Các Enzyme và Vector sử dụng trong công nghệ gen
Kỹ thuật chuyển gen vào thực vật CONCEPTS ONBIOTECHNOLOGYPh¬ng ph¸p t¹o gièng Khái niệmKỹ thuật chuyển gen vào thực vật là kỹ thuật đưa một hay nhiều gen lạ đã được thiết kế ở dạng ADN tái tổ hợp vào tế bào làm cho gen lạ gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein/enzyme đặc trưng dẫn tới việc xuất hiện các đặc tính mới của cơ thể chuyển gen. 1. Các phương pháp chuyển gen vào thực vật•Trực tiếp: súng bắn gen, vi tiêm, xung điện, siêu âm, hóa chất. • Gián tiếp: chuyển gen thông qua sinh vật trung gian (Virus hoặc vi khuẩn).1.1. Giới thiệu về vi khuẩn A. tumefaciens- Là một loài vi khuẩn đất thuộc nhóm vk Gram âm- Có chứa 1 loại plasmid đặc biệt gọi là Ti-plasmid khi chuyển vào thực vật sẽ gây bệnh khối u (crown gall) hay hình thành lông rễ (hairy roots)- Chủng Agrobacterium tumefaciens và A. rhizogenes được sử dụng trong chuyển gen vào thực vật. Agrobacterium tumefaciensCrown Gall Disease Ti-plasmid (tumor-inducing plasmid). Ti-Plasmid có kích thước khoảng 200kb đã được xác định trình tự, gồm có 3 vùng cơ bản trong vận chuyển ADN và cảm ứng hình thành khối u là T-DNA, các bờ T-DNA và vùng Vir. [...]... các dòng cây chuyển gen - Đánh giá các dòng cây chuyển gen (biotest) trong phòng cách ly - Giới thiệu vật liệu chuyển gen. / 1.5 Phương pháp chuyển gen trực tiếp vào thực vật •Phương pháp chuyển gen bằng súng bắn gen: là sử dụng những công cụ (súng bắn gen) có thể tạo được áp lực trong không khí đẩy được các viên đạn (bằng kim loại trơ, đường kính khoảng 1µm) có phủ các vector chuyển gen đi với tốc độ... quan các lớp tế bào bên ngoài của mô và xâm nhập vào các tế bào bên trong gặp nhân và gắn vào nhiễm sắc thể của tế bào Chọn lọc tế bào mang gen và tái sinh thành cây chuyển gen Phương pháp “bắn gen DNA Các hạt Gen quan tâm Nhiễm sắc thể thực vật + Ưu điểm: - Có thể áp dụng với hầu hết các loại mô, tế bào - Quá trình chuyển gen nhanh, đơn giản về mặt kỹ thuật - Có thể xử lý một lượng mẫu lớn trong. .. quả tạo ra vector liên hợp được sử dụng chuyển gen vào thực vật Plasmid này khá phức tạp nên ít được sử dụng - Vetor nhị thể (Binary vector) : là hệ thống dùng 2 plasmid riêng biệt: - Plasmid 1: Có nguồn gốc từ E coli nhưng được thiết kế lại: + Thêm gốc tái bản trong A tumefaciens + Gắn các gen mục tiêu, promoter, gen chỉ thị nằm giữa LB, RB - Plasmid 2: là Ti-plasmid được cắt bỏ toàn bộ các phần LB,... bộ các phần LB, RB, T-DNA, gen mã hóa enzyme sử dụng opine nhưng vẫn giữ lại góc tái bản trong A tumefaciens, vùng gen Vir Chuyển cả plasmid 1 và plasmid 2 vào tế bào vi khuẩn A tumefaciens Binary vector system Co-integrative and binary vectors LB RB Co-integrative Binary vector 1.4 Qui trình chuyển gen nhờ vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens - Tạo cây in vitro - Cắt tạo các đĩa lá nhằm tạo vết thương... tái sinh của cây trong qúa trình nuôi cấy Nó còn chứa các gen điều khiển tổng hợp opine sử dụng các nguyên liệu của cây ảnh hưởng đến năng suất - Ti-plasmid không mang gen chỉ thị (reporter, seletion genes) nên khó chọn lọc cây chuyển gen - Các điểm cắt của RE nằm rải rác nên khó thao tác Do đó, cần thiết kế lại Ti-plasmid tự nhiên để đáp ứng tiêu chuẩn cần thiết của một vector chuyển gen thực vật Quá... tạo vết thương cho mô thực vật - Ngâm đĩa lá trong dung dịch có chứa vi khuẩn A.tumefaciens mang hệ thống vector chuyển gen trong vài phút đến vài chục phút Trong dung dịch có bổ sung acetosyringone - Nuôi cấy trên môi trường đồng nuôi cấy Cho thêm thời gian để vi khuẩn A tumefaciens sống và chuyển gen vào tế bào lá trong thời gian 2-5 ngày - Lấy mẫu ra và diệt khuẩn A tumefaciens bằng dung dịch kháng... vector chuyển gen thực vật Quá trình thiết kế vector này như sau: * Nguyên lý chung: - Giữ lại các gen Vir cần thiết cho quá trình vận chuyển T-DNA gắn vào NST tế bào thực vật - Giữ lại vùng bờ trái (LB), bờ phải (RB) và thay thế các gen cần thiết vào vùng T-DNA •Có 2 loại hệ thống vector chuyển gen vi khuẩn A tumefaciens: - Vector đồng liên hợp (co-integrated vector) * Dựa trên sự tái tổ hợp của 2 loại... chế chuyển gen tự nhiên vào thực vật của vi khuẩn A tumefaciens 1.3 Thiết kết vector chuyển gen nhờ vi khuẩn A tumefaciens Vector Ti-plasmid tự nhiên của vi khuẩn A tumefaciens có một số hạn chế trong khi chuyển gen vào thực vật vì: - Ti-plasmid có kích thước lớn (200-800 kb) - Ti-plasmid không tự tái bản trong E coli - Đoạn T-DNA của Ti-plasmid mang các gen điều khiển sinh tổng hợp auxin và cytokinin... vật còn khó khăn •Chuyển gen bằng phương pháp vi tiêm (micoinjection): Sử dụng các thiết bị hiển vi, vi thao tác Sử dụng các kim tiêm rất mảnh để đưa các đoạn ADN trực tiếp vào nhân của tế bào trần, tế bào tiền phôi của hợp tử hay hạt phấn + Ưu điểm: - Lượng ADN được biến nạp tuỳ ý và xác định - ADN được đưa đúng vị trí mong muốn, thậm chí nhân tế bào - Có thể áp dụng đối với các tế bào có kích thước... tới các mô đó, là chất hoạt hoá nhóm gen vir (gồm 6-9 đơn vị sao mã) điều khiển sinh tổng hợp các sản phẩm (protein /enzyme) Các protein/enyme có các chức năng sau: + Cắt vùng bờ trái, bờ phải (T-DNA) giải phóng sợi đơn T-DNA + Bảo vệ sợi đơn T-DNA vừa cắt + Vận chuyển sợi đơn T-DNA xâm nhập TBTV và gắn vào NST (hệ gen) Do trên đoạn T-DNA chứa một số gen mã hoá sinh tổng hợp phytohormone (auxin và cytokinin) . tái tổ hợp vào tế bào làm cho gen lạ gắn vào bộ gen tế bào chủ. Trong tế bào chủ, các gen này hoạt động tổng hợp nên các protein /enzyme đặc. (RB) và thay thế các gen cần thiết vào vùng T-DNA. •Có 2 loại hệ thống vector chuyển gen vi khuẩn A. tumefaciens:- Vector đồng liên hợp (co-integrated vector) *