Đánh giá mức độ sao chép hMAM mRNA, survivin mRNA từ tế bào ung thư vú

Header Page of 134 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGUYỄN MINH HIỀN ĐÁNH GIÁ MỨC ĐỘ SAO CHÉP hMAM mRNA, SURVIVIN mRNA TỪ TẾ BÀO UNG THƯ VÚ Chuyên ngành Mã số : Hóa sinh : 62720112 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SỸ Y HỌC HÀ NỘI - 2014 Footer Page of 134 Header Page of 134 CÔNG TRÌNH ĐƯỢC HOÀN THÀNH TẠI TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Phạm Thiện Ngọc PGS.TS Trần Văn Thuấn Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án Tiến sỹ cấp Trường họp Trường Đại học Y Hà Nội Vào hồi ngày tháng năm 2014 Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam - Thư viện Trường Đại học Y Hà Nội - Thư viện Thông tin Y học Trung ương Footer Page of 134 Header Page of 134 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN Nguyễn Minh Hiền, Phạm Thiện Ngọc, Lê Thị Minh Phúc, Lê Quang Huấn (2012), Nghiên cứu phát Survivin mRNA, hMAM mRNA từ tế bào ung thư máu, Tạp chí Y học Việt Nam, tháng 8- số 2/2012, trang 5-12 Nguyễn Minh Hiền, Phạm Thiện Ngọc, Lê Thị Minh Phúc, Lê Quang Huấn (2012), Nghiên cứu chép (Transcription) gen Survivin từ tế bào ung thư vú lưu hành máu (2012), Tạp chí Y học thực hành số 8462012, trang 204-208 Nguyễn Minh Hiền, Phạm Thiện Ngọc, Lê Thị Minh Phúc, Lê Quang Huấn, Nghiên cứu phát hMAM mRNA từ tế bào ung thư vú máu (2013), Tạp chí ung thư học Việt Nam, số 1-2013, trang 443-450 Footer Page of 134 Header Page of 134 ĐẶT VẤN ĐỀ Lý chọn đề tài Ung thư vú loại ung thư hay gặp giới, đứng hàng đầu ung thư nữ giới Theo IARC, ung thư vú chiếm 21% tổng số loại ung thư phụ nữ giới Hàng năm toàn giới có khoảng 1,15 triệu phụ nữ mắc bệnh ung thư vú chẩn đoán 465 000 ca tử vong Theo nhà ung thư học, ung thư vú phát sớm, điều trị kịp thời tỷ lệ sống năm cao cách rõ rệt Từ hai thập niên gần công nghệ sinh học, đặc biệt sinh học phân tử có tiến vượt bậc nhiều lĩnh vực chẩn đoán, điều trị theo dõi sau điều trị ung thư vú nhờ mà việc phát ung thư vú sớm hơn, đánh giá giai đoạn ung thư vú xác hơn, có nhiều phương thức điều trị chuyên biệt phù hợp cho bệnh nhân cải thiện kết sống chất lượng sống cho người bệnh Một phương pháp phát tế bào ung thư dựa vào chép bất thường mRNA đặc trưng khối u mà người bình thường không thấy, từ phát tế bào ung thư từ mô ung thư tế bào ung thư di chuyển máu từ giai đoạn sớm Các nghiên cứu giới chứng minh có nhiều gen liên quan đến ung thư vú, survivin, hMAM, coi gen có độ nhậy độ đặc hiệu cao Việc phát nhiều dấu ấn ung thư có chất mRNA đặc hiệu từ TBUTM (tế bào ung thư máu) mở triển vọng phát khối u di từ giai đoạn sớm nghiên cứu: “Đánh giá mức độ chép hMAM mRNA, survivin mRNA từ tế bào ung thư vú” Mục tiêu nghiên cứu:  Đánh giá mức độ chép hMAM mRNA, survivin mRNA từ mô ung thư vú  Đánh giá mức độ chép hMAM mRNA, survivin mRNA từ tế bào ung thư vú lưu hành máu 3.Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài Một đặc tính quan trọng ung thư xâm lấn lan rộng, tế bào thoát mạch, di chuyển di tượng phân bào TBUTM có giá trị chẩn đoán, tiên lượng, dự báo di xa Biểu gen thay đổi phụ thuộc vào đặc tính khối u phân biệt TBUTM với tế bào bình thường khỏe mạnh Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát chép bất thường gen ung thư mô ung thư vú Footer Page of 134 Header Page of 134 nghiên cứu Việt Nam năm gần thu nhiều thành công Tuy nhiên nghiên cứu chép bất thường gen ung thư từ tế bào ung thư máu Việt Nam giới Nghiên cứu dựa chép bất thường gen hMAM survivin dòng tế bào ung thư để phát tế bào ung thư mô, máu bệnh nhân ung thư vú Nghiên cứu xây dựng quy trình phát hiện, đường chuẩn xác định số gen hMAM survivin từ dòng tế bào ung thư vú nuôi cấy Bằng kỹ thuật RT-PCR nghiên cứu xác định tỷ lệ phát chép hMAM mRNA, Survivin mRNA mô máu bệnh nhân ung thư vú, mô máu bệnh nhân u xơ vú, đồng thời làm sáng tỏ mối liên hệ chép hMAM mRNA, survivin mRNA mô máu bệnh nhân ung thư vú với yếu tố lâm sàng, mô bệnh học liên quan đến ung thư vú Luận án chứng minh mức độ chép hMAM mRNA, survivin mRNA mô ung thư cao mô u xơ, mức độ chép gen mô ung thư khác biệt ý nghĩa thống kê với máu ung thư lượng RNA tổng số đưa vào Kết mở triển vọng phát TBUTM từ giai đoạn sớm góp phần chẩn đoán, theo dõi điều trị ung thư vú Cấu trúc luận án: - Luận án trình bày 120 trang (không kể tài liệu tham khảo phần phụ lục) Luận án chia làm phần: + Đặt vấn đề: trang + Chương 1: Tổng quan tài liệu 31 trang + Chương 2: Đối tượng phương pháp nghiên cứu 15 trang + Chương 3: Kết nghiên cứu 38 trang + Chương 4: Bàn luận 32 trang + Kết luận: trang + Kiến nghị: trang Luận án gồm 18 bảng, sơ đồ 33 hình, sử dụng 108 tài liệu tham khảo gồm tiếng Việt, tiếng Anh số trang Web Phần phụ lục gồm: danh sách 43 bệnh nhân ung thư vú, 21 bệnh nhân u xơ vú khám điều trị bệnh viện K; kết tách chiết RNA tổng số; kết nhân gen hMAM, survivin; kết xây dựng đường chuẩn xác định gen hMAM, survivin kỹ thuật realtime PCR Footer Page of 134 Header Page of 134 Chương 1:TỔNG QUAN 1.1 Ung thư vú Ung thư vú có nguồn gốc từ ống dẫn sữa gọi ung thư biểu mô tuyến sữa, ung thư có nguồn gốc từ tiểu thùy gọi ung thư biểu mô tiểu thuỳ Có nhiều dạng ung thư vú khác với trạng thái khác nhau, ác tính khác nhau, chất di truyền khác tỷ lệ sống sót khác phụ thuộc vào yếu tố 1.1.1 Tiến triển giai đoạn ung thư vú  Tiến triển ung thư vú Giai đoạn chỗ: Khối u nguyên phát xuất phát từ đơn vị tiểu thùy - ống tuyến tận cùng, tức phần chế tiết tuyến vú Sau phát triển lan sang mô lân cận, xô đẩy tổ chức tuyến vú bình thường, xu hướng vượt khỏi mô tuyến vú xâm nhiễm mô xung quanh đến cấu trúc lân cận da, làm co rút da, sần da cam, phù nề da, đỏ loét da Giai đoạn lan tràn: + Theo đường bạch huyết + Theo đường máu: chiếm 80%  Các giai đoạn ung thư vú Hệ thống xếp giai đoạn AJCC (2004) Hiện nay, hầu hết quốc gia áp dụng hệ thống xếp giai đoạn 1.1.2 Chẩn đoán ung thư vú Hiện tại, ung thư vú chẩn đoán xác định dựa vào: + Lâm sàng: sờ thấy khối u ranh giới tương đối rõ + Cận lâm sàng: Chẩn đoán hình ảnh Chụp XQ thường, chụp vú (Mammography), Siêu âm, PET/CT PET/ MRI, ghi hình miễn dịch phóng xạ (Radioimmunoscintigrapy- RIS) Giải phẫu bệnh học ứng dụng chẩn đoán ung thư vú Có nhiều phương pháp chẩn đoán ung thư vú kết mô bệnh học coi tiêu chuẩn vàng chẩn đoán xác định ung thư vú Hóa sinh học hóa mô miễn dịch chẩn đoán ung thư vú Dấu ấn ung thư (turmor marker) nhóm chất (enym, hormon, receptor, protein ) tế bào khối u trực tiếp sản xuất tế bào bình thường sản xuất tác động kích ứng tế Footer Page of 134 Header Page of 134 bào ung thư, chất vào vòng tuần hoàn sử dụng để chẩn đoán theo dõi điều trị ung thư 1.2 TBUTM 1.2.1 Đặc điểm TBUTM TBUTM phát máu bệnh nhân ung thư coi dấu hiệu phát tán bệnh Các tế bào mang đặc tính tế bào ung thư nguyên phát, mang số gen đặc trưng khối u mà người bình thường không thấy biểu Khi di chuyển máu tế bào tồn dạng không biệt hoá, phân chia đến tổ chức thích hợp diện tác nhân đặc thù Theo quan niệm trước di ung thư vú xảy giai đoạn muộn có khối u nguyên phát rõ ràng, năm gần nhà khoa học sử dụng kỹ thuật sinh học phân tử chứng minh trình di ung thư xảy giai đoạn sớm từ hình thành khối u gọi TBUTM Vì tế bào xuất sớm nên coi dấu ấn chẩn đoán ung thư từ giai đoạn sớm 1.2.2 Kỹ thuật acid nucleic phát TBUTM  Kỹ thuật RT-PCR (Reverse Transcription-PCR)  Real-Time PCR: 1.2.3.Phát tế bào ung thư vú máu nhân hMAM mRNA survivin mRNA  Survivin Survivin thành viên thuộc nhóm protein ức chế chết theo chương trình tế bào (IAP) điều hòa phân chia tế bào Survivin phát vào năm 1997 từ thư viện gen người Gen survivin có chiều dài 15 kb, nằm vị trí NST 17q25 DNA survivin có cấu trúc mở gồm 426 nucleotid mã hóa cho protein gồm 142 aa với TLPT vào khoảng 16,3 kDa Survivin ban đầu phát tuyến ức trưởng thành bình thường thai, nhiên nghiên cứu sử dụng phương pháp đại cho thấy nhiều mô lớn thể survivin mức độ thấp so với tế bào ung thư Mức độ thấp survivin mô bình thường tác động lên cytokine cho thấy survivin có vai trò sinh lý việc điều chỉnh phát triển tồn tế bào Survivin chất ức chế trình apoptosis, thể cao hầu hết bệnh ung thư có mặt liên quan đến tình trạng Footer Page of 134 Header Page of 134 kháng với hóa trị liệu, tăng tái phát khối u sống bệnh nhân ngắn Các chế survivin tác động lên tế bào ung thư chưa hiểu rõ, nhiên survivin điều chỉnh trình apoptosis, chu kỳ tế bào, hay thông qua tương tác vật lý với chức protein sốc nhiệt  Human mammaglobin (hMAM) Mammaglobin thành viên họ uteroglobin, lần mô tả năm 1996 Watson Fleming Cho đến người ta phát 23 thành viên thuộc siêu họ ung thư uteroglobin, thành viên phát người Người ta quan tâm tới thành viên mammaglobin MammaglobinB mã hóa gen SCGB2A1 (secretoglobinB2A1), biểu cao ung thư buồng trứng MammaglobinA (thường gọi hMAM) mã hóa gen SCGB2A2, biểu cao ung thư vú SCGB2A2 nằm nhiễm sắc thể 11q12.2 tổng hợp nên glycoprotein gồm 93aa, có TLPT 10,5kDa SCGB2A2 phát lần tiền liệt tuyến chuột xuất nhóm protein có liên quan đến hormon steroid SCGB2A2 đoạn gen gồm exon (119bp, 188bp 199bp) intron (603 bp and 1888 bp) Mặc dù vai trò gây bệnh ung thư vú hMAM chưa rõ ràng có hai giả thuyết mà người ta thấy hMAM có liên quan đến ung thư vú: (i) người ta phát có mặt hMAM mẫu mô chẩn đoán chắn ung thư vú kỹ thuật Northern blot RT-PCR, không thấy mẫu mô vú lành tính (ii) hMAM biểu nhiều dòng tế bào ung thư vú hMAM chiếm tỷ lệ dương tính 5/10 dòng tế bào ung thư vú, 21% mô ung thư vú nguyên phát, 62% mô ung thư vú có di xa Cơ chế gây ung thư gen hMAM liên quan đến thay đổi tế bào biểu mô tuyến vú, kích thích tăng trưởng, tăng tỷ lệ phân bào, đặc hiệu cho ung thư dạng biểu mô 1.3 Nghiên cứu phát tế bào ung thư vú kỹ thuật sinh học phân tử Việt Nam Trong năm gần đây, sinh học phân tử áp dụng để phát tế bào ung thư thu thành công đáng kể Đầu tiên nghiên cứu Tạ Thành Văn cộng chép gen HIP (Heparansulfate Interacting protein) mô ung thư vú Đến năm 2008 kỹ thuật RT- PCR PCR định lượng điện di mao quản, Nghiên cứu Đặng thị Tuyết Minh cộng gen HIP EGFR Footer Page of 134 Header Page of 134 mô ung thư vú khẳng định mức độ chép mRNA HIP EGRF mô ung thư vú cao mô u xơ tăng theo giai đoạn tiến triển ung thư vú Ứng dụng kỹ thuật sinh học phân tử phát tế bào ung thư mô qua biểu gen đặc hiệu ung thư kỹ thuật có độ nhạy độ đặc hiệu cao góp phần chẩn đoán, điều trị tiên lượng bệnh ung thư vú Tuy nhiên theo AJCC tế bào ung thư mô không giai đoạn M0 M1, giai đoạn di khối u, bệnh nhân Mx (di ẩn) dù thêm chứng lâm sàng ảnh phóng xạ cho di coi đối xử điều trị di ung thư Phát tế bào ung thư vú máu kỹ thuật khó thu hút nhiều quan tâm nhà khoa học Cho đến kết nghiên cứu tế bào ung thư máu Việt Nam mới, cần đầu tư công sức kỹ thuật để đem lại hiệu tích cực chẩn đoán điều trị ung thư vú Chương 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Chia nhóm Nhóm bệnh: Nhóm bệnh nhân ung thư vú theo phân loại ung thư vú TNM ( n = 43) Nhóm chứng: Nhóm bệnh nhân chẩn đoán u xơ tuyến vú (n = 21) Đối tượng nghiên cứu thu thập từ khoa ngoại vú bệnh viện K Tiêu chuẩn lựa chọn, loại trừ chặt chẽ Phương pháp chọn mẫu: Chọn mẫu thuận tiện 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Thiết kế nghiên cứu sử lý số liệu - Mô tả cắt ngang - Thống kê dựa vào phần mềm SPSS 16.0 2.2.2 Địa điểm, thiết bị nghiên cứu - Bệnh nhân lựa chọn từ khoa ngoại vú bệnh viện K - Hoá chất trang thiết bị nghiên cứu phục vụ cho phân tích gen: Thực phòng thí nghiệm Phòng Công nghệ Tế bào Động vật Viện Công nghệ sinh học, môn Hóa sinh trường Đại học Y Hà Nội Footer Page of 134 Header Page 10 of 134 - Quy trình nghiên cứu Sơ đồ tóm tắt quy trình nghiên cứu BN NC Máu (lấy trước điều trị) - Tách chiết, tinh RNA - RT-PCR tạo cDNA - PCR khuếch đại gen hMAM, survivin, GDPH - Điện di sản phẩm Chọn dòng tế bào UTV (BT474, MDA-MB23-1, KPL4, MCF7) Mô (Lấy mổ) cDNA hMAM, Survivin - Giải trình tự DNA hMAM,survivin - So sánh trình tự gen hMAM,Survivin với ngân hàng gen biết - Định lượng số hMAM, Survivin Kết 1.Đánh giá mức độ chép hMAM mRNA, survivin mRNA từ mô ung thư vú Kết luận Footer Page 10 of 134 2.Đánh giá mức độ chép hMAM mRNA, Survivin mRNA từ TBUTM Header Page 14 of 134 11 N0 13 N1 17 N2 13 Thể mô bệnh học Thể ống tuyến xâm nhập 29 Thể tiểu thùy Thể nhày marker ung thư vú CA15-3 (bình thường 0,05 0,85>0,05 Nhận xét: RNA tổng số mô cao máu, không thấy khác biệt khối lượng RNA tổng số mô ung thư mô u xơ vú, máu ung thư máu u xơ vú với p>0,05 3.2.2 RT-PCR phát chép hMAM mRNA survivin mRNA mô bệnh nhân ung thư vú Dựa vào kết điện di sản phẩm RT-PCR khuếch đại gen hMAM survivin, xác định tỷ lệ phát hMAM mRNA, survivin mRNA mô ung thư vú mô u xơ vú Footer Page 14 of 134 Header Page 15 of 134 12 83.7 74.4 UTV UXV % 100 50 14.3 9.5 hMAM mRNA Survivin mRNA Hình 3.4: Tỷ lệ phát chép hMAM mRNA survivin mRNA mô nghiên cứu Nhận xét: Kết điện di RT-PCR khuếch đại hMAM mRNA survivin mRNA mô ung thư vú: hMAM có 36/43 trường hợp (chiếm tỷ lệ 83,7%), survivin có 32/43 trường hợp (chiếm tỷ lệ 74,4%) Ở mô u xơ tỷ lệ phát hMAM 2/21 trường hợp (chiếm tỷ lệ 9,5%), survivin có 3/21 trường hợp (chiếm tỷ lệ 14,3%) Bảng 3.3: Mối liên quan tỷ lệ chép hMAM mRNA, survivin mRNA mô ung thư với số yếu tố sinh học Các yếu tố liên quan bệnh ung thư vú Tuổi ≤ 50 >50 Tổng Kích thước u T1 T2 T3 T4 Tổng Di xa M0 M1 Tổng Di hạch Không di hạch Có di hạch Tổng Giai đoạn bệnh I Footer Page 15 of 134 n hMAM (+) Survivin (+) 21 22 43 16/21(76,2%) 20/22(90,9%) p=0,19 16/21 (76,%) 16/22 (72,7%) p=0,7 10 17 16 43 9/10 (90,0%) 13/17 (76,5%) 14/16 (87,5%) P=0,5 5/10 (50,0%) 13/17 (76,5%) 14/16 (87,5%) p=0,1 38 43 31/38 (81,6%) 5/5 (100%) p=0,29 28/38 (73,7%) 4/5 (80,0%) p=0,76 13 30 43 10/13 (76,9%) 26/30(86,7%) p=0,4 8/13(61,5%) 24/30(80,0%) p=0,2 7/8(87,5%) 4/8(50,0%) Header Page 16 of 134 13 II III IV Tổng Thể mô bệnh học Thể ống xâm nhập Thể tiểu thùy Thể nhầy Tổng Biến đổi CA 15-3 Không tăng Có tăng Tổng 19 16 43 15/19(78,9%) 14/16(87,5%) p=0,75 14/19(73,7%) 14/16(87,5%) p=0,13 29 43 27/29 (93,1%) 5/8 (62,5%) 4/6 (66,7%) p=0,06 24/29 (82,8%) 4/8 (50,0%) 4/6 (66,7%) p=0,15 33 10 43 29/33(84,4%) 7/10 (70,0%) p=0,5 26/33(87,8%) 6/10(60,0%) p=0,2 Nhận xét: Tỷ lệ chép hMAM mRNA, survivin mRNA mô ung thư khác biệt ý nghĩa thống kê nhóm 50 tuổi (p>0,05), kích thước u, giai đoạn bệnh khác nhau, nhóm có di chưa phát thấy di (p>0,05), không khác biệt thể mô bệnh học khác nhau, bệnh nhân có tăng CA15-3 nhóm không tăng (p>0,05) 3.2.3 Tỷ lệ phát chép hMAM mRNA survivin mRNA máu bệnh nhân ung thư vú máu bệnh nhân u xơ vú hMAM mRNA survivin mRNA % 60.00 40.00 53.5 44.2 20.00 0 00 ung thư vú u xơ vú Hình 3.4: Tỷ lệ phát chép hMAM mRNA survivin mRNA máu bệnh nhân ung thư vú u xơ vú Nhận xét: Tỷ lệ khuếch đại hMAM mRNA máu bệnh nhân ung thư vú 23/43 trường hợp (chiếm tỷ lệ 53,5%), survivin mRNA 19/43 trường hợp (chiếm tỷ lệ 44,2%) Không phát hMAM mRNA survivin mRNA máu bệnh nhân u xơ vú Bảng 3.4: Mối liên quan tỷ lệ chép hMAM mRNA, survivin mRNA máu ung thư vú với số yếu tố sinh học Footer Page 16 of 134 Header Page 17 of 134 14 Các yếu tố liên quan ung thư vú Tuổi ≤50 >50 Tổng Kích thước u T1 T2 T3 T4 Tổng Di xa M0 M1 Tổng Hạch Tổng Giai đoạn bệnh I II III IV Tổng Thể mô bệnh học Thể ống xâm nhập Thể tiểu thùy Thể nhầy Tổng Biến đổi CA 15-3 Không tăng Có tăng Tổng n hMAM (+) (%) Survivim (+) (%) 21 22 43 10/21(47,6%) 13/22(59,1%) p=0,45 6/21(28,6%) 13/22(59,1%) p=0,051 10 17 16 43 3/10 (30,0%) 7/17 (41,2%) 13/16 (81,2%) p= 0,02 2/10(20,0%) 6/17(35,3%) 11/16(68,8%) p=0,03 38 43 18/38 (47,4%) 5/5(100%) p= 0,027 15/38(39,5%) 4/5(80,0%) p=0,08 13 30 43 5/13 (38,5%) 18/30 (60,0%) p=0,19 3/13(23,1%) 16//30(53,3%) p=0,06 19 16 43 2/8 (25,0%) 8/19 (42,1%) 13/16 (81,2%) p=0,01 2/8(25,0%) 6/19(31,6%) 11/16(68,8) p=0,04 29 43 16/29 (55,2%) 3/8(37,5%) 4/6((66,7%) p=0,52 16/29(55,2%) 2/8(25,0%) 1/6(16,7%) p=0,1 33 10 43 16/33(48,5%) 7/10(70,0%) p=0,23 16/33(48,5%) 3/10(30,0%) p=0,9 Nhận xét: Không có khác biệt tỷ lệ chép hMAM mRNA, survivin mRNA máu bệnh nhân ung thư vú nhóm tuổi 50 (p>0,05), nhóm có di hạch di hạch (p>0,05), không khác biệt nhóm biến đổi CA15-3, nhóm mô bệnh học khác (p>0,05) Tỷ lệ chép hMAM mRNA, survivin mRNA máu bệnh nhân ung thư vú tăng theo kích thước u, giai đoạn bệnh (p