Tài liệu là bản tóm tắt
Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỖ THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH ĐIỆN HÓA CỦA FENOFIBRAT VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC HÀ NỘI - 2016 Footer Page of 126 Header Page of 126 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỖ THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH ĐIỆN HÓA CỦA FENOFIBRAT VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN THỊ KIM THƢỜNG HÀ NỘI - 2016 Footer Page of 126 Header Page of 126 LỜI CẢM ƠN Với lòng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn TS Nguyễn Thị Kim Thường giao đề tài, nhiệt tình hướng dẫn tạo điều kiện thuận lợi giúp thực luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn thầy, cô môn Hóa Phân Tích nói riêng khoa Hóa Học nói chung dạy dỗ, bảo động viên suốt thời gian học tập trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên - Đại Học Quốc Gia Hà Nội Tôi xin cảm ơn đề tài mã số GG.15.14 Đại Học Quốc Gia Hà Nội tài trợ kinh phí để thực thành công luận văn Cuối cùng, xin cảm ơn gia đình, bạn sinh viên, học viên Bộ môn Hóa phân tích động viên tinh thần, cổ vũ, tận tình giúp đỡ thời gian học tập thực luận văn Hà Nội, ngày tháng 12 năm 2016 Học viên Đỗ Thị Kim Dung Footer Page of 126 Header Page of 126 MỤC LỤC Trang MỞ ĐẦU CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1 Giới thiệu chất nghiên cứu fenofibrat 1.1.1 Cấu tạo fenofibrat 1.1.2 Dược lực học động học fenofibrat 1.2 Các phương pháp xác định fenofibrat 1.2.1 Phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao 1.2.2 Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử 1.2.3 Phương pháp von - ampe hòa tan 1.3 Giới thiệu phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ 10 1.3.1 Nguyên tắc phương pháp von - ampe hòa tan hấ p phu ̣ 10 1.3.2 Các kỹ thuật ghi đo tín hiệu hoà tan chất cần phân tích 13 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nội dung nghiên cứu 15 2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 15 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1 Tiến trình thí nghiệm theo phương pháp CV 15 2.2.2 Tiến trình thí nghiệm theo phương pháp DP - AdSV 16 2.2.3 Xử lý mẫu 17 2.3 Trang thiết bị hóa chất 18 2.3.1 Các dụng cụ thiết bị sử dụng 18 2.3.2 Hóa chất 19 2.3.3 Chuẩn bị dung dịch hóa chất 20 2.4 Các thông số đánh giá độ tin cậy phương pháp phân tích 21 2.4.1 Giới hạn phát (LOD) giới hạn định lượng (LOQ) 21 2.4.2 Độ chụm (độ lặp lại) phương pháp 22 Footer Page of 126 Header Page of 126 2.4.3 Độ (độ thu hồi) phương pháp 23 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 24 3.1 Khảo sát đặc tính điện hóa fenofibrat phương pháp von ampe vòng (CV) 24 3.2 Tối ưu hóa điều kiện xác định fenofibrat 26 3.2.1 Khảo sát ảnh hưởng pH 26 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng thời gian hấp phụ 28 3.2.3 Khảo sát ảnh hưởng hấp phụ 30 3.2.4 Khảo sát ảnh hưởng tốc độ quét 31 3.3 Đánh giá phương pháp phân tích 33 3.3.1 Xây dựng đường chuẩn xác định fenofibrat 33 3.3.2 Đánh giá độ lặp lại phương pháp 34 3.4 Áp dụng phân tích số mẫu thuốc thị trường 35 3.5 Xác định fenofibrat mẫu huyết tương 37 3.5.1 Quy trình xử lý mẫu huyết tương 37 3.5.2 Xây dựng đường chuẩn xác định fenofibrat mẫu huyết tương 40 3.5.3 Đánh giá độ lặp lại phương pháp 42 3.5.4 Đánh giá độ thu hồi phương pháp 43 KẾT LUẬN 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO 45 Footer Page of 126 Header Page of 126 MỤC CHỮ VIẾT TẮT STT Viết tắt Tiếng Anh Absorptive Stripping Tiếng Việt AdSV ASV Anodic Stripping Voltammetry Von - ampe hòa tan anot CSV Cathodic StrippingVoltammetry Von - ampe hòa tan catot CV Cyclic Voltammetry Von - ampe vòng DPV Differential Pulse Stripping Von - ampe hòa tan xung vi Voltammetry phân HMDE HPLC Voltammetry Hanging Mercury Dropping Electrode Von - ampe hòa tan hấp phụ Điện cực giọt thủy ngân treo High Performance Liquid Phương pháp sắc ký lỏng Chromatography hiệu cao LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantitation Giới hạn định lượng 10 MFE Mercury Film Electrode Điện cực màng thủy ngân 11 SMDE 12 SqW 13 SV Footer Page of 126 Stastic Mercury Dropping Electrode Điện cực giọt thủy ngân tĩnh Square - Wave Stripping Von - ampe hòa tan sóng Voltammetry vuông StrippingVoltammetry Von - ampe hòa tan Header Page of 126 DANH MỤC BẢNG SỐ LIỆU Bảng 3.1: Kết khảo sát ảnh hưởng pH đến cường độ dòng đỉnh píc 27 bảng 3.2: Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian hấp phụ đến cường độ dòng đình pic 29 Bảng 3.3: Kết khảo sát ảnh hưởng hấp phụ đến cường độ dòng đỉnh píc 30 Bảng 3.4: Kết khảo sát ảnh hưởng tốc độ quét đến cường độ dòng đỉnh píc .32 Bảng 3.5: Ảnh hưởng nồng độ fenofibrat đến cường độ dòng đỉnh píc 33 Bảng 3.6: Độ lặp lại cường độ dòng đỉnh píc fenofibrat 34 Bảng 3.7: Kết phân tích mẫu thuốc SanDor .35 Bảng 3.8: Kết phân tích mẫu thuốc 36 Bảng 3.9: Sự phụ thuộc cường dộ dòng píc vào thành phần dung môi 39 Bảng 310: Cường độ dòng đỉnh píc fenofibrat mẫu huyết tương 41 Bảng 3.11: Độ lặp lại cường độ dòng đỉnh píc fenofibrat mẫu huyết tương 42 Bảng 3.12: Nồng độ fenofibrat mẫu huyết tương xác định dựa vào đường chuẩn 43 Footer Page of 126 Header Page of 126 DANH MỤC HÌNH VẼ VÀ ĐỒ THỊ Hình 1.1: Công thức cấu tạo fenofibrat Hình 2.1: Thiết bị phân tích điện hóa Metrohm - Autolab 19 Hình 3.1: Đường CV (von – ampe vòng) fenofibrat 24 Hình 3.2: Quá trình khử fenofibrat 25 Hình 3.3: Đường von - ampe vòng fenofibrat quét vòng liên tục 26 Hình 3.4: Ảnh hưởng pH đến cường độ dòng đỉnh píc 27 Hình 3.5: Đường von - ampe hòa tan fenofibrat thay đổi pH 28 Hình 3.6: Đường von - ampe hòa tan fenofibrat thay đổi thời gian hấp phụ 29 Hình 3.7: Ảnh hưởng thời gian hấp phụ đến cường độ dòng đỉnh píc 29 Hình 3.8: Ảnh hưởng hấp phụ đến cường độ dòng đỉnh píc .30 Hình 3.9: Đường von – ampe hòa tan fenofibrat thay đổi hấp phụ 31 Hình 3.10: Đường von – ampe hòa tan fenofibrat thay đổi tốc độ quét 32 Hình 3.11: Ảnh hưởng tốc độ quét đến cường độ dòng đỉnh píc 32 Hình 3.12: Đường chuẩn xác định fenofibrat 33 Hình 3.13: Đường von - ampe hòa tan fenofibrat mẫu thuốc Sandoz 36 Hình 3.14: Đường von – ampe hòa tan mẫu huyết tương nồng độ fenofibrat khác sử dụng chiết pha rắn có thêm chuẩn 38 Hình 3.15: : Đường von - ampe hòa tan fenofibrat phụ thuộc vào thành phần dung môi 39 Hình 3.16: Đường von - ampe hòa tan fenofibrat mẫu huyết tương 40 Hình 3.17: Đường chuẩn fenofibrat mẫu huyết tương 41 Footer Page of 126 Header Page of 126 MỞ ĐẦU Cholesterol dưỡng chất quan trọng cần thiết cho hoạt động phát triển cách bình thường thể Tuy nhiên lượng chất máu cao gây nhiều ảnh hưởng nghiêm trọng đến sức khỏe như: xơ vữa động mạch, cao huyết áp Nguyên nhân gây tăng cholesterol có liên quan đến chế độ ăn, thói quen sinh hoạt, luyện tập, có xu hướng ngày tăng xã hội phát triển Hiện nay, có nhiều loại thuốc uống làm giảm cholesterol máu, chủ yếu tập trung hai nhóm fibrat statin Một hoạt chất sử dụng phổ biến cho bệnh nhân điều trị cholesterol cao fenofibrat Fenofibrat có nhiều ưu điểm vượt trội so với dẫn chất nhóm, tần suất cường độ tác dụng phụ thấp, phối hợp với thuốc thuộc nhóm statin điều trị chứng tăng cholesterol máu Hiện nay, lợi ích kinh tế có không tổ chức, cá nhân cho đời nhiều loại thuốc giả, thuốc chất lượng làm nguy hại cho sức khỏe kinh tế người bệnh Vì vậy, vấn đề kiểm định lại hàm lượng thuốc theo tiêu chuẩn vấn đề quan trọng thực cần thiết Việc kiểm định chất lượng thuốc dạng bào chế dược động học thuốc cần phải có phương pháp phân tích lượng thuốc nhỏ mẫu sinh học để tìm hiểu khả tồn khả hấp thu thuốc thể để từ đưa liều lượng phù hợp với người bệnh Có nhiều phương pháp sử dụng để xác định chất có hoạt tính sinh học nói chung fenofibrat nói riêng phương pháp sắc ký, phương pháp quang phổ UV-Vis, phương pháp cực phổ von - ampe hòa tan hấp phụ Trong dược điển Việt Nam, fenofibrat nghiên cứu xác định phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) Tuy nhiên, chi phí cho phân tích HPLC cao, quy trình xử lý mẫu phức tạp, thiết bị đắt tiền Do vậy, với mong muốn nghiên cứu phương pháp kiểm tra song hành với phương pháp dược điển nên lựa chọn phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ Đây phương pháp có độ Footer Page of 126 Header Page 10 of 126 nhạy độ chọn lọc cao, quy trình phân tích đơn giản, chi phí phân tích cho mẫu cần kiểm nghiệm không cao Chính vậy, phạm vi luận văn, chọn phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ để nghiên cứu đặc tính điện hóa quy trình xác định fenofibrat mẫu dược phẩm mẫu huyết tương Footer Page 10 of 126 Header Page 12 of 126 1.1.2.2 Dược động học Fenofibrat hấp thu tốt từ đường dày, ruột Trong nước tiểu người uống, fenofibrat chủ yếu tồn dạng axit fenofibric Nồng độ axit fenofibric cao huyết tương xảy vòng đến sau uống Lúc fenofibrat nhanh chóng thủy phân thành axit fenofibric Trong máu không tìm thấy fenofibrat nguyên dạng Dạng chuyển hóa có hoạt tính, axit fenofibrat, kết hợp với axit glucuronic sau tiết nước tiểu Fenofibrat tiết chủ yếu nước tiểu chiếm khoảng 60% [2,3] 1.2 Các phƣơng pháp xác định fenofibrat Hiện nay, có nhiều phương pháp khác để xác định fenofibrat như: phương pháp sắc ký lỏng, phương pháp quang phổ, phương pháp von - ampe… 1.2.1 Phƣơng pháp sắc kí lỏng hiệu cao Phương pháp sắc ký lỏng sử dụng chủ yếu để xác định đồng thời fenofibrat số chất khác mẫu sinh học với điều kiện: chất phân tích thực cột RP C18, kích thước hạt phù hợp, detector UV A.Arora1 cộng xác định fenofibrat mẫu huyết tương phương pháp HPLC Nội dung nghiên cứu mô tả cụ thể quy trình xác định fenofibrat huyết tương người sử dụng sắc kí lỏng pha đảo Pha động sử dụng đơn giản với độ nhạy đủ để định lượng fenofibrat với lượng thấp 0,095 mg /mL, hệ số biến thiên thấp 20% độ xác dao động từ 101,99 -107,41%, Khoảng tuyết tính từ 0,095 mg/mL đến 19,924 mg/mL, R2 lớn 0,98 Phương pháp có giá trị việc phân tích thuốc huyết tương người Các phương pháp với hiệu chỉnh nhỏ sử dụng để phân tích thuốc dạng bào chế khác [14] Để xác định đồng thời atorvastatin canxi, ezetimib fenofibrat mẫu sinh học, Archita Patel cộng sử dụng phương pháp sắc kí lỏng hiệu cao Các chất phân tích thực cột RP C18 (kích thước hạt mm, Footer Page 12 of 126 Header Page 13 of 126 đường kính 150 mm × 4,6 mm), pha động gồm metanol - axetonitrin - nước (76 + 13 + 11, v/v/v), tốc độ dòng ml/phút Sử dụng detector UV bước sóng 253 nm thời gian lưu atorvastatin canxi, ezetimib fenofibrat 2,25; 3,68; 6,41 phút, khoảng tuyến tính từ – 10 µg/mL (R2 = 0,998) cho atorvastatin ezetimib, 40 – 120 µg/mL (R2 = 0,998) cho fenofibrat, LOD LOQ atorvastatin nằm khoảng 0,11 - 0,3477 µg.mL-1; ezetimibe 0,07 - 0,2177 µg.mL-1; fenofibrat 0,25 - 0,77 µg.mL-1 Hiệu suất thu hồi atorvastatin canxi; ezetimib fenofibrat 99,83%; 99,89%; 99,98% độ lệch chuẩn nhỏ 2% [21] Phương pháp sắc kí lỏng Fathy M.M Salama cộng sử dụng để xác định xác hàm lượng fenofibrat mẫu dược phẩm với điều kiện cột C18 restekpinnacle II phenyl (5µm, 250mm × 4,6mm) pinnacle II phenyl (5 µm, 10 mm × 4), pha động gồm metanol 0,1%; axit photphoric ( 60 : 40; v/v) với tốc độ dòng mL/phút, nhiệt độ cột 500C, pH = 2,5 Detector UV đặt bước sóng 302 nm chất nội chuẩn (IS) 289 nm fenofibrat Khoảng tuyến tính từ 60 - 140 ppm với hệ số tương quan 0,9999; hiệu suất thu hồi quy trình xử lý mẫu fenofibrat từ 99,77 - 100,39% [27] Rayan G Alamri, Kazi Mohsina, Ajaz Ahmad, Mohammad Raishc Fars K Alanazia sử dụng phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu cao với detector UV (UHPL - UV) để xác định fenofibrat axit fenofibric bị chuyển hóa mẫu huyết tương chuột bạch Nhóm tác giả sử dụng điều kiện phân tích hệ sắc ký lỏng sau: cột C18 với thành phần pha động metanol nước (65 : 35), tốc độ dòng 0,3 mL/phút (đẳng dòng) bước sóng hấp thụ detector UV 284 nm Để đo nồng độ fenofibrat axit fenofibric mẫu huyết tương chuột tác giả sử dụng kĩ thuật xử lý mẫu chiết lỏng lỏng với quy trình sau: mẫu huyết tương lấy chuyển vào ống ly tâm 1,5 mL Sau thêm chuẩn dung dịch fenofibrat, axit fenofibric chất nội chuẩn (2500 ng/mL) trộn Sử dụng metanol để kết tủa huyết tương Tiếp theo quay ly tâm 10 phút với tốc độ quay 2500 vòng/ phút Sau ly tâm, phần dung dịch Footer Page 13 of 126 Header Page 14 of 126 đuổi N2 45 - 50oC cuối cặn hòa tan 200 µl pha động bơm vào hệ sắc ký Các kết đạt được: giới hạn phát giới hạn định lượng 30 90 ng/mL với fenofibrat 40 100 ng/mL axit fenofibric với hệ số biến thiên ngày nhỏ 5% [32] Để xác định nồng độ fenofibrat huyết tương người, nhóm nghiên cứu sử dụng xử lý mẫu kĩ thuật chiết pha rắn phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao với detector UV Điều kiện hệ sắc ký pha động đệm phosphat với metanol tỉ lệ 40 : 60, bước sóng UV 288 nm, nhiệt độ cột 350C tốc độ dòng 0,8 mL/phút, giới hạn phát 36 µg/mL Với đặc điểm mẫu phức tạp nhóm tác giả nghiên cứu thành công tìm quy trình chiết pha rắn: trước hết rửa cột 1ml metanol 1ml đệm photphat với tốc độ 6,00 mL/phút Sau đó,bơm lên cột 0,8 mL mẫu với tốc độ 0,18 mL/phút; dung dịch rửa tạp 1mL đệm photphat pH = 7,4, tốc độ chảy 1,5 mL/phút; dung dịch rửa giải 1mL metanol 1mL axit photphoric 0,04 M, hiệu suất thu hồi xác định fenofibrat huyết tương người đạt 99% [23] Nhóm tác giả Dasandi Bhavesh, Sanjay Shaha Shivprakash xác định hàm lượng axit fenofibric huyết tương người phương pháp sắc kí khối phổ với điều kiện đo: Cột C18 sử dụng chế độ đẳng dòng với tốc độ 0,2 mL/phút sử dụng chiết lỏng lỏng để chiết axit fenofibric với quy trình: 250 µL huyết tương người thêm 25 µL chất nội chuẩn axit mefenamic 7,0 µg/mL; sau trộn với 250 µL axit formic 0,1% lắc 10 s; đem lắc với 4,5 mL hỗn hợp đietylete etyl acetat tỉ lệ 1: phút; tiếp quay ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút; cuối lấy phần hữu đem đuổi dung môi khí N2 nhiệt độ 450C hòa tan phần cặn 0,5 mL ACN nước tỉ lệ 1:1 Kết thu được: khoảng tuyến tính từ 0,05 - 7,129 µg/mL kết cho thấy hàm lượng axit fenofibric giảm dần sau người bệnh uống thuốc sau lượng hấp thụ lớn người bệnh từ - sau uống [25] Footer Page 14 of 126 Header Page 15 of 126 Để xác định đồng thời hàm lượng atorvastatin canxi fenofibrat thuốc viên, tác giả N.Jain, R Raghuwanshi Deepti Jain sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao – pha đảo Với điều kiện hệ sắc ký cột luna C18; pha động metanol – đệm axetat pH 3,7 tỉ lệ 82 : 18 (v/v); tốc độ dòng 1,5 mL/phút, nhiệt độ cột 25oC, bước sóng xác định 248 nm chất có thời gian lưu 3,02 phút 9,05 phút Kết thu khoảng tuyến tính từ 1-5 µg/mL 16 - 80 µg/mL tương ứng với atorvastatin canxi fenofibrat Sau áp dụng điều kiện phân tích để xác định hàm lượng atorvastatin canxi fenofibrat mẫu thuốc viên với quy trình xử lý mẫu sử dụng metanol – nước tỉ lệ 80 : 20 (v/v) để chiết, thu kết tốt hai chất chiết đạt hiệu suất thu hồi 100% [30] Phương pháp sắc kí lỏng khối phổ - khối phổ (UPLC - MS/MS) Alothman ZA cộng dùng để xác định fenofibrat mẫu dược phẩm mẫu huyết tương người Quy trình xử lý mẫu: mẫu huyết tương thêm mL dung môi có chứa (etyl acetat : đietylete) sau cho vào máy lắc 10 phút quay li tâm 10 phút 5000 rpm, tiếp tách lấy lớp huyết tương Các điều kiện tối ưu: cột tách C18 cột (kích thước hạt 1,7 mm; ID 50 mm x 2.1 mm), dung dịch rửa giải isocratic, pha động gồm metanol nước (80 : 20%, v/v), tổng thời gian phân tích phút Khoảng tuyến tính từ 0,5 - 200 ng/mL (r2 = 0,993; n = 6), với (LOD) = 0,12 µg/mL; (LOQ) = 0,41 µg/mL, độ thu hồi fenofibrat huyết tương (96,41 ± 6,14)% với độ lệch chuẩn tương đối 3% [17] Để xác định hàm lượng fenofibrat sản phẩm thủy phân chúng mẫu thuốc, Alaa El - Gindy cộng sử dụng phương pháp sắc kí lỏng khối phổ với điều kiện: cột tách ODS với pha động gồm axetonitrin: nước (80 : 20, v/v, pH = 4) với detector UV bước sóng 287 nm cho fenofibrat pha động chứa axetonitrin – 10 mM KH2HPO4 0,1% dietylamin (60 : 40, v/v; pH = 4,6) với bước sóng phát 270 nm cho vinpocetine Phép phân tích cho kết LOD LOQ vinpocetin 2,00.10-2 µm.mL-1 6,66.10-2 Footer Page 15 of 126 Header Page 16 of 126 µm.mL-1; hệ số tương quan R2 = 0,9999; tương ứng với fenofibrat 2,02.10-2 µm.mL-1 6,72 10-2 µm.mL-1 hệ số tương quan R2 = 0,9998 [16] 1.2.2 Phƣơng pháp quang phổ hấp thụ phân tử Phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử xác định đồng thời hàm lượng fenofibrat rosuvastin mẫu huyết tương người nghiên cứu Các điều kiện đo thực metanol với bước sóng cho tín hiệu rosuvastin 243 nm, fenofibrat 287 nm, khoảng nồng độ tuyến tính fenofibrat - 28 ng/L; rosuvastin – ng/L, hệ số tương quan R2 = 0,9921; hiệu suất thu hồi fenofibrat nằm khoảng 96,3 % - 100,27 % [20] Bên cạnh đó, phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao kết hợp với quang phổ đạo hàm bậc Amer M.A Alanazi cộng sử dụng để xác định đồng thời pravastatin fenofibrat dược phẩm Các điều kiện phân tích thực cột C18 ( kích thước hạt mm, đường kính 125 mm x 4,6 mm), chất rửa giải isocratic, sử dụng pha động gồm axetonitrin 0,1% đietylamin (50 : 50, v/v, pH = 4,5) với tốc độ dòng 1,0 mL/phút, chất đo bước sóng 240 nm hai chất xác định với thời gian lưu 2,15 phút 5,79 phút cho pravastatin fenofibrat Khoảng tuyến tính pravastatin 5-50 µg.mL-1, hệ số tương quan R2 = 0,999 tương ứng với fenofibrat 20 – 200 µg.mL-1, hệ số tương quan R2 = 0,996 Giới hạn phát giới hạn định lượng pravastatin fenofibrat 1,5; 5,0 µg.mL-1 6,5; 5,0 µg.mL-1 Cùng với phương pháp HPLC, tác giả sử dụng phương pháp đạo hàm quang phổ bậc để xác định pravastatin fenofibrat hai bước sóng 237,6 nm 295,1 nm; hệ số tương quan pravastatin fenofibrat đồng thời R2 = 0,999, khoảng tuyến tính pravastatin fenofibrat - 20 - 20 µg.mL-1, giới hạn phát pravastatin 1,5 µg.mL-1; fenofibrat 1,0 µg.mL-1 Giới hạn định lượng pravastatin fenofibrat tương ứng 5,0 µg.mL-1 3,0 µg.mL-1 [18] Phương pháp hấp thụ phân tử Panikumar D Anumolu cộng sử dụng để xác định atorvastatin fenofibrat thuốc Atorvastatin fenofibrat Footer Page 16 of 126 Header Page 17 of 126 phát bước sóng 281 nm 296 nm Khoảng nồng độ tuyến tính xác định khoảng - 12 ng/mL cho atorvastatin – 30 ng/mL cho fenofibrat, hệ số tương quan thu tương ứng atovastatin fenofibrat R2 = 0,9971 0,9985; hiệu suất thu hồi 98,8 - 102,5% cho atorvastatin 99,6 100,25% cho fenofibrat [31] M.S.Kondawar cộng sử dụng phương pháp quang phổ UV để xác định đồng thời ezetimibe fenofibrat thuốc dạng bào chế Bước sóng tìm thấy tối đa cho ezetimibe 232,6 nm fenofibrat 286,6 nm Khoảng nồng độ xác định cho hai chất – 20 µg/ml Hiệu suất thu hồi đạt 98,67% - 100,34 % [29] Phương pháp quang phổ Faizal P P cộng sử dụng để xác định fenofibrat dựa hấp thụ quang fenofibrat metanol môi trường pH = 3,07 bước sóng 596 nm Khoảng tuyến tính fenofibrat từ μg/mL Hiệu suất thu hồi 100,3 % đến 100,37 %, với giới hạn phát (LOD) 0,02 µg/mL, giới hạn định lượng (LOQ) 0,1 µg/mL [26] 1.2.3 Phƣơng pháp von - ampe hòa tan Fathy M M Salama cộng sử dụng kĩ thuật quét sóng vuông xung vi phân với điện cực giọt thủy ngân rơi, điện cực so sánh điện cực AgCl sử dụng để xác định đồng thời etofibrate, fenofibrat atorvastatin mẫu huyết tương mẫu dược phẩm Thu giá trị độ lệch chuẩn tương đối < 2% Giới hạn phát (LOD) định lượng (LOQ) phạm vi 0,037 0,21 µg/mL 0,12 - 0,71 µg/mL, cho thấy độ nhạy cao [27] Abdel - Hay KM cộng sử dụng hai kĩ thuật xung vi phân von – ampe sóng vuôn để xác định etofibrat, fenofibrat atovastatin mẫu dược phẩm huyết tương người khử điện cực giọt thủy ngân với điện cực so sánh Ag/AgCl Với việc dùng kĩ thuật von – ampe vòng nhận thấy chất bất thuận nghịch Sau tối ưu tất điều kiện: pH tương ứng etofibrat, fenofibrat atovastatin 7,0; 7,0 7,5; tốc độ quét tương ứng Footer Page 17 of 126 Header Page 18 of 126 50 mV/s; 40 mV/s 60mV/s biên độ xung 50 mV, tác giả xây dựng đường chuẩn xác định giới hạn phát giới hạn định lượng nằm khoảng 0,037 – 0,21 µg/mL 0,12 – 0,71µg/mL Cuối tác giả áp dụng phân tích 03 mẫu thuốc Với quy trình xử lí mẫu huyết tương: 1,0 mL huyết tương thêm chuẩn pha loãng mL metanol đựng ống 10mL Sau dung dịch quay li tâm 10 phút với tốc độ quét 5000 vòng/phút Lấy 2,5 mL dung dịch sau li tâm chuyển vào bình định mức 5,0 mL định mức hệ đệm với điều kiện [15] Ceren Yardımcı, Nuran Özaltın tiến hành nghiên cứu tính chất điện hóa fenofibrat mẫu dược phẩm phương pháp cực phổ sóng vuông điện cực thủy ngân treo với dung dịch đệm borat pH = 9,0 Tác giả sử dụng metanol, hệ số khuếch tán 2,38 × 10-6 cm2.s-1 Thế đỉnh píc fenofibrat Ep= 1,2 V, khoảng tuyến tính từ 0,146 ppm - 4,96 ppm, hệ số tương quan R2 = 0,9992; giới hạn phát (LOD) 0,025 ppm [24] Qua tổng quan tài liệu thấy rằng, phương pháp von - ampe xác định fenofibrat mẫu thuốc mẫu sinh học Tuy nhiên, chưa nhiều công trình nghiên cứu đầy đủ đặc tính điện hóa khả hấp phụ chất điện cực HDME Do luận văn này, lựa chọn phương pháp von – ampe hòa tan hấp phụ để nghiên cứu xác định fenofibrat mẫu thuốc huyết tương 1.3 Giới thiệu phƣơng pháp von - ampe hòa tan hấp phụ 1.3.1 Nguyên tắc phƣơng pháp von - ampe hòa tan hấ p phu ̣ Về sở lý thuyết, phương pháp AdSV khác biệt với phương pháp ASV chế trình làm giàu (hay trình tıć h lu ỹ chất bề mặt cực làm việc) + Giai đoạn làm giàu: Trong phương pháp AdSV, chất phân tích chất hữu thân chất phân tích có khả tự hấp phụ lên bề mặt điện cực thích hợp Nếu chất phân tích ion kim loại cần thêm phối tử hữu có khả Footer Page 18 of 126 Header Page 19 of 126 tạo phức với ion kim loại để tạo thành phức có khả hấp phụ bề mặt điện cực Trong thời gian làm giàu, giữ không đổi Các điện cực làm việc AdSV thường sử dụng như: HMDE, SMDE, Pt, than nhão (CPE), điện cực graphit ngâm tẩm, điện cực có biến tính hoá học Tuy nhiên đa số nghiên cứu sử dụng kĩ thuật AdSV thường sử dụng điện cực HMDE điện cực có nhiều ưu điểm: bề mặt tự làm lặp lại, dễ tự động hoá + Giai đoạn hoà tan: quét theo chiều catot (chiều âm hơn) lúc xảy trình khử tiểu phần bị hấp phụ theo ba chế sau: (1) Khử ion kim loại phức chất (2) Khử phối tử phức chất (3) Khử xúc tác hydro Trong phương pháp AdSV, ghi đường von - ampe hoà tan, sử dụng kỹ thuật ghi đường von - ampe phương pháp ASV Tín hiệu đỉnh đường von - ampe hoà tan sở để định lượng theo phương pháp AdSV Tín hiệu von - ampe hoà tan tỷ lệ thuận với nồng độ bề mặt phức hấp phụ cực làm việc theo phương trình (1) Q = n.F.S.C0 (1) Trong đó, Q : điện lượng cầ n thiết để khử chất điện hoạt hấp phụ n : Số electron trao đổi phản ứng điện cực tổng cộng F (C/mol): số Faraday S (cm2): diện tích bề mặt cực làm việc C0 (mol/cm2): nồng độ bề mặt phức hấp phụ điện cực Với tốc độ quét xác định, dòng đỉnh píc hòa tan (Ip) tỉ lệ thuận với Q nên Ip tỉ lệ với S C0 Mà C0 tỉ lệ với nồng độ chất dung dịch phân tích (C) các điề u kiê ̣n hấ p phu ̣ đươ ̣c lă ̣p la ̣i , nên Ip tỉ lệ với S C Để đạt độ nhạy Footer Page 19 of 126 Header Page 20 of 126 cao phân tích AdSV cần tìm điều kiện tối ưu cho trình hấp phụ Do vậy, cường độ dòng phụ thuộc vào số yếu tố loại điện cực, thời gian tích lũy, tích lũy, dung môi, đặc tính bề mặt điện cực, diện tích điện cực, lực ion, pH nhiệt độ Vì thế, cường độ dòng Ip = K.C, K hệ số thực nghiệm, phụ thuộc vào điều kiện: 1) điều kiện tích lũy (làm giàu) thời gian tích lũy, tích lũy, tốc độ khuấy, nhiệt độ thành phần dung dịch pH, nồng độ đệm; 2) Điều kiện hòa tan tốc độ quét thế, kiểu quét (xung vi phân, xung thường, sóng vuông, dòng xoay chiều); 3) Nồng độ chất nghiên cứu chất chất dung dịch (chất có khả hấp phụ trực tiếp hay gián tiếp thông qua tạo phức với phối tử khác) Khi khống chế điều kiện tích lũy thành phần dung dịch tìm mối quan hệ trực tiếp Ip C Ip bị ảnh hưởng trực tiếp chất chất hấp phụ bị ảnh hưởng gián tiếp vào thời gian tích lũy, tích lũy, tốc độ khuấy, thành phần dung dịch điện phân, nhiệt độ Do vậy, phải nghiên cứu chọn điều kiện tối ưu để hệ số K không thay đổi, đảm bảo độ lặp lại độ xác phép đo Cần phải nhấn mạnh thêm rằng, thực chất phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ thực trình tích lũy chất lên bề mặt điện cực (giai đoạn tích lũy chất cố định thời gian định kỹ thuật làm giàu chất), sau ghi tín hiệu hòa tan, tín hiệu thu dạng píc dòng hoà tan sản phẩm hấp phụ lên bề mặt điện cực Thế đỉnh píc hòa tan (Ep) cường độ dòng píc hòa tan (Ip) phụ thuộc vào yếu tố như: thành phần nền, phối tử tạo phức, pH, thời gian tích lũy, tích lũy, chất của ện cực làm việc, kỹ thuật ghi đường von - ampe hòa tan Trong điều kiện xác định, Ep đặc trưng cho chất điện hóa chất phân tích dùng để phân tích định tính Ip tỉ lệ thuận với nồng độ chất phân tích dung dịch, Ip dùng để phân tích định lượng Phương pháp AdSV đặc biệt thích hợp để phân tích ion kim loại xác định kĩ thuật cực phổ thông thường (hay trình xác định phức tạp) như: Al, Ca, Be, Pt, Ga, Nb hay chất hữu Cũng von - ampe hoà tan thông thường, phương pháp von - ampe hoà tan hấp phụ nhạy so với phương pháp Footer Page 20 of 126 Header Page 21 of 126 von - ampe điện hoá trực tiếp qua yếu tố làm giàu (tích luỹ) Ngoài ưu điểm trên, phương pháp AdSV có ưu điểm riêng so với phương pháp SV như: - Độ nhạy AdSV thường lớn nhiều so với ASV kim loại không hoà tan thuỷ ngân mà tạo thành lớp phức đơn phân tử Ví dụ điện cực màng thuỷ ngân - Xác định nhiều kim loại độ chọn lọc cao so với phương pháp ASV CSV lựa chọn nhiều thuốc thử tạo phức bền chọn lọc với kim loại cần phân tích [19,22] - AdSV đặc biệt tỏ có ưu điểm phân tích chất có hoạt tính sinh học, dược phẩm bao gồm chất có hoạt tính điện hóa, có khả hấp phụ bề mặt điện cực giọt Hg chất hoạt tính điện hóa trực tiếp điện cực giọt xác định sau dẫn xuất hoá cách gắn với nhóm dễ khử nitroso, nitro thủy phân tạo thành chất có hoạt tính điện hóa - Một điểm đặc biệt phương pháp von - ampe hoà tan hấp phụ dựa vào đặc tính hấp phụ ta giải toán liên quan đến trình điện cực, chế phản ứng xảy điện cực - Phương pháp AdSV loại trừ ảnh hưởng yếu tố cản trở cách chọn điều kiện thí nghiệm thích hợp như: thành phần nền, pH, hấ p phu ̣ làm giàu 1.3.2 Các kỹ thuật ghi đo tín hiệu hoà tan chất cần phân tích 1.3.2.1 Kỹ thuật DP Điê ̣n cực chı̉ thi ̣đươ ̣c phân cực bằ ng điê ̣n áp mô ̣t chiề u biế n thiên tuyế n tın ́ h với tố c đô ̣ châ ̣m (vài mV/s), cuố i chu kỳ gio ̣t người ta đă ̣t vào mô ̣t xung vuông góc với biên đô ̣ 10 - 100 mV (thường cho ̣n 50 mV), thời gian đă ̣t xu ng 40 - 100 ms, cường đô ̣ dòng đươ ̣c ghi lầ n ta ̣i thời điể m 16,7 ms trước na ̣p xung và ngắ t xung Đường biểu diễn khác hai dòng vào điện cực có dạng píc, dễ xác định có độ phân giải cao Do xung vi phân giảm tối đa dòng dư, hạn chế cực phổ cổ điển Footer Page 21 of 126 Header Page 22 of 126 Thông thường ều kiện đươ ̣c cho ̣n sau : thời gian xung 100 ms; độ dài xung 30 ms; thời gian đo 10 ms; bước 5mV; tốc độ quét đạt 50 mV/s Cho kế t quả tố t với cả ̣ thuâ ̣ n nghich ̣ và không thuâ ̣n nghich ̣ , không quét đươ ̣c với tố c đô ̣ cao [5] 1.3.2.2 Kỹ thuật xung thường Điê ̣n cực đươ ̣c phân cực bằ ng điê ̣n áp mô ̣t chiề u không đổ i suố t thời gian ghi , thời điểm xác định điện cực đ ược phân cực thêm xung điện dạng vuông góc có thời gian tồn ngắn (30 - 50 ms), sau đó xung bi ̣ngắ t và cả quá trình phân cực biên độ xung tăng dần, dòng khử cực ghi thời điểm xác định ( thường 16,7 ms trước ngắ t xung) [5] Cực làm việc cực HDME dùng phương pháp von - ampe hòa tan hấp phụ xác định fenofibrat Cực HMDE loại cực dùng phổ biến phương pháp von ampe hòa tan Nó giọt thủy ngân hình cầu kích thước nhỏ treo đầu cuối mao quản có đường kính 0,15 – 0,5 mm Sau phép đo, giọt thủy ngân bị cưỡng rơi khỏi mao quản thay giọt tương tự Một kiểu cực giống với cực HMDE thường dùng cực giọt thủy ngân tĩnh (SMDE) hãng PAR (USA) chế tạo Cực HMDE SMDE cho kết đo có độ xác cao độ lặp lại cao, có với hidro lớn khoảng -1,5 V môi trường kiềm trung tính; - 1,2 V môi trường axit, nên cực có khoảng điện hoạt rộng, cho phép nghiên cứu khoảng rộng Chúng dùng rộng rãi để xác định kim loại, hợp chất hữu Điểm hạn chế HMDE SMDE khó chế tạo, khó tạo giọt thủy ngân có kích thước lặp lại hoàn hảo Ngoài chúng không cho phép xác định kim loại hòa tan dương Footer Page 22 of 126 Header Page 23 of 126 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu Tiếng Việt Dược điển Việt Nam (2009), tái xuất lần thứ 4, Nhà xuất Y dược Dược lý học lâm sàng (2009), Trường đại học Y Hà Nội, Nhà xuất Y học Dược thư quốc gia Việt Nam (2011), Bộ Y tế, Nhà xuất Y học Lê Quốc Hùng, Vũ Thị Thu Hà (2006), “ Sự phát triển xu khả sử dụng điện cực màng thủy ngân phân tích điện hóa”, Tạp chí hóa học, Viện hóa học, Viện khoa học Công nghệ Việt Nam Nguyễn Văn Ri (2012), “Các phương pháp phân tích công cụ”, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên–Đại Học Quốc Gia Hà Nội Phạm Luận (1998), “Giáo trình vấn đề sở kỹ thuật xử lý mẫu phân tích”, Khoa hóa học, Đại học Khoa học Tự Nhiên, Đại học Quốc Gia Hà Nội Phạm Luận (1989), “Sổ tay pha chế dung dịch”, Bộ môn hóa phân tích, Khoa hóa học, Đại học Tổng hợp Hà Nội Tạ Thị Thảo (2006), “Chuyên đề thống kê hóa phân tích”, Đại Học Quốc Gia Hà Nội Từ Vọng Nghi ( 1969) , “Phương pháp phân tích cực phổ - Các tập môn phân tích – khoa hóa học – Đại học Tổng hợp” 10 Từ Vọng Nghi, Trần Chương Huyến, Phạm Luận (1990), “Một số phương pháp phân tích điện hóa đại, Đại học tổng hợp Hà Nội” Footer Page 23 of 126 Header Page 24 of 126 11 Trần Tứ Hiếu, Từ Vọng Nghi, Nguyễn Văn Ri, Nguyễn Xuân Trung (2006), “Hóa học phân tích”, Đại Học Khoa Học Tự Nhiên – NXB Đại Học Quốc Gia Hà Nội 12 Trương Xuân Hà (2014), “ Thuốc giả ngành công nghiệp tội lỗi”, Sức khẻo & đời sống, Cơ quan ngôn luận Y tế, Hà Nội 13 Trung Kiên (2015), “ Sóng ngầm thuốc giả”, An ninh thủ đô, Cơ quan công an thành phố Hà Nội, Hà Nội Tài liệu Tiếng Anh 14 A.Arora1, M.T.Zzaman1, O.Ahmad2, S.A.Khan2,(2009) “Method development and validation of fenofibrat by HPLC using human plasma” , Rev Electron Biomed Electron J Biomed 2009, 3, pp.41-54 15 Abdel - Hay KM, Korany MHewala II, (2008) “Determination of etofibrate, fenofibrate, and atorvastatin in pharmaceutical preparations and plasma using differential pulse polarographic and square wave voltammetric techniques”, US National Library of Medicine National Institutes of HealthSearch database 16 Alaa El-Gindy, Samy Emara, Mostafa K Mesbah, Ghada M Hadad, (2005) “Spectrophotometric and liquid chromatographic determination of fenofibrate and vinpocetine and their hydrolysis products”, II Farmaco pp.425-438 17 Alothman ZA, Mohsin K and Wabaidur SM,( 2013) “Development of a stability indicating UPLC-MS/MS method for rapid and reliable determination of fenofibrat in marketed product (lypanthyl 200M) and human plasma”, Journal of pharmaceutic & drug development 18 Amer M.A Alanazi, Gamal A.E.Mostafa, Mohammed A.Abounassif, Mohamed M.Hefnawy, Mostafa S Mohamed “High-performance liquid chromatography and derivative spectrophotometry for simultaneous determination of pravastatin and fenofibrate in the dosage form”, Pharmaceutical Chemistry, (2014), pp.433-446 Footer Page 24 of 126 Header Page 25 of 126 19 Ali Z., Abu Z., Wolfgang V (1998), “Applications of adsorptive stripping voltammetry for the trace analysis of metals, pharmaceuticals and biomolecules”, Fresenius J Anal Chem, vol.360, pp.1-9 20 Anandakumar Karunakaran, Vetsa Subhash, Ramu Chinthala, Jayamaryapan Muthuvijayan, (2011) “Simultaneous estimation of rosuvastatin calcium and fenofibrate in bulk and in tablet dosage form by UV-Spectrophotometry and RPHPLC”, Stamford Journal of Pharmaceutical Sciences, 4(1),pp 58-63 21 Archita Patel, Chhaya MaCwana, Vishal Parmar, Samir Patel, (2012) “ Simultaneous determination of atorvastatin calcium, ezetimibe, and fenofibrate in a tablet formulation by HPLC” Journal of AOAC International 95(2), pp.419 22 Bond A.M (1980), Modern polarographic methods in analytical chemistry, New York 23 B Streel, Ph Hubert, A Ceccato (2000), “Determination of fenofibric acid in human plasma using automated solid - phase extraction coupled to liquid chromatography”, Journal of Chromatography B, 742, 391-400 24 Ceren Yardımcı, NuranÖzaltın, (2004) “Electrochemical studies and square wave voltammetric determination of fenofibrat in pharmaceutical formulations”, analytical and bioanalytical chemistry Vol 378, pp 495 - 498 25 Dasandi Bhavesh, Sanjay Shaha and Shivprakash (2009), “John Wiley & Sons, Ltd Determination of fenofibric acid in human plasma by ultra - performance liquid chromatography – electrospray ionization mass spectrometry: application to a bioequivalence study”, Biomedical Chromatography, 23, 922-928 26 Faizal PP (2012), Mohammed Shameer,Sheeja Velayudhan Kutty, Susamma Cicy Eapen “Validated UV-Visible spectrophotometric method for the estimation of fenofibrat in pure and pharmaceutical formulation using MBTH reagent”, International journal of pharmaceutical sciences and drug research 2012; 4(1), pp.74-76 Footer Page 25 of 126 Header Page 26 of 126 27 Fathy M M Salama, Mohamed W I Nassar, Mohie M K Sharaf El-Din, Khalid A M Attia, Mohamed Yousri Kaddah, (2011) “Determination of fenofibrate and the degradation product using simultaneous UV-Derivative spectrometric method and HPLC”, American journal of analytical chemistry, 2, pp.332-34 28 Gosser Jr D.K (1993), Cyclic Voltammetry: Simulation and analysis of reaction mechanisms, VCH Publishers, New York, p 43 29 K.G.Kamble, K.H.Maharshi, M.M.Khandare, M.S.Kondawar “UV spectrophotometric estimation of ezetimibe and fenofibrat in Bulk drug and Dosage form using simultaneous equation method”, International Joumal of ChemTech CODEN(USA), (2011), 3(2), pp.748-754 30 N.Jain, R Raghuwanshi and Deepti Jain (2008), “Development and validation of RP-HPLC method for simultaneous estimation of atorvastatin calcium and fenofibrate in table dosage forms”, Indian journal of Pharmaceutical Sciences, 70 (2), 263-265 31 Panikumar D Anumolu, Swetha Bhavani N, Sathesh Babu Pr, Subrahmanyam Cvs (2009) “A validated spectral discriminating derivative spectrophotometric method for simultaneous quantification of atorvastatin calcium and fenofibrat combination in tablets”, Oriental Journal of Chemistry 29(4) 32 Rayan G Alamri, Kazi Mohsina, Ajaz Ahmad, Mohammad Raishc Fars K Alanazia (2016), “ Development and validation of bioanalytical UHPLC - UV method for simultaneous analysis of unchanged fenofibrat and its metabolite fenofibric acid in rat plasma: application to Pharmaceutical Journal, Accepted Manuscript Footer Page 26 of 126 pharmacokinetics”, Saudi ... HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - ĐỖ THỊ KIM DUNG NGHIÊN CỨU ĐẶC TÍNH ĐIỆN HÓA CỦA FENOFIBRAT VÀ ỨNG DỤNG TRONG PHÂN TÍCH Chuyên ngành: Hóa phân tích Mã số: 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI... tan chất cần phân tích 13 CHƢƠNG 2: NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1 Nội dung nghiên cứu 15 2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 15 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 15 2.2 Phương pháp nghiên cứu 15 2.2.1... ampe hòa tan Trong điều kiện xác định, Ep đặc trưng cho chất điện hóa chất phân tích dùng để phân tích định tính Ip tỉ lệ thuận với nồng độ chất phân tích dung dịch, Ip dùng để phân tích định lượng