Tổng quan về enzyme ngoại bào Bacillus subtilis 04- nội dung đề tài

Tổng quan về enzyme ngoại bào Bacillus subtilis

LỜI MỞ ĐẦU

I Đặt vấn đề

Enzyme đã được sử dụng từ rất lâu Khoảng 5.000 năm trước công nguyên ở Jerico, người ta đã biết đến kỹ thuật làm bánh mì Trong thành cổ Babylon, nấu rượu vang, sản xuất dấm, tương, chao… ở các mức độ khác nhau,

là những quá trình sinh học xưa nhất trong lịch sử phát triển văn minh nhân loại

Ngày nay, cùng với sự phát triển mạnh mẽ của Công nghệ sinh học, các chế phẩm enzyme được sản xuất ngày càng nhiều và được sử dụng trong hầu hết trong các lĩnh vực như: chế biến thực phẩm, nông nghiệp, chăn nuôi, y tế… Hàng năm khối lượng enzyme được sản xuất trên thế giới đạt khoảng trên 300.000 tấn với giá trị trên 500 triệu USD, được phân phối trong các lĩnh vực khác nhau

Phần lớn enzyme được sản xuất ở quy mô công nghiệp đều thuộc loại enzyme đơn cấu tử, xúc tác cho phản ứng phân hủy Khoảng 75% chế phẩm là enzyme thủy phân được sử dụng cho việc thủy phân cơ chất tự nhiên

Qua nhiều năm, việc sử dụng vi sinh vật một nguồn cung cấp enzyme đã cải thiện đáng kể hiệu quả sản xuất, các sản phẩm được tạo ra nhiều hơn giá thành giảm, chất lượng sản phẩm tăng lên đáng kể, làm giảm tác động xấu tới môi trường

II Lý do chọn đề tài

Trong các loài vi sinh vật được sử dụng làm nguồn cung cấp enzyme, vi

khuẩn Bacillus subtilis là một ví dụ điển hình được các nhà khoa học nghiên cứu

nhiều Các enzyme ngoại bào của vi khuẩn này đã được đưa vào sản xuất và ứng dụng rộng rãi ở qui mô công nghiệp vì chúng có các đặc tính hơn hẳn và khả năng sinh tổng hợp các enzyme rất mạnh so với các enzyme ngoại bào của những

vi sinh vật khác

Ở nước ta, việc nghiên cứu và ứng dụng các chế phẩm enzyme ngoại bào

từ Bacillus subtilis đã được tiến hành ở một số cơ sở nghiên cứu, các nhà máy

sản xuất ở qui mô công nghiệp và đóng góp một phần lợi ích vào nền kinh tế quốc dân

III Mục đích của đề tài

Để tìm hiểu về một số vấn đề như:

• Tổng quan về enzyme ngoại bào của vi sinh vật

• Các enzyme ngoại bào của vi khuẩn Bacillus subtilis

• Các điều kiện hoạt động của enzyme ngoại bào và quá trình sinh tổng hợp các enzyme này ở vi sinh vật

• Qui trình tách chiết các enzyme ngoại bào của Bacillus subtilis

• Khả năng ứng dụng chúng vào đời sống cũng như sản xuất ở qui

mô công nghiệp

Đó là những cơ sở và tính cấp thiết mà tôi tiến hành đề tài nghiên cứu:

“Tổng quan về enzyme ngoại bào Bacillus subtilis”

IV Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

Đối tượng nghiên cứu: là vi khuẩn Bacillus subtilis

Phạm vi nghiên cứu: nghiên cứu tổng quan về enzyme ngoại bào của

Bacillus subtilis

V Phương pháp nghiên cứu

Đọc tài liệu tham khảo các nghiên cứu trong nước và ngoài nước về vi

khuẩn Bacillus subtilis

Tổng hợp, phân tích các công trình nghiên cứu, các tài liệu khoa học về vi

khuẩn Bacillus subtilis và một số enzyme ngoại bào của vi khuẩn này nhằm giải

quyết các mục đích đề ra

Đua ra kết luận và kiến nghị sau quá trình thực hiện đề tài

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ ENZYME

NGOẠI BÀO CỦA VI SINH VẬT

1.1 Khái niệm enzyme ngoại bào

1.1.1 Định nghĩa

Enzyme ngoại bào (exoenzyme) là những enzyme được vi sinh vật sinh tổng hợp sau đó tiết ra ngoài tế bào và tham gia vào quá trình thủy phân (dị hóa) các hợp chất hữu cơ bên ngoài môi trường xung quanh (Nguyễn Đức Lượng, 2004)

Các quá trình dị hóa ngoài tế bào chủ yếu là cung cấp nguyên liệu cho quá trình sinh tổng hợp của tế bào Vì thực tế bên ngoài môi trường xung quanh, các hợp chất làm nguồn dinh dưỡng cho vi sinh vật tồn tại và phát triển là các hợp chất cao phân tử không thể vận chuyển qua màng tế bào nên cần có các enzyme để xúc tác các phản ứng dị hóa các hợp chất cao phân tử này thành các hợp chất có phân tử lượng thấp hơn có thể đi qua màng tế bào Các enzyme được tổng hợp và tham gia các phản ứng ngoài tế bào có những đặc điểm rất riêng chỉ

có ở vi sinh vật

1.1.2 Phân loại

Từ năm 1961, Hội Hóa Sinh quốc tế lần thứ 5 đã thống nhất phân loại các enzyme thành 6 nhóm chính, trong mỗi nhóm còn có các nhóm phụ, phân nhóm phụ:

• Nhóm 1: Oxydroreductase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng oxy hóa khử

• Nhóm 2: Transpherase là nhóm các enzyme xúc tác cho phản ứng chuyển vị

• Nhóm 3: Hydrolase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng thủy phân (sự phân giải có mặt của H2O tham gia)

• Nhóm 4: Lyase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng cắt đứt liên kết tạo thành 2 phân tử nhưng không cần H2O tham gia; hoặc loại H2O tạo thành nối đôi hoặc kết hợp phân tử H2O vào nối đôi

• Nhóm 5: Isomerase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng đồng phân hóa

• Nhóm 6: Lygase là nhóm enzyme xúc tác cho phản ứng xúc tác cho phản ứng kết hợp hai phân tử kèm theo cắt đứt liên kết giàu năng lượng của ATP hoặc các nucleoside triphosphate khác

Trong đó, các enzyme ngoại bào của vi sinh vật phần lớn là các enzyme thuộc nhóm enzyme thủy phân hydrolase

Phương trình phản ứng: R1 – R2 +H2O R1OH + R2H

Ví dụ: Tinh bột + H2O Dextrin + Maltose + Glucose Các enzyme ngoại bào của vi sinh vật gồm các loại phổ biến như enzyme: amylase, cellulase, protease và pectinase…

• Vì có bản chất là protein, enzyme cũng có tính chất lưỡng tính (do

có nhóm -COOH và -NH2 trong cấu tạo phân tử) Trong môi trường kiềm và acid chúng sẽ bị phân ly như sau:

Protein -COOH Protein -COO- + H+

Protein -NH2 Protein -NH+ + H+

α-amylase

Kiềm Acid Acid Kiềm

• Enzyme tan được trong nước tạo thành dung dịch dạng keo và chúng cũng tan trong dung dịch muối loãng, glycerin và các dung môi hữu cơ hữu cực khác Khi hòa tan enzyme vào nước, các phân tử lưỡng cực nước sẽ kết hợp với các ion, các nhóm ion hoặc các nhóm phân cực trong phân tử enzyme tạo thành lớp vỏ hydrate Lượng nước hydrate hóa khá lớn và có vai trò quan trọng trong các phản ứng sinh hóa

• Enzyme không bền và dễ dàng bị biến tính dưới tác dụng của nhiệt

độ cao Enzyme bị biến tính thì mất khả năng xúc tác Mức độ giảm hoạt tính của enzyme tương ứng với mức độ biến tính của protein trong chế phẩm Kiềm, acid mạnh và kim loại nặng cũng làm cho enzyme biến tính Tuy nhiên, có nhiều loại enzyme có thể chịu được nhiệt độ cao đến 110oC như: α-amylase từ vi khuẩn ưa

nhiệt Bacillus amyloliquefciens và Bacillus lichenniformis có thể chịu được nhiệt

độ 110oC Enzyme ngoại bào từ vi sinh vật ngoài khả năng chịu nhiệt tốt còn có khả năng chịu được các ngưỡng pH khác nhau như pH acid, pH trung tính và pH kiềm Ví dụ: protease acid, protease kiềm và protease trung tính thu nhận từ vi

khuẩn Bacillus; Aspergillus niger sinh tổng hợp α-amylase chịu được pH acid

2,1…

• Enzyme có trung tâm hoạt động chỉ chiếm một tỷ lệ thể tích tương đối nhỏ trong phân tử, nằm trong túi hoặc khe, ở gần hoặc trên phân tử enzyme Trong trung tâm hoạt động của enzyme ngoại bào hầu như không có coenzyme (trừ enzyme lipase là enzyme hai cấu tử) như enzyme amylase, protease, cellulase, pectinase và hemicellulase… nhưng chúng cũng cần có các ion kim loại để ổn định khả năng xúc tác như α-amylase có chứa ion Ca2+

• Là những enzyme chuyên biệt hóa cao có khả năng xúc tác với độ đặc hiệu với cơ chất

• Quá trình tổng hợp và phân hủy của các enzyme này tuân theo qui luật cảm ứng cơ chất Quá trình này xảy ra trong trường hợp cơ chất có kích thước lớn hơn kích thước của thành và màng nguyên sinh chất Muốn sử dụng được những chất này, vi sinh vật phải phân hủy chúng thành cơ chất có kích thước nhỏ hơn để có thể xâm nhập vào trong tế bào thông qua thành và màng tế

hợp một lượng enzyme lớn hơn gấp nhiều lần so với mức bình thường khi không

có cơ chất để phân hủy cơ chất đó Enzyme được sinh tổng hợp trong trường hợp này gọi là enzyme cảm ứng Những chất được đưa vào môi trường, kích thích và thúc đẩy nhanh quá trình sinh tổng hợp ra enzyme cảm ứng để phân hủy chúng được gọi là cơ chất cảm ứng

• Là những enzyme cảm ứng với cơ chất nên quá trình tổng hợp enzyme rất phức tạp và được kiểm soát chặt chẽ Cơ chất cảm ứng thường được coi là yếu tố rất quan trọng dùng để điều khiển quá trình sinh tổng hợp enzyme Khi cho cơ chất với lượng tăng dần thì khả năng tổng hợp enzyme cảm ứng cũng tăng dần Nếu tiếp tục tăng dần lượng cơ chất thì đến một mức độ nào đó quá trình này sẽ chậm lại và thậm chí sẽ giảm do hiện tượng tăng áp suất thẩm thấu

cơ chất gây ra Như vậy, muốn điều khiển và kiểm soát quá trình này cần phải chú ý hai điểm:

− Thứ nhất, muốn vi sinh vật sinh tổng hợp enzyme cảm ứng nào

đó thì phải cho cơ chất mà enzyme đó có thể phân hủy vào môi trường, ví dụ: sinh tổng hợp amylase thì bổ sung vào môi trường tinh bột; protease thì bổ sung protein; pectinase thì bổ sung pectin và cellulase thì bổ sung cellulose…

− Thứ hai, tác động cảm ứng đạt hiệu quả cao chỉ ở một liều lượng nhất định nào đó Vượt quá liều lượng này, khả năng sinh tổng hợp sẽ giảm Do đó, không phải càng cho nhiều cơ chất, khả năng sinh tổng hợp càng cao

• Enzyme có thể tham gia xúc tác các phản ứng trong và ngoài cơ thể

từ giai đoạn đầu đến giai đoạn giải phóng hoàn toàn năng lượng dự trữ trong các hợp chất hóa học Quá trình này được thực hiện theo chuỗi phản ứng, mỗi chuỗi phản ứng được xúc tác bởi một loại enzyme và cuối cùng tạo thành CO2, H2O, một số chất khác và giải phóng năng lượng Trong mỗi chuỗi phản ứng, sản phẩm của phản ứng trước là cơ chất cho phản ứng sau

• Enzyme có thể thực hiện một số phản ứng, các phản ứng này xảy ra

ở ngoài tế bào

• Phản ứng enzyme là phản ứng tiêu hao năng lượng rất ít Trong khi

đó, các phản ứng hóa học được xúc tác bởi các chất xúc tác hóa học thường đòi hỏi năng lượng rất lớn

Ví dụ: Trong quá trình thủy phân sucrose thành fructose và glucose

− Khi không có xúc tác: năng lượng hoạt hóa là 32.000 cal/phân

tử gam

− Khi xúc tác là acid: năng lượng hoạt hóa là 25.000 cal/phân tử gam

Phương trình phản ứng: Sucrose Fructose + Glucose

− Khi xúc tác là enzyme saccharase: năng lượng hoạt hóa là 9.000 cal/phân tử gam

Phương trình phản ứng: Sucrose Fructose + Glucose

• Enzyme chịu sự điều khiển bởi gen và các điều kiện phản ứng Gen quyết định việc tổng hợp ra một loại enzyme Mỗi một enzyme quyết định một hoặc một số phản ứng sinh hóa

• Enzyme không tham gia vào thành phần của sản phẩm sau phản ứng

• Chỉ làm tăng nhanh phản ứng mà các phản ứng này có thể xảy ra ở điều kiện không có enzyme

• Không làm mất vị trí cân bằng của phản ứng mà chỉ làm tăng tốc

độ của phản ứng

• Có nhiều ưu điểm hơn so với các enzyme thu nhận từ tế bào động vật và thực vật như: sản xuất và thu nhận dễ dàng, trên môi trường lên men rẻ tiền, năng suất sinh học cao, cải biến bằng công nghệ gen dễ, thành phần enzyme

dễ dàng dự đoán và kiểm soát, không chứa các chất độc gây hại cho người như chất phenolic từ thực vật và các chất nội sinh gây ức chế protease ở động vật, giá thành các chế phẩm enzyme ngoại bào từ vi sinh vật rẻ hơn nhiều so với các chế phẩm enzyme của động vật và thực vật Đặc điểm rất dễ nhận thấy ở giới động

SaccharaseAcid

như từ malt có thể thu nhận enzyme amylase, dứa (khóm, thơm) thu nhận enzyme bromelin, đu đủ thu nhận enzyme papain, trong khi enzyme ngoại bào từ

vi sinh vật thì ngược lại; từ một loài vi sinh vật có thể thu nhận nhiều enzyme vì

số lượng enzyme vi sinh vật rất phong phú và đa dạng Tốc độ sinh sản của vi sinh vật rất mạnh do đó chỉ trong thời gian ngắn có thể thu nhận một khối lượng enzyme rất lớn Chúng có hoạt tính rất cao và có khả năng chuyển hóa một khối lượng vật chất rất lớn Nuôi cấy vi sinh vật không phụ thuộc vào điều kiện địa lý, thời tiết như nuôi, trồng động vật và thực vật Có thể sản xuất theo qui mô công nghiệp và kiểm soát được quá trình sản xuất

1.2 Một số enzyme ngoại bào của vi sinh vật

Nguồn enzyme ngoại bào của vi sinh vật vô cùng phong phú và đa dạng Sau đây là một số loại enzyme quan trọng của vi sinh vật được nghiên cứu và ứng dụng rộng rãi trong đời sống và sản xuất công nghiệp

Endoamylase gồm có α-amylase và nhóm enzyme khử nhánh Nhóm

enzyme khử nhánh này được chia thành 2 loại: khử trực tiếp là Pullulanase dextrin 6-glucosidase); khử gián tiếp là oligo-1,6-glucosidase hay dextrinase tới

(α-hạn và transglucosidase Các enzyme này thủy phân các liên kết bên trong của chuỗi polysaccharide

Exoamylase gồm có β-amylase và glucoamylase (amyloglucosidase hay

γ-amylase) Đây là những enzyme thủy phân tinh bột từ đầu không khử của chuỗi polysaccharide

Amylase

1.2.1.1 Đặc tính và cơ chế xúc tác của enzyme α-amylase (1,4-α-glucan

α-amylase có ít methionine (Met) và có khoảng 7 - 10 gốc cysteine (Cys) Trọng lượng phân tử của α-amylase từ các nguồn khác nhau không giống nhau Trọng lượng phân tử của α-amylase có nguồn gốc từ thực vật khoảng 45.000 - 60.000 Da, trong khi α-amylase có nguồn gốc từ vi khuẩn 24.000 - 100.000 Da, từ nấm mốc: 45.000 - 50.000 Da (Knir, 1956; Fisher và Stein,

1960)

α-amylase có chứa các nhóm -COOH và NH3 trong trung tâm hoạt động

α-amylase kết tủa trong dung dịch (NH4)2SO4 25 - 30%, α-amylase dễ tan

trong nước, trong dung dịch muối và tan trong ethanol loãng nhưng kết tủa ở ethanol 60%

Protein của các α-amylase có tính acid yếu và có tính chất của globuline Điểm đẳng điện nằm trong vùng pH khoảng 4,2 - 5,7 (Bernfeld P, 1951)

Giá trị pH tối ưu của α-amylase phụ thuộc vào nguồn enzyme, thường là ở

vùng acid yếu, giữa 4,8 và 6,9 Tuy nhiên cũng có ngoại lệ, chẳng hạn như

α-amylase từ Bacillus acidocadarius có pH tối ưu là 3,5 còn của enzyme từ

Bacillus licheniformis lại có pH tối ưu là 9,0

Nhiệt độ tối ưu cũng tùy thuộc vào nguồn enzyme, thường vào khoảng 60 -70oC, nhưng cũng có thể tới 80 - 90oC đối với một số loại vi khuẩn chịu nhiệt

amylase là một metaloenzyme (enzyme cơ kim) Trong mỗi phân tử amylase đều có chứa 1 - 30 nguyên tử gam Ca/mol, nhưng không ít hơn 1 - 6

α-nguyên tử gam Ca/mol Ca2+ tham gia vào sự hình thành và ổn định cấu trúc bậc

3 của enzyme, duy trì hoạt động của enzyme (Modolova, 1965) Do đó, Ca2+ còn

có vai trò duy trì sự tồn tại và độ bền cực lớn của enzyme khi bị tác động bởi các

α-amylase bị loại bỏ hết Ca2+ thì nó sẽ hoàn toàn bị mất hết khả năng thủy phân

cơ chất Theo Wallerstein (1969), các ion Ca2+ có tác dụng ổn định hoạt tính của

α-amylase nhưng chỉ có tác dụng ở nồng độ thấp Với nồng độ ion Ca2+ 0,1 nguyên tử gam/lít sẽ có tác dụng làm giảm hằng số vận tốc vô hoạt K của malt đại mạch xuống 1500 lần trong điều kiện pH 4,0; còn đối với nấm mốc hằng số này chỉ giảm 13 lần Khi nồng độ tăng quá 0,3 nguyên tử gam/lít tác dụng giảm

rõ rệt α-amylase bền với nhiệt độ hơn các enzyme khác Người ta cho rằng đặc tính này của α-amylase có liên quan tới hàm lượng Ca2+ trong phân tử (α-amylase

của các vi khuẩn ưa nhiệt có chứa nhiều Ca2+ hơn nấm mốc khoảng 3 - 4 lần nên

nó bền nhiệt hơn) Tất cả các amylase đều bị kìm hãm bởi các kim loại nặng như

Cu2+, Ag+, Hg2+ và các ion thuộc nhóm halogen có tác dụng bất hoạt α-amylase theo thứ tự Cl - < Br - < F - < I - Một số kim loại như: Li+, Na+, Cr3+, Mn2+, Zn2+,

Co2+ và Sn2+ không ảnh hưởng lắm đến α-amylase

Hình 1.1 Cấu trúc không gian của α-amylase

Cơ chế tác dụng: α-amylase (1,4-α-glucan-glucanhydrolase) từ các nguồn khác nhau có nhiều điềm rất giống nhau α-amylase có khả năng phân cắt các liên kết α-1,4-glucoside nằm ở phía bên trong phân tử cơ chất (tinh bột hoặc glycogen) một cách ngẫu nhiên, không theo một trật tự nào cả α-amylase không

Giai đoạn dextrin hóa

Giai đoạn đường hóa

Phân cắt polyglucose tạo polyglucose collagen

Maltotetrose, maltotriose và maltose

chỉ thủy phân hồ tinh bột mà nó thủy phân cả hạt tinh bột nguyên thủy song với tốc đột rất chậm

Quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase là quá trình xảy ra qua nhiều giai đoạn:

Hình 1.2 Sơ đồ quá trình thủy phân tinh bột bởi α-amylase

• Ở giai đoạn đầu (giai đoạn dextrin hóa): chỉ một số phân tử cơ chất

bị thủy phân tạo thành một lượng lớn dextrin phân tử thấp (α-dextrin), độ nhớt của hồ tinh bột giảm nhanh (các amylose và amylopectin đều bị dịch hóa nhanh)

• Sang giai đoạn 2 (giai đoạn đường hóa): các dextrin phân tử thấp tạo thành bị thủy phân tiếp tục tạo ra các tetra-trimaltose không cho màu với iodine Các chất này bị thủy phân rất chậm bởi α-amylase cho tới disaccharide và monosaccharide Dưới tác dụng của α-amylase, amylose bị phân giải khá nhanh thành oligosaccharide gồm 6 - 7 gốc glucose (vì vậy, người ta cho rằng α-amylase luôn phân cắt amylose thành từng đoạn 6 - 7 gốc glucopiranose 1)

• Sau đó, các polyglucose này bị phân cắt tiếp tục tạo nên các mạch polyglucose collagen cứ ngắn dần và bị phân giải chậm đến maltotetrose, maltotriose và maltose

• Qua một thời gian tác dụng dài, sản phẩm thủy phân của amylose

cũng xảy ra tương tự nhưng vì không phân cắt được liên kết α-1,6-glycoside ở chỗ mạch nhánh trong phân tử amylopectin nên dù có chịu tác dụng lâu thì sản phẩm cuối cùng, ngoài các đường nói trên (72% maltose và 19% glucose) còn có dextrin phân tử thấp và isomaltose 8%

Tóm lại, dưới tác dụng của α-amylase, tinh bột có thể chuyển thành maltotetrose, maltose, glucose và dextrin phân tử thấp Tuy nhiên, thông thường α-amylase chỉ thủy phân tinh bột thành chủ yếu là dextrin phân tử thấp không cho màu với iodine và một ít maltose Khả năng dextrin hóa cao của α-amylase là tính chất đặc trưng của nó, khi enzyme này tác dụng lên tinh bột thì sẽ làm giảm nhanh độ nhớt của tinh bột Vì vậy, người ta thường gọi loại amylase này là amylase dextrin hóa hay amylase dịch hóa Các giai đoạn của quá trình thủy phân tinh bột của enzyme α-amylase:

• Giai đoạn dextrin hóa:

Tinh bột dextrin phân tử lượng thấp

• Giai đoạn đường hóa:

Dextrin tetra Trimaltose Di & monosaccharide

Amylose Oligosacharide Poliglucose

Maltose Maltotriose Maltotetrose

1.2.1.2 Đặc tính và cơ chế xúc tác của β-mylase (α-1,4

glucan-maltohydrolase)

Enzyme β-amylase là enzyme có chứa gốc -SH đặc trưng Nhiều nhà khoa học cho rằng có sự tham gia của nhóm imidazol và carboxyl trong trung tâm hoạt động của β-amylase Nhóm carboxyl của enzyme sẽ tương tác với C1 của glucoside tạo ra phức trung gian đồng hóa trị kiểu ester axcetal Ester này tiếp đó

sẽ bị phân giải do tác dụng của một phân tử nước lên nhóm carboxyl để giải phóng ra β-maltose và nhóm carboxyl của enzyme lại được phục hồi

Phân tử β-amylase chỉ gồm một chuỗi polypeptide có khối lượng phân tử 60.000 Da

Enzyme β-amylase có pH hoạt động tối ưu giữa 5 và 6, β-amylase khá bền trong môi trường acid ở pH = 3 - 4, nhiệt độ tố ưu là 50 - 65oC β-amylase bị

α-amylase

bất hoạt hoàn toàn ở nhiệt độ ở nhiệt độ 70oC Thường β-amylase có nguồn gốc

từ vi khuẩn có độ bền nhiệt cao hơn β-amylase có nguồn gốc từ thực vật

β-amylase không tác dụng lên tinh bột nguyên vẹn, chỉ tác dụng lên tinh bột đã hồ hóa Khác với α-amylase, β-amylase vẫn giữ được hoạt tính khi không

có Ca+2

Hình 1.3 Cấu trúc không gian của β-amylase

Cơ chế tác dụng của β-amylase: β-amylase là một enzyme đường hóa, phân cắt được các liên kết α-1,4 glucoside trong phân tử amylose cũng như trong amylopectin, bắt đầu từ bên ngoài đầu không khử giải phóng maltose dưới dạng

β Tác dụng của enzyme này sẽ bị dừng lại khi gặp liên kết α-1,6 Enzyme amylase thủy phân hoàn toàn amylose, ngược lại nó chỉ thủy phân được 54 - 58% amylopectin thành β-amylose Phần amylopectin còn lại là một β-dextrin giới hạn

β-có khối lượng phân tử cao và β-có chứa toàn bộ các liên kết α-1,6 của phân tử ban đầu Quá trình này xảy ra ở phần thẳng của mạch và dừng lại ở vị trí phân nhánh

• Enzyme β-amylase có thể thủy phân lần lượt nhiều liên kết glucoside của cùng một chuỗi trước khi được giải phóng trở lại vào môi trường

Số lần tác dụng trên một chuỗi α-glucan phụ thuộc vào chiều dài của chuỗi, thường là 4 lần đối với chuỗi ngắn và nhiều lần đối với chuỗi dài

• Theo phương pháp sản xuất truyền thống β-amylase được thu nhận

từ malt, tuy nhiên ở các nước phương Đông nó có thể được thu nhận từ đậu

còn chứa cả α-amylase Điều kiện thích hợp của β-amylase malt đại mạch là 60 -

65oC, pH 5,4 - 5,6 (trong dung dịch tinh bột) Vùng pH thích hợp cho β-amylase hoạt động hẹp hơn so với α-amylase Trước đây, β-amylase được coi là nguồn enzyme chỉ có trong hệ thực vật Ngày nay người ta đã phát hiện ra nhiều loại vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp ra loại enzyme này và ứng dụng vào sản xuất

Một số vi khuẩn có khả năng sinh tổng hợp β-amylase là Bacillus circulans,

Bacillus polymyxa, Bacillus cereus, Bacillus megaterium, Streptomyces sp và Pseudomonas Đặc biệt là Bacillus cereus và mycoides có thể đồng thời tạo ra cả

chúng thường nằm giữa 27.000 và 112.000 Da

Nói chung khối lượng phân tử glucoamylase của nấm mốc lớn hơn so với nấm mem Theo Pazur (1959) khối lượng phân tử của glucoamylase từ

Aspergillus awamori là 62.000 Da Trong khi đó khối lượng phân tử của

glucoamylase từ Endomycopsis sp 20-9 là 53.000 Da (Gratrova và Sadova,

1959) và từ Endomycopsis sp IFO.011 là 55.000 Da

Trong cấu tạo phân tử của các glucoamylase đều chứa gốc Met, Trp và một nửa gốc Cys trong trung tâm hoạt động Các glucoamylase của nấm mốc là những glucoprotein chứa từ 5 đến 20% glucid cao phân tử của glucose, manose

và glucosamin

Điểm đẳng điện của glucoamylase từ các nguồn khác nhau cũng không

đồng nhất Điểm đẳng điện của glucoamylase từ Aspergillus niger là 6,5; từ

Aspergillus awamori là 7,5; Rhizopus delemar là 7,4; Endomyces sp.IFO.0111 là

4,8 - 5,5

Hình 1.4 Cấu trúc không gian của glucoamylase

Glucoamylase thủy phân liên kết α-1,4 glucan trong polysaccharide, tách tuần tự từng gốc glucose một khỏi đầu không khử của mạch Glucoamylase có khả năng xúc tác thủy phân cả liên kết α-1,4 lẫn α-1,6 glucan Vì thế, các nhà nghiên cứu Nhật Bản (Ono và cộng sự, 1961) đề nghị đặt một tên phân loại khác cho nó là α-1,4:1,6 glucan-4:6-glucohydrolase Nhiều nhà nghiên cứu ủng hộ đề nghị này (Dobrolinxkai, 1965; Fenikxova và Ruza-kova, 1976) Glucoamylase

được các nhà khoa học Nhật tách lần đầu tiên từ Aspergillus awamori (Katitara

và Kurushima, 1966) Sau đó nó được tìm thấy ở Rhizopus delemar, Aspergillus

niger, Aspergillus oryzae rồi ở các nhóm vi sinh vật khác Enzyme này còn có

nhiều tên gọi khác nhau như: amyloglucosidase, taka-amylase Bac, γ-amylse, matulase,…

Glucoamylase là enzyme ngoại phân (exoenzyme) nó thủy phân polysaccharide từ đầu không khử để tạo ra glucose Khi thủy phân tinh bột cùng với glucose còn có thể tạo thành các α-oligosaccharide Ngoài các liên kết α-1,4

và α-1,6 glucoside, glucoamylase còn có khả năng thủy phân các liên kết α-1,2

và α-1,3 glucoside (Sawasaki 1960; Ueyama và cộng sự, 1965; Watanabe và Fukimbara, 1965, 1966)

Glucoamylase có khả năng thủy phân hoàn toàn tinh bột, glycogen, amylopectin dextrin cuối, panose, isomaltose và maltose thành glucose (Azarova, 1981; Jerebtxov và Pankratov, 1977; Dobrolinxkaia và Rodzevits, 1974; Logina

glucogen, β-dextrin) bị glucoamylase thủy phân với tốc độ khá nhanh Khi thủy phân các cơ chất khác nhau bằng glucoamylase tinh thể cho thấy các polysaccharide phân tử lớn hơn thì bị thủy phân nhanh hơn các cơ chất phân tử thấp Đa số glucoamylase đã biết đều thuộc loại enzyme “acid” Thể hiện hoạt lực tối đa ở vùng pH 3,5 - 5,5; nhiệt độ tối ưu là 40 - 60oC So với α-amylase, glucoamylase bền đối với acid và khi có mặt các oligosaccharide trong môi trường sẽ làm cho enzyme bền hơn, nhưng kém bền dưới tác dụng của rượu ethylic, aceton và không được bảo vệ khi có mặt Ca2+ mà sẽ bị Ca2+ ức chế enzyme và làm cho enzyme dễ dàng biến tính Glucoamylase thường tồn tại ở 2 hoặc 3 dạng đồng phân, trong đó đồng phân AM-1 (HM), AM-2 (LM) có phân tử lượng tương ứng là 82.000 và 70.000 Da Dạng đồng phân HM cắt mạch nhánh mạnh hơn dạng LM

Cơ chế tác dụng của glucoamylase cũng như cơ chế tác dụng của enzyme amylase khác Việc phân cắt liên kết glucoside được tiến hành thông qua việc tạo thành một hợp chất Oxycacbonium trung gian, tiếp theo là sự nghịch đảo cấu hình của carbon C1 của phân tử glucose được giải phóng ra Các nhóm Tyr, Trp, Histidine (His) và amin có vai trò gắn cơ chất vào, còn các nhóm -COOH và COO- thì tham gia vào quá trình xúc tác hóa học Việc thủy phân các liên kết α-1,4 và α-1,6 một cách không phân biệt của enzyme là do các nhóm thực hiện việc gắn cơ chất không phải do các nhóm tham gia vào quá trình xúc tác hóa học

Khi nghiên cứu các cơ chế của quá trình thủy phân một số oligosaccharide

và polysaccharide bằng glucoamylase của nấm mốc, Barker và cộng sự (1957) thấy rằng quá thủy phân tinh bột được thực hiện theo cơ chế đa mạch

Sơ đồ thủy phân glucid bởi enzyme glucoamylase như sau:

Tinh bột hay oligosaccharide 100% glucose (có liên kết α-1,4 và α-1,6 )

Tinh bột hay 80 - 85% glucose + Oligosaccharide

Glucoamylase kiểu

Rhizopus delemar

Glucoamylase kiểu

Aspergillus niger

1.2.1.4 Đặc tính và cơ chế xúc tác của pullulanase (α-dextrin

6-glucosidase)

Enzyme này có thể thuỷ phân các liên kết α-1,6 của tinh bột, glycogen, pululan và các dextrin Điều đáng chú ý là sự định vị của các liên kết α-1,6 có ảnh hưởng lớn đến tác động của enzyme Đặc biệt sự có mặt của hai liên kết α-1,4 nằm liền kề bên liên kết α-1,6 là điều kiện cần thiết cho enzyme phân cắt liên kết này Do đó pullulan chính là cơ chất lý tưởng của pullulanase, vì nó là một phân tử không phân nhánh cấu tạo bởi những đơn vị maltotriose (có hai liên kết α-1,4) liên kết với nhau bằng cầu nối α-,6 glucoside

Pullulanase phân giải các liên kết α-1,6 glucoside bị bao quanh tứ phía bởi các liên kết α-1,4 Nó còn có khả năng thủy phân cả những dextrin phân tử thấp chỉ gồm có hai gốc maltose nối nhau bằng liên kết α-1,6 glucoside Tác dụng hiệp đồng của α-amylase và pullulanase làm dextrin này bị thủy phân hoàn toàn

Pullulanase có pH tối ưu là 5 - 7, nhiệt độ tối ưu là 10 – 50oC Ion Ca2+hoạt hóa các enzyme này, trong khi đó các ion Hg2+, Zn2+, Cu2+, Ag2+ và Co2+ lại

có tác dụng kìm hãm

Hình 1.5 Cấu trúc không gian của enzyme pullulanase

1.2.1.5 Đặc tính và cơ chế xúc tác của oligo-1,6-glucosidase hay

dextrinase tới hạn

Enzyme này có thể thuỷ phân liên kết α-1,6-glucoside trong isomaltose, panose và các dextrin tới hạn thành đường có thể lên men được Enzyme này có

mầm) Ngoài oligo-1,6-glucosidase, hệ dextrinase của hạt ngũ cốc, hạt nảy mầm còn có amylopectin-1,6-glucosidase hay R-enzyme và dextrin-1,6-glucoside hay amylo-1,6-glucoside hay dextrin-6-glucocanhydrolase Hai loại enzyme này đều thuỷ phân dextrin triệt để hơn α-amylase và β-amylase do đó trong dung dịch thuỷ phân có nhiều maltose hơn

Nhiệt độ tối ưu cho hoạt động của các dextrinase là 40oC và pH tối ưu là 5,1 Theo số liệu của Kirxanov và Pankratov (1969), hoạt tính của enzyme này từ

Rhizopus delemar được bảo vệ ở điều kiện nhiệt độ 30oC; pH 5,0 - 6,0 sau 96 giờ Cũng ở pH này hoạt tính của enzyme này sẽ giảm 15% khi tăng nhiệt độ lên tới 50oC sau 2 giờ

Hình 1.6 Cấu trúc không gian của oligo-1,6-glucosidase

1.2.1.6 Đặc tính và cơ chế xúc tác của transglucosidase

Ở nhiều loài nấm sợi Aspergillus, enzyme transglucosidase luôn luôn

tương tác với glucoamylase Transglucosidase có cả hoạt tính transferase lẫn hoạt tính thủy phân Vì thế sự có mặt của transglucosidase trong dung dịch thường gây nên sự nhầm lẫn về sự tồn tại của glucoamylase Transglucosidase thực hiện việc chuyển gốc glucosyl sang các nhóm mono, di và oligosaccharide, xúc tác tạo thành liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside Pazur (1961) đã tách được enzyme này từ

Aspergillus niger bằng phương pháp sắc ký hấp phụ trên DEAE - cellulose và

cho biết cơ chế tác dụng của nó Transglucosidase không những chỉ thủy phân maltose thành glucose mà còn tổng hợp izomaltose, izotriose và panose; tức là có

khả năng chuyển gốc glucose và gắn nó vào phân tử maltose hoặc phân tử glucose khác nhau bằng liên kết α-1,6 để tạo thành panose hoặc izomaltose

Rodzevit và Butova (1965) đã tìm thấy trong canh trường nuôi cấy nấm

sợi Aspergillus niger, Aspergillus oryzae và Aspergillus awamori có enzyme

transglucosidase, đồng thời cho biết enzyme này xúc tác sự tổng hợp các oligosaccharide với các liên kết α-1,4 và α-1,6 glucoside từ maltose Các tác giả cho rằng, trong các vi sinh vật trên có hai hệ enzyme transglucosidase Một hệ tổng hợp các sản phẩm có liên kết α-1,4 glucoside kiểu maltose và chuyển các gốc glucose từ maltose tới vị trí C4 của gốc glucose cuối: n-maltose-(1,4-α-glucose)n + n-glucose Một hệ chuyển các gốc glucose có vị trí C6 khi tổng hợp các kiểu sản phẩm isomaltose: n-maltose-(1,6-glucose)n + n-glucose Hệ thứ nhất bền ở pH 8,5 còn hệ thứ hai thì bất hoạt hoàn toàn ở pH này trong 2 giờ Còn ở

pH 3,3 trong thời gian 1 giờ thì hoạt tính transglucosidase của cả hai hệ đều không thay đổi Transglucosidase của nấm sợi bị bất hoạt hoàn toàn ở pH = 1,9 - 2,0 sau 24 giờ Ở các chủng nấm sợi khác nhau thì có khác biệt về hoạt tính

transglucosidase (Buger, 1956), các loài Rhizopus có ưu thế hơn các loài

Aspergillus là không tạo transglucosidase

Sự có mặt của transglucosidase trong các chế phẩm amylase (dùng trong công nghiệp sản xuất mật tinh bột, đường glucose và công nghiệp sản xuất rượu ) là điều không mong muốn Glucoamylase xúc tác sự thủy phân tinh bột, còn transglucosidase lại tổng hợp các isosaccharide từ các sản phẩm thủy phân này, do đó làm giảm mức độ thủy phân sâu sắc tinh bột và làm cho dịch thủy phân có vị đắng

Hình 1.7 Quá trình thủy phân tinh bột dưới sự xúc tác của một số loại

enzyme amylase

1.2.2 Enzyme protease

Nhóm enzyme protease (peptide - hydrolase E.C.3.4) xúc tác quá trình thuỷ phân liên kết liên kết peptide (-CO-NH-)n trong phân tử protein, polypeptide đến sản phẩm cuối cùng là các amino acid

Hình 1.8 Mô hình enzyme protease xúc tác quá trình thủy phân protein

Protease cần thiết cho các sinh vật sống, rất đa dạng về chức năng từ mức

độ tế bào, cơ quan đến cơ thể nên được phân bố rất rộng rãi trên nhiều đối tượng

từ vi sinh vật (virus, vi khuẩn và nấm) đến thực vật (đu đủ, dứa ) và động vật (gan, dạ dày bê ) So với protease động vật và thực vật, protease vi sinh vật có những đặc điểm khác biệt Trước hết hệ protease vi sinh vật là một hệ thống rất phức tạp bao gồm nhiều enzyme rất giống nhau về cấu trúc, khối lượng và hình dạng phân tử nên rất khó tách ra dưới dạng tinh thể đồng nhất

Do là phức hệ gồm nhiều enzyme khác nhau nên protease vi sinh vật thường có tính đặc hiệu rộng cho sản phẩm thuỷ phân triệt để và đa dạng

Hình 1.9 Cấu trúc không gian của enzyme protease

1.2.2.1 Phân loại và đặc tính của protease vi sinh vật

Protease thuộc phân lớp 4 của lớp thứ 3 (E.C.3.4) Căn cứ vào cơ chế phản ứng, dựa vào đặc trưng của trung tâm hoạt động, pH hoạt động thích hợp… các nhà khoa học đã phân loại protease của vi sinh vật thành 4 nhóm sau:

• Protease serine: là những protease có chứa nhóm (-OH) của serine trong trung tâm hoạt động Các protease serine thường hoạt động ở pH kiềm và

có tính đặc hiệu tương đối rộng Tính đặc hiệu thể hiện về phía gốc amino acid chứa nhóm (-CO-) của liên kết peptide bị thủy phân Nhóm (-OH) này có vai trò đặc biệt quan trọng đối với hoạt động xúc tác của enzyme Trong nhóm này có

enzyme subtilisin là enzyme protease kiềm quan trọng nhất và ứng dụng nhiều nhất trong các ngành công nghiệp sản xuất chất tẩy rửa

• Protease thiol: là những protease có chứa nhóm thiol (-SH) của amino acid cystein trong trung tâm hoạt động Nhóm (-SH) này có vị trí đặc biệt trong trung tâm hoạt động xúc tác của enzyme, vì nó có khả năng phản ứng cao, tham gia nhiều biến đổi hóa học như: acid hóa, phosphoryl hóa, oxy hóa… Vai trò của nhóm thiol trong phân tử enzyme thể hiện ở nhiều mặt khác nhau như tạo thành phức trung gian enzyme - cơ chất, kết hợp giữa cơ chất và cofactor… Các protease thiol thường hoạt động mạnh ở pH trung tính và có tính đặc hiệu rộng; chỉ hoạt động khi nhóm thiol trong trung tâm hoạt động không bị bao vây Do đó, các chất như Cys, acid ascorbic ở nồng độ xác định thường có tác dụng làm bền

và hoạt hóa enzyme này Một số ion kim loại nặng, đặc biệt là các muối thủy ngân và các chất khác như iodoacetamid có tác dụng ức chế enzyme protease thiol và các chất như: iodine, H2O2, EDTA… cũng có tác dụng ức chế enzyme này vì chúng có khả năng gắn với ion kim loại nên thường làm tăng độ bền của ion kim loại Protease thiol thường là protease của thực vật như papain, bromeline…

• Protease acid: là những protease chứa nhóm (-COOH) trong trung tâm hoạt động Các nhóm (-COOH) này thuộc mạch bên của Asp hoặc Glu hay cũng có thể là nhóm (-COOH) đầu C của chuỗi polypeptide Các protease acid thường hoạt động ở vùng pH acid, bị ức chế bởi diazoacetyl norleucine methyl ester (DNME) và và có tính đặc hiệu đối với các amino acid có vòng thơm hoặc

kỵ nước ở hai phía của liên kết peptide bị thủy phân Protease acid là các enzyme

và của vi nấm như renin (renet)…

• Protease kim loại (metalloprotease): là những protease trong trung tâm hoạt động của chúng có các ion kim loại Các protease kim loại thường hoạt động mạnh nhất ở vùng pH trung tính và có tính đặc hiệu về phía gốc amino acid chứa nhóm (-NH2-) của liên kết peptide; chúng có thể tác dụng lên các peptide chứa nhóm (-NH-) của các amino acid kỵ nước có kích thước hoặc các liên kết peptide được tạo thành từ các amino acid có phân tử thấp Các protease kim loại

thường bị giảm hoạt tính dưới tác dụng của EDTA… Protease kim loại carboxylpeptidase A, collagenase và thermolysin…

Ngoài ra, protease còn được chia thành 3 nhóm dựa vào pH hoạt động của chúng bao gồm:

• Protease acid: hoạt động được ở pH < 3

• Protease trung tính: là một metalloenzyme (enzyme cơ kim), chúng

• Các protease serine có trọng lượng phân tử khoảng 20.000 - 27.000

Da, trọng lượng phân tử của các protease kim loại lớn hơn so với protease serine khoảng 33.800 - 48.400 Da Protease thiol và nhiều protease acid cũng có phân

tử lượng khoảng 30.000 - 40.000 Da

Protease của vi sinh vật gồm protease ngoại bào và protease nội bào Mỗi loại có các chức năng khác nhau đối với hoạt động sống của vi sinh vật như sau:

• Protease ngoại bào: phân giải protein và các cơ chất cao phân tử khác có trong môi trường dinh dưỡng thành các dạng phân tử thấp để vi sinh vật

có thể dễ dàng hấp thụ Một số dẫn liệu cho thấy các đột biến vi sinh vật mất khả năng tiết ra protease ngoại bào không thể sử dụng nguồn protein làm nguồn đạm dinh dưỡng Trong quá trình tiết protease ngoại bào cũng như quá trình tổng hợp chúng ở nhiều vi khuẩn bị giảm khi trong môi trường chứa một lượng lớn amino acid

• Protease nội bào: có thể ở dạng tự do trong tế bào chất hoặc liên kết với ribosome, mặt trong của màng tế bào và chỉ tìm thấy ở môi trường xung quanh sau khi tế bào bị phá vỡ Cho đến nay, các protease nội bào đang tiếp tục được nghiên cứu và chưa biết rõ hết vai trò của chúng trong tế bào Theo Hiroshi

(1976), protease nội bào có thể có vai trò quan trọng hơn protease ngoại bào

Chúng có thể hoàn thành một số chức năng sau:

− Phân giải các peptide được đưa từ môi trường ngoài vào thành các amino acid để tổng hợp protein trong tế bào hoặc dùng làm nguồn C, S, N,…

giúp cho vi sinh vật thích nghi với điều kiện thay đổi của môi trường

− Sự phân giải các peptide phân tử lượng thấp còn có vai trò loại trừ tác dụng độc hại của nó đối với tế bào vì một số peptide phân tử lượng thấp

có thể là kháng nguyên gây kìm hãm sự sinh trưởng của vi sinh vật

− Các protease nội bào có thể tham gia quá trình cải tiến một số phân tử protein và enzyme Điều này có ý nghĩa đối với việc hình thành và nảy

mầm của bào tử vi sinh vật

− Protease nội bào còn có tác dụng phân hủy protein vô dụng, tổng hợp sai do đột biến hoặc cũng có thể tham gia vào quá trình sinh trưởng của

vách tế bào…

1.2.2.2 Cơ chế xúc tác của protease vi sinh vật

a) Cơ chất tác dụng

• Cơ chất của tất cả các loại protease là các phân tử protein, chúng

phân giải các liên kết peptide và sản phẩm tạo thành cuối cùng là các acid amin

Các nguồn giàu protein như: thịt động vật, cá, trứng và đậu tương…

Bảng 1.1 Một số nguồn thực phẩm giàu protein Nguồn protein Hàm lượng (%) Nguồn protein Hàm lượng (%)

(tổng hợp từ nguồn internet)

b) Cơ chế tác dụng

• Trong trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật, ngoài gốc amino acid đặc trưng cho từng nhóm còn có một gốc amino acid khác tham gia

Ví dụ: histidine thường tham gia và cấu tạo trung tâm hoạt động của các protease

có serine và protease có nhóm -SH; tyrosine là trung tâm hoạt động của các protease có kim loại Mặc dù trung tâm hoạt động của các protease vi sinh vật có khác nhau nhưng các enzyme này đều xúc tác cho phản ứng thủy phân liên kết peptide theo cùng một cơ chế chung như sau:

E – S*: phức chất trung gian enzyme - cơ chất hóa (axilenzyme)

P1: là sản phẩm đầu tiên của phản ứng (với nhóm amino tự do mới được tạo thành)

P2: là sản phẩm thứ hai của phản ứng (với nhóm carboxyl tự do được tạo thành)

1.2.3 Enzyme pectinase

Enzyme pectinase là nhóm enzyme xúc tác quá trình thủy phân các polymer pectin thành các hợp phần khác nhau như: galacturonic, arabinose, methanol Sự phân hủy pectin trong tự nhiên thường xảy ra khi trái cây chín Những enzyme này có vai trò rất quan trọng trong việc bảo quản trái cây và rau quả Enzyme pectinase còn được ứng dụng trong quá trình chế biến thực phẩm, đặc biệt là khả năng làm trong nước quả Việc kiểm soát hoạt động của enzyme pectinase cũng có thể điều chỉnh được độ nhớt của sản phẩm

1.2.3.1 Đặc điểm và tính chất của pectinase vi sinh vật

Trong hệ enzyme pectinase phân giải pectin gồm nhiều nhóm enzyme khác nhau, chúng có khối lượng phân tử khoảng 40.400 Da Pectinase cũng như các enzyme khác là chất xúc tác sinh học có bản chất là protein, có khả năng xúc

Các enzyme trong phức hệ enzyme pectinase thường có cấu trúc phức tạp,

và để đảm bảo hoạt tính xúc tác chúng phải có cấc trúc bậc IV Trong cấu trúc bậc IV hình thành nên trung tâm hoạt động của enzyme pectinase chứa một vùng

8 - 10 vòng xoắn kép Người ta nhận thấy rằng trung tâm hoạt động chứa 2 amino acid là aspartate và lysine

Hình 1.10 Cấu trúc không gian của pectinase

1.2.3.2 Phân loại và cơ chế xúc tác của pectinase ngoại bào

Dựa vào cơ chế tác dụng người ta chia hệ enzyme này thành các loại sau: a) Pectinesterase (pectin pectylhydrolase)

• Pectinesterase là các enzyme xúc tác thủy phân liên kết ester trong phân tử pectin hoặc acid pectinic, kết quả là tạo ra acid pectinic và methanol Khi toàn bộ các nhóm methoxyl đều bị tách khỏi cơ chất thì sản phẩm tạo thành là methanol và polygalacturonic Sự thủy phân chỉ xảy ra ở liên kết ester liền kề với nhóm -COOH tự do

Hình 1.11 Sơ đồ tác dụng pectinesterase lên hợp chất pectin

• Pectinesterase thu được từ các nguồn khác nhau thì có pH tối ưu khác nhau Pectinesterase của vi sinh vật có pH tối ưu từ 4,5 - 5,5 còn của chế phẩm đã loại bỏ enzyme polygalacturonase có pH tối ưu từ 2,0 - 6,5 Trái lại pH tối ưu của polyesterase từ thực vật bậc cao thường cao hơn và vào khoảng 5,0 - 8,0

• Nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ nấm mốc là: 30 - 45oC và bị mất hoạt tính khi ở nhiệt độ 55 - 62oC, nhiệt độ tối ưu của pectinesterase từ thực vật bậc cao thường cao hơn và vào khoảng 55 - 60oC

• Pectinesterase thường được hoạt hóa bởi các ion Na+, K+, Ca2+ và

Mg2+ Trái lại các cation hóa trị 3 và 4 từ các chất như: Pb(NO3)3, Al2(SO4)3, FeCl3 sẽ kìm hãm tác dụng của pectinesterase

• Các enzyme pectinesterase từ vi sinh vật đều có những đặc điểm

khác nhau Pectinesterase của Trichoderma reerei có điểm đẳng điện nằm trong khoảng 8,3 - 9,5 và pH tối ưu là 7,6 Tuy nhiên, pectinesterase của Aspergillus có

điểm đẳng điện và pH tối ưu nằm trong khoảng acid Hoạt động của enzyme

pectinesterase thu được từ Aspergillus niger đạt tối đa ở pH 4,5 ở 40oC Các pectinesterase kiềm và acid có thể đề methyl hóa cơ chất pectin theo cùng một kiểu Các pectinesterase kiềm đề ester hóa các pectin và pectin này có thể tạo gel yếu với Ca2+; pectinesterase acid tạo ra pectin bị đề ester hóa có khả năng tạo gel mạnh đối với ion Ca2+

• Cơ chế đề methyl hóa: pectinesterase loại bỏ các nhóm methoxyl trong phân tử pectin bằng tương tác ái nhân của enzyme và phóng thích methanol Tiếp theo sau là phản ứng deacyl hóa, là phản ứng thủy phân các hợp chất trung gian acyl - enzyme, để giải phóng enzyme và carboxylic acid

b) Polygalacturonase (poly-α-1,4-galacturoniglucanohydrolase)

• Là enzyme xúc tác quá trình thủy phân các liên kết α-1,4-glycoside trong phân tử pectin

• Polygalacturonase ít gặp ở thực vật, polygalacturonase chủ yếu có

ở các vi sinh vật, đặc biệt là nấm mốc và vi khuẩn, nó thường có trọng lượng phân tử khoảng 65.000 Da Polygalacturonase là một phức hệ enzyme gồm nhiều

ở pH từ 4,0 - 6,0 Nhiệt độ tối ưu của đa số polygalacturonase nằm trong khoảng

40 - 45oC Ở khoảng nhiệt độ đó chúng thường bền vững, nhưng sẽ bị mất hoạt tính khi nhiệt độ tăng lên 50 - 60oC

• Dựa vào tính đặc hiệu và cơ chế tác dụng trên cơ chất nên H.Deuel

và E.Stutz (1958) đã chia ra 4 loại polygalacturonase:

− Polymethylgalacturonase hay còn gọi là methylesglucannohydrolase, tác dụng trên acid polygalacturonic đã được methyl hóa (tức là pectin) Các enzyme này được chia thành hai nhóm nhỏ tùy theo vị trí liên kết glucoside bị cắt đứt dưới xúc tác của enzyme ở đầu mạch hay giữa mạch

α-1,4-galacturonite-như:

+ Endo-glucosidase-polymethylgalacturonase kiểu I: còn gọi

là enzyme polygalacturonase dịch hóa Đây là enzyme xúc tác thủy phân các liên kết α-1,4 glucoside nội mạch của các phân tử acid polygalacturonic được ester hóa ở mức độ cao Hoạt tính của enzyme này bị giảm khi có mặt của enzyme pectinesterase trong môi trường Endo-glucosidase-polymethylgalacturonase kiểu

I rất phổ biến ở các vi sinh vật, đặc biệt là ở nấm mốc: Aspergillus niger, Botrylis

cinerea và Aspergillus awamori

Hình 1.12 Sơ đồ tác dụng của Endo-glucosidase-polymethylgalacturonase

kiểu I lên hợp chất pectin

+ Exo-glucosidase-polymethylgalacturonase kiểu III: còn gọi

là enzyme polygalacturonase đường hóa Đây là enzyme xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết α-1,4 glucoside ở đầu mạch để tách dần từng gốc acid polygalacturonic ra khỏi phân tử pectin hay acid pectinic, bắt đầu từ đầu không khử Enzyme này có ái lực với gốc acid polygalacturonic đã methyl hóa, nghĩa là phân cắt các liên kết α-1,4 ở đầu mạch nằm giữa 2 gốc acid polygalacturonic có nhóm -COOCH3

Hình 1.13 Sơ đồ tác dụng của Exo-glucosidase-polymethylgalacturonase

kiểu III lên hợp chất pectin

− Polygalacturonase: là enzyme tác dụng chủ yếu lên các acid pectic và acid pectinic Đối với nhóm enzyme này sự có mặt của pectinesterase

có tác dụng thúc đẩy khả năng xúc tác của chúng Các enzyme này cũng được chia thành 2 nhóm nhỏ nhờ vào vị trí liên kết glucoside bị cắt đứt

+ Endo-glucosidase-polymethylgalacturonase kiểu II: đây là loại enzyme polygalacturonase dịch hóa Endo-glucosidase-polygalacturonase kiểu II thủy phân liên kết α-1,4-glucoside các phân tử acid pectic hay acid pectinic, các enzyme này chỉ tác dụng khi có nhóm -COOH tự do Vị trí đứt mạch của cơ chất được xử lý sơ bộ bằng pectinesterase Đa số nấm mốc và vi

khuẩn là những vi sinh vật có khả năng sinh tổng hợp được enzyme này

Hình 1.14 Sơ đồ tác dụng của Endo-glucosidase-polymethylgalacturonase

kiểu II lên hợp chất pectin

+ xo-glucosidase-polymethylgalacturonase kiểu IV: enzyme này xúc tác phản ứng thủy phân các liên kết glucoside ở đầu mạch của phân tử acid pectic hoặc pectinic Enzyme này có ái lực với các liên kết glucoside ở đầu

mạch gần với nhóm carboxyl tự do

Hình 1.15 Sơ đồ tác dụng của Exo-glucosidase-polymethylgalacturonase

1.2.4 Enzyme cellulase

Enzyme cellulase là một trong những enzyme có vai trò rất quan trọng trong quá trình chuyển quá vật chất hữu cơ trong thiên nhiên, có ý nghĩa rất lớn trong công nghiệp thực phẩm và bảo vệ môi trường Đây cũng là enzyme được nghiên cứu và ứng dụng chậm hơn rất nhiều so với enzyme amylase và protease

Enzyme cellulase là một phức hệ hydrolase gồm các enzyme C1, Cx và glucosidase Chúng tham gia các phản ứng kế tiếp nhau khi phân hủy cellulose cuối cùng tạo ra sản phẩm là đường glucose

β-1.2.4.1 Phân loại và đặc điểm của cellulase vi sinh vật

Theo Wood và Mc.Cral (1979) enzyme cellulase được phân chia theo chức năng thành 3 nhóm:

• Exocellulase (exobiohydrolase; 1,4-β-D-glucan cellobiohydrolase)

• Endocellulase (endoglucanase; glucanohydrolase)

1,4-β-D-glucan-4-• β-glucosidase (cellbiase; β-D-glucoside glucohydrolase)

Hoạt tính của hệ enzyme cellulase đạt cao nhất khi nhiệt độ nằm trong khoảng từ 40 - 60oC, pH nằm trong khoảng từ 4 - 7

Cellulase bị ức chế bởi những sản phẩm phản ứng của nó như glucose, cellobiose Hg2+ ức chế hoàn toàn cellulose, trong khi các ion như Mn2+, Ag+,

Cu2+ và Zn2+ chỉ ức chế nhẹ Hoạt tính của chế phẩm cellulase bị mất hoàn toàn sau 10 - 15 phút ở 80oC

Exocellulase được tổng hợp bởi Trichoderma reesei và đã được các nhà

khoa học nghiên cứu rất kỹ Chúng bao gồm hai loại: exocellulase kiểu I và exocellulase kiểu II

• Exocellulase kiểu I chiếm đến 60% lượng protein có trong dịch

nuôi cấy Trichoderma reesei Chúng có phân tử lượng khoảng 66.000 Da, điểm

đẳng điện là 4,4 (PI = 4,4) Loại enzyme này tác dụng cả lên cellulose vô định hình và cellulose kết tinh Nhưng chúng lại không tác dụng đến cellulose biến tính như carboxylmethyl cellulose (CMC) hay hydroxyethylcellulose,

cellohexaose β-nitrophenyl, β-glucoside hay β-glucan Exocellulase kiểu I chứa khoảng 496 amino acid

• Exocellulase kiểu II có phân tử lượng 53.000 Da, PI = 5,0 Chúng cũng không tác động lên CMC, chúng có khả năng tác động đến cellulose hòa tan

và cả cellulose không hòa tan Exocellulase kiểu II chứa khoảng 471 amino acid

Exocellulase của Cellulomonas fimi có một số tính chất khác biệt so với của Trichoderma reesei Exocellulase của Cellomonas fimi có chứa 443 amino

acid Enzyme này có ba cầu nối disufide Hai cầu nối disulfide nằm trong trung tâm hoạt động còn một cầu nối nằm ngoài trung tâm hoạt động

Exocellulase của Clostridium thermocellum có phân tử lượng 68.000 -

75.000 Da

Endoglucanase có nhiều trong dịch nuôi cấy Trichoderma reesei Các nhà

khoa học chia chúng thành hai loại endoglucanase kiểu I và endoglucanase kiểu

II Endoglucanase kiểu I chứa 459 amino acid, phân tử lượng khoảng 48.121 Da Endoglucanase kiểu II chứa 418 amino acid, phân tử lượng 42.200 Da Các enzyme này có thể hoạt động ở nhiệt độ khá cao Ngoài ra endoglucanase còn

được tìm thấy ở Clostridium thermocellum, Cellulomonas fimi và các vi sinh vật

khác Các endoglucanase của các vi sinh vật khác thường không khác biệt nhiều

β-glucosidase là nhóm enzyme khá phức tạp, chúng có khả năng hoạt động trong khoảng pH rất rộng (pH từ 4,4 - 8,4) phân tử lượng 50.000 - 98.000

Da, PI (isoelectric point) 8,4 và có thể hoạt động ở nhiệt độ cao β-glucosidase

của Trichoderma reesei chứa đến 713 amino acid với phân tử lượng là 75.340

Da Trong dịch chiết, chúng chiếm 1% so với tổng lượng protein thu được

β-glucosidase của Clostridium thermocellum được chia ra làm hai loại glucosidase A và β-glucosidase B β-glucosidase A chứa khoảng 448 amino acid

β-và có phân tử lượng 51.482 Da Chúng hoạt động mạnh ở pH 6,0 - 6,5 β-và ở nhiệt

độ 60oC Chúng tham gia thủy phân cellobiose nhưng không thủy phân CMC

1.2.4.2 Cơ chế xúc tác của cellulase vi sinh vật

Cellulase C1 còn được gọi là exocellulase (exobiohydrolase; glucan cellobiohydrolase) Enzyme này thủy phân đặc hiệu liên kết β-1,4-

1,4-β-D-glucoside ở đầu không khử của chuỗi cellulose hoặc các cellodextrin để giải phóng cellobiose (cấu trúc gồm 2 phân tử D-glucose nối với nhau bằng liên kết β-1,4-glucoside) Enzyme này không có khả năng phân giải cellulose ở dạng kết tinh mà chỉ làm thay đổi tính chất lý hóa, giúp cho enzyme endocellulase phân giải chúng

Cellulase Cx còn được gọi là endocellulase (endoglucanase; glucan-4-glucanohydrolase) Enzyme này thủy phân liên kết β-1,4-glucoside ở vị trí ngẫu nhiên trong chuỗi cellulose, chuỗi cellodextrin và các dẫn xuất cellulose như CMC và Hydroxylethyl Cellulose (HEC) Chúng tham gia tác động mạnh đến cellulose vô định hình, tác động yếu đến cellulose kết tinh

1,4-β-D-β-glucosidase (cellbiase; β-D-glucoside glucohydrolase) không có khả năng phân hủy cellulose nguyên thủy mà tham gia phân hủy cellobiose, cellodextrin tạo thành D-glucose

Hình 1.16 Cơ chế chuyển hóa cellullose dưới sự xúc tác của hệ enzyme

cellulase

Cellulose kết tinh

Glucose

Cellulose vô định hình

Endoglucanase

Ngoài ra, còn có các loại enzyme khác như: lipase, hemicellulase và lignase

1.3 Ưu điểm - nhược điểm của enzyme ngoại bào so với enzyme nội bào của vi sinh vật

Không bị biến tính enzyme cần thu nhận do không sử dụng các phương pháp phá vỡ tế bào

Các enzyme ngoại bào đa phần ổn định và bền vững hơn so với enzyme nội bào nhờ sự có mặt của liên kết disulfide

Hoạt tính cao hơn so với các enzyme nội bào

Độ bền nhiệt cũng như khả năng chịu acid cũng cao hơn so với các enzyme nội bào

Giá thành chế phẩm enzyme thu nhận được rẻ hơn rất nhiều so với các enzyme nội bào

1.3.2 Nhược điểm

Các enzyme ngoại bào phần lớn là enzyme thủy phân ở dạng hòa tan nên trong quá trình sản xuất công nghiệp chúng thường lẫn vào sản phẩm gây khó khăn và đòi hỏi chi phí khá cao để tách chúng ra khỏi sản phẩm Ví dụ như sản xuất glucose sử dụng trong y học phải tuyệt đối sạch cả về phương diện hóa học

và sinh học Còn các enzyme nội bào thường không tan (trừ các enzyme nội bào thuộc nhóm hydrolase) nên dễ dàng tách ra khỏi sản phẩm ở giai đoạn cuối của

Sau phản ứng, nếu tách các enzyme ở dạng hòa tan ra khỏi phản ứng để thực hiện phản ứng tiếp theo hoạt tính sẽ giảm dần Như vậy việc tái sử dụng chúng không có hiệu quả cao, có nhiều trường hợp không thể sử dụng được nữa

Một số enzyme nội bào được ứng dụng trong y học nhằm mục đích điều trị, nghiên cứu, sản xuất kháng sinh bán tổng hợp và dược phẩm được tinh sạch

kỹ lưỡng trong khi các enzyme ngoại bào phần lớn ứng dụng trong các ngành sản xuất công nghiệp thực phẩm, sản xuất các chất tẩy rửa, ngành công nghiệp thuộc da… chỉ ở dạng enzyme kỹ thuật thường không được tinh sạch nhất

CHƯƠNG 2: ENZYME NGOẠI BÀO CỦA

BACILLUS SUBTILIS

2.1 Tổng quan về Bacillus subtilis

2.1.1 Lịch sử phát hiện

Bacillus subtilis được phát hiện lần đầu tiên vào năm 1835 do Christion

Erenberg và tên của loài vi khuẩn này lúc bấy giờ là “Vibrio subtilis” Gần 30 năm sau, Casimir Davaine đặt tên cho loài vi khuẩn này là “Bacteridium” Năm

1872, Ferdimand Cohn xác định thấy loài trực khuẩn này có đầu vuông và đặt tên

là Bacillus subtilis

Năm 1941, Bacillus subtilis được phát hiện trong phân ngựa bởi tổ chức y

học Nazi của Đức Lúc đầu, chúng được dùng chủ yếu để phòng bệnh lị cho các binh sĩ Đức chiến đấu ở Bắc Phi Năm 1949 - 1957, Henry và cộng sự tách được

các chủng thuần khiết của Bacillus subtilis Gần đây, Bacillus subtilis đã được

nghiên cứu, sử dụng rộng rãi trên thế giới Từ đó, thuật ngữ “Subtilis therapy” ra

đời Bacillus subtilis được sử dụng ngày càng phổ biến và được xem như sinh vật

phòng và trị các bệnh về rối loạn đường tiêu hóa, các chứng viêm ruột, viêm đại tràng, tiêu chảy…

Ngày nay, Bacillus subtilis đã và đang được nghiên cứu rộng rãi với nhiều

tiềm năng và ứng dụng hiệu quả trong chăn nuôi, công nghiệp, xử lý môi trường…

2.1.2 Phân loại

Theo phân loại của Bergey (1974), Bacillus subtilis thuộc:

Giới (Kingdom) : Bacteria Ngành (Division) : Firmicutes Lớp (Class) : Bacilli

Bộ (Order) : Bacillales

Họ (Family) : Bacillaceae

Loài (Species) : Bacillus subtilis

2.1.3 Đặc điểm của Bacillus subtilis

2.1.3.1 Đặc điểm sinh thái học và phân bố trong tự nhiên

Vi khuẩn Bacillus subtilis thuộc nhóm vi sinh vật hiếu khí hay kỵ khí tùy

nghi Chúng phân bố hầu hết trong môi trường tự nhiên, phần lớn cư trú trong đất

và rơm rạ, cỏ khô nên được gọi là “trực khuẩn cỏ khô”, thông thường đất trồng trọt có khoảng 106 - 107 triệu CFU/g Đất nghèo dinh dưỡng ở vùng sa mạc, đất hoang thì sự hiện diện của chúng rất hiếm Ngoài ra, chúng còn có mặt trong các

nguyên liệu sản xuất như bột mì (trong bột mì vi khuẩn Bacillus subtilis chiếm

75 - 79% vi khuẩn tạo bào tử), bột gạo, trong các thực phẩm như mắm, tương,

chao… Bacillus subtilis đóng vai trò đáng kể về mặt có lợi cũng như mặt gây hại

trong quá trình biến đổi sinh học

Bacillus subtilis có khả năng dùng các hợp chất vô cơ làm nguồn carbon

trong khi một số loài khác như Bacillus sphaericus, Bacillus cereus cần các hợp

chất hữu cơ là vitamin và amino acid cho sự sinh trưởng Đặc biệt các loài như

Bacillus popilliae, Bacillus lentimobus có nhu cầu dinh dưỡng phức tạp, chúng

không phát triển trong môi trường nuôi cấy vi khuẩn thông thường như: Nutrient Agar (NA), Nutrient Broth (NB)

Năm 1993, giáo sư Richard Losik và cộng sự thuộc Đại học Havard ở Boston (Mỹ) và Jose Gonzalez-Pastor của Trung tâm công nghệ sinh học quốc

gia ở Madrid (Tây Ban Nha) đã chứng minh được loài Bacillus subtilis có tập

tính ăn thịt đồng loại Chúng dùng cách này như một phương pháp đơn giản để thoát khỏi những trường hợp có đời sống giới hạn như dinh dưỡng trong môi trường đã cạn kiệt Một cách đơn giản là các cá thể khỏe mạnh sinh tổng hợp kháng sinh tiêu diệt những cá thể xung quanh cả khác loài lẫn cùng loài, để thu lấy chất dinh dưỡng bên trong, giúp chúng sống sót chờ đến khi môi trường thuận lợi hơn Ngoài ra, để tránh những ảnh hưởng của môi trường khắc nghiệt, chúng thường tạo ra bào tử, nhưng cách này tiêu hao khá nhiều năng lượng