BACILLUS SUBTILIS
2.2.3.2.Thu nhận và tách chiết enzyme protease của Bacillus subtilis
a) Thu nhận enzyme protease của Bacillus subtilis
• Kết thúc quá trình nuôi cấy ta thu nhận được dịch enzyme protease thô. Để đảm bảo cho dịch enzyme protease thô không bị mất hoạt tính nhanh người ta thường sấy khô dịch bằng máy sấy chân không. Độ ẩm cần đạt được sau quá trình sấy kết thúc là nhỏ hơn 10%. Để đảm bảo hoạt tính enzyme không thay đổi người ta thường sấy ở nhiệt độ 38 - 40oC.
• Tùy theo mục đích sử dụng ta có thể dùng chế phẩm thô không qua quá trình tinh sạch. Trong những trường hợp cần thiết phải tiến hành làm sạch enzyme. Để sản xuất enzyme tinh khiết người phải tiến hành như sau:
− Toàn bộ khối lượng enzyme protease thô được nghiền nhỏ. Mục đích của quá trình nghiền là vừa phá vỡ thành tế bào, vừa làm nhỏ các thành phần của chế phẩm thô. Khi thành tế bào được phá vỡ, các enzyme nội bào dễ dàng thoát khỏi tế bào. Phần lớn enzyme protease ngoại bào khi được tổng hợp và thoát ra khỏi tế bào ngay lập tức thấm vào thành phần môi trường. Khi nghiền nhỏ, enzyme thoát ra khỏi các thành phần này dễ dàng hơn. Khi nghiền người ta thường sử dụng các chất trợ nghiền như cát thạch anh và bột thủy tinh. Đây là những chất vô cơ không tham gia vào phản ứng và tăng khả năng ma sát, trước khi sử dụng cát thạch anh và bột thủy tinh phải được rửa sạch, sấy khô ở nhiệt độ lớn hơn 100oC để loại bỏ nước và tiêu diệt vi sinh vật.
b) Tách chiết enzyme protease của Bacillus subtilis
• Sau khi nghiền mịn, người ta cho nước vào để trích ly enzyme protease. Các loại enzyme thủy phân có khả năng tan trong nước nên dùng nước như một dung môi hòa tan. Cứ một phần chế phẩm enzyme thô, cho 4 - 5 phần nước, khuấy nhẹ và sau đó lọc lấy dịch.
• Quá trình kết tủa enzyme nhờ những tác nhân gây tủa như: cồn 96%, sulphate ammon, muối (NH4)2SO4… Khi tiến hành tủa, phải làm lạnh cả dung dịch enzyme thô và cả những tác nhân kết tủa để tránh làm mất hoạt tính của enzyme. Khi đổ chất kết tủa enzyme vào dung dịch enzyme thô phải tiến hành từ từ để tránh hiện tượng biến tính.
• Trong quá trình kết tủa người ta dùng cồn hoặc sulphate ammon với liều lượng như sau: cứ một phần dung dịch enzyme thô cho 2 đến 2,5 lần cồn hoặc sulphate ammon.
• Khi cho chất kết tủa vào dung dịch enzyme thô, tiến hành khuấy nhẹ, sau đó để yên trong điều kiện nhiệt độ lạnh (thường là từ 4 - 7oC) theo thời gian, các enzyme sẽ được kết tủa và lắng xuống đáy, tiến hành gạn và lọc thu nhận tủa (độ ẩm lớn hơn 70% trọng lượng).
• Ở trạng thái này enzyme rất dễ bị biến tính vì còn nhiều nước. Để dễ bảo quản, sấy kết tủa enzyme protease ở 40oC cho đến khi độ ẩm cuối cùng đạt 5 - 8% trọng lượng (thiết bị sấy thường dùng là máy sấy phun sương).
• Trong nhiều trường hợp chế phẩm enzyme protease ở dạng kết tủa vẫn hoàn toàn chưa sạch về mặt hóa học vì trong đó còn chứa một số enzyme ngoài enzyme khác lẫn vào.