống marker - Gây đa dạng sinh học: làm tăng khả gây độc trồng biến đổi gen với sinh vật mục tiêu, ảnh hưởng xấu đến môi trường - Tạo loài cỏ kháng thuốc trừ cỏ; tăng tính kháng loài sâu - Ảnh hưởng xấu tới sức khỏe người vật nuôi: gây độc; gây dị ứng; tăng tính kháng kháng sinh vi khuẩn đường ruột * Đối với người: Marker mã hóa cho chất kháng thuốc trừ cỏ, kháng kháng sinh nhiều chất khác,… chất vào thể gây độc, gây bệnh nguy hiểm gây dị ứng sốc phản vệ L-tryptophan: Thực phẩm biến đổi gen bổ sung chất gây 37 trường hợp tử vong 1500 trường hợp tàn tật Mỹ chất độc không xác định Công ty sản xuất bồi thường tỷ USD cho 2000 nạn nhân Điều dự đoán trước gây hại cho người khuyến cáo dùng cho chăn nuôi => Vậy người ăn động vật sử dụng sản phẩm có bị dị ứng? Thực phẩm bình thường gây dị ứng việc dị ứng tùy thuộc vào địa người Vì khó để xác định có bị dị ứng ăn động vật sử dụng sản phẩm GMO Tuy nhiên gần đây, nghiên cứu độc lập nhà khoa học Nga thí nghiệm chuột ăn đậu tương biến đổi gen khả sinh sản Kết luận phù hợp với kết đồng nghiệp Pháp Áo - Tính kháng: Một số nhà nghiên cứu cho marker kháng kháng sinh thực phẩm GMO bất ngờ tái hợp với vi khuẩn gây bệnh ruột động vật Có thể xảy trình chuyển gen ngang từ thực vật sang động vật gây biến đổi hệ gen người Dẫn chứng cụ thể Nghiên cứu Đại học Newcastle chuyển nạp gen: Kết cho thấy ăn thực phẩm chứa đậu nành biến đổi gen có tượng gen chuyển nạp thoát chuyển nạp vào vi khuẩn đường ruột Các nhà nghiên cứu Đức tìm thấy vi khuẩn kháng kháng sinh ruột ong ăn phấn hoa cải dầu chuyển gen => Hậu : số bệnh nhiễm trùng chữa trị thuốc kháng sinh truyền thống Ví dụ vi khuẩn Clostridium difficile (C difficile), E.coli… Các yếu tố cho thấy nguy thấp: + Gen kháng kháng sinh dùng thực vật chuyển gen lấy từ plasmid vi khuẩn có sẵn tự nhiên tự tổng hợp phòng thí nghiệm Chẳng hạn gen NptII kháng kanamycin phát năm 1979 từ chủng vi khuẩn E coli => Xét cách tổng thể, nguy phân tán gen gen kháng kháng sinh từ thực vật biến đổi gen sang vi sinh vật khác thấp * Đối với môi trường: Các gen kháng thuốc trừ cỏ chuyển vào trồng chuyển sang loài họ hàng hoang dại chúng, tạo loài siêu cỏ dại Ví dụ: Cải dầu bị biến đổi gen Khi trồng chuyển gen kháng sâu, loài sâu có khả kháng gen sống sót di truyền cho hệ sau làm tăng khả kháng sâu bệnh với chuyển gen Các nhà khoa học dịch hại thực vật phổ biến sâu đục bông, sống áp lực liên tục từ trồng chuyển gen, sớm phát triển thành siêu sâu hoàn toàn miễn dịch với thuốc trừ sâu Bt * Đối với đa dạng sinh học: Khả gây độc trồng biến đổi gen với sinh vật mục tiêu Năm 1999, nhà nghiên cứu Đại học Cornell phát đáng ngạc nhiên phấn hoa từ ngô chuyển gen Bt gây độc hại cho loài bướm chúa Nghiên cứu khác cho thấy trồng GMO ảnh hưởng xấu đến số côn trùng có ích, bao gồm bọ rùa, vi sinh vật đất có lợi, ong, loài chim Các chiến lược cải tiến hệ thống marker - Sử dụng hệ thống marker chọn lọc nguy cơ, để thay hệ thống marker cũ ẩn chứa nhiều nguy - Loại bỏ marker chọn lọc khỏi gen thực vật - Chuyển gen vào lục lạp * Hệ thống marker chọn lọc mới: • Phát triển hệ thống thị phân tử DNA • Hệ thống lựa chọn tích cực • Sử dụng gen thị chọn lọc liên quan đến khả chống chịu - Phát triển hệ thống thị phân tử DNA Sử dụng cặp mồi để nhân đoạn gen đặc trưng liên kết chặt chẽ với gen muốn đưa vào: SSR, MAS, RAP, PCR… - Hệ thống lựa chọn tích cực Một số marker lựa chọn tích cực cho phép việc xác định lựa chọn biến đổi gen tế bào mà không gây tổn thương hay gây chết cho tế bào Ví dụ: Gen GUS gen mã hóa β-glucuronidase (tức là, GUS protein) vi khuẩn E.coli Các gen GUS thường sử dụng marker chọn lọc cho GMO β-glucuronidase gây thay đổi màu sắc, môi trường nuôi cấy có chất X-gluc (không màu), enzyme cắt X-gluc thành X (xanh) gluc - Sử dụng gen thị chọn lọc liên quan đến khả chống chịu Được biết đến gen mã hóa protein khác để bảo vệ trồng thời điểm áp lực môi trường lớn hạn hán, stress muối stress oxi hóa Ví dụ: gen ESKIMO1 có khả giúp trồng chịu lạnh muối Sử dụng gen làm marker môi trường chọn lọc môi trường có hàm lượng muối cao *Loại bỏ gen chọn lọc: • • • • • • Co-transformation (hệ thống đồng biến nạp ) Transposon -based marker methods (hệ thống yếu tố chuyển vị) Multi-autotransformation (MAT) Site-specific recombination (Tái tổ hợp tương đồng) Chemical-inducible system (Hệ thống hóa chất cảm ứng ) Heat-inducible system (Hệ thống cảm ứng nhiệt) - Co-transformation (hệ thống đồng biến nạp ) Sử dụng chế phân ly di truyền để loại bỏ marker chọn lọc khỏi hệ gen thực vật Khi vi khuẩn Agrobacterium xâm nhập vào cây, T-DNA tích hợp vào hệ gen thực vật Vị trí chèn T-DNA vào hệ gen ngẫu nhiên nên có khả T-DNA chèn vào vị trí không liên kết với Qua trình giảm phân, T-DNA phân ly tách tạo dòng chứa T-DNA - Multi-autotransformation (MAT) Hệ thống vector MAT thiết kế gồm gen cần chuyển, gen gây ung thư (ipt, iaaM / H, rol), hệ thống tái tổ hợp cụ thể (R / RS) phần cần thiết Khi vi khuẩn Agrobacterium xâm nhập vào cây, T-DNA tích hợp vào hệ gen thực vật Gen gây ung thư tái sinh chuyển gen sau loại bỏ hệ thống R/RS để tạo chuyển gen marker - Transposon -based marker methods (hệ thống yếu tố chuyển vị) Các transposon trình tự di động, có khả tách di chuyển đến vị trí khác genome Do đó, hệ thống sử dụng việc tách gen marker khỏi vị trí liên kết với gen mục tiêu Các transposon cảm ứng chất cảm ứng, có mặt chất transposon tách di chuyển đến vị trí khác genome Trong phương pháp này, gen marker đặt yếu tố di động transposon, có mặt chất cảm ứng, transposon tách di chuyển đến vị trí khác, làm cho gen marker gen mục tiêu không liên kết với Qua di truyền, gen biểu hệ sau cách riêng rẽ chọn thể mang gen mục tiêu - Site-specific recombination (Tái tổ hợp tương đồng) Hệ thống vector thiết kế gồm gen cần chuyển, marker chọn lọc, hệ thống tái tổ hợp cụ thể (R / RS) phần cần thiết Khi vi khuẩn Agrobacterium xâm nhập vào cây, T-DNA tích hợp vào hệ gen thực vật Khi cảm ứng, gen R hoạt động tạo RE cắt vị trí RS, đầu marker có trình tự bổ sung nên gắn vào với tách khỏi gen thực vật - Heat-inducible system (Hệ thống cảm ứng nhiệt) - Chemical-inducible system (Hệ thống hóa chất cảm ứng ) Ví dụ chuyển gen Cry1Ac vào cà cách sử dụng hệ thống tái tổ hợp quy định mặt hóa học Cre / LOX Khi cảm ứng 2μM β-estradiol, gen marker npt II bị loại bỏ * Chuyển gene vào lục lạp: - Là kĩ thuật cho phép biểu gene lục lạp - Chuyển nạp gen HIV-1 p24 vào lạp thể cà chua với gen chọn lọc aadA kháng spectinomycin streptomycin thực cách bắn gien vào thật mầm - Kĩ thuật có nhiều ưu điểm số lượng copy gene lớn, biểu gene chuyển mức cao, dễ dàng kiểm soát biểu gene theo cấu trúc operon, nâng cao tính an toàn sinh học… - Hạt phấn đa số thực vật có hoa không chứa DNA lục nạp lục nạp di truyền theo dòng mẹ giải vấn đề phát tán gen chuyển thông qua hạt phấn Kết luận - Marker chọn lọc thành phần thiếu vecter công nghệ tạo GMO - Tuy nhiên hệ thống marker có nhiều nguy gây hại tới sức khỏe người, sinh vật, môi trường… hệ thống marker thị gen kháng kháng sinh - Không sử dụng gen marker có tính kháng kháng sinh phổ biến - Sử dụng hệ thống thị phân tử DNA chuyển gen lục lạp tạo trồng chuyển gen mang lại hiệu cao Tài liệu tham khảo Nguyễn Thị Phương Thảo, Nguyễn Thị Thùy Linh Cây trồng công nghệ sinh học Charles P Scutt, Elena Zubko, Peter Meyer Techniques for the removal of marker genes from transgenic plants 24 October 2002 3.https://www.o.facebook.com/l.php?u=https%3A%2F%2Fwww.academia.edu %2F5824557%2FRisk_of_selectable_markers_and_recent_methods_to_reduce_th ese_risk&h=wAQHy_Nus 4.http://www.o.facebook.com/l.php?u=http%3A%2F%2Fwww.ccmb.res.in %2Fstaff%2FAggarwal%2Fpap_36.pdf&h=wAQHy_NUs Một số câu hỏi câu trả lời - Có phải tất sử dụng marker chống chịu lạnh chịu muối không? Trả lời: Tất sử dụng marker để làm thị miễn chuyển gen vào hệ gen thực vật - Quan điểm nhóm có lên sử dụng marker chuyển gen hay không? Trả lời: Lên sử dụng marker thị chuyển gen không sử dụng marker thị xác định gen cần chuyển chuyển vào thực vật hay chưa - Sản phẩm chuyển gen dùng marer có lên sử dụng hay không? Trả lời: Chúng ta không lên đặt câu hỏi có lên sử dụng hay không lên sử dụng chuyển gen có chứa marker, mà ta phải quản lý việc sử dụng sản phẩm Vì sản phẩm biến đổi gen người sử dụng làm thực phẩm hàng ngày đậu tương chuyển gen, đậu tương chắn có sử dụng marker thị dù ta có muốn hay không muốn ta phải sử dụng  ... thống thị công nghệ sinh học Các nguy gặp phải sử dụng hệ thống marker Các chiến lược cải tiến hệ thống marker Kết luận Tài liệu tham khảo Đặt vấn đề - Hiện trồng biến đổi phát triển sử dụng rộng... đặc điểm dễ dàng nhận diện sử dụng để xác định xem đoạn gen mà cần chuyển vào thành công hay chưa Marker chọn lọc (hay lựa chọn - selectable marker gene) Các gen chọn lọc thường có tính trội, thường... thấy trồng GMO ảnh hưởng xấu đến số côn trùng có ích, bao gồm bọ rùa, vi sinh vật đất có lợi, ong, loài chim Các chiến lược cải tiến hệ thống marker - Sử dụng hệ thống marker chọn lọc nguy cơ,