nghiên cứu nuôi cấy tảo chlorella thu nhận sinh khối

Header Page of 133 Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối Mục Lục LỜI CẢM ƠN MỞ ĐẦU Mục Tiêu Đề Tài Cách Tiếp Cận, Phƣơng Pháp Nghiên Cứu, Phạm Vi Nghiên Cứu 2.1 Phạm Vi Nghiên Cứu: quy mô phòng thí nghiệm 2.2 Phương Pháp Nuôi Cấy Phần 1: Tổng Quan 1.1 Tổng quan tảo Chlorella vulgaris 1.1.1 Giới thiệu chung chi tảo Chlorella 1.1.2 Đặc điểm sinh học 1.1.3 Giá Trị Dinh Dƣỡng 10 1.2 Tổng quan kỹ thuật nuôi tảo Error! Bookmark not defined 1.2.1 Nuôi cấy batch Error! Bookmark not defined 1.2.2 Nuôi kỹ thuật fed-batch Error! Bookmark not defined 1.2.3 Nuôi kỹ thuật cyclic fed-batch Error! Bookmark not defined 1.2.4 Ƣu điểm kỹ thuật fed-batch kỹ thuật cyclic fed-batch Error! Bookmark not defined 1.3 Hệ Thống Nuôi Tảo Quy Mô Phòng Thí Nghiệm Error! Bookmark not defined Phần 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP Error! Bookmark not defined 2.1 Vật liệu v môi trƣờng thí ngiệm Error! Bookmark not defined 2.1.1 Giống tảo Error! Bookmark not defined 2.1.2 Địa điểm thí nghiệm Error! Bookmark not defined 2.1.3 Hóa chất sử dụng Error! Bookmark not defined 2.1.3.1 Hóa chất pha môi trƣờng nuôi tảo Error! Bookmark not defined 2.1.3.2 Hóa chất dùng phân tích thí nghiệm Error! Bookmark not defined 2.1.4 Thiết bị Error! Bookmark not defined 2.1.4.1 Thiết bị nuôi tảo Error! Bookmark not defined 2.1.4.2 Thiết bị dùng cho phân tích Error! Bookmark not defined 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu Error! Bookmark not defined 2.2.1 Trình tự tiến hành thí nghiệm Error! Bookmark not defined 2.2.2 ố trí thí nghiệm Error! Bookmark not defined 2.2.2.1 Thí nghiệm - Xác định động học sinh trƣởng tảo Chlorella vulgaris nuôi cấy bình erlen thể tích ml Error! Bookmark not defined GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page of 133 Page iv Header Page of 133 Nghiên cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối 2.2.2.2 Thí nghiệm - Động học sinh trƣởng tảo Chlorella vulgaris nuôi cấy fed-batch cyclic fed-batch hệ thống bể nuôi cấy quang học dạng phẳng thể tích với th nh phần môi trƣờng Walne Error! Bookmark not defined 2.2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu động học sinh trƣởng vi sinh vật (GS TS Nguyễn ân Dũng, ) Error! Bookmark not defined 2.2.3.1 Đƣờng cong sinh trƣởng Error! Bookmark not defined 2.2.3.2 Tính toán trình sinh trƣởng (PGS TSKH Bookmark not defined 2.2.4 V N HOÀNG) Error! Phƣơng pháp phân tích tiêu Error! Bookmark not defined Phần : K T QUẢ VÀ ÀN UẬN 29 3.1 Động học sinh trƣởng tảo Chlorella vulgaris nuôi cấy erlen thể tích 500ml 29 Động học sinh trƣởng tảo Chlorella vulgaris nuôi cấy fed-batch cyclic fedbatch hệ thống bể nuôi cấy quang học dạng phẳng thể tích với th nh phần môi trƣờng Walne Error! Bookmark not defined 3.3 Kết đo h m lƣợng protein sinh khối tảo Error! Bookmark not defined K T UẬN VÀ Đ XUẤT KI N Error! Bookmark not defined Kết luận Error! Bookmark not defined Đề xuất ý kiến Error! Bookmark not defined TÀI IỆU TH M KHẢO Error! Bookmark not defined GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page of 133 Page v Header Page of Nghiên 133 cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối LỜI CẢM ƠN Lời xin gửi lời cảm ơn quý thầy cô khoa Công Nghệ Hóa Học & Thực Phẩm trƣờng Đại Học Sƣ Phạm Kỹ Thuật Tp HCM tạo điều kiện tốt để em ho n th nh đề tài nghiên cứu khoa học Đặc biệt em xin chân thành cảm ơn thầy Trịnh Khánh Sơn hƣớng dẫn tận tình truyền đạt kinh nghiệm quý báu để em hoàn thành nghiên cứu Bên cạnh xin cảm ơn anh ê Th nh Đạt, chị Nguyễn Trần Kim Ngân, Nguyễn Thị Phƣơng Thùy, Nguyễn Thị Ý bạn sinh viên lớp đồng h nh v giúp đỡ em suốt trình nghiên cứu Xin chân thành cảm ơn! Tp.HCM Ngày 16 tháng năm Sinh viên thực Nguyễn Văn Thôi GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page of 133 Page Header Page of Nghiên 133 cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối MỞ ĐẦU Mục Tiêu Đề Tài Khảo sát động học sinh trƣởng tảo Chlorella vulgaris kỹ thuật nuôi cấy mẻ (batch) nuôi cấy mẻ có bổ sung chất (fed-batch) Xây dựng đƣợc hệ thống phép đo, công thức tính toán để khảo sát động học sinh trƣởng tảo Khảo sát tác động cụ thể yếu tố môi trƣờng , nhiệt độ, pH, nguồn cung cấp carbon, nitơ…tác động đến sinh trƣởng tảo, từ tiến hành tính toán tối ƣu hóa trình nuôi tảo thu sinh khối Cách Tiếp Cận, Phƣơng Pháp Nghiên Cứu, Phạm Vi Nghiên Cứu 2.1 Phạm Vi Nghiên Cứu: quy mô phòng thí nghiệm Nuôi trồng tảo qui mô phòng thí nghiệm đƣợc tiến hành bình chứa nhỏ suốt có dung tích từ 0,5 – lít hệ thống quang học phẳng 60L Môi trƣờng nuôi cấy bao gồm thành phần hóa chất tinh khiết phù hợp với loại tảo cần nuôi trồng Kết hợp sục khí đảo trộn môi trƣờng, có bơm điều chỉnh lƣợng khí CO đƣa v o bình Sử dụng nguồn ánh sáng nhân tạo từ đèn huỳnh quang Ngo i sử dụng hệ thống bình lên men (photobioreactor) có dung tích nhỏ phòng thí nghiệm Về nguyên tắc, hệ thống giống nhƣ bể lên men vi sinh vật nhƣng phải đƣợc trang bị thêm thiết bị chiếu sáng cho tảo quang hợp Nhiều nƣớc sử dụng hệ thống kèm theo thiết bi điều chỉnh tự động thông số môi trƣờng thông qua máy vi tính Vi tảo nuôi trồng hệ thống khiết 2.2 Phương Pháp Nuôi Cấy + Nuôi cấy mẻ (batch) + Nuôi cấy mẻ có bổ sung chất (fed-batch) + Nuôi cấy phƣơng pháp cyclic fed-batch GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page of 133 Page Header Page of Nghiên 133 cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối Phần 1: Tổng Quan 1.1 T ng u n tả Chlorella vulgaris 1.1.1 Giới thiệu chung chi tảo Chlorella Vị trí phân loại: − Nhóm: Eukaryota − Giới: Flora ( thực vật) − Ngành: Chlorophyta (tảo lục) − Lớp: Trebouxiophyceae − Bộ: Chlorellales − Họ: Chlorellaceae − Chi: Chlorella − Loài : Chlorella vulgaris (Bold and Wynne, 1978) 1.1.2 Đặc điểm sinh học Chlorella loại tảo đơn b o, tiêm mao, khả di động chủ động, tế bào có dạng hình cầu hình oval Kích cỡ tế bào từ 3-5µm, hay 2-4 µm tùy lo i, tùy điều kiện môi trƣờng v giai đoạn phát triển Màng tế bào có vách cellulose bao bọc, chịu đƣợc tác động học nhẹ Sự thay đổi điều kiện môi trƣờng nhƣ ánh sáng, nhiệt độ, thành phần chất hóa học môi trƣờng ảnh hƣởng đến hình thái chất lƣợng tế bào tảo (Trần Văn Vĩ, 99 ) Chlorella thƣờng sống vùng nƣớc v có h m lƣợng chlorophyll cao (đạt 28,9g/kg) so với thực vật quang hợp n o đƣợc biết đến trái đất Chlorella xuất cách , tỷ năm v l dạng sống có nhân thật Các hóa thạch kỹ tiền Cambri tồn Chlorella thời kỳ Tảo Chlorella sinh sản bào tử gặp điều kiện sống thuận lợi, tảo Chlorella lớn dần lên đến kích thƣớc định tiến hành trình phân bào Chất nguyên sinh thu nhỏ lại nhiều lòng vỏ tế bào, sau tiến h nh chia đôi từ 1-3 lần liên tiếp hình thành nên từ 2-8 khối bào chất riêng lẻ có nhân lục lạp Mỗi tế bào chất GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page of 133 Page Header Page of Nghiên 133 cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối hình thành lớp vỏ mới, lớp vỏ cũ vỡ phóng thích tế bào Quá trình sinh sản nói chung đƣợc chia thành nhiều bƣớc theo nghiên cứu Tamiya (1963) (trích Sharma, 1998) nghiên cứu vòng đời Chlorella ellipsoidea chia l m giai đoạn:  Giai đoạn tăng trƣởng: giai đoạn tự bào tử tăng nhanh kích thƣớc nhờ sản phẩm sinh tổng hợp  Giai đoạn bắt đầu chín: tế bào mẹ chuẩn bị trình phân chia  Giai đoạn chín mùi: tế b o nhân lên điều kiện có ánh sáng bóng tối  Giai đoạn phân cắt: màng tế bào mẹ bị vỡ ra, tự bào tử đƣợc phóng thích ngo i : Sinh trƣởng - trƣởng thành - thành thục - phân chia Hình 1.1.Sự sinh sản tảo Chlorella Dƣới điều kiện sống tối ƣu: nhiều ánh sáng, nƣớc không khí Chlorella sinh sản với tốc độ vô lớn Một tế bào Chlorella phân chia thành 2-8 tế bào thời gian chƣa đến 24 Tuổi thọ vòng đời tế bào Chlorella phụ thuộc v o cƣờng độ ánh sáng mặt trời, nhiệt độ nguồn dinh dƣỡng trung bình khoảng Một số loài phổ biến thuộc chi Chlorella là: Chlorella pyrenoidosa Chlorella vulgaris GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page of 133 Page Header Page of Nghiên 133 cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối 1.1.3 Giá Trị Dinh Dƣỡng Sinh khối tảo chlorella thực phẩm giúp làm ruột hệ tiết, lọc gan máu tốt chlorophyll – chất có nhiều rau (đặc biệt l rau có m u xanh đậm) cỏ linh lăng; nhiên lƣợng chlorophyll tìm thấy loại khoảng 0,2 – 1% Trong tỷ lệ tảo lục Chlorella cao nhất: chiếm từ – 5% chlorophyll Bổ sung chlorophyll vào phần ăn tăng tốc độ lọc ruột, máu gan, bên cạnh giúp làm lành mô bị tổn thƣơng + Thực phẩm giàu chlorophyll + Chứa nhiều vitamin, đặc biệt B, C, E + Cũng cố sức khỏe hệ tiêu hóa v đƣờng ruột + Tăng cƣờng hệ miễn dịch + Kích thích phục hồi mô thƣơng tổn + H m lƣợng protein cao với đầy đủ acid amine thiết yếu,Có hàm lƣợng protein cao (chiếm khoảng 40-55% chất khô) đặc biệt lysine + Cho đến chƣa tìm thấy độc tố nguy hiểm tồn sinh khối tảo + Không bị virus công, sống điều kiện đơn giản + Tảo có khả l m nguồn nƣớc bẩn, giữ vệ sinh môi trƣờng Giải độc: Nhờ có lớp màng thớ( sporopolleine), chllorella hấp thu đƣợc kim laọi nặng, thuốc trừ sâu, thuốc diệt côn trùng v dƣ chất loại phân hoá học nhờ giúp thể đ o thải độc tố Chlorophylle: Làm cung cấp oxy: Chlorella giàu Chlorophylle, thành phần giúp cung cấp oxy cho mô làm đƣờng ruột C.G.F(Chlorella grow factor)- Nhân tố sinh trƣởng Chlorella: GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page of 133 Page 10 Header Page of Nghiên 133 cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối Nằm nhân Chlorella, C.F.G hỗn hợp đƣợc tạo thành từ Vitamin, nucleoit ( DN, RN) v axit amin C F G l sở di truyền Chlorella - Tăng sức đề kháng tự nhiên: Với C.F.G, Chlorella tham gia vào trình l m tăng bạch huyết bào T( thuộc hệ miễn dịch thể) -Tăng khả chịu đựng dẻo dai: C.F.G coi nguồn tập trung lƣợng: thí nghiệm vận động viên thể thao cho thấy với liều dùng nhất, tác dụng khả chịu đựng dai sức trì 10 tiếng sau - Hiệu probiotic cân hệ vi khuẩn ruột: Số lƣợng vi khuẩn actobaccilius tăng lên nhờ có mặt C.F.G Do hiệu probiotic( lợi ích sức khoẻ vi khuẩn có ích đƣợc nuôi cấy mang lại) đƣợc phát huy Vitamin khoáng chất: - Tăng cƣờng sức sống: phải đặc biệt kể đến vai trò vitamin B6, B12 phốt có tác dụng cố hệ thần kinh cải thiện giấc ngủ - H m lƣợng sắt cao Tảo lục giúp tăng cƣờng chức tạo máu - Do có nhiều sợi Xenlulô( chất xơ) nên giúp tiêu hoá tốt trì khoẻ mạnh đƣờng ruột Tảo lục bạn đồng hành phụ nữ tuổi mãn kinh Mọi nghiên cứu cho thấy phụ nữ độ tuổi mãn kinh từ đến 55 dùng tảo lục liều lƣợng giảm hẳn rắc rối thƣờng gặp tuổi mãn kinh nhƣ táo bón, mệt mỏi, tùng bốc hoả Giảm lƣợng mỡ máu: Giảm ngƣng đọng Cholesterol, chống đƣợc bệnh tim nhƣ nhồi máu tim, xơ cứng động mạch vành Có tác dụng tốt chức nam giới Là chất khử mùi hôi có hiệu quả: GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page of 133 Page 11 Header Page of Nghiên 133 cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối - Chlorella có chứa loại hormon kích thích tái sinh tế bào Các bác sỹ Nhật Bản chữa trị thành công nhiều ca viêm loét dày với Chlorella với loại thuốc chống dƣ axit - Chlorella có tác dụng làm giảm huyết áp Điều đặc biệt không làm giảm huyết áp bình thƣờng mà phát huy tác dụng trƣờng hợp huyết áp cao, làm giảm cholesterol xấu v tăng cƣờng cholesterol tốt Hiện sản phẩm từ tảo ngoại nhập với giá th nh cao, ngƣời tiêu dùng chƣa có điều kiện tiếp cận, từ kết thấy đƣợc việc nghiên cứu phát triển đề t i n y để tìm phƣơng pháp sản xuất quy mô lớn,tạo sản phẩm mang nhiều ý nghĩa dinh dƣỡng nhƣ y học [theo wikipedia] Bảng 1.1.Thành phần sinh hóa tảo Chlorella vulgaris Thành phần % KLK Protein 51÷58 Lipid 14÷12 Carbohydrat 12÷17 Kham khảo Trubachev (1976) 1.2.T ng u n ỹ thuật nuôi tả 1.2.1 Nu i cấ batch Là kỹ thuật nuôi truyền thống nuôi cấy vi sinh vật, sau đợt nuôi cấy ngƣời ta thu toàn sinh khối chừa lại phần giống vi sinh vật nuôi cấy đợt Thông thƣờng công nghiệp tỷ lệ giống giữ lại 10% so với tổng sinh khối thu hoạch 1.2.2 Nu i ng ỹ thuật -batch Kỹ thuật fed-batch kỹ thuật đại nuôi cấy vi sinh vật Trong trình nuôi ngƣời ta bổ sung thêm môi trƣờng v o, v nhƣ thể tích môi trƣờng nuôi tăng dần đạt đƣợc mức thể tích cần thu hoạch GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page of 133 Page 12 Header Page 10 ofNghiên 133 1.2.3 Nu i cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối ng ỹ thuật cyclic fed-batch Kỹ thuật cyclic fed-batch kỹ thuật đại nuôi cấy vi sinh vật, sinh khối vi sinh vật đạt cực đại ngƣời ta tiến hành thu sinh khối nhiên lƣợng lớn sinh khối đƣợc giữ lại để nuôi cấy cho mẻ tiếp, thƣờng tỷ lệ sinh khối thu hoạch so với tổng thể tích sinh khối 1:3, 1:2 1.2.4 Ƣu điểm kỹ thuật fed-batch kỹ thuật cyclic fed-batch So với kỹ thuật nuôi cấy batch truyền thống kỹ thuật fed-batch cyclic fed-batch có nhiều ƣu điểm v đƣợc minh chứng qua nhiều đề tài nghiên cứu khác kết thu đƣợc minh chứng 1.3 Hệ Thống Nuôi Tảo Quy Mô Phòng Thí Nghiệm Hiện có nhiều hệ thống nuôi tảo quy mô phòng thí nghiệm khác nhƣng đa phần dựa nguyên tắc dùng bể bình chứa suốt có độ truyền sáng tốt, có ống sục khí CO2 chiếu sáng Dạng bể mỏng Bình erlen ( 0,5-1L) Dạng chai thủy tinh GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page 10 of 133 Dạng quang học phẳng 60L Page 13 Header Page 22 ofNghiên 133 cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối Lấy mẫu cho vào bình Kjeldahl Tùy loại nguyên liệu nhiều hay chất đạm, mẫu rắn cân 0.2÷0.5g mẫu lỏng lấy từ 2÷5ml Thêm vào từ từ 10mL H2SO4 đậm đặc (tỷ trọng 84) Để tăng nhanh trình vô hóa (đốt cháy) cần phải cho thêm chất xúc tác Hỗn hợp xúc tác có tác dụng tăng nhiệt độ sôi, l m tăng vận tốc trình phản ứng Có thể dùng xúc tác axit perchloric HClO4, giải phóng O2 cho phản ứng oxy hóa Sau thêm chất xúc tác, đun nhẹ hỗn hợp tránh sôi trào, đun mạnh hỗn hợp ho n to n chuyển sang dịch lỏng Trong trình đun lắc nhẹ, tráng khéo léo cho không vết đen n o mẫu nguyên liệu thí nghiệm chƣa bị phân hủy sót lại th nh bình Đun dung dịch bình hoàn toàn trắng Cất đạm: Tiến hành máy cất đạm bán tự động GERHARDT Đức Chuẩn bị máy cất đạm: cắm điện, bật máy hình lên “H”, mở vòi nƣớc làm lạnh, chờ hình lên “P”, máy sẵn sàng làm việc Chuyển toàn dung dịch mẫu sau vô hóa xong bình Kjeldahl vào bình định mức ml, thêm nƣớc cất vạch định mức Lúc nhiệt tỏa mạnh l m nƣớc bay phần Làm nguội v điều chỉnh lại mức nƣớc để tránh sai số, sau đổ erlen để dễ lắc trộn dung dịch mẫu đồng Lấy vào erlen 10mL dung dịch H2SO4 0,1N, lắp vào máy, ý nhúng ngập ống vào dịch lỏng Lấy vào ống phản ứng 10mL dung dịch thí nghiệm từ bình định mức, lắp vào hệ thống, ý không lắp lệch, khí thoát ngoài, mẫu Định phân Lấy erlen khỏi máy sau tráng nƣớc cất để lấy hết mẫu bám ống Cho 10 giọt phenolphthalein v o bình v định phân NaOH 0,1N - Xác định hệ số hiệu chỉnh K - Lấy 10mL H2SO4 , N v o erlen, định phân NaOH 0,1N - Tính nồng độ thực tế NaOH đem định phân - K tỷ số nồng độ thực tế nồng độ tính toán NaOH Tính kết quả: GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page 22 of 133 Page 25 Header Page 23 ofNghiên 133 cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối H m lƣợng phần trăm Nitơ tổng mẫu: N = (a – bK) × 0,0014 × V × 100/(v × m) T ng đó: − N: H m lƣợng nitơ tính phần trăm khối lƣợng − a: số mL dung dịch chuẩn H2SO4 , N đem hấp thụ NH3 − b: số mL NaOH 0,1N tiêu tốn cho chuẩn độ − m: khối lƣợng mẫu đem vô hóa, g − V: tổng thể tích định mức dung dịch vô hóa ( m ) − v: thể tích dung dịch vô hóa dùng chƣng cất (10mL) − 4: lƣợng gam nitơ ứng với 1mL H2SO4 0,1N − K: hệ số điều chỉnh nồng độ NaOH 0,1N T nh h ƣợng protein thô Nitơ vật liệu sinh học chủ yếu l Nitơ protein ngo i có lƣợng nhỏ Nitơ th nh phần khác gọi l Nitơ phi protein Nitơ t ng=Nitơ p t in + Nitơ phi p t in H m lƣợng protein vật liệu sinh học đƣợc tính cách nhân hàm lƣợng Nitơ protein với hệ số chuyển đổi , h m lƣợng Nitơ có tỷ lệ ổn định từ đến 18% protein, trung bình 16% Trong nguyên vật liệu sinh học h m lƣợng Nitơ phi protein nhỏ việc tách riêng phức tạp nên theo quy ƣớc ngƣời ta tính h m lƣợng protein theo Nitơ tổng gọi protein thô hay protein tổng Công thức tính h m lƣợng phần trăm protein thô là: P t in % = Nitơ % x , Trên nhãn hiệu bao bì thực phẩm, h m lƣợng protein sản phẩm đƣợc xác định phƣơng pháp Kjeldahl v đƣợc ghi rõ: Protein (%) (Nx6.25) b Phƣơng pháp xác định h ƣợng chlorophyll Dựa vào khả hấp thụ ánh sáng loại sắc tố bƣớc sóng định để xác định h m lƣợng chúng có mẫu Mẫu đƣợc ly tâm 3000 GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page 23 of 133 Page 26 Header Page 24 ofNghiên 133 cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối vòng/phút nhiệt độ phòng phút để thu sinh khối mẫu Phần sinh khối đƣợc bổ sung ml etanol 98% Lắc nhẹ để lắng sinh khối tảo đáy ống ly tâm hoàn toàn màu tiếp tục đem ly tâm vòng/phút phút Lấy dịch v đo máy quang phổ bƣớc sóng 665nm, 649nm Áp dụng công thức tính nồng độ chlorophyll theo độ hấp thu quang phồ dung môi trích ly ethanol 95% (theo Journal of Food, Agriculture Environment Vol.9 (3và4): 1012-1018)  H m lƣợng chlorophyll a: ( ) Ca= (mg/l)  Hàm lƣợng chlorophyll b: ( ) Cb= (mg/l)  H m lƣợng chlorophyll tổng: C= Ca+Cb= ( ) (mg/l) Trong đó: V: thể tích dung dịch nuôi tảo đem trích ly (ml); v: Thể tích dịch chiết đem trích ly (ml); F: hệ số pha loãng mẫu trƣớc đo quang phổ c Phƣơng pháp đ pH i t ƣờng Sử dụng máy đo pH METT ER TO EDO d Xác định h ƣợng sinh khối khô tảo Đầu tiên, sấy khô ống ly tâm 800C đến khối lƣợng không đổi Cho vào bình hút ẩm làm nguội v cân ta đƣợc m1 Tiến h nh ly tâm vòng ml dịch tảo với tốc độ phút, sau loại bỏ phần nƣớc phía ta thu đƣợc sinh khối tảo ƣớt, sinh khối tảo ƣớt đƣợc sấy nhiệt độ C (trong h) đến khối lƣợng không đổi Cho v o bình hút ẩm v cân ta đƣợc m3  H m lƣợng sinh khối khô đƣợc tính nhƣ sau: M= e .1000 (mg/l) Phƣơng pháp định ƣợng trực tiếp tế bào b ng buồng đếm hồng cầu e1 Cấu tạ uồng đế hồng cầu uồng đếm hồng cầu l phiếng kính d y hình chữ nhật, l phần lởm phẳng, có kẻ lƣới gồm GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page 24 of 133 ô vuông nhỏ có diện tích tổng cộng l Page 27 Header Page 25 ofNghiên 133 mm2 ao gồm cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối ô vuông lớn; ô vuông lớn n y gồm có ô vuông nhỏ Vì mm2 v hình vuông lớn l / − Pha loảng huyền phù tế b o tảo cho ô vuông lớn có - thế, diện tích hình vuông nhỏ l /4 mm2 e2 Cách tiến h nh tế b o − ắc mạnh dịch huyền phù tế b o (đã pha loãng), dùng pipet Pasteur để hút dịch huyền phù n y − Đậy buồng đếm phiến kính mỏng − Nhẹ nh nh dùng đầu pippet (chứa giọt huyền phù tảo), đặt v o cạnh buồng đếm (nơi tiếp giáp với phiến kính mỏng) Dịch huyền phù di chuyển v o buồng đếm nhờ chế mao dẫn uồng đếm đƣợc chuẩn bị có vùng không gian nằm kính v buồng đếm đƣợc phủ dịch huyền phù tế b o, rảnh xung quanh không bị dính ƣớt − Di chuyển nhẹ nh ng khung đếm để dịch huyền phù tr n đầy khoang Khi đó, dịch nằm khoang có độ d y khoảng , mm − Đặt buồn đếm lên kính hiển vi, sử dụng vật kính X để tìm buồng đếm Sau chuyển qua vật kính X4 để đếm e3 Cách t nh số ƣợng tế N=( × ) × 103× n Trong đó: N l tổng số tế bào 1ml mẫu nghiên cứu; a tổng số tế bào ô vuông lớn; b: Số ô vuông nhỏ ô vuông lớn; 400 tổng số ô vuông nhỏ ; 0.1 thể tích dịch tế bào (tính mm3) chứa ô trung tâm; 103 số chuyển mm3 thành ml (1000mm3= 1ml); với n: Độ pha loãng mẫu GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page 25 of 133 Hình 2.6.Buồng đếm hồng cầu Page 28 Header Page 26 ofNghiên 133 cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối Phần : T QUẢ V N LUẬN 3.1 Động học sinh t ƣởng tảo Chlorella vulgaris nuôi cấ t ng erlen thể t ch Hình 3.1 Log N pH nuôi cấy bình thủy tinh 500ml Hình 3.2 Hằng số tốc độ phân chia (k), số tốc độ sinh trưởng (μ) số hệ (n) nuôi cấy bình thủy tinh 500ml GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page 26 of 133 Page 29 Header Page 27 ofNghiên 133 cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối Động học sinh trƣởng tảo Chlorella vulgaris đƣợc trình bày qua hình 3.1 hình 3.2 Hình 3.1 thể thay đổi mật độ tế bào pH, hình 3.2 thể thay đổi số tốc độ phân chia (K), số tốc độ sinh trƣởng (μ) v số hệ (n) Hình 3.1 cho thấy mật độ tế bào pH có mối quan hệ mật thiết với mật độ tế b o đạt cực đại pH tăng cực đại v o ng y v ngƣợc lại mật độ tế bào giảm pH giảm xuống vào ngày Căn vào hình 3.1 cho thấy thời gian để mật độ tế b o không đổi ngắn, nhỏ 4h nuôi cấy (khoảng cách lần đo mật độ tế b o) nên không xác định đƣợc thời gian cụ thể suy đoán giai đoạn tiềm phát (lag phase) diễn tính từ bắt đầu nuôi cấy nhanh ( 8; ; ng y đầu từ pha tiềm phát kết thúc logN có tăng ; tăng lần lƣợt), pH tăng (7 4; ;8 ; tăng lần lƣợt) , số tốc độ phân chia (K), số tốc độ sinh trƣởng (μ), số hệ (n) tăng nhanh v đạt cực đại vào ngày (0.03;0.023; 0.80; lần lƣợt) Hằng số tốc độ phân chia (K) số tốc độ sinh trƣởng (μ) đạt cực đại chứng tỏ trình sinh tổng hợp chất phân bào diễn mạnh theo (Coutteau, 99 ) pha cấp số nhân (exponential phase) Từ ng y đến ng y 4, logN tăng Tuy nhiên, số tốc độ phân chia (k), số tốc độ tăng trƣởng (μ) v số hệ giảm theo (Coutteau, 99 ) l pha tốc độ tăng trƣởng giảm (phase of declining growth rate) Nhƣng nhìn chung, ta gộp chung pha giai đoạn theo (GS TS.Nguyễn ân Dũng, 010) sinh trƣởng phát triễn vi sinh vật l giai đoạn logarit (log phase) Từ ng y đến ngày mật độ tế bào khác biệt (p=0.05), ngày có khác biệt mật độ tế bào Ngày pH giảm, số tốc độ sinh trƣởng (μ) 0, số tốc độ phân chia (k) số hệ (n) đạt giá trị âm, điều cho thấy trình sinh tổng hợp chất phân bào tảo kém, đủ để trì mật độ tế bào theo tài liệu cho thấy l giai đoạn ổn định (Nguyễn ân Dũng, ) Từ ng y đến ngày 9, mật độ tế bào pH giảm, số tốc độ phân chia (K), số tốc độ sinh trƣởng (μ) v số hệ (n) tiếp tục giảm giá trị âm Chứng tỏ trình tổng hợp chất nhƣ phân b o suy giảm đến mức không đủ để trì mật độ tế b o v giai đoạn tử vong (GS TS Nguyễn ân Dũng, GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page 27 of 133 ) Page 30 Header Page 28 ofNghiên 133 cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối Nhƣ vậy, trình nhân giống thể tích 500ml Từ kết thu đƣợc cho thấy trình sinh trƣởng tảo Chlorella vulgaris gồm giai đoạn: (a) giai đoạn tiềm phát < 4h; (b) giai đoạn logarit ng y (tính đến hết ngày 3), (c) giai đoạn ổn định ngày (từ ng y đến hết ng y 7); (d) giai đoạn tử vong (ng y đến kết thúc trình nuôi cấy) Thời gian thu hoạch giống tốt từ ng y đến ng y l thời điểm mật độ tế b o đạt cực đại (logN=7.33) 3.2 Động học sinh t ƣởng tảo Chlorella vulgaris nuôi cấy fed-batch cyclic fed-batch hệ thống bể nuôi cấy quang học dạng phẳng thể t ch 60L với th nh phần i t ƣờng W n Hình 3.3 Mật độ tế bào LogN pH GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page 28 of 133 Page 31 Header Page 29 ofNghiên 133 cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối Hình 3.4 Hằng số tốc độ phân chia (k), số tốc độ sinh trưởng (μ) số hệ (n) nuôi cấy hệ thống bể quang học dạng phẳng 60L K (thế hệ/giờ); u (mg/l/h); n: số hệ; mũi tên xanh cho biết thời điểm môi trường bổ sung vào bể nuôi tảo mũi tên đỏ cho biết thời điểm môi trường bể lấy bổ sung môi trường vào Hình 3.5.Hàm lượng chlorophyll (C) sinh khối khô (DCW) nuôi cấy hệ thống bể nuôi cấy quang học dạng phẳng 60L C (mg/l); DCW (mg/l) TCK: trước chu kỳ; CK: chu kỳ; CKC: chu kỳ Cycle GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page 29 of 133 Page 32 Header Page 30 ofNghiên 133 cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối Động học sinh trƣởng tảo Chlorella vulgaris nuôi cấy hệ thống bể quang học dạng phẳng đƣợc thể qua Hình 3.3,Hình 3.4 Hình 3.5 Hình 3.3 thể mật đô tế bào pH Hình 3.4 thể đổi số tốc độ phân chia (K), số tốc độ sinh trƣởng (μ) v số hệ (n) Hình 3.5 thể thay đổi h m lƣợng chlorophyll (C) sinh khối khô (DCW) Tỉ lệ ban đầu 3L tảo giống nƣớc vô trùng Kết động học cho thấy mật độ tế bào cao vào ngày thứ sau bƣớc vào giai đoạn ổn định, theo khảo sát đến ngày thứ ta bổ sung môi trƣờng walne vào (fed-batch), việc bổ sung môi trƣờng v o lúc n y có ý nghĩa trì phát triển tảo nhƣ tăng lƣợng môi trƣờng nuôi cấy lên cao từ tăng lƣợng sinh khối cần thu qua đợt nuôi cấy mà thao tác lại từ đầu nhƣ nuôi cấy mẻ ( batch ) Tƣơng tự ngày thứ ta lại fed-batch môi trƣờng walne lần vào ngày thứ 9, đến lúc thể tích môi trƣờng nuôi cấy tăng lên, thời gian mà tế bào phát triển nhanh ban đầu số lƣợng tế b o lúc n y có tăng lên đáng kể qua lần fed-batch ( ngày thứ ) Sau bƣớc vào trạng thái ổn định ngày thứ 12, lúc tỉ lệ môi trƣờng nuôi cấy đạt đến 45L ta cyclic-fed batch, lấy 20L sinh khối tảo v sau bổ sung lại vào môi trƣờng walne, tiếp tục theo d i ngày thứ 15 sau đạt đến pha ổn định (mật độ tế bào cao nhất), tiếp tục cyclic-fed batch cách lấy 20L sinh khối tảo bổ sung môi trƣờng walne Khả sát động học nuôi cấy fed-batch chu kỳ (CK1): (t ng thể tích 48L bao gồm 33L sinh khối gi i đ ạn t ƣơc chu Chu kì kéo dài ngày từ ng y v L i t ƣờng fed-batch vào) đến ngày pH trƣớc fed-batch 8.55 sau fed-batch với thể tích môi trƣờng walne 15L pH 8.12 pH tăng chậm v đến ngày thứ đạt 8.73 khác biệt nhiều LogN, sinh khối tảo chlorophyll tổng tăng lên đáng kể so với trƣớc chu kì Điều cho thấy sinh trƣởng CK1 tốt TCK GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page 30 of 133 Page 33 Header Page 31 ofNghiên 133 cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối Khả sát động học nuôi cấy fed-batch chu kỳ (CK2): (t ng thể tích 63L) Chu kì kéo dài ngày từ ng y đến ngày 12 pH trƣớc fed-batch (ngày thứ 9) 8.73 sau fed-batch môi trƣờng walne pH giảm xuống 8.32 pH tăng chậm v qua ngày, LogN,sinh khối khô (460mg/l > 360mg/l ), chlorophyll tổng tăng cho thấy hiệu việc fed-batch mục đích nuôi tảo thu nhận sinh khối Điều cho thấy sinh trƣởng CK2 tốt CK Khả sát động học nuôi cấy fed-batch chu kỳ (CK3): (t ng thể tích 63L) đến ngày thứ 15 Đến lúc mật độ tế Chu kì kéo dài ngày từ ngày thứ b o nhƣ lƣợng sinh khối khô khảo sát đƣợc ổn định ta cyclic-fed batch Thao tác lấy 20L sinh khối tảo bổ sung môi trƣờng walne pH trƣớc sau cyclic-fed batch 8.89-7.05 LogN, sinh khối khô tiếp tục tăng nhƣng không cao CK2( 490mg/l < 510mg/l), lƣợng chlorophyll tổng cao CK2 Từ kết cho thấy sau cyclic-fed batch CK3 sinh trƣởng không tốt CK nhƣng trì đƣợc lƣợng sinh khối mức cao, điều n y đƣợc lý giải việc lƣợng lớn sinh khối tảo bị lấy (20L) Khả sát động học nuôi cấy fed-batch chu kỳ cuối (CKC): (t ng thể tích 63L) Chu kì cuối kéo dài ngày từ ng y đến ng y giống CK3 tế bào vào giai đoạn ổn định ta tiếp tục cyclic-fed batch thao tác lấy 20L sinh khối tảo bổ sung môi trƣờng walne pH trƣớc sau cyclic-fed batch 8.69-7.08 ogN tăng bên cạnh h m lƣợng chlorophyll tổng đƣợc giữ đƣợc mức CK ƣợng sinh khối khô (500mg/l) tăng cao CK (49 mg/l) Điều cho thấy CKC sinh trƣởng tốt CK , điều n y đƣợc lý giải việc tảo thích nghi sau cyclic-fed batch CK3 GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page 31 of 133 Page 34 Header Page 32 ofNghiên 133 cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối Bảng 3.1 LogN, h ng số tốc độ phân chia (k), h ng số tốc độ sinh t ƣởng μ b ng kỹ thuật nuôi cấy fed-batch cyclic fed-batch hệ thống quang học phẳng 60L kmax μmax 0,026 0,008 7,009b1±0.001 0,019 0,005 7,005b2±0.031 0,011 0,003 7,019c1±0.012 0,008 0,006 7,017c2±0.002 0,007 0,005 LogNmax Chu kì Trƣớc chu kì (TCK) Chu kì (CK1) Chu kì (CK2) Chu kì (CK3) Chu kì cuối (CKC) 7,034a±0.021 (*) a, b, c: Thể khác biệt có ý nghĩa thống kê cho biết giá trị nhỏ dần theo thứ bảng K: số tốc độ phân chia (thế hệ/giờ); μ: số tốc độ sinh trưởng (mg/l/h) (*) : Độ lệch chuẩn giá trị trung bình; Các giá trị bảng giá trị lớn chu kỳ; dấu (-) thể thời điểm không tiến hành đo đạc dừng thí nghiệm LogNmax; Kmax; μmax: mật độ tế bào (logN), số tốc độ phân chia (k), số tốc độ sinh trưởng (μ) đạt cực đại GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page 32 of 133 Page 35 Header Page 33 ofNghiên 133 cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối Bảng 3.2 Chlorophyll t ng, sinh khối khô, pH b ng kỹ thuật nuôi cấy fedbatch cyclic fed-batch hệ thống quang học phẳng 60L Chu kì Chlorophyll Tổngmax Sinh khối khômax mg/l mg/l/h 9,564a±0.212 360 7,034 12,890b1±0.421 460 7,009 18,633b2±0.336 510 7,005 18,699c1±0.522 490 7,019 18,733c2±0.435 500 7,017 Trƣớc chu kì (TCK) Chu kì (CK1) Chu kì (CK2) Chu kì (CK3) Chu kì cuối (CKC) pHmax a, b, c: Thể khác biệt có ý nghĩa thống kê cho biết giá trị nhỏ dần theo thứ bảng 3.3 Kết đ h ƣợng protein sinh khối tảo Sau nuôi trồng thu nhận sinh khối ta đem mẫu kiểm tra với kết khảo sát h m lƣợng protein trung bình sinh khối tảo đạt 55%, giá trị cho thấy lƣợng protein tảo cao so với loại thực phẩm khác GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page 33 of 133 Page 36 Header Page 34 ofNghiên 133 cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối T LUẬN V Đ XUẤT I N Kết luận Kết nghiên cứu toàn thí nghiệm cho thấy: (a) sinh trƣởng tảo Chlorella vulgaris gồm giai đoạn: giai đoạn tiềm phát (lag phase), giai đoạn logarit (log Phase), giai đoạn ổn định (Stationary Phase), giai đoạn tử vong (Death Phase) Áp dụng kỹ thuật cyclic fed-batch vào nuôi tảo đem lại hiệu tích cực nuôi cấy batch fed-batch (sản lƣợng chlorophyll, sinh khô khô cao hơn, thời gian thu sinh khối rút ngắn) Đề xuất ý kiến Từ lợi ích thật tế mà tảo Chlorella vulgaris đem lại ta nên có nghiên cứu khảo sát sâu động học sinh trƣởng tối ƣu hóa trình nuôi cấy để lƣợng sinh khối thu đƣợc lớn tạo lƣợng sinh khối đủ lớn ta nghiên cứu phát triển sản phẩm đề nhằm đa dạng nhƣ tăng cƣờng dinh dƣỡng cho sản phẩm GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page 34 of 133 Page 37 Header Page 35 ofNghiên 133 cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối T I LIỆU THAM HẢO Tài liệu tiếng việt: Lê Viễn Chí, 1996 Nghiên cứu số đặc điểm sinh học tảo Skeletonema costatum Luận văn phó tiến sỹ Viện nghiên cứu Hải Sản Hải Phòng GS TS.Nguyễn ân Dũng, Giáo trình vi sinh vật học Đại học Quốc gia Hà Nội PGS TSKH V N HOÀNG, Sinh trƣởng phát triển vi sinh vật Đặng Đình Kim, Đặng Ho ng Phƣớc Hiền (1999), Công nghệ sinh học vi tảo, NXB Nông Nghiệp Hà Nội, Hà Nội Vũ Trần Khánh inh, ê Văn Việt Mẫn (2006) Application of fed-batch fermentation in high-gravity brewing VNU Journal of Science, Natural Sciences and Technology 23 166-173 Tài liệu tiếng anh: Bold, H.C & Wynne, M.J (1978), Introduction to the Algae: Structure and Reproduction Prentice-Hall, Engelwood Cliffs, New Jersey Sharma O P, 1998 Texbook of algal, Seventh preprint, Tata Mc Graw library cataloguing in publication Data, Pillay, T V R R Giridhar and A K Srivastava (2001) Cyclic Fed-batch Sorbose Fermentation by Gluconobacter oxydans A.W.Mayo T.Noike (1994)-Response of mixed cultures of chlorella vulgaris and heterotrophic bacteria to variation of pH Water Science and Technology Vol 30 No pp 285–294 GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page 35 of 133 Page 38 Header Page 36 ofNghiên 133 cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối GVHD: TS.Trịnh Khánh Sơn Footer Page 36 of 133 Page 39 ... Page 10 ofNghiên 133 1.2.3 Nu i cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối ng ỹ thu t cyclic fed-batch Kỹ thu t cyclic fed-batch kỹ thu t đại nuôi cấy vi sinh vật, sinh khối vi sinh vật đạt... Header Page of Nghiên 133 cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối MỞ ĐẦU Mục Tiêu Đề Tài Khảo sát động học sinh trƣởng tảo Chlorella vulgaris kỹ thu t nuôi cấy mẻ (batch) nuôi cấy mẻ có bổ... Page 24 ofNghiên 133 cứu nuôi cấy tảo Chlorella thu nhận sinh khối vòng/phút nhiệt độ phòng phút để thu sinh khối mẫu Phần sinh khối đƣợc bổ sung ml etanol 98% Lắc nhẹ để lắng sinh khối tảo đáy