Nghiên cứu tình trạng stress oxi hóa ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT 4-HNE 4 - hydroxinonenal 8-OHdG 8-hydroxy-2' -deoxyguanosine AJCC Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ American Joint Committee on Cancer ASK Protein quy định tín hiệu chết

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Đỗ Minh Hà – PGS-TS Trịnh Hồng Thái- người thầy đã luôn quan tâm, tận tình chỉ bảo, hướng dẫn tôi trong suốt

quá trình học tập và thực hiện khóa luận này

Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành đến các thầy cô và các bạn học viên, sinh viên đang làm việc và học tập, đặc biệt là nhóm nghiên cứu tại phòng thí nghiệm Proteomic và Sinh học cấu trúc thuộc Phòng thí nghiệm Trọng điểm công nghệ Enzyme và Protein và Bộ môn Sinh lý học và Sinh học người, Khoa sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội vì đã giúp đỡ, hỗ trợ tôi rất nhiều trong quá trình học tập, làm việc và thực hiện luận văn

Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn tới ThS BS Phạm Mạnh Cường cùng khoa Tế bào và Giải phẫu bệnh, bệnh viện quân y 103 vì đã quan tâm, giúp đỡ, hướng dẫn

và cung cấp mẫu trong quá trình thực hiện luận văn

Tôi cũng xin bày tỏ lòng cảm ơn tới Phòng thí nghiệm Trọng điểm Công nghệ Enzyme và Protein, trường Đại học Khoa học Tự nhiên đã tạo điều kiện giúp

tôi trong hoàn thành luận văn này

Tôi xin cảm ơn toàn thể các anh chị và các bạn học viên lớp K23 cao học Sinh học, trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội, đặc biệt là gia đình và anh chị em đồng nghiệp, ban giám hiệu trường Cao đẳng y tế Thanh Hóa vì đã luôn động viên, giúp đỡ, tạo điều kiện cho tôi được học tập và nghiên cứu

đề tài này

Cuối cùng, tôi xin cảm ơn đề tài KC.04.10/11-15 đã giúp phần kinh phí quan

trọng cho nghiên cứu này

Hà Nội, tháng 12 năm 2016

Học viên

Lê Thị Mai

DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT

4-HNE 4 - hydroxinonenal 8-OHdG 8-hydroxy-2' -deoxyguanosine AJCC Hiệp hội ung thư Hoa Kỳ (American Joint Committee on Cancer) ASK Protein quy định tín hiệu chết theo chương trình của tế bào

(Apoptosis Signalregulated Kinase)

CA 19 -9 Kháng nguyên ung thư biểu mô (Carcinoma antigen 19-9) CAE Kháng nguyên ung thư phôi bào thai (Carcinoembryonic antigen)

Cyt c Cytochrome c GPx Glutathione peroxidase GSH Glutathione

GST Glutathione S-tranferase JNK c- Jun N-terminal kinase LDL Lipid tỷ trọng thấp (Low density lipoproteins) MAPK Protein hoạt hóa phân bào (Mitogen activated protein kinases) MDA Malondialdehyde

NF-κB Yếu tố nhân κB (Nuclear factor κB) PBS Đệm Phosphate sinh lý (Phosphate buffer Saline) PI3K Phosphatidylinositol 3-kinase

PIP2 Phosphatidylinositol 4,5 bisphosphatePIP3 Phosphatidylinositol 3,4,5 triphosphate PUFA Acid béo chưa no có nhiều liên kết đôi (Polyunsaturated fatty

acids)ROS Các dạng oxi phản ứng mạnh (Reactive oxigen species)

SOD Superoxide dismutase TBA Thiobarbituric acid TCA Trichloacetic acid UTĐTT Ung thư đại trực tràng

MỤC LỤC

1.1 Các dạng oxi hoạt động, chất chống oxi hóa và trạng thái stress

oxi hóa trong cơ thể

3

1.2 Ảnh hưởng của stress oxi hóa trong một số bệnh lý ở người 7

1.2.2 ROS trong quá trình lão hóa và một số bệnh lý khác 8 1.3 Liên quan giữa stress oxi hóa và bệnh ung thư 9 1.3.1 ROS làm tổn thương các đại phân tử sinh học trong tế bào 10 1.3.2 ROS ảnh hưởng đến một số con đường tín hiệu trong ung thư 11 1.3.3 ROS tác động vào quá trình viêm tiến triển thành ung thư 15

1.3.6 ROS điều hòa quá trình di căn trong ung thư 18 1.4 Liên quan giữa stress oxi hóa và bệnh ung thư đại trực tràng 19 1.5 Các chỉ thị sinh học (biomarker) để đánh giá tình trạng stress

1.6 Các nghiên cứu về stress oxi hóa trên bệnh ung thư trên thế giới

và tại Việt Nam

25

1.6.1 Tình hình nghiên cứu trên thế giới 25

Chương 2- ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30

2.2.2.2 Phương pháp định lượng MDA đối với mẫu máu 34 2.2.2.3 Phương pháp định lượng MDA đối với mẫu mô 36 2.2.3 Đánh giá các đặc điểm lâm sàng, giai đoạn bệnh và đại thể của

ung thư đại trực tràng

37

2.2.3.1 Chẩn đoán giai đoạn ung thư đại trực tràng 37

3.1.1 Phân bố bệnh nhân theo lứa tuổi và giới tính 40 3.1.2 Một số đặc điểm bệnh học lâm sàng của nhóm đối tượng

nghiên cứu

40

3.2.1 Hàm lượng MDA trên mẫu máu bệnh nhân UTĐTT 42

3.2.2 Hàm lượng MDA trên mẫu máu UTĐTT theo tiến trình điều trị

bước đầu bằng phương pháp triệt căn

42

3.2.3 Hàm lượng MDA trên mẫu máu UTĐTT theo nhóm tuổi 44 3.2.4 Hàm lượng MDA trên mẫu máu UTĐTT theo giai đoạn bệnh 45 3.2.5 Hàm lượng MDA trên mẫu máu UTĐTT theo số hạch di căn 46 3.2.6 Hàm lượng MDA trên mẫu máu UTĐTT theo hình ảnh đại thể 47 3.2.7 Hàm lượng MDA trên mẫu máu UTĐTT theo mức độ biệt hóa mô u 48 3.2.8 Hàm lượng MDA trên mẫu máu UTĐTT theo kích thước khối u 49

3.3.1 Hàm lượng MDA ở các vị trí khác nhau của mẫu mô u UTĐTT 50 3.3.2 Hàm lượng MDA ở mẫu mô u UTĐTT theo các giai đoạn bệnh 51 3.3.3 Hàm lượng MDA ở mẫu mô UTĐTT có hạch và u không có hạch di

căn gần

52

3.3.4 Hàm lượng MDA ở mẫu mô u UTĐTT theo đặc điểm hình ảnh đại thể 53 3.3.5 Hàm lượng MDA ở mẫu mô u UTĐTT theo mức độ biệt hóa khối u 54 3.3.6 Hàm lượng MDA ở mẫu mô u UTĐTT theo kích thước khối u 55

PHỤ LỤC

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.1: Một số gốc ROS trong cơ thể 4

Bảng 1.2: Các phương pháp định lượng MDA 23

Bảng 2.1: Danh mục hóa chất sử dụng 31

Bảng 2.2: Danh mục thiết bị sử dụng 31

Bảng 2.3: Phân chia giai đoạn ung thư đại trực tràng của AJCC 38

Bảng 3.1: Phân nhóm bệnh nhân theo độ tuổi và giới tính 40

Bảng 3.2: Một số đặc điểm lâm sàng cuả nhóm đối tượng nghiên cứu 40

DANH MỤC CÁC HÌNH

Hình 1.2 Các chất chống oxi hóa bảo vệ tế bào 6 Hình 1.3 Sự hình thành ROS trong quá trình viêm 8 Hình 1.4: Cơ chế kích hoạt của ROS trong con đường MAPK 13 Hình 1 5 ROS kích hoạt các con đường truyền tín hiệu của tế bào

qua các chất trung gian

15

Hình 1.6: Các chỉ thị sinh học của stress oxi hóa 21

Hình 3.1 Hàm lượng MDA trên mẫu máu bệnh ung thư đại trực tràng so với đối chứng

đoạn bệnh

51 Hình 3.11 Hàm lượng MDA trên mẫu mô UTĐTT theo đặc điểm có 52

hạch và không có hạch di căn gần Hình 3.12 Hàm lượng MDA trên mẫu mô UTĐTT theo theo đặc điểm hình ảnh đại thể

ĐẶT VẤN ĐỀ

Các dạng oxi hoạt động (reactive oxygen species – ROS) bao gồm các gốc tự

do và một số phân tử đặc biệt mà trong cấu trúc có chứa nguyên tử oxi có khả năng tham gia phản ứng oxi hóa khử mạnh Trong cơ thể, ROS là một sản phẩm chuyển hóa tự nhiên của quá trình trao đổi chất [5,17,63] Sản phẩm này có nhiều vai trò quan trọng trong dẫn truyền tín hiệu tế bào, cân bằng nội môi, apoptosis và

có liên quan cả trong sự phát triển khối u [16, 44, 79]

Khi lượng ROS hình thành vượt quá khả năng kiểm soát của hệ thống chống oxi hóa của cơ thể sẽ dẫn đến tình trạng stress oxi hóa, kéo theo đó là một loạt các tác hại đối với cơ thể trong đó có quá trình peroxi hóa lipid Thuyết stress oxi hóa là một thuyết quan trọng để giải thích nguồn gốc của ung thư và nhiều bệnh lý khác [79]

Trạng thái stress oxi hóa của cơ thể có thể được đánh giá thông qua việc định lượng các chỉ thị sinh học chính của quá trình peroxi hóa lipid, biến đổi DNA hay protein như: malonyldialdehyde (MDA), 4-hydroxynoneal (HNE), 8-OHdG, Trong đó MDA là một trong số các chỉ thị sinh học được nghiên cứu nhiều nhất và được xem như một chỉ số chính để đánh giá mức độ peroxi hóa lipid [32,53,69,80]

Ung thư đại trực tràng là một trong số các các căn bệnh ác tính thường gặp ở các nước phát triển Tại Việt Nam, ung thư đại trực tràng cũng là nguyên nhân gây

tử vong đứng hàng thứ 4 sau ung thư dạ dày, ung thư phổi và ung thư gan [7,4]

Các nghiên cứu trên thế giới cho thấy có sự gia tăng về lượng ROS ở các bệnh mãn tính đường tiêu hóa [33] Tuy nhiên, cơ chế của stress oxi hóa trong các tế bào ung thư và vai trò của ROS trong tiến triển bệnh ung thư đại trực tràng vẫn còn đang tiếp tục nghiên cứu

Trong xét nghiệm lâm sàng, dấu chuẩn ung thư đại trực tràng là kháng nguyên ung thư carcinoembryonic antigen (CEA) và carcinoantigen 19-9 (CA 19-9) Các dấu chuẩn này có nồng độ tăng dần theo quá trình phát triển ung thư và chỉ tăng cao ở giai đoạn sau của ung thư Trong khi đó, nhiều nghiên cứu cho thấy nồng

độ các sản phẩm của của trình peroxi hóa lipid ở trong máu bệnh nhân ung thư đại

trực tràng đều cao hơn so với nhóm đối chứng và cao ở mọi giai đoạn phát triển ung thư Như vậy, chỉ số này có thể được sử dụng để góp phần phát hiện ung thư sớm[45]

Mối liên quan giữa stress oxi hóa với các bệnh ung thư ngày càng được các nhà sinh - y học quan tâm và nghiên cứu trên thế giới Tuy nhiên ở Việt Nam vẫn chưa có nghiên cứu nào được công bố về mối quan hệ này

Vì vậy, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tình trạng stress oxi hóa ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng” nhằm mục đích:

1 Đánh giá tình trạng stress oxi hóa ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng thông qua định lượng MDA (malondialdehyd) trong máu ngoại vi và trong mô đại trực tràng

2 Tìm hiểu mối liên quan giữa hàm lượng MDA trong máu ngoại vi và mô đại trực tràng với một số đặc điểm bệnh học ở bệnh nhân ung thư đại trực tràng

CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN

1.1 Các dạng oxi hoạt động (reactive oxygen species - ROS), chất chống oxi hóa và trạng thái stress oxi hóa trong cơ thể

1.1.1 Các dạng oxi hoạt động (reactive oxygen species - ROS)

Các dạng oxi hoạt động (reactive oxygen species – ROS) bao gồm các gốc tự

do và một số phân tử đặc biệt khác mà trong cấu trúc có chứa nguyên tử oxi có khả năng tham gia phản ứng mạnh do có chứa electron độc thân hay electron tự do chưa ghép đôi [18] Trong cơ thể, ROS là một sản phẩm chuyển hóa tự nhiên của quá trình trao đổi chất [5,17,63] Sản phẩm này có nhiều vai trò quan trọng trong dẫn truyền tín hiệu tế bào, cân bằng nội môi, chết tế bào theo chương trình (appoptosis)

và có liên quan cả trong sự phát triển khối u [16,44,79]

Các dạng oxi hoạt động có thể là các gốc tự do như: hydroxyl (·OH), alkoxyl (RO·), peroxyl (ROO·), superoxide (O2·), nitroxyl radical (NO·) Ngoài ra, ROS còn bao gồm các phân tử không phải gốc tự do như: hydrogen peroxide (H2O2), hydroperoxide hữu cơ (ROOH); ozon (O3); oxi singlet (O21) [28,69]

Vì chứa electron chưa bão hòa nên các dạng oxi hoạt động không ổn định về

cấu trúc phân tử (hình 1.1) Chúng có thể cho và nhận electron từ các phân tử khác

Do đó ROS vừa là các chất khử, vừa là các chất oxi hóa

Các dạng oxi hoạt động có thể tồn tại độc lập, tuy nhiên thời gian tồn tại của các ROS thường rất ngắn (khoảng một phần triệu giây đến vài giây) (bảng 1.1) Hầu hết các ROS đều rất không bền và nhanh chóng phản ứng với những hợp chất khác,

Hình 1.1: Cấu tạo gốc tự do [18]

với xu hướng cho đi hoặc nhận thêm electron cần thiết để có thể trở lại trạng thái ổn định [9]

Bảng 1.1: Một số dạng ROS trong cơ thể [28]

Gốc tự do Ký

hiệu

Chu kỳ bán hủy

Gốc Hydroxyl OH· 10-9

giây

Được hình thành từ phản ứng Fenton hoặc phản ứng Haber-Weiss Khả năng phản ứng của gốc hydroxyl là rất lớn trong môi trường sinh học, có khả năng phản ứng với rất nhiều thành phần của tế bào Đây là gốc có độ hoạt động mạnh nhất trong các ROS và gây nhiều thương tổn cho tế bào

Hydrogen

peroxide

H2O2 Vài phút Được hình thành trong cơ thể với số lượng

lớn, chủ yếu do sự mất đi một electron của phần tử nước Với tính chất tan trong lipid,

H2O2 hòa toàn có khả năng khuếch tán qua màng

Gốc alkoxyl RO•

(LO•)

10-6 giây Có thể được tạo ra dưới tác động của một gốc

tự do có chứa oxygen (•O2, HO• ) trên những chuỗi acid béo có nhiều nối đôi

Gốc Peroxyl ROO·

(LOO·)

Vài giây Phản ứng và hình thành trong quá trình

peroxide hóa lipid và oxy hóa protein, DNA, đường,…

Hydroperoxide ROOH ổn định Phản ứng với các kim loại chuyển tiếp để

hình thành các dạng oxi phản ứng

Singlet oxygen O21 10-6

giây

Khả năng phản ứng cao, có tính oxi hóa cực mạnh Được hình thành trong hệ ở hệ thống sinh học trong một số sắc tố như chlorophyll, retinal và flavin khi chúng khi được chiếu sáng với sự có mặt của oxi

Nitric oxide NO giây Có vai trò trong điều hòa huyết áp và dẫn

truyền xung thần kinh, là một chất oxi hóa mạnh, liên quan đến các trạng thái bệnh lý Hầu hết các ROS nội sinh chuyển hóa từ gốc tự do anion superoxide (O2.-), vì vậy anion superoxide được gọi là ROS sơ cấp, các ROS chuyển hóa từ nó gọi là ROS thứ cấp Gốc tự do anion superoxide được hình thành chủ yếu thông qua hệ enzyme NADPH oxidases (NOXs), xanthine oxidase (XO) và chuỗi truyền điện tử

ty thể (mETC); ngoài ra cũng có thể từ sự hoạt hóa oxi bởi các tác nhân khác [75]

1.1.2 Hệ thống chống oxi hóa trong cơ thể

Theo định nghĩa của Lobo, chất chống oxi hóa là những phân tử ổn định đủ

để nhận hoặc nhường electron cho các gốc tự do và trung hòa chúng, do đó làm giảm hoặc mất khả năng gây hại tới tế bào của ROS [47]

Cơ chế quá trình chống oxi hóa trong tế bào: Chất chống oxi hóa có thể làm giảm tồn thương oxi hóa trực tiếp thông qua phản ứng với các ROS hoặc gián tiếp bằng cách ức chế các hoạt động hoặc biểu hiện của enzyme tạo ra các ROS như NAD(P)H oxidase và xanthine oxidase (XO) hoặc bằng cách tăng cường các hoạt động và biểu hiện của các enzym chống oxi hóa như superoxide dismutase ( SOD), catalase (CAT) và glutathione peroxidase (GPX) trong tế bào [48]

Hệ thống này hoạt động theo các con đường sau [21,58]:

(1) Tạo phức làm mất khả năng xúc tác của các kim loại chuyển tiếp (ví dụ: transferin)

(2) Làm gián đoạn các phản ứng lan truyền (ví dụ: α-tocoferol)

(3) Làm giảm nồng độ các gốc tự do hoạt động (ví dụ: glutathion -GPx)

(4) Thu dọn các gốc tự do tham gia khơi mào phản ứng (ví dụ: superoxid dismutase -SOD)

Hệ thống gồm các chất chống oxi hóa có bản chất enzym (SOD, CAT, Peroxidase, Glutathion peroxidase – GPx, …) và có bản chất phi enzym (nhóm các polyphenol, Vitamin E- α-tocoferol, các flavonoid, β-caroten, Vitamin C, …) (hình 1.2)

Hình 1.2: Các chất chống oxi hóa thu dọn các ROS trong tế bào [78]

1.1.3 Khái niệm trạng thái stress oxi hóa

Trong cơ thể sống khỏe mạnh, gần như có sự cân bằng giữa sản sinh các dạng oxi hoạt động (ROS) với hệ thống chống oxi hóa [22]

Năm 1985, nhà nghiên cứu người Đức là Sies đã lần đầu tiên đưa ra định nghĩa về stress oxi hóa: “Stress oxi hóa” (oxidative stress) là kết quả của sự mất cân bằng trong trạng thái cân bằng giữa chất oxi hóa - chất chống oxi hóa [68] Cụm từ

“stress oxi hóa” chỉ một trạng thái của tế bào mà ở đó lượng gốc tự do chứa oxi vượt xa khả năng trung hòa, hay các cơ chế bảo vệ của tế bào [59]

Trải qua hơn 30 năm, các nhà khoa học đã đưa ra định nghĩa hoàn chỉnh hơn:

“Stress oxi hóa là sự gia tăng lâu dài hoặc nhất thời mức ROS, gây rối loạn hoạt động tế bào và quá trình dẫn truyền tín hiệu, gồm cả những quá trình ROS gây oxi hóa các thành phần tế bào mà nếu không lấy lại được cân bằng, có thể dẫn đến hậu quả làm chết tế bào do hoại tử hay tế bào tự chết theo chương trình” [48] Stress oxi hóa ở mức độ nhẹ, các phân tử sinh học bị tổn thương có thể được sửa chữa Ở mức

độ nặng nề hơn, stress oxi hóa có thể gây tổn thương không hồi phục hoặc hoại tử tế bào [5,25] Hậu quả của stress oxi hóa là rất lớn, do ROS có khả năng phản ứng với bất kỳ phần tử nào gần bên chúng làm tổn thương các tế bào, mô, cơ quan ROS ở nồng độ cao từ lâu đã được công nhận là tác nhân gây thiệt hại trực tiếp đến các phân tử lipid [14]

Stress oxi hóa có thể là kết quả của ba yếu tố: suy giảm hệ thống chống oxi hóa; tăng tạo thành các dạng oxi hoạt động và thiếu khả năng sửa chữa các tổn thương do quá trình oxi hóa trong cơ thể [5]

Rất nhiều nghiên cứu mới đây cho thấy ảnh hưởng của stress oxi hóa đến sự phát triển của nhiều loại bệnh khác nhau như: ung thư, thoái hóa thần kinh, xơ vữa động mạch, tiểu đường và lão hóa [58, 56, 59] Ngày nay, stress oxi hóa được ghi nhận là một đặc điểm nổi bật của nhiều bệnh lý cấp và mãn tính cũng như các bệnh gây ra do quá trình lão hóa như bệnh tim mạch, ung thư, rối loạn thần kinh, đái tháo đường [75] Thuyết stress oxi hóa là một thuyết quan trọng để giải thích nguồn gốc của ung thư và nhiều bệnh lý khác [79]

1.2 Ảnh hưởng của stress oxi hóa trong một số bệnh lý ở người

Khi cơ thể ở trạng thái cân bằng oxi hóa - khử, ROS ở mức "nồng độ sinh lý" sẽ giữ các chức năng quan trọng: là các phân tử tín hiệu trong “bật tắt” gen [16], tham gia vào nhiều quá trình sinh lý của tế bào: điều tiết tăng trưởng, biệt hóa, apoptosis thông qua tín hiệu tế bào Bên cạnh đó, ROS còn có vai trò quan trọng trong một số chức năng sinh lý của cơ thể [49]: điều hòa hoạt động tim và trương

lực mạch máu [36,42], duy trì cân bằng nồng độ oxi nội môi, chống viêm [36, 43,

44, 49], … Tuy nhiên trong điều kiện của stress oxi hóa, ROS có thể gây hại cho các tế bào, dẫn đến sự tăng sinh không kiểm soát, viêm, apoptosis, đặc biệt là ung thư [52, 75]

1.2.1 ROS trong các bệnh viêm

Nồng độ cao kéo dài của ROS ở trạng thái stress oxi hóa được coi là yếu tố cốt lõi trong sự tiến triển của các bệnh viêm nhiễm [49] Trong quá trình chống viêm do nhiễm các mầm bệnh vi sinh vật, bạch cầu đã sản xuất các gốc tự do để tiêu diệt chúng, sự “bùng nổ hô hấp” (respiratory burst) xảy ra [12, 69] (hình 1.3)

Hình 1.3 Sự hình thành ROS trong quá trình viêm [43]

(Chú thích: Khi các tác nhân (kháng nguyên) xâm nhập vào cơ thể sẽ bị bạch cầu đa nhân trung tính bắt giữ, đồng thời kích hoạt bạch cầu đa nhân trung tính tăng sử dụng oxi Khi bắt đầu thực bào, các tế bào này sử dụng một lượng lớn oxi

và giải phóng các enzyme như NADPH oxidase (NOX), nitric oxide synthase (NOS)

sẽ tham gia quá trình biến đổi O2, NO, Cl - để hình thành các ROS (OH●, ONOO, OCl ,O2 ●- ) Các gốc ROS này sẽ tấn công vi khuẩn hay kháng nguyên lạ [27]

-Để bảo vệ mình khỏi tác hại của các gốc tự do, bạch cầu cũng sản sinh ra rất nhiều các chất chống oxi hoá như SOD, GSH, catalase Song vẫn có khoảng 10% bạch cầu chết, do chính các dạng oxi hoạt động mà nó sinh ra Khi bạch cầu bị ly giải, các gốc tự do của oxi thoát ra ngoài, tấn công vào các tế bào xung quanh, gây

tổn thương làm cho sự đáp ứng kích thích của tế bào ở khu vực đó càng xảy ra mạnh hơn, những đáp ứng đó tương ứng trên lâm sàng là các triệu chứng sưng, nóng, đỏ, đau [12].

1.2.2 ROS trong quá trình lão hoá và một số bệnh lý khác

Các bằng chứng cho thấy rằng lão hóa có liên quan với tăng sản xuất các gốc tự do, dẫn đến tăng quá trình oxi hóa của chất béo, protein, và các vật liệu di truyền [30] Stress oxi hóa trong lão hóa gây ra sự thay đổi cấu trúc và chức năng của tế bào, thay đổi trong quá trình truyền tín hiệu, làm tăng tính nhạy cảm cuả cơ thể với nhiều loại bệnh do lão hóa, trong đó bệnh ung thư [52]

Lão hóa là một quá trình tích luỹ các biến đổi gây nên bởi những thiếu sót

về gene, bởi những yếu tố môi trường ô nhiễm và các quá trình bệnh tật Tuổi càng cao thì hoạt độ các enzyme SOD, GPx, nồng độ các chất chống oxi hoá, trạng thái chống oxi hoá toàn phần càng giảm Do vậy việc theo dõi các chất chống oxi hoá một cách định kỳ là hết sức cần thiết trong việc phòng chống lão hoá và các bệnh

liên quan đến lão hóa và các bệnh lý khác [47]

Sự dư thừa gốc tự do đã làm tăng sự oxi hoá LDL (low density lipoprotein) và khởi đầu cho xơ vữa động mạch, dẫn đến các hiện tượng như thiếu máu cục bộ cơ tim, nhồi máu cơ tim cấp trong trường hợp trạng thái chống oxi hoá toàn phần trong

cơ thể giảm thấp Tạo ra các mảng vữa xơ động mạch, chính là do các lipoprotein tỷ trọng thấp LDL bị oxi hoá Sự oxi hoá LDL là một phản ứng dây chuyền của quá trình peroxi hoá lipid do các gốc tự do điều khiển và chi phối Nếu các gốc tự do của oxi xuất hiện nhiều, quá trình peroxi hoá lipid xảy ra mạnh, tích tụ nhiều các sản phẩm MDA (malodialdehyd), 4- HNE (4 hydroxynonenal) là những sản phẩm bền

có độc tính cao Các đại thực bào nhận ra các sản phẩm độc hại này, thâu tóm chúng

và hình thành các tế bào bọt – tiền đề hình thành mảng xơ vữa động mạch [47]

Stress oxi hóa còn góp phần vào tiến triển nhiều tình trạng bệnh lý như rối loạn thần kinh, xơ vữa động mạch, tăng huyết áp, thiếu máu cục bộ, tiểu đường, hội chứng suy hô hấp cấp tính, xơ hóa phổi tự phát, bệnh phổi tắc nghẽn mãn tính và hen suyễn, viêm, lão hóa và đặc biệt là trong bệnh ung thư [21]

1.3 Liên quan giữa stress oxi hóa và bệnh ung thư

Ung thư là bệnh mà một nhóm tế bào phân chia quá mức kiểm soát, dẫn đến xâm lấn, phá hủy các mô lân cận và có thể di căn thông qua hệ thống hạch lympho hoặc dòng máu Ung thư hình thành do những sự thay đổi bất thường về vật chất di truyền của các tế bào chuyển dạng Ung thư có thể do di truyền hoặc do tác động của các tác nhân gây ung thư (carcinogen)

Sự tăng sinh không kiểm soát này thường bắt đầu từ sự kiện bất thường trên con đường tín hiệu điều hòa và kiểm soát tăng trưởng tế bào Cụ thể hơn là do

sự kích hoạt gene tiền ung thư (pro-oncogene) hoặc bất hoạt gene ức chế ung thư (anti –oncogene) dẫn đến việc kéo dài tín hiệu tăng sinh, phá vỡ cơ chế kìm hãm sinh trưởng, cũng như mất kiểm soát chu kỳ tế bào Ngày nay, các nghiên cứu đã chỉ ra ROS có tham gia vào hầu hết các quá trình này Vì vậy, các nhà nghiên cứu

đã đề xuất sự tham gia của ROS trong vai trò là chất sinh ung thư Cùng với các gốc

tự do, ROS ngày càng được biết đến là có liên quan đến một loạt các bệnh và là nguồn gốc quan trọng trong việc gây ung thư [75] Cho dù tác nhân gây ung thư có nhiều bản chất khác nhau nhưng hậu quả chung là chúng đều làm tăng các dạng oxi hoạt động [47] Trong thập kỷ qua, số lượng ngày càng tăng của các báo cáo điều tra mối liên hệ giữa ROS và ung thư đã được công bố [26,76]

1.3.1 ROS làm tổn thương các đại phân tử sinh học trong tế bào

Các dạng oxi hoạt động ROS có thể tham gia vào ung thư thông qua các cơ chế: cảm ứng đột biến gen, đây là kết quả của tổn thương tế bào và tác động đến con đường truyền tín hiệu và các yếu tố phiên mã [54, 33] Sự hiện diện của ROS ở trạng thái stress oxi hóa trong hệ thống sinh học có thể dẫn đến biến đổi vật chất di truyền, đột biến và cuối cùng là ung thư [47]

ROS cảm ứng đột biến gen thông qua làm hư hại các đại phân tử trong tế bào như acid nucleic, phospholipid, protein và carbohydrate trên màng tế bào Các telomere cũng rất dễ bị biến đổi trong sự hiện diện của ROS ở điều kiện stress oxi hóa Các gen ức chế khối u như p53 và các gen liên quan đến chu kỳ tế bào cũng có thể bị tổn thương dưới tác động của ROS [54]

ROS có thể tác động trực tiếp hoặc gián tiếp đến DNA Tác động trực tiếp của ROS có thể dẫn đến sự thay đổi DNA trong nhiều cách, trong đó bao gồm phá

vỡ DNA đơn hoặc kép, oxi hóa và làm hư hại vòng purine, pyrimidine hoặc sửa đổi gốc đường [21] Điều này có thể dẫn đến các đột biến làm thay đổi trình tự DNA từ

đó dẫn đến các sai lệch trong quá trình phiên mã, dịch mã ROS có thể tác động gián tiếp đến DNA thông qua các yếu tố phiên mã hay các enzyme tham gia vào quy định biểu hiện gen hoặc tham gia sửa chữa gen Kết quả làm tăng nguy cơ đột biến gen, có thể dẫn đến gây chết tế bào, tổn thương mô và gây ung thư [77] Sự hình thành của 8-OH-G là sản phẩm tổn thương DNA do stress oxi hóa được nhiều nghiên cứu quan tâm nhất và là một dấu ấn sinh học tiềm năng trong nghiên cứu ung thư [21]

Với phân tử ARN, oxi hóa ARN có thế làm ảnh hưởng đến điều hòa biểu hiện gen hoặc tạo ra các protein sai hỏng, không giữ đúng chức năng (nếu tác động đến mARN) Đã có các nghiên cứu cho thấy các ARN bị oxi hóa có liên quan đến một số bệnh như tim mạch, tiểu đường hay Alzheimer

Đối với protein, tác động của ROS có thể xảy ra ở nhiều cấp độ cấu trúc: từ acid amin đến cả thay đổi cấu trúc bậc 3 hoặc bậc 4, có thể tạo các liên kết chéo, làm sai lệch các cầu disulfides, làm mất các nhóm sulfhydryl quan trọng…Ngoài ra, tác động đến các acid amin có thể dẫn đến hình thành các gốc andehide hoặc xeton, phân cắt các vòng trong histidine, tryptophan ROS có thể gây ra sự phân mảnh của chuỗi peptide, thay đổi điện tích của các protein, tăng tính nhạy cảm với sự phân giải protein do sự thoái hóa của các protease Cysteine và methionine trong các protein đặc biệt dễ bị oxi hóa [21] Quá trình oxi hóa protein ảnh hưởng đến chức năng của phân tử protein, làm thay đổi cơ chế truyền tín hiệu, thay đổi hoạt động của enzyme, và có thể phân giải protein nhạy cảm, dẫn đến lão hóa [58]

Các dạng oxi hoạt động tác động đến lipid cuả màng tế bào gây ra quá trình peroxi hóa lipid Chúng làm thay đổi cấu trúc màng tế bào, phá vỡ sự sắp xếp màng kép photpho lipid, có thể làm bất hoạt các thụ thể màng và các enzym, thay đổi tính lưu động của màng tế bào, làm giảm khả năng duy trì cân bằng gradient nồng độ, và

làm tăng tính thấm của màng và gây viêm [52] Sản phẩm của peroxi hóa lipid như malondialdehyde (MDA), 4-hydroxy-2-nonenal (4 - HNE) còn có khả năng gây ảnh hưởng đến biểu hiện gen và phát triển bình thường của tế bào [21, 52, 54] Quá trình peroxi hóa lipid xảy ra còn tạo ra nhiều sản phẩm oxi hóa, thậm chí có thể là các chất gây độc cho tế bào, chất gây đột biến gene [54] MDA là một sản phẩm thứ sinh như vậy và là chỉ số sinh học dùng để đánh giá tình trạng peroxi hóa lipid cũng như stress oxi hóa ở nhóm đối tượng bệnh nhân nghiên cứu MDA đóng vai trò như một promoter khối u và tác nhân gây ung thư vì gây độc cao và có tác động ức chế các enzym bảo vệ cơ thể [32, 54, 65]

1.3.2 ROS ảnh hưởng đến một số con đường tín hiệu trong ung thư

Stress oxi hóa đã được chứng minh là có liên quan đến đến ung thư thông qua tác động của ROS lên các protein có vai trò quan trọng trong việc tiếp nhận và dẫn truyền tín hiệu tế bào - tế bào hay khoảng gian bào - tế bào trong các con đường tín hiệu trong ung thư như: tác động lên các tín hiệu sinh trưởng, tín hiệu phân chia tế bào, tín hiệu tự chết theo chương trình… Cụ thể ROS tác động lên yếu tố NIK trong con đường NF-KB (nuclear factor κB) [24]; tác động lên ASK1 (Apoptosis Signalregulated Kinase 1), ASK2 (Apoptosis Signalregulated Kinase 2) trong con đường tín hiệu protein kinase hoạt hóa phân bào MAPK (mitogen activated protein kinase) [62,68];…

a) ROS tham gia điều hòa con đường MAPK bằng cách hoạt hóa ASK1, ASK2

Trong chu trình MAPK, các tín hiệu được chuyển đến nhân tế bào và qua một loạt các phản ứng dây chuyền để tác động lên quá trình sao chép DNA, qua đó tham gia điều hoà sự tăng sinh và biệt hóa tế bào

Một thành viên trong họ protein MAPK là tín hiệu điều hòa apoptosis ASK1, được kích hoạt trong điều kiện stress oxi hóa [35] Sự hoạt hóa MAPK dẫn đến phosphoril hóa nhiều protein khác nhau, bao gồm cả các yếu tố phiên mã tham gia điều hòa sự biểu hiện gen

Bình thường ASK1 bị bất hoạt nhờ gắn với Thioreducxin (TRX), nhưng khi

có mặt của ROS với nồng độ cao, chúng sẽ oxi hóa TRX và điều này tạo ra cầu liên kết giữa Cys-32 và Cys-35, khiến cho TRX không còn khả năng liên kết với ASK1 Lúc này, 2 phân tử ASK1 liên kết với nhau sau đó được phosphoryl hóa threonine thứ 838 nhờ protein phosphatase 5 (PP5) [81] Quá trình này giúp phân tử ASK1 được hoạt hóa (hình 1.4A)

Hình 1.4 Cơ chế kích hoạt của ROS trong con đường MAPK [73]

A ROS hoạt hóa tín hiệu điều hòa apoptosis ASK1

B ROS hoạt hóa tín hiệu điều hòa apoptosis ASK2 Ngoài ra ASK1 còn có thể bắt cặp với ASK2 Hai phân tử kép này sau khi được hoạt hóa sẽ liên kết với thụ thể hoại tử khối u TRAF (tumor receptor associated factors) Cùng với các protein khác trong các con đường tín hiệu, chúng

sẽ làm ảnh hưởng đến quá trình apoptosis của tế bào (hình 1.4B) [73]

b) ROS tham gia vào chu trình phosphatidylinositol 3-kinase (PI3K)

Con đường PI3K/AKT thường được kích hoạt trong các bệnh ung thư của con người và được công nhận như là một đích tiềm năng cho liệu pháp chống ung thư [15] PI3K xúc tác cho quá trình tổng hợp phosphatidylinositol 3,4,5 triphosphate (PIP3) từ phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) PIP3 được xem như một phân tử tín hiệu kích hoạt con đường tổng hợp các protein như: Phosphoinositide-dependent protein kinase (PDK), AKT (protein kinase B), serine/threonine kinases, chúng là các chất trung gian của các con đường truyền tín hiệu khác nhau trong cơ thể [25] Ngoài ra PIP2 còn được chuyển hóa ngược lại