BACILLUS SUBTILIS
2.2.3.1. Thu nhận và tách chiết enzyme α-amylase của Bacillus subtilis
Trong một số ngành công nghiệp nhiều khi đòi hỏi phải có những chế phẩm có độ tinh khiết cao. Trong thập kỷ 70 của thế kỷ này đã xuất hiện lĩnh vực khác nhau sử dụng các chế phẩm enzyme tinh khiết. Trong quá trình sinh tổng hợp amylase đồng thời cũng xảy ra quá trình sinh tổng hợp protease. Trong trường hợp cần loại bỏ protease ra khỏi chế phẩm amylase người ta cho amylase hấp phụ lên tinh bột, công trình này đã được nêu trong chế phẩm Patent của Mỹ. Trong Patent người ta cũng đã nêu lên việc ứng dụng calci acetate với tỷ lệ từ 2 - 10% (W/V) vì calci acetate đã góp phần hoạt hóa enzyme. Sau đó bổ sung dung môi hữu cơ với nồng độ khoảng từ 0,6 - 1,0 Vdung môi/Vban đầu khi đó amylase bị kết tủa khi bổ sung dung môi. Theo Molodova (1966) để loại bỏ protease ra khỏi α-amylase của nấm mốc Aspergillus và Rhizopus sử dụng hạt trao đổi anion, có thể sử dụng nhựa phenolformadehyde, polystiren và các dẫn xuất của cellulose… Người ta đã thu nhận được trên 90% α-amylase. Quá trình thu nhận và làm sạch như sau:
• Chế phẩm enzyme thô thu được sau lên men phải xử lý sơ bộ bằng các phương pháp hóa học như điều chỉnh pH, thêm các chất ổn định 0,1% CaCl2 so với dịch lên men để tạo kết tủa dẫn đến lắng cặn hoạt hóa enzyme và lọc để loại bỏ tạp chất. Việc này làm mất hoạt tính của enzyme khoảng 2%. Quá trình lọc bỏ tạp chất cũng gặp những khó khăn vì sinh khối tế bào lớn bịt kín các lỗ loc khiến tốc độ lọc chậm dần và thời gian lọc dài dẫn đến tổn thất enzyme rất lớn, cho nên khi lọc người ta còn bổ sung bột trợ lọc, hoặc lọc bằng màng hoặc sử dụng máy li tâm có tốc độ cao 5000 - 6000 vòng/phút, 96 - 97% sinh khối được tách. Bổ sung các chất trợ lọc như: diatomit của Nhật, filtroperlit của Liên Xô (cũ).
• Sau khi có chế phẩm enzyme khá sạch ở dạng lỏng người ta tiến hành cô đặc. Thông thường người ta hay cô chân không ở nhiệt độ thấp 28 – 30oC để tránh hiện tượng bất hoạt enzyme đây là giai đoạn rất thuận lợi đối với các chế phẩm nuôi cấy bằng phương pháp bề mặt vì chế phẩm này có nồng độ chất khô cao hơn so với chế phẩm enzyme nuôi cấy bằng phương pháp chìm.
pháp chìm thường hay dẫn đến một số biến đổi hóa học, bất lợi cho hoạt động của enzyme làm ảnh hưởng đến tính bền vững của enzyme. Trong vấn đề này Vexelov (1970) đã có nhiều thành tựu, ông cô đặc enzyme bằng phương pháp đóng băng nhiều lần.
• Ngày nay với thành tựu của công nghệ màng siêu lọc, phương pháp cô đặc dịch lên men đã được thực hiện đơn giản hơn, hiệu quả hơn. Để ứng dụng được phương pháp này có hiệu quả người ta làm sạch enzyme, chọn nguyên liệu và kích thước màng sao cho phù hợp. Phương pháp này không những chỉ cô đặc enzyme mà còn làm cho chế phẩm sạch hơn, hoạt tính của enzyme bị giảm không đáng kể trong quá trình lọc.
• Sau khi có được chế phẩm enzyme cô đặc người ta tiến hành sấy phun để thu enzyme khô ở nhiệt độ 120 - 130oC rồi giảm nhiệt độ xuống khoảng 60 - 65oC. Trước khi sấy phun có thể thêm các chất như NaCl nồng độ 200 mg/l hoặc CaSO4, MgSO4 nồng độ 30 - 60 mg/l. Trong quá trình sấy phun hoạt tính enzyme giảm khoảng 10%. Đây hiện là một phương pháp hữu hiệu nhất để sản xuất chế phẩm enzyme kỹ thuật. Tuy nhiên để sấy phun có hiệu quả thì việc xử lý chế phẩm trước sấy phun là việc quan trọng. Độ ẩm của chế phẩm thu được là yếu tố quyết định tác dụng và độ bền vững của enzyme. Chế phẩm thu được có thể bảo quản được 2 năm, sấy phun đơn giản hơn và hạ giá thành sản phẩm.
• Để thu nhận được chế phẩm có độ tinh khiết cao người ta có thể tiến hành như sau: kết tủa bằng dung môi hữu cơ như aceton, ethanol, muối trung tính để tách enzyme ra khỏi dung dịch, sau đó tách α-amylase ra khỏi hỗn hợp enzyme đã được kết tủa bằng màng siêu lọc, hoặc phương pháp hấp phụ enzyme trên tinh bột. Sắc ký trao đổi ion hoặc dùng phương pháp đẳng điện, rồi kết tinh và sấy khô. Kvesitadze (1984) đã đưa ra bảng quá trình làm sạch và kết tinh α- amylase của Bacillus subtilis như sau:
− Lọc chế phẩm − Hấp phụ tinh bột
− Muối tách M/30 Na2HPO4 − Tẩy màu trên nhựa Đayrut A2
− Hòa tan kết tủa trong calci acetate M/500 − Thêm aceton ở 00C đến 60% bão hòa − Hòa tan kết tủa trong calci acetate 0,01M − Chỉnh pH đến 6,0
− Bảo quản trong lạnh − Kết tinh
• Tuy nhiên, theo các nghiên cứu gần đây, quá trình kết tủa enzyme lại dùng cồn 96%. Theo Nguyễn Thanh Thủy (2007) khi khảo sát tỷ lệ tủa enzyme α-amylase bằng cồn 96% và tủa bằng (NH4)2SO4 đã cho kết quả như sau:
Bảng 2.6. Ảnh hưởng của tỷ lệ cồn 96% lên khả năng tủa α-amylase
Tỷ lệ enzyme/cồn 96% Protein (mg/100ml chế phẩm tươi) Hiệu suất thu hồi protein (%) Hoạt tính (UI/100ml chế phẩm tươi) Hiệu suất thu hồi hoạt tính (%) 1:1 10,462 ± 0,232 10,78 4366,90 ± 190,003 8,698 1:2 15,963 ± 0,568 16,45 44056,08 ± 80,497 87,751 1:3 21,756 ± 0,232 22,42 45607,75 ± 185,067 90,842 1:4 23,127 ± 0,154 23,83 44284,27 ± 109,698 88,206 1:5 23,696 ± 0,154 24,42 43219,40 ± 270,422 86,085
(trích Nguyễn Thanh Thủy, 2007)
− Theo bảng 2.6 thì ở tỷ lệ 1:1, nồng độ cồn thấp chỉ tủa được một lượng nhỏ protein (α-amylase) nên hoạt tính α-amylase thấp. Nhưng ở tỷ lệ 4:1 và 5:1, tuy lượng protein thu nhận được cao hơn, song hoạt tính thấp hơn tỷ lệ 3:1 là do ở hai tỷ lệ trên nồng độ cồn quá cao đã làm protein bị biến tính nên hoạt tính α-amylase giảm.
Bảng 2.7. Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 lên khả năng tủa α-amylase Độ bão hòa (%) Protein (mg/100ml chế phẩm tươi) Hiệu suất thu hồi protein (%) Hoạt tính (UI/100ml chế phẩm tươi) Hiệu suất thu hồi hoạt tính (%) 50 14,805 ± 0,118 15,02 31835,132 ± 205,852 61,73 55 15,846 ± 0,101 16,08 36916,077 ± 73,132 71,58 60 16,683 ± 0,195 16,53 37575,282 ± 20,283 72,86 65 16,683 ± 0,108 16,92 37281,175 ± 123,378 72.29 70 19,037 ± 0,166 19,31 36926,219 ± 126,669 71,60
(trích Nguyễn Thanh Thủy, 2007)
− Theo bảng 2.7 thì tủa bằng (NH4)2SO4 ở 60% độ bão hòa, α- amylase có hoạt tính cao nhất. Ở độ bão hòa 70%, hoạt tính α-amylase giảm, do nồng độ muối quá cao làm biến tính protein.
− Từ các kết quả trên, tác giả đã kết luận kết tủa bằng cồn 96% ở tỷ lệ enzyme/cồn 1:3 hoạt tính của α-amylase thu hồi được cao hơn khi kết tủa bằng (NH4)2SO4.
Như vậy, quá trình tách và làm sạch enzyme là một quá trình phức tạp, đòi hỏi trang thiết bị hiện đại, hóa chất tinh khiết và rất tốn kém. Người ta đã đề nghị một số ngành sử dụng enzyme nếu không cần tinh khiết thì có thể sử dụng enzyme thô như công nghệ thuộc da và sản xuất rượu bia… Ngày nay trên thị trường tồn tại khá nhiều chế phẩm enzyme. Trong ngành công nghiệp sản xuất bia người ta đã sử dụng khá nhiều loại enzyme kỹ thuật. Hãng Novo - Nordish của Đan Mạch đã đưa vào thị trường Việt Nam một loại chế phẩm enzyme cho khá nhiều ngành công nghiệp trong đó có ngành công nghệp sản xuất bia.