Nghiên cứu đặc tính điện hóa của fenofibrat và ứng dụng trong phân tích

Việc kiểm định chất lượng thuốc ở dạng bào chế cũng như dược động học của thuốc cần phải có phương pháp phân tích một lượng thuốc nhỏ trong các mẫu sinh học để có thể tìm hiểu khả năng t

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LỜI CẢM ƠN

Với lòng biết ơn sâu sắc, tôi xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Kim Thường

đã giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn và tạo mọi điều kiện thuận lợi nhất giúp tôi thực hiện luận văn này

Tôi xin chân thành cảm ơn các thầy, cô trong bộ môn Hóa Phân Tích nói riêng và trong khoa Hóa Học nói chung đã dạy dỗ, chỉ bảo và động viên tôi trong suốt thời gian tôi học tập tại trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia Hà Nội

Tôi xin cảm ơn đề tài mã số GG.15.14 của Đại Học Quốc Gia Hà Nội đã tài trợ kinh phí để tôi thực hiện thành công luận văn này

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn gia đình, các bạn sinh viên, học viên của Bộ môn Hóa phân tích đã luôn động viên tinh thần, cổ vũ, tận tình giúp đỡ tôi trong thời gian học tập và thực hiện luận văn này

Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2016

Học viên

Đỗ Thị Kim Dung

MỤC LỤC

Trang

1.2.1 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao 4

1.2.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 8

1.3 Giới thiệu về phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ 10

1.3.1 Nguyên tắc của phương pháp von - ampe hòa tan hấp phu ̣ 10

1.3.2 Các kỹ thuật ghi đo tín hiệu hoà tan chất cần phân tích 13

2.2.1 Tiến trình thí nghiệm theo phương pháp CV 15

2.2.2 Tiến trình thí nghiệm theo phương pháp DP - AdSV 16

2.3.1 Các dụng cụ và thiết bị được sử dụng 18

2.4 Các thông số đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích 21

2.4.1 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ) 21

2.4.2 Độ chụm (độ lặp lại) của phương pháp 22

2.4.3 Độ đúng (độ thu hồi) của phương pháp 23

3.1 Khảo sát các đặc tính điện hóa của fenofibrat bằng phương pháp von -

3.2 Tối ưu hóa các điều kiện xác định fenofibrat 26

3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của thời gian hấp phụ 28

3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét thế 31

3.3.2 Đánh giá độ lặp lại của phương pháp 34

3.4 Áp dụng phân tích một số mẫu thuốc trên thị trường 35

3.5 Xác định fenofibrat trong mẫu huyết tương 37

3.5.2 Xây dựng đường chuẩn xác định fenofibrat trong nền mẫu huyết tương 40

MỤC CHỮ VIẾT TẮT

1 AdSV Absorptive Stripping

Voltammetry Von - ampe hòa tan hấp phụ

2 ASV Anodic Stripping Voltammetry Von - ampe hòa tan anot

3 CSV Cathodic StrippingVoltammetry Von - ampe hòa tan catot

4 CV Cyclic Voltammetry Von - ampe vòng

5 DPV Differential Pulse Stripping

Voltammetry

Von - ampe hòa tan xung vi phân

6 HMDE Hanging Mercury Dropping

Electrode Điện cực giọt thủy ngân treo

7 HPLC High Performance Liquid

Chromatography

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao

8 LOD Limit of Detection Giới hạn phát hiện

9 LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng

10 MFE Mercury Film Electrode Điện cực màng thủy ngân

11 SMDE Stastic Mercury Dropping

Electrode Điện cực giọt thủy ngân tĩnh

12 SqW Square - Wave Stripping

DANH MỤC BẢNG SỐ LIỆU

Bảng 3.1: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của pH đến cường độ dòng đỉnh píc 27

bảng 3.2: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian hấp phụ đến cường độ dòng đình pic 29

Bảng 3.3: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thế hấp phụ đến cường độ dòng đỉnh píc 30 Bảng 3.4: Kết quả khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét đến cường độ dòng đỉnh píc .32

Bảng 3.5: Ảnh hưởng của nồng độ fenofibrat đến cường độ dòng đỉnh píc 33

Bảng 3.6: Độ lặp lại của cường độ dòng đỉnh píc của fenofibrat 34

Bảng 3.7: Kết quả phân tích mẫu thuốc SanDor 35

Bảng 3.8: Kết quả phân tích các mẫu thuốc 36

Bảng 3.9: Sự phụ thuộc của cường dộ dòng píc vào thành phần dung môi 39

Bảng 310: Cường độ dòng đỉnh píc của fenofibrat trong nền mẫu huyết tương 41

Bảng 3.11: Độ lặp lại của cường độ dòng đỉnh píc của fenofibrat trong nền mẫu huyết tương 42

Bảng 3.12: Nồng độ fenofibrat trong mẫu huyết tương được xác định dựa vào đường chuẩn 43

DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của fenofibrat 3

Hình 2.1: Thiết bị phân tích điện hóa Metrohm - Autolab 19

Hình 3.1: Đường CV (von – ampe vòng) của fenofibrat 24

Hình 3.2: Quá trình khử của fenofibrat 25

Hình 3.3: Đường von - ampe vòng của fenofibrat quét 5 vòng liên tục 26

Hình 3.4: Ảnh hưởng của pH đến cường độ dòng đỉnh píc 27

Hình 3.5: Đường von - ampe hòa tan của fenofibrat khi thay đổi pH 28

Hình 3.6: Đường von - ampe hòa tan của fenofibrat khi thay đổi thời gian hấp phụ 29

Hình 3.7: Ảnh hưởng của thời gian hấp phụ đến cường độ dòng đỉnh píc 29

Hình 3.8: Ảnh hưởng của thế hấp phụ đến cường độ dòng đỉnh píc 30

Hình 3.9: Đường von – ampe hòa tan của fenofibrat khi thay đổi thế hấp phụ 31

Hình 3.10: Đường von – ampe hòa tan của fenofibrat khi thay đổi tốc độ quét thế 32 Hình 3.11: Ảnh hưởng của tốc độ quét thế đến cường độ dòng đỉnh píc 32

Hình 3.12: Đường chuẩn xác định fenofibrat 33

Hình 3.13: Đường von - ampe hòa tan của fenofibrat trong mẫu thuốc Sandoz 36

Hình 3.14: Đường von – ampe hòa tan trong mẫu huyết tương ở các nồng độ fenofibrat khác nhau sử dụng chiết pha rắn có thêm chuẩn 38

Hình 3.15: : Đường von - ampe hòa tan fenofibrat phụ thuộc vào thành phần dung môi 39

Hình 3.16: Đường von - ampe hòa tan của fenofibrat trong nền mẫu huyết tương 40 Hình 3.17: Đường chuẩn của fenofibrat trên nền mẫu huyết tương 41

Hiện nay, có nhiều loại thuốc uống làm giảm cholesterol trong máu, chủ yếu tập trung ở hai nhóm đó là fibrat và statin Một trong những hoạt chất được sử dụng khá phổ biến cho bệnh nhân điều trị cholesterol cao là fenofibrat Fenofibrat có nhiều ưu điểm vượt trội so với các dẫn chất cùng nhóm, tần suất và cường độ tác dụng phụ thấp, có thể phối hợp với các thuốc thuộc nhóm statin trong điều trị chứng tăng cholesterol trong máu

Hiện nay, vì lợi ích kinh tế đã có không ít tổ chức, cá nhân đã cho ra đời nhiều loại thuốc giả, thuốc kém chất lượng làm nguy hại cho sức khỏe và kinh tế người bệnh Vì vậy, vấn đề kiểm định lại hàm lượng của thuốc theo đúng tiêu chuẩn

là một vấn đề rất quan trọng và thực sự cần thiết

Việc kiểm định chất lượng thuốc ở dạng bào chế cũng như dược động học của thuốc cần phải có phương pháp phân tích một lượng thuốc nhỏ trong các mẫu sinh học để có thể tìm hiểu khả năng tồn tại cũng như khả năng hấp thu của thuốc trong cơ thể để từ đó đưa ra liều lượng đúng và phù hợp với người bệnh

Có nhiều phương pháp được sử dụng để xác định các chất có hoạt tính sinh học nói chung và fenofibrat nói riêng như các phương pháp sắc ký, phương pháp quang phổ UV-Vis, phương pháp cực phổ và von - ampe hòa tan hấp phụ Trong dược điển Việt Nam, fenofibrat đã được nghiên cứu và xác định bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Tuy nhiên, chi phí cho phân tích HPLC cao, quy trình xử lý mẫu phức tạp, thiết bị đắt tiền Do vậy, với mong muốn nghiên cứu một phương pháp có thể kiểm tra song hành với phương pháp trong dược điển nên chúng tôi đã lựa chọn phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ Đây là phương pháp có độ

nhạy và độ chọn lọc cao, quy trình phân tích đơn giản, chi phí phân tích cho mẫu cần kiểm nghiệm không cao Chính vì vậy, trong phạm vi của luận văn, chúng tôi chọn phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ để nghiên cứu các đặc tính điện hóa

và quy trình xác định fenofibrat trong mẫu dược phẩm và mẫu huyết tương

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu về chất nghiên cứu fenofibrat

1.1.1 Cấu tạo của fenofibrat

Fenofibrat có tên khoa học theo IUPAC là propan-2-yl{2-4-[(4-clophenyl) cacbonyl] phenoxy}-2- methylpropanoate được biết với tên thương mại là tricor, là một dẫn xuất của axit fibric [1]

Công thức cấu tạo của fenofibrat như ở hình 1.1:

Hình 1.1: Công thức cấu tạo của fenofibrat Công thức phân tử là: C20H21ClO4, khối lượng mol phân tử là 360,831(g/mol) Fenofibrat là bột kết tinh màu trắng, ít tan trong nước (< 0,5 mg/lít), tan tốt trong metanol [1]

1.1.2 Dược lực học và động học của fenofibrat

1.1.2.1 Dược lực học

Fenofibrat là dẫn chất của axit fibric, thuốc hạ lipid máu Thuốc ức chế sinh tổng hợp cholesterol ở gan, làm giảm các thành phần gây vữa xơ (lipoprotein tỷ trọng rất thấp VLDL và lipoprotein tỷ trọng thấp LDL) làm tăng sản xuất lipoprotein

tỷ trọng cao (HDL), và còn làm giảm triglycerid máu Do đó, thuốc fenofibrat làm cải thiện đáng kể sự phân bố cholesterol trong huyết tương Fenofibrat được dùng để điều trị bệnh nhân có lipoprotein cao trong mẫu huyết tương Fenofibrat có thể làm giảm 20 - 25% cholesterol toàn phần và 40 - 50% triglycerid trong máu [2,3]

1.1.2.2 Dược động học

Fenofibrat được hấp thu tốt từ đường dạ dày, ruột Trong nước tiểu của người uống, fenofibrat chủ yếu tồn tại dưới dạng axit fenofibric Nồng độ của axit fenofibric cao nhất trong huyết tương xảy ra trong vòng 6 đến 8 giờ sau khi uống Lúc này fenofibrat nhanh chóng thủy phân thành axit fenofibric Trong máu không tìm thấy fenofibrat nguyên dạng Dạng chuyển hóa có hoạt tính, axit fenofibrat, kết hợp với axit glucuronic và sau đó được bài tiết trong nước tiểu Fenofibrat được bài tiết chủ yếu trong nước tiểu chiếm khoảng 60% [2,3]

1.2 Các phương pháp xác định fenofibrat

Hiện nay, có nhiều phương pháp khác nhau để xác định fenofibrat như: các phương pháp sắc ký lỏng, phương pháp quang phổ, phương pháp von - ampe…

1.2.1 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao

Phương pháp sắc ký lỏng được sử dụng chủ yếu để xác định đồng thời fenofibrat và một số chất khác trong mẫu sinh học với các điều kiện: các chất phân tích được thực hiện trên cột RP C18, kích thước hạt phù hợp, detector UV

A.Arora1 và các cộng sự đã xác định fenofibrat trong mẫu huyết tương bằng phương pháp HPLC Nội dung nghiên cứu là mô tả cụ thể quy trình xác định fenofibrat trong huyết tương người sử dụng sắc kí lỏng pha đảo Pha động được sử dụng đơn giản với độ nhạy đủ để định lượng fenofibrat với lượng thấp 0,095 mg /mL, hệ số biến thiên thấp hơn 20% và độ chính xác dao động từ 101,99 -107,41%, Khoảng tuyết tính từ 0,095 mg/mL đến 19,924 mg/mL, R2 lớn hơn 0,98 Phương pháp trên có giá trị trong việc phân tích của thuốc trong huyết tương người Các phương pháp với hiệu chỉnh nhỏ có thể được sử dụng để phân tích thuốc ở dạng bào chế khác nhau [14]

Để xác định đồng thời atorvastatin canxi, ezetimib và fenofibrat trong mẫu sinh học, Archita Patel và các cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu năng cao Các chất phân tích được thực hiện trên cột RP C18 (kích thước hạt 5 mm,

đường kính 150 mm × 4,6 mm), pha động gồm metanol - axetonitrin - nước (76 + 13 + 11, v/v/v), tốc độ dòng 1 ml/phút Sử dụng detector UV ở bước sóng 253 nm thì thời gian lưu của atorvastatin canxi, ezetimib và fenofibrat lần lượt ở 2,25; 3,68; 6,41 phút, khoảng tuyến tính từ 2 – 10 µg/mL (R2 = 0,998) cho atorvastatin và ezetimib, 40 – 120 µg/mL (R2 = 0,998) cho fenofibrat, LOD và LOQ của atorvastatin nằm trong khoảng 0,11 - 0,3477 µg.mL-1; của ezetimibe 0,07 - 0,2177 µg.mL-1; và của fenofibrat 0,25 - 0,77 µg.mL-1 Hiệu suất thu hồi của atorvastatin canxi; ezetimib và fenofibrat lần lượt là 99,83%; 99,89%; 99,98% và độ lệch chuẩn nhỏ hơn 2% [21]

Phương pháp sắc kí lỏng cũng được Fathy M.M Salama và các cộng sự sử dụng để xác định chính xác hàm lượng fenofibrat trong mẫu dược phẩm với điều kiện cột C18 restekpinnacle II phenyl (5µm, 250mm × 4,6mm) và pinnacle II phenyl (5 µm, 10 mm × 4), pha động gồm metanol 0,1%; axit photphoric ( 60 : 40; v/v) với tốc độ dòng 2 mL/phút, nhiệt độ cột 500C, pH = 2,5 Detector UV đặt tại các bước sóng 302 nm đối với chất nội chuẩn (IS) và 289 nm đối với fenofibrat Khoảng tuyến tính từ 60 - 140 ppm với hệ số tương quan bằng 0,9999; hiệu suất thu hồi của quy trình xử lý mẫu fenofibrat từ 99,77 - 100,39% [27]

Rayan G Alamri, Kazi Mohsina, Ajaz Ahmad, Mohammad Raishc và Fars K Alanazia đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu năng cao với detector UV (UHPL - UV) để xác định fenofibrat và axit fenofibric bị chuyển hóa trong mẫu huyết tương của chuột bạch Nhóm tác giả đã sử dụng điều kiện phân tích của hệ sắc ký lỏng như sau: cột C18 với thành phần pha động là metanol và nước (65 : 35), tốc độ dòng là 0,3 mL/phút (đẳng dòng) và bước sóng hấp thụ của detector UV là

284 nm Để đo được nồng độ của fenofibrat và axit fenofibric trong mẫu huyết tương chuột thì các tác giả đã sử dụng kĩ thuật xử lý mẫu là chiết lỏng lỏng với quy trình như sau: mẫu huyết tương được lấy và chuyển vào các ống ly tâm 1,5 mL Sau

đó thêm chuẩn các dung dịch fenofibrat, axit fenofibric và chất nội chuẩn (2500 ng/mL) rồi trộn đều Sử dụng metanol để kết tủa huyết tương Tiếp theo quay ly tâm trong 10 phút với tốc độ quay là 2500 vòng/ phút Sau khi ly tâm, phần dung dịch

được đuổi bằng N2 ở 45 - 50oC và cuối cùng cặn được hòa tan bằng 200 µl pha động

và được bơm vào hệ sắc ký Các kết quả đạt được: giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng là 30 và 90 ng/mL với fenofibrat và 40 và 100 ng/mL đối với axit fenofibric cùng với hệ số biến thiên trong ngày nhỏ hơn 5% [32]

Để xác định được nồng độ fenofibrat trong huyết tương của người, nhóm nghiên cứu đã sử dụng xử lý mẫu bằng kĩ thuật chiết pha rắn và phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector UV Điều kiện của hệ sắc ký là pha động đệm phosphat với metanol tỉ lệ 40 : 60, bước sóng UV là 288 nm, nhiệt độ cột là 350C và tốc độ dòng là 0,8 mL/phút, giới hạn phát hiện là 36 µg/mL Với đặc điểm là nền mẫu phức tạp thì nhóm tác giả đã nghiên cứu thành công khi tìm ra quy trình chiết pha rắn: trước hết rửa cột bằng 1ml metanol và 1ml đệm photphat với tốc độ là 6,00 mL/phút Sau đó,bơm lên cột 0,8 mL mẫu với tốc độ là 0,18 mL/phút; dung dịch rửa tạp là 1mL đệm photphat pH = 7,4, tốc độ chảy là 1,5 mL/phút; dung dịch rửa giải là 1mL metanol và 1mL axit photphoric 0,04 M, hiệu suất thu hồi xác định fenofibrat trong huyết tương người đạt trên 99% [23]

Nhóm tác giả Dasandi Bhavesh, Sanjay Shaha và Shivprakash cũng đã xác định hàm lượng của axit fenofibric trong huyết tương người bằng phương pháp sắc

kí khối phổ với các điều kiện đo: Cột C18 sử dụng chế độ đẳng dòng với tốc độ là 0,2 mL/phút và sử dụng chiết lỏng lỏng để chiết axit fenofibric với quy trình: 250

µL huyết tương của người được thêm 25 µL chất nội chuẩn axit mefenamic là 7,0 µg/mL; sau đó trộn với 250 µL axit formic 0,1% và lắc đều trong 10 s; rồi đem đi lắc với 4,5 mL hỗn hợp đietylete và etyl acetat tỉ lệ 1: 1 trong 5 phút; tiếp đó quay ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút; cuối cùng lấy phần hữu cơ đem đuổi dung môi bằng khí N2 ở nhiệt độ 450C rồi hòa tan phần cặn bằng 0,5 mL ACN và nước tỉ lệ 1:1 Kết quả thu được: khoảng tuyến tính từ 0,05 - 7,129 µg/mL và kết quả cho thấy hàm lượng của axit fenofibric sẽ giảm dần sau khi người bệnh uống thuốc sau 5 giờ và lượng hấp thụ lớn nhất của người bệnh là từ 4 - 5 giờ sau khi uống [25]

Để xác định đồng thời hàm lượng của atorvastatin canxi và fenofibrat trong thuốc viên, các tác giả N.Jain, R Raghuwanshi và Deepti Jain đã sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao – pha đảo Với các điều kiện của hệ sắc ký là cột luna C18; pha động metanol – đệm axetat pH 3,7 tỉ lệ 82 : 18 (v/v); tốc độ dòng 1,5 mL/phút, nhiệt độ cột là 25oC, bước sóng xác định là 248 nm và các chất có thời gian lưu lần lượt là 3,02 phút và 9,05 phút Kết quả thu được khoảng tuyến tính từ 1-5 µg/mL và 16 - 80 µg/mL tương ứng với atorvastatin canxi và fenofibrat Sau đó

áp dụng điều kiện phân tích đó để xác định hàm lượng atorvastatin canxi và fenofibrat trong mẫu thuốc viên với quy trình xử lý mẫu sử dụng metanol – nước tỉ

lệ 80 : 20 (v/v) để chiết, thu được kết quả rất tốt khi cả hai chất đều được chiết đạt hiệu suất thu hồi trên 100% [30]

Phương pháp sắc kí lỏng khối phổ - khối phổ (UPLC - MS/MS) được Alothman ZA và các cộng sự dùng để xác định fenofibrat trong mẫu dược phẩm và mẫu huyết tương người Quy trình xử lý mẫu: mẫu huyết tương được thêm 5 mL dung môi có chứa (etyl acetat : đietylete) sau đó được cho vào máy lắc 10 phút rồi quay li tâm trong 10 phút ở 5000 rpm, tiếp đó tách lấy lớp huyết tương Các điều kiện tối ưu: cột tách C18 cột (kích thước hạt 1,7 mm; ID 50 mm x 2.1 mm), dung dịch rửa giải isocratic, pha động gồm metanol và nước (80 : 20%, v/v), tổng thời gian phân tích 2 phút Khoảng tuyến tính từ 0,5 - 200 ng/mL (r2 = 0,993; n = 6), với (LOD) = 0,12 µg/mL; (LOQ) = 0,41 µg/mL, độ thu hồi fenofibrat trong huyết tương (96,41 ± 6,14)% với độ lệch chuẩn tương đối ít hơn 3% [17]

Để xác định được hàm lượng của fenofibrat và sản phẩm thủy phân của chúng trong mẫu thuốc, Alaa El - Gindy và các cộng sự đã sử dụng phương pháp sắc

kí lỏng khối phổ với các điều kiện: cột tách ODS với pha động gồm axetonitrin: nước (80 : 20, v/v, tại pH = 4) với detector UV bước sóng ở 287 nm cho fenofibrat

và một pha động chứa axetonitrin – 10 mM KH2HPO4 0,1% dietylamin (60 : 40, v/v; pH = 4,6) với bước sóng phát hiện ở 270 nm cho vinpocetine Phép phân tích cho kết quả LOD và LOQ của vinpocetin lần lượt là 2,00.10-2 µm.mL-1 và 6,66.10-2

µm.mL-1; hệ số tương quan R2 = 0,9999; tương ứng với fenofibrat là 2,02.10-2 µm.mL-1 và 6,72 10-2 µm.mL-1 và hệ số tương quan R2 = 0,9998 [16]

1.2.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử

Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử xác định đồng thời hàm lượng fenofibrat và rosuvastin trong mẫu huyết tương người đã được nghiên cứu Các điều kiện đo được thực hiện trong nền metanol với bước sóng cho tín hiệu của rosuvastin

là 243 nm, fenofibrat là 287 nm, khoảng nồng độ tuyến tính của fenofibrat là 4 - 28 ng/L; của rosuvastin là 1 – 6 ng/L, hệ số tương quan R2 = 0,9921; hiệu suất thu hồi fenofibrat nằm trong khoảng 96,3 % - 100,27 % [20]

Bên cạnh đó, phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao kết hợp với quang phổ đạo hàm bậc 2 được Amer M.A Alanazi và các cộng sự sử dụng để xác định đồng thời pravastatin và fenofibrat trong dược phẩm Các điều kiện phân tích được thực hiện trên cột C18 ( kích thước hạt 5 mm, đường kính 125 mm x 4,6 mm), chất rửa giải isocratic, sử dụng pha động gồm axetonitrin 0,1% và đietylamin (50 : 50, v/v, tại pH = 4,5) với tốc độ dòng 1,0 mL/phút, chất được đo ở bước sóng 240 nm và hai chất này được xác định với thời gian lưu là 2,15 phút và 5,79 phút cho pravastatin và fenofibrat Khoảng tuyến tính đối với pravastatin là 5-50 µg.mL-1, hệ số tương quan

R2 = 0,999 tương ứng với fenofibrat là 20 – 200 µg.mL-1, hệ số tương quan R2 = 0,996 Giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng của pravastatin và fenofibrat lần lượt là 1,5; 5,0 µg.mL-1 và 6,5; 5,0 µg.mL-1 Cùng với phương pháp HPLC, tác giả cũng sử dụng phương pháp đạo hàm quang phổ bậc 2 để xác định pravastatin và fenofibrat tại hai bước sóng 237,6 nm và 295,1 nm; hệ số tương quan của pravastatin và fenofibrat đồng thời là R2 = 0,999, khoảng tuyến tính của pravastatin

và fenofibrat lần lượt là 5 - 20 và 3 - 20 µg.mL-1, giới hạn phát hiện của pravastatin

là 1,5 µg.mL-1; fenofibrat là 1,0 µg.mL-1 Giới hạn định lượng của pravastatin và fenofibrat tương ứng là 5,0 µg.mL-1 và 3,0 µg.mL-1 [18]

Phương pháp hấp thụ phân tử được Panikumar D Anumolu và cộng sự sử dụng để xác định atorvastatin và fenofibrat trong thuốc Atorvastatin và fenofibrat

được phát hiện ở bước sóng lần lượt là 281 nm và 296 nm Khoảng nồng độ tuyến tính được xác định trong khoảng 2 - 12 ng/mL cho atorvastatin và 1 – 30 ng/mL cho fenofibrat, hệ số tương quan thu được tương ứng của atovastatin và fenofibrat là R2

= 0,9971 và 0,9985; hiệu suất thu hồi 98,8 - 102,5% cho atorvastatin và 99,6 - 100,25% cho fenofibrat [31]

M.S.Kondawar và các cộng sự đã sử dụng phương pháp quang phổ UV để xác định đồng thời ezetimibe và fenofibrat trong thuốc và các dạng bào chế Bước sóng tìm thấy tối đa cho ezetimibe là 232,6 nm và fenofibrat là 286,6 nm Khoảng nồng độ có thể xác định được cho cả hai chất là 2 – 20 µg/ml Hiệu suất thu hồi đạt 98,67% - 100,34 % [29]

Phương pháp quang phổ cũng đã được Faizal P P và các cộng sự sử dụng để xác định fenofibrat dựa trên sự hấp thụ quang của fenofibrat trên nền metanol trong môi trường pH = 3,07 tại bước sóng 596 nm Khoảng tuyến tính của fenofibrat từ 2 -

5 μg/mL Hiệu suất thu hồi 100,3 % đến 100,37 %, với giới hạn phát hiện (LOD) 0,02 µg/mL, giới hạn định lượng (LOQ) 0,1 µg/mL [26]

1.2.3 Phương pháp von - ampe hòa tan

Fathy M M Salama và các cộng sự đã sử dụng kĩ thuật quét sóng vuông và xung vi phân với điện cực giọt thủy ngân rơi, điện cực so sánh là điện cực AgCl được sử dụng để xác định đồng thời etofibrate, fenofibrat và atorvastatin trong mẫu huyết tương và mẫu dược phẩm Thu được các giá trị độ lệch chuẩn tương đối là < 2% Giới hạn phát hiện (LOD) và định lượng (LOQ) được trong phạm vi 0,037 - 0,21 µg/mL và 0,12 - 0,71 µg/mL, cho thấy độ nhạy cao [27]

Abdel - Hay KM và cộng sự đã sử dụng hai kĩ thuật xung vi phân và von – ampe sóng vuôn để xác định etofibrat, fenofibrat và atovastatin trong mẫu dược phẩm và huyết tương người bởi sự khử trên điện cực giọt thủy ngân với điện cực so sánh là Ag/AgCl Với việc dùng kĩ thuật von – ampe vòng thì nhận thấy rằng các chất này là bất thuận nghịch Sau khi tối ưu tất cả các điều kiện: pH tương ứng của etofibrat, fenofibrat và atovastatin lần lượt là 7,0; 7,0 và 7,5; tốc độ quét tương ứng

lần lượt là 50 mV/s; 40 mV/s và 60mV/s và biên độ xung 50 mV, các tác giả đã xây dựng đường chuẩn xác định giới hạn phát hiện và giới hạn định lượng nằm trong khoảng 0,037 – 0,21 µg/mL và 0,12 – 0,71µg/mL Cuối cùng tác giả đã áp dụng phân tích được 03 mẫu thuốc Với quy trình xử lí mẫu huyết tương: 1,0 mL huyết tương đã được thêm chuẩn được pha loãng bằng 5 mL metanol được đựng trong ống 10mL Sau đó dung dịch được quay li tâm trong 10 phút với tốc độ quét 5000 vòng/phút Lấy 2,5 mL dung dịch sau li tâm chuyển vào bình định mức 5,0 mL và định mức bằng hệ đệm với điều kiện như trên [15]

Ceren Yardımcı, Nuran Özaltın đã tiến hành nghiên cứu tính chất điện hóa của fenofibrat trong mẫu dược phẩm bằng phương pháp cực phổ sóng vuông trên điện cực thủy ngân treo với dung dịch đệm borat tại pH = 9,0 Tác giả sử dụng nền metanol, hệ số khuếch tán là 2,38 × 10-6 cm2.s-1 Thế đỉnh píc của fenofibrat Ep= -1,2 V, khoảng tuyến tính từ 0,146 ppm - 4,96 ppm, hệ số tương quan R2 = 0,9992; giới hạn phát hiện (LOD) là 0,025 ppm [24]

Qua tổng quan tài liệu thấy rằng, phương pháp von - ampe có thể xác định được fenofibrat trong mẫu thuốc và mẫu sinh học Tuy nhiên, chưa nhiều công trình nghiên cứu đầy đủ các đặc tính điện hóa cũng như khả năng hấp phụ chất trên điện cực HDME Do vậy trong luận văn này, chúng tôi lựa chọn phương pháp von – ampe hòa tan hấp phụ để nghiên cứu và xác định fenofibrat trong mẫu thuốc và huyết tương

1.3 Giới thiệu về phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ

1.3.1 Nguyên tắc của phương pháp von - ampe hòa tan hấp phu ̣

Về cơ sở lý thuyết, phương pháp AdSV khác biệt cơ bản với phương pháp ASV ở cơ chế của quá trình làm giàu (hay quá trình tı́ch lu ỹ chất trên bề mặt cực làm việc)

+ Giai đoạn làm giàu: Trong phương pháp AdSV, nếu chất phân tích là chất hữu cơ thì bản thân chất phân tích có khả năng tự hấp phụ lên bề mặt điện cực tại 1 thế thích hợp Nếu chất phân tích là ion kim loại thì cần thêm phối tử hữu cơ có khả

năng tạo phức với ion kim loại để tạo thành phức có khả năng hấp phụ trên bề mặt điện cực Trong thời gian làm giàu, thế được giữ không đổi Các điện cực làm việc trong AdSV thường được sử dụng như: HMDE, SMDE, Pt, than nhão (CPE), điện cực graphit ngâm tẩm, các điện cực có biến tính hoá học Tuy nhiên đa số các nghiên cứu sử dụng kĩ thuật AdSV thường sử dụng điện cực HMDE do điện cực này

có nhiều ưu điểm: bề mặt được tự làm sạch và lặp lại, dễ tự động hoá

+ Giai đoạn hoà tan: thế được quét theo chiều catot (chiều âm hơn) và lúc này xảy ra quá trình khử các tiểu phần đã bị hấp phụ theo ba cơ chế sau:

(1) Khử ion kim loại trong phức chất

(2) Khử phối tử trong phức chất

(3) Khử xúc tác hydro

Trong phương pháp AdSV, khi ghi đường von - ampe hoà tan, có thể sử dụng các kỹ thuật ghi đường von - ampe như trong phương pháp ASV Tín hiệu đỉnh trên đường von - ampe hoà tan là cơ sở để định lượng theo phương pháp AdSV Tín hiệu von - ampe hoà tan tỷ lệ thuận với nồng độ bề mặt của phức được hấp phụ trên cực làm việc theo phương trình (1)

Q = n.F.S.C0 (1) Trong đó,

Q : điện lượng cần thiết để khử chất điện hoạt đã được hấp phụ

n : Số electron trao đổi trong phản ứng điện cực tổng cộng

F (C/mol): hằng số Faraday

S (cm2): diện tích bề mặt cực làm việc

C0 (mol/cm2): nồng độ bề mặt của phức hấp phụ trên điện cực

Với một tốc độ quét thế xác định, dòng đỉnh píc hòa tan (Ip) tỉ lệ thuận với Q nên Ip tỉ lệ với S và C0 Mà C0 tỉ lệ với nồng độ chất trong dung dịch phân tích (C) khi các điều kiê ̣n hấp phu ̣ được lă ̣p la ̣i , nên Ip tỉ lệ với S và C Để đạt được độ nhạy

cao khi phân tích bằng AdSV cần tìm các điều kiện tối ưu cho quá trình hấp phụ

Do vậy, cường độ dòng phụ thuộc vào một số yếu tố như loại điện cực, thời gian tích lũy, thế tích lũy, dung môi, đặc tính bề mặt của điện cực, diện tích điện cực, lực ion, pH và nhiệt độ Vì thế, cường độ dòng Ip = K.C, trong đó K là hệ số thực nghiệm, phụ thuộc vào các điều kiện: 1) điều kiện tích lũy (làm giàu) như thời gian tích lũy, thế tích lũy, tốc độ khuấy, nhiệt độ và thành phần dung dịch như pH, nồng

độ đệm; 2) Điều kiện hòa tan như tốc độ quét thế, kiểu quét thế (xung vi phân, xung thường, sóng vuông, dòng xoay chiều); 3) Nồng độ chất nghiên cứu và bản chất của chất trong dung dịch (chất đó có khả năng hấp phụ trực tiếp hay gián tiếp thông qua tạo phức với các phối tử khác) Khi khống chế được các điều kiện tích lũy và thành phần dung dịch thì tìm được mối quan hệ trực tiếp Ip và C Ip bị ảnh hưởng trực tiếp bởi bản chất của chất hấp phụ và bị ảnh hưởng gián tiếp vào thời gian tích lũy, thế tích lũy, tốc độ khuấy, thành phần dung dịch điện phân, nhiệt độ Do vậy, phải nghiên cứu chọn các điều kiện tối ưu để hệ số K không thay đổi, đảm bảo độ lặp lại

và độ chính xác của phép đo Cần phải nhấn mạnh thêm rằng, thực chất của phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ là thực hiện quá trình tích lũy chất lên bề mặt điện cực (giai đoạn tích lũy chất tại một thế cố định trong một thời gian nhất định như là một kỹ thuật làm giàu chất), sau đó ghi tín hiệu hòa tan, tín hiệu thu được dạng píc

là dòng hoà tan của sản phẩm hấp phụ lên bề mặt điện cực

Thế đỉnh píc hòa tan (Ep) và cường độ dòng píc hòa tan (Ip) phụ thuộc vào các yếu tố như: thành phần nền, phối tử tạo phức, pH, thời gian tích lũy, thế tích lũy, bản chất của đi ện cực làm việc, kỹ thuật ghi đường von - ampe hòa tan Trong những điều kiện xác định, Ep đặc trưng cho bản chất điện hóa của chất phân tích và

do đó dùng để phân tích định tính Ip tỉ lệ thuận với nồng độ chất phân tích trong dung dịch, do vậy Ip dùng để phân tích định lượng

Phương pháp AdSV đặc biệt thích hợp để phân tích các ion kim loại không thể xác định được bằng kĩ thuật cực phổ thông thường (hay quá trình xác định rất phức tạp) như: Al, Ca, Be, Pt, Ga, Nb hay các chất hữu cơ Cũng như von - ampe hoà tan thông thường, phương pháp von - ampe hoà tan hấp phụ nhạy hơn so với các phương pháp

von - ampe điện hoá trực tiếp qua yếu tố làm giàu (tích luỹ) Ngoài những ưu điểm trên, phương pháp AdSV còn có những ưu điểm riêng so với phương pháp SV như:

- Độ nhạy của AdSV thường lớn hơn nhiều so với ASV do kim loại không hoà tan trong thuỷ ngân mà tạo thành các lớp phức đơn phân tử Ví dụ như điện cực màng thuỷ ngân

- Xác định được nhiều kim loại hơn và độ chọn lọc cao hơn so với phương pháp ASV và CSV do có thể lựa chọn được nhiều thuốc thử tạo phức bền và chọn lọc với kim loại cần phân tích [19,22]

- AdSV đặc biệt tỏ ra có ưu điểm trong phân tích các chất có hoạt tính sinh học, dược phẩm bao gồm những chất có hoạt tính điện hóa, có khả năng hấp phụ trên

bề mặt điện cực giọt Hg và cả các chất không có hoạt tính điện hóa trực tiếp trên điện cực giọt cũng có thể được xác định sau khi dẫn xuất hoá bằng cách gắn với các nhóm

dễ khử như nitroso, nitro hoặc thủy phân tạo thành chất mới có hoạt tính điện hóa

- Một điểm đặc biệt của phương pháp von - ampe hoà tan hấp phụ là dựa vào các đặc tính hấp phụ ta có thể giải quyết được bài toán liên quan đến các quá trình điện cực, cơ chế phản ứng xảy ra trên điện cực như thế nào

- Phương pháp AdSV có thể loại trừ được ảnh hưởng của các yếu tố cản trở bằng cách chọn các điều kiện thí nghiệm thích hợp như: thành phần nền, pH, và thế hấp phu ̣ làm giàu

1.3.2 Các kỹ thuật ghi đo tín hiệu hoà tan chất cần phân tích

1.3.2.1 Kỹ thuật DP

Điê ̣n cực chı̉ thi ̣ được phân cực bằng điê ̣n áp mô ̣t chiều biến thiên tuyến tı́nh với tốc đô ̣ châ ̣m (vài mV/s), cuối chu kỳ gio ̣t người ta đă ̣t vào mô ̣t xung vuông góc với biên đô ̣ 10 - 100 mV (thường cho ̣n 50 mV), thời gian đă ̣t xu ng 40 - 100 ms, cường đô ̣ dòng được ghi 2 lần ta ̣i thời điểm 16,7 ms trước khi na ̣p xung và ngắt xung Đường biểu diễn sự khác nhau giữa hai dòng này vào thế điện cực có dạng píc, rất dễ xác định và có độ phân giải cao Do vậy xung vi phân giảm tối đa dòng dư, một hạn chế của cực phổ cổ điển

Thông thường các đi ều kiện được cho ̣n như sau : thời gian giữa các xung 100 ms; độ dài xung 30 ms; thời gian đo 10 ms; bước thế 5mV; khi đó tốc độ quét cũng đạt 50 mV/s Cho kết quả tốt với cả hê ̣ thuâ ̣ n nghi ̣ch và không thuâ ̣n nghi ̣ch , nhưng không quét được với tốc đô ̣ cao [5]

1.3.2.2 Kỹ thuật xung thường

Điê ̣n cực được phân cực bằng điê ̣n áp mô ̣t chiều không đổi trong suốt thời gian ghi, tại một thời điểm xác định điện cực đ ược phân cực thêm một xung điện dạng vuông góc có thời gian tồn tại ngắn (30 - 50 ms), sau đó xung bi ̣ ngắt và cả quá trình phân cực biên độ xung tăng dần, dòng khử cực được ghi tại thời điểm xác định ( thường 16,7 ms trước khi ngắt xung) [5]

Cực làm việc là cực HDME dùng trong phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ xác định fenofibrat

Cực HMDE là loại cực được dùng phổ biến nhất trong phương pháp von - ampe hòa tan Nó là một giọt thủy ngân hình cầu kích thước nhỏ được treo trên đầu cuối của một mao quản có đường kính trong 0,15 – 0,5 mm Sau mỗi phép đo, giọt thủy ngân bị cưỡng bức rơi ra khỏi mao quản và nó được thay thế bằng một giọt mới tương tự Một kiểu cực giống với cực HMDE cũng thường được dùng là cực giọt thủy ngân tĩnh (SMDE) do hãng PAR (USA) chế tạo Cực HMDE và SMDE cho kết quả đo có độ chính xác cao và độ lặp lại cao, có quá thế với hidro lớn khoảng -1,5 V trong môi trường kiềm và trung tính; - 1,2 V trong môi trường axit, nên các cực này

có khoảng điện hoạt rộng, do đó cho phép chúng ta nghiên cứu trong một khoảng thế rộng Chúng được dùng rộng rãi để xác định các kim loại, các hợp chất hữu cơ

Điểm hạn chế của HMDE và SMDE là khó chế tạo, vì rất khó tạo ra các giọt thủy ngân có kích thước lặp lại hoàn hảo Ngoài ra chúng không cho phép xác định các kim loại có thế hòa tan dương

CHƯƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu

Mục tiêu của đề tài là nghiên cứu đặc tính điện hóa và quy trình xác định fenofibrat bằng phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ xung vi phân, sử dụng điện cực giọt thủy ngân treo (HMDE) Từ đó, ứng dụng quy trình để phân tích một

số mẫu thuốc và mẫu huyết tương

2.1.2 Nội dung nghiên cứu

Để đạt được mục tiêu đề ra, các nội dung cần thực hiện bao gồm:

- Nghiên cứu đặc tính điện hóa của fenofibrat bằng phương pháp von - ampe vòng

- Khảo sát các điều kiện tối ưu :

+ Khảo sát ảnh hưởng pH của dung dịch đệm

+ Khảo sát ảnh hưởng của thời gian hấp phụ

+ Khảo sát ảnh hưởng của thế hấp phụ

+ Khảo sát ảnh hưởng của tốc độ quét

- Xây dựng đường chuẩn và đánh giá phương pháp

- Ứng dụng phân tích một số mẫu thuốc

- Xây dựng đường chuẩn của fenofibrat trong nền mẫu huyết tương

2.2 Phương pháp nghiên cứu

2.2.1 Tiến trình thí nghiệm theo phương pháp CV

Các thí nghiệm đo đường von - ampe vòng được ghi trong một khoảng thế rộng nhất định trong hai trường hợp ghi trực tiếp (tacc = 0 s) và có tích lũy (tacc = 30 s), xác định giá trị Ip và Ep của tín hiệu thu được Tất cả các thí nghiệm được tiến hành ở nhiệt độ phòng, thường là 250C

- Ghi đường CV trực tiếp: Cho dung dịch cần nghiên cứu vào bình điện phân (hệ 3 điện cực) Loại oxy bằng khí nitơ với thời gian 300 s Sau đó ghi đường hòa tan một vòng trong khoảng thế nhất định, quan sát sự xuất hiện píc trên đường phân cực catot và trên đường phân cực anot, xác định các thông số đặc trưng của đường

CV

- Ghi đường CV hòa tan hấp phụ:

+ Bước 1: Tích lũy chất trên bề mặt điện cực HMDE tại một thế tích lũy (Ehp

= 0 V) trong một khoảng thời gian nhất định (thp = 60s) Trong giai đoạn này dung dịch được khuấy bởi một thanh khuấy với tốc độ không đổi, chất nghiên cứu đi đến

bề mặt điện cực, hấp phụ trên bề mặt điện cực đó

+ Bước 2 - Cân bằng: Kết thúc giai đoạn tích lũy, dung dịch được ngừng khuấy, thời gian cân bằng 5 s để chất phân bố đồng đều trên bề mặt điện cực

+ Bước 3 - Hòa tan: Kết thúc giai đoạn cân bằng, ghi đường hòa tan một vòng hoặc đa vòng trong một khoảng thế nhất định Quan sát sự xuất hiện píc trên đường phân cực catot và anot, xác định các giá trị đặc trưng như thế đỉnh píc, cường

độ dòng píc Lý giải các quá trình xảy ra dựa vào đường CV [28]

Ghi đường CV của mẫu trắng ( nền) là mẫu có thành phần tương tự như dung dịch nghiên cứu, nhưng không chứa chất nghiên cứu fenofibrat cũng được ghi tương

tự như trên và thường được ghi trước trong bất kỳ nghiên cứu nào Toàn bộ quá trình ghi đường CV và xác định Ep và Ip được thực hiện trên thiết bị phân tích điện hóa Autolab µA III (Hà Lan) kết nối với VA Stand 663 (Metrohm, Thụy Sĩ), bình điện hóa là hệ 3 điện cực

2.2.2 Tiến trình thí nghiệm theo phương pháp DP - AdSV

Bước 1- Tích lũy chất: Cho dung dịch gồm chất nghiên cứu, nền vào bình điện hóa, sau giai đoạn sục khí N2 để loại oxy là giai đoạn tích lũy chất lên bề mặt điện cực tại thế tích lũy với thời gian tích lũy nhất định Thế tích lũy là thông số quan trọng, ảnh hưởng nhiều đến cường độ dòng nên cần được nghiên cứu khảo sát trước tiên để chọn thế thích hợp

Bước 2 – cân bằng: Sau thời gian tích lũy chất là thời gian cân bằng để chất phân tích được phân bố đồng đều trên bề mặt điện cực Thời gian cân bằng là 5 s

Bước 3 - Hòa tan: Ghi đường hòa tan catot với tốc độ quét 10,0 mV/s Các yếu tố ảnh hưởng đến dòng hòa tan (Ip) như thế tích lũy, pH, thời gian tích lũy, nhiệt

độ, nồng độ, khoảng tuyến tính đều lần lượt được khảo sát, quy trình thực nghiệm tiến hành tương tự

2.2.3 Xử lý mẫu

2.2.3.1 Xử lý mẫu thuốc

Cân khối lượng 10 viên thuốc trên cân phân tích có độ chính xác ± 0,0001 g Tính khối lượng trung bình của 1 viên (m) Cân a (g) thuốc đã nghiền mịn trên cân phân tích, thêm 20,00 mL metanol vào cốc 100,00 mL, rung siêu âm 20 phút cho thuốc tan hết, định mức vào bình 25,0 ml Lọc dung dịch bằng giấy lọc băng xanh thu được dung dịch A có nồng độ C0 (M) Hút 0,25 mL dung dịch A định mức 25,00

mL được dung dịch B có nồng độ C1 (M) Từ dung dịch B có nồng độ C1(M), ta lấy 0,25 mL dung dịch B và 10,00 mL dung dịch đệm B - R tại pH = 8,5 định mức trong bình 25,00 mL, ta được dung dịch C có nồng độ Cx (M) Nồng độ fenofibrat (Cx) trong viên thuốc được xác định bằng phương pháp thêm chuẩn một điểm

Khối lượng fenofibrat trong 1 viên thuốc được tính theo công thức:

+ mfenofibrat: hàm lượng của fenofibrat trong 1 viên thuốc (mg)

+ m: khối lượng 1 viên thuốc (g)

+ a: khối lượng thuốc đem phân tích(g)

+ Cx: nồng độ mol/l của dung dịch đo

2.2.3.2 Mẫu huyết tương

Huyết tương (plasma) là một trong hai thành phần chính của mô máu, là dịch chứa các thành phần vô hình và hòa tan rất nhiều protein, hormone và các chất khác Huyết tương chứa 90% nước về thể tích và 10% còn lại là các chất tan như: albumin, globumin, axit amin và các nguyên tố vi lượng…Các chất này gây ảnh hưởng nhiều đến kết quả phân tích nên không thể đo trực tiếp mẫu huyết tương Bởi vậy, trước

khi đo phải tiến hành xử lý mẫu

Trong phân tích mẫu, xử lí mẫu là bước đầu tiên nhưng lại là bước rất quan trọng Nó thường là nguồn sai số số lớn cho kết quả, thậm chí quyết định sự thành công của phương pháp phân tích

Xử lí mẫu trước hết nhằm đảm bảo chất phân tích không bị mất đi trong cả quá trình phân tích Việc xử lí mẫu huyết tương sẽ loại bỏ được thành phần gây cản trở cho chất phân tích mà thành phần chủ yếu là protein

Quy trình xử lí mẫu huyết tương

Mẫu huyết tương được đông lạnh ngay sau khi lấy mẫu và được bảo quản ở

nhiệt độ - 400C để hạn chế sự chuyển hóa của axit lactone Trước khi phân tích lấy mẫu huyết tương ra để rã đông ở nhiệt độ phòng Lấy 1,00 mL huyết tương đã thêm fenofibrat chuẩn và 4,00 mL dung dịch axeton nitrin vào ống nghiệm có nắp xoáy Sau đó đem lắc votex trong 2 phút và đem quay ly tâm ở 4000 vòng/phút trong 15 phút Dịch thu được đem lọc qua màng lọc 0,45 µm Sau đó hút 2,50 mL dịch lọc, thêm 10,00 mL đệm B - R vào, định mức bình 25,00 mL rồi tiến hành đo với các điều kiện đã được khảo sát

2.3 Trang thiết bị và hóa chất

2.3.1 Các dụng cụ và thiết bị đƣợc sử dụng

* Thiết bị:

- Thiết bị phân tích điện hóa Metrohm - Autolab có ghép nối với máy tính và phần mềm điều khiển

Hình 2.1: Thiết bị phân tích điện hóa Metrohm - Autolab

Hệ điện cực:

Điện cực làm việc: điện cực giọt thủy ngân treo (HMDE)

Điện cực so sánh: Ag/AgCl/KCl (bão hòa)

Điện cực phụ trợ: thanh cacbon

- Máy đo pH meter TOA – Nhật Bản

- Cân phân tích startorius (độ chính xác 0,1 mg)

2.3.2.1 Chất chuẩn

- Fenofibrat dạng bột, tinh khiết 99,99% (USA)

2.3.2.2 Hóa chất dung môi

- Axit axetic (CH3COOH) ( PA, Merck)

- Axit photphoric (H3PO4) ( PA, Deajung, Hàn Quốc, 85%)

- NaOH ( PA, Merck)

- Axit H3BO3( PA, Merck)

- Metanol (CH3OH), ( PA, Merck)

- Axetonitrin (ACN), (PA, Merck)

- Nước siêu tinh khiết là nước cất hai lần được lọc qua bộ lọc siêu tinh khiết

có cột trao đổi cation, anion và màng lọc 0,2 µm

2.3.3 Chuẩn bị các dung dịch hóa chất

2.3.3.1 Pha dung dịch chuẩn gốc fenofibrat 1x10 -2mol.L-1

Cân chính xác 90,2 ± 0,1 mg chất chuẩn fenofibrat (M = 360,831 g/mol), cân bằng cân phân tích startorius (độ chính xác 0,1 mg) pha trong metanol, rung siêu âm

10 phút và chuyển vào bình định mức 25,00 mL Định mức tới vạch ta được dung dịch chuẩn gốc có nồng độ 1x10-2 M Dung dịch gốc được bảo quản trong tủ lạnh với nhiệt độ khoảng 00C

Dung dịch gốc trước khi sử dụng phải đưa về nhiệt độ phòng sau đó lắc đều dung dịch Các dung dịch chuẩn làm việc được pha từ dung dịch gốc sử dụng trong ngày

2.3.3.2 Pha dung dịch chuẩn làm việc fenofibrat

Pha dung dịch fenofibrat nồng độ 1x10-4 mol.L-1 từ dung dịch gốc fenofibrat 1x10-2 mol.L-1: Hút 0,25 mL dung dịch fenofibrat 1x10-2 mol.L-1 vào bình định mức 25,00 mL Thêm 7,5 mL metanol sau đó định mức bằng nước cất hai lần

Pha dung dịch chuẩn làm việc fenofibrat nồng độ 1x10-5 mol.L-1 từ dung dịch fenofibrat 1x10-4 mol.L-1: Hút 2,50 mL dung dịch fenofibrat nồng độ 1x10-4 mol.L-1 cho vào bình định mức 25,0 mL Sau đó thêm 1,00 mL metanol và định mức đến vạch bằng nước cất 2 lần

Pha dung dịch làm việc 1x10-7 mol.L-1 từ dung dịch fenofibrat 1x10-5 mol.L

-1: Hút 0,25 mL fenofibrat 10-5 M vào bình định mức 25,00 mL, thêm 10,00 mL đệm

Dung dịch B: Dung dịch NaOH 0,2 mol.L-1

Dùng dung dịch B để điều chỉnh pH của dung dịch A Hỗn hợp dung dịch A

và B là dung dịch đệm B - R

2.4 Các thông số đánh giá độ tin cậy của phương pháp phân tích

2.4.1 Giới hạn phát hiện (LOD) và giới hạn định lượng (LOQ)

Giới hạn phát hiện (LOD) là nồng độ nhỏ nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích còn cho tín hiệu phân tích khác có nghĩa so với tín hiệu mẫu trắng hay tín hiệu nền

LOD = 3 Sy

b (3) Trong đó: Sy : độ lệch chuẩn

b : hệ số góc đường hồi quy Công thức này chỉ áp dụng được cho các phương pháp xây dựng đường chuẩn : phân tích mẫu chuẩn, mẫu thêm chuẩn, mẫu thực

Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ thấp nhất của chất phân tích mà hệ thống phân tích định lượng được