Nghiên cứu xác định thành phần, cấu tạo một số hợp chất hóa học trong lá của cây keo gai (Acacia Greggii)

Ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng sản phẩm chiết đối với dung môi hexane Lấy 5 mẫu bột lá cây keo gai, mẫu có khối lượng mo.. Khối lượng sản phẩm chiết được tính như sau: '10 m Gọ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

ĐÀO THỊ VÂN TRANG

NGHIÊN CỨU XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN, CẤU TẠO MỘT SỐ HỢP CHẤT HÓA HỌC TRONG LÁ CỦA CÂY KEO GAI

Công trình được hoàn thành tại

ĐẠI HỌC ĐÀ NẴNG

Người hướng dẫn khoa học: GS.TS ĐÀO HÙNG CƯỜNG

Phản biện 1: TS Trần Mạnh Lục

Phản biện 2: TS Bùi Xuân Vững

Luận văn đã được bảo vệ trước Hội đồng chấm Luận văn thạc

sĩ Khoa học họp tại Đại học Đà Nẵng vào ngày 29 tháng 06 năm 2014

Có thể tìm hiểu luận văn tại:

- Trung tâm Thông tin - Học liệu, Đại học Đà Nẵng

- Thư viện Trường Đại học Sư phạm, Đại học Đà Nẵng

MỞ ĐẦU

1 Lý do chọn đề tài

Là một quốc gia cận nhiệt đới và được thiên nhiên ưu đãi, Việt Nam có thảm thực vật vô cùng phong phú và đa dạng Từ xưa đến nay, nhiều loài thực vật đã cung cấp những nguồn dược liệu hết sức quan trọng

Trong y dược, cây keo gai có tác dụng làm thuốc giảm đau, thuốc viêm đường hô hấp, tiêu hóa, trị ho, thuốc nhỏ mắt, trị tiêu chảy và kiết lỵ, chống viêm dạ dày, rửa cầm máu và kháng sinh, chất làm se Dân gian ta uống nước lá cây keo gai và truyền kinh nghiệm nước từ lá cây keo gai có tác dụng liền xương nhanh, rất thích hợp chữa bệnh khớp Tuy nhiên chưa có nghiên cứu nào về tác dụng này của cây keo gai ở nước ta

Trên thế giới có một số công trình nghiên cứu về cây keo gai:

“Pithedulosides A-G, Oleanane glycosides from Pithecellobium dulce” của SK Nigam, Misra Gopal, Rais Uddin (National Botanical

Research Institute and Institule of Unani Medicinal Plants, Lucknow, India), Kazuko Yoshikawa, Miwako Kawamoto và Shigenobu Arihasa (Faculty of Pharmaceutical Sciences, Yamashiro-Cho,

Tokushima Bunri University, Tokushima 770, Japan); “Biochemical

evaluation of antidiabetic properties of Pithecellobium dulce fruits studied in streptozotocin induced experimental diabetic rats” của S

Pradeepa, S Subramanian (Department of Biochemistry, University

of Madras, Guindy Campus, Chennai 600 025, India), V Kaviyarasan (Centre for advanced studies in Botany,University of

Madras, Guindy Campus, Chennai 600 025, India); “Physical and

Mechanical Properties of Three-Layer Particleboard Manufactured from the Tree Pruning of Seven Wood Species” của Ramadan Abdel-

Sayed Nasser (Forestry and Wood Technology Department, Faculty

of Agriculture (Al-Shatby), Alexandria University,

Egypt);“Phytochemical studies on Pithecellobium dulce Benth A

medicinal plant of Sindh, Pakistan” của Samina Kabir Khanzada

(Institute of Plant Sciences, University of Sindh, Jamshoro, Pakistan), Wazir Khaikh và Syed Abid Ali (HEJ Research Institute

of Chemistry, International Center for Chemical and Biological Sciences (ICCBS), University of Karachi, Karachi-75270, Pakistan);

“A review on pharmacological activities of Pithecellobium Dulce extract, and there effective doses”của Sharma Shweta, Mehta B.K

(School of studies in chemistry and Biochemistry department, Ujjain

(M.P.)); “Ten Medicinal Plants from Burma”của Alireza Sesoltani

(A literature study, Institue of Pharmacy, The faculty of Mathematics and Nature Sciences, The University of Oslo);

“Antioxidant and free radical scavenging activity of Pithecellobium

dulce (Roxb.) Benth wood bark and leaves”của Shankar D

Katekhaye, Maheshkumar S Kale(MNPRL, Department of Pharmaceutical Sciences and Technology, Institute of Chemical

Technology, Matunga (E), Mumbai-400019)

Các nghiên cứu đã chỉ ra rằng: Thành phần chính của cây keo gai gồm: alkaloid, flavonoid, glycosides, saponin, phytosterol, tannin và triterpenoids Mặc dù cây keo gai có nhiều công dụng và được nghiên cứu nhiều trên thế giới song ở Việt Nam chưa có đề tài nào về cây keo gai Do đó, việc nghiên cứu về thành phần hóa học và ứng dụng dược liệu của cây keo gai ở nước ta là hết sức cần thiết Với mong muốn góp phần tìm hiểu, xác định thành phần hóa học

chính của cây keo gai, tôi thực hiện đề tài “Nghiên cứu xác định thành phần, cấu tạo một số hợp chất hóa học trong lá của cây keo gai (Acacia greggii)”

2 Mục đích nghiên cứu

- Xây dựng quy trình chiết tách thích hợp

- Xác định thành phần, cấu tạo một số hợp chất trong lá của cây keo gai

3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

- Đối tượng nghiên cứu: Lá tươi của cây keo gai

- Phạm vi nghiên cứu: Chiết tách và xác định thành phần hóa học trong lá cây keo gai

4 Phương pháp nghiên cứu

- Nghiên cứu lý thuyết: Tổng quan các tài liệu về đặc điểm hình thái thực vật, thành phần hoá học, ứng dụng của cây keo gai

- Nghiên cứu thực nghiệm:

+ Phương pháp chọn mẫu

+ Xác định một số chỉ tiêu hóa lý: độ ẩm bằng phương pháp trọng lượng, hàm lượng tro bằng phương pháp tro hóa mẫu, hàm lượng kim loại bằng phương pháp phổ hấp thụ nguyên tử (AAS)

+ Chiết bằng phương pháp soxhlet và chưng ninh

+ Định danh và xác định thành phần các dịch chiết hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol từ lá cây keo gai bằng phương

+ Các phương pháp thử nghiệm hoạt tính sinh học

5 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài

- Ý nghĩa khoa học: Cung cấp thêm thông tin về cây keo gai: một số chỉ tiêu hóa lý, thành phần hóa học và cấu tạo của một số hợp chất chính có trong cây

- Ý nghĩa thực tiễn: Giải thích khoa học các kinh nghiệm dân gian, thuận tiện cho việc ứng dụng

6 Bố cục luận văn

Luận văn gồm 93 trang, trong đó có 25 bảng và 42 hình Phần mở đầu (04 trang), kết luận và kiến nghị (01 trang), tài liệu tham khảo (06 trang) và phần phụ lục Nội dung của luận văn chia làm 3 chương: Chương 1 - Tổng quan

Chương 2 - Nghiên cứu thực nghiệm

Chương 3 - Kết quả và bàn luận

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 1.1 NGUỒN GỐC CÂY KEO GAI TRONG GIỚI THỰC VẬT 1.1.1 Họ Đậu (Fabaceae) và chi Me Keo (Pithecellobium) 1.1.2 Giới thiệu về cây keo gai

1.2 MỘT SỐ NGHIÊN CỨU VỀ THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CỦA CÂY KEO GAI

1.3 TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU VỀ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA CÂY KEO GAI

1.4 GIÁ TRỊ SỬ DỤNG CỦA CÂY KEO GAI

CHƯƠNG 2 NGHIÊN CỨU THỰC NGHIỆM 2.1 NGUYÊN LIỆU, DỤNG CỤ, HÓA CHẤT

2.1.1 Thu gom nguyên liệu

2.2.3 Hàm lượng một số kim loại

2.3 PHƯƠNG PHÁP CHIẾT VÀ KHẢO SÁT ĐIỀU KIỆN CHIẾT

2.3.1 Phương pháp chiết

2.3.2 Khảo sát thời gian chiết thích hợp

2.4 XÁC ĐỊNH THÀNH PHẦN, ĐỊNH DANH CÁC DỊCH CHIẾT LÁ KEO GAI BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ KHÍ GHÉP KHỐI PHỔ

2.5 THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC

2.6 SƠ ĐỒ NGHIÊN CỨU

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1 MỘT SỐ CHỈ TIÊU HÓA LÍ CỦA LÁ CÂY KEO GAI 3.1.1 Độ ẩm

Độ ẩm trung bình của lá keo gai là 51.885 %

3.1.2 Hàm lượng tro

Hàm lượng tro trung bình của lá keo gai là 18.265%

3.1.3 Hàm lượng một số kim loại

Hàm lượng một số kim loại so với tiêu chuẩn khá cao Theo kết quả QCVN 8-2:2011/BYT-Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia đối với giới hạn ô nhiễm kim loại nặng trong thực phẩm) thì Pb và Zn không nằm trong khoảng cho phép; Pb vượt cao gấp 8.45 lần, Zn vượt cao gấp 8.9 lần so với hàm lượng cho phép, riêng As nằm trong giới hạn quy định Vì vậy khi sử dụng lá keo gai làm dược phẩm phải hết sức lưu ý

3.2 ẢNH HƯỞNG CỦA YẾU TỐ THỜI GIAN ĐẾN QUÁ TRÌNH CHIẾT BẰNG PHƯƠNG PHÁP CHIẾT SOXHLET 3.3.1 Ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng sản phẩm

chiết đối với dung môi hexane

Lấy 5 mẫu bột lá cây keo gai, mẫu có khối lượng mo Tiến hành chiết soxhlet với 100 ml hexane (d = 0.655 g/ml) trong các khoảng thời gian là 30 phút, 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ và 5 giờ Đối với mỗi mẫu đo thể tích (V) dịch chiết thu được Dùng pipet lấy chính xác 10 ml dịch chiết của mỗi mẫu cho vào cốc đã biết chính xác khối lượng Cân cốc và tính khối lượng (m) của 10 ml dịch chiết,

từ đó suy ra khối lượng riêng (d’) của mỗi mẫu dịch chiết Khối lượng sản phẩm chiết được tính như sau:

'10

m

Gọi m’ là khối lượng chất chiết ra được từ 10g nguyên liệu:

Vì Vchất tan quá nhỏ, có thể bỏ qua nên:

m’ = d’.V – d.V (g) (3.2)

Với d là khối lượng riêng của dung môi nguyên chất

Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng

sản phẩm chiết đối với dung môi hexane được biểu diễn ở bảng 3.4

Bảng 3.4 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối

lượng sản phẩm chiết đối với dung môi hexane

Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.4 cho thấy khi tăng thời gian

chiết từ 30 phút lên 4 giờ thì khối lượng sản phẩm chiết tăng lên nhưng khi tiếp tục tăng thời gian chiết thì khối lượng sản phẩm chiết giảm Nguyên nhân do ban đầu khi được gia nhiệt khả năng hòa tan của các chất trong nguyên liệu vào dung môi lớn nên khối lượng chất chiết ra tăng lên Sau một thời gian, các chất có trong nguyên liệu không thể tan vào dung môi thêm được nữa, khi đó quá trình hòa tan kém dần và quá trình bay hơi tăng lên nên khối lượng sản phẩm chiết giảm Hơn nữa, những chất tan được trong dung môi hexane là những chất kém phân cực, dễ bay hơi nên khi đun càng lâu thì số chất bay hơi càng nhiều, đồng thời một số chất bị phân cắt thành những cấu tử nhỏ hơn làm hiệu suất chiết giảm Vì vậy, đối với dung

môi hexane chúng tôi chọn thời gian chiết thích hợp là 4 giờ, tỉ lệ % khối lượng sản phẩm chiết ra là 5.177%

3.3.2 Ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng sản phẩm

chiết đối với dung môi chloroform

Lấy 2 mẫu nguyên liệu lá keo gai, 30 g/mẫu Tiến hành chiết soxhlet mỗi mẫu với 300 ml hexane trong 4 giờ Tổng bã rắn thu được chia thành 5 phần, khoảng 10 g/mẫu Mỗi mẫu tiếp tục chiết soxhlet với 100 ml dung môi chloroform (d = 1.489 g/ml) trong các khoảng thời gian là 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ và 6 giờ Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng sản phẩm chiết đối với dung môi chloroform được biểu diễn ở bảng 3.5

Bảng 3.5 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối

lượng sản phẩm chiết đối với dung môi chloroform

Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.5 cho thấy khối lượng chất

chiết ra được là rất ít và đạt kết quả cao nhất sau 4 giờ Điều này có thể giải thích là do quá trình chiết phân lập, chiết bằng hexane trước, hầu hết các chất này đã được chiết ra nên khi chiết với chloroform lượng chất còn lại là rất ít Dù có tăng thời gian chiết thì khối lượng sản phẩm chiết không tăng lên được nữa Vì vậy, đối với dung môi

chloroform chúng tôi chọn thời gian chiết thích hợp là 4 giờ, tỷ lệ % khối lượng sản phẩm chiết ra là 2.445%

3.3.3 Ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng sản phẩm

chiết đối với dung môi ethyl acetate

Bã rắn sau khi chiết hexane và chloroform tiếp tục chiết soxhlet với dung môi ethyl acetate (d = 0.897 g/ml) trong các khoảng thời gian 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ, 5 giờ và 6 giờ Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng sản phẩm chiết được biểu diễn ở bảng 3.6

Bảng 3.6 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng sản phẩm chiết đối với dung môi ethyl acetate

Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.6 cho thấy khối lượng sản

phẩm chiết tăng lên khi tăng thời gian và đạt kết quả cao nhất sau 5 giờ Nếu tiếp tục tăng thời gian chiết thì khối lượng sản phẩm chiết giảm (Tương tự cách giải thích với dung môi hexane) Đối với dung

môi ethyl acetate chúng tôi chọn thời gian chiết thích hợp là 5 giờ, tỉ

lệ % khối lượng sản phẩm chiết ra là 17.074%

3.3.4 Ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng sản phẩm

chiết đối với dung môi methanol

Bã rắn sau khi chiết hexane, chloroform, ethyl acetate tiếp tục chiết soxhlet với dung môi methanol (d = 0.792 g/ml) trong các khoảng thời gian là 30 phút, 1 giờ, 2 giờ, 3 giờ, 4 giờ Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối lượng sản phẩm chiết đối với dung methanol được biểu diễn ở bảng 3.11 và đồ thị hình 3.12

Bảng 3.7 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến khối

lượng sản phẩm chiết đối với dung môi methanol

Nhận xét: Từ kết quả ở bảng 3.7 cho thấy khi tăng thời gian

chiết thì khối lượng sản phẩm chiết tăng dần và đạt giá trị cao nhất sau 3 giờ; tiếp tục tăng thời gian chiết đến 4 giờ thì khối lượng sản phẩm chiết giảm nhẹ Nguyên nhân là do methanol là dung môi có khả năng hòa tan được nhiều cấu tử nên khi tăng thời gian chiết, lượng chất chiết ra được càng nhiều nhưng khi đun với thời gian lâu thì một số cấu tử có khối lượng phân tử lớn, mạch phân tử dài bị bẻ gãy thành những phân tử nhỏ hơn nên dễ bị bay hơi hơn Do đó, khối lượng sản phẩm chiết giảm Vì vậy, đối với dung môi methanol

chúng tôi chọn thời gian chiết thích hợp là 3 giờ, tỷ lệ % khối lượng sản phẩm chiết ra là 14.540%

Nhận xét chung:

Qua khảo sát ảnh hưởng của thời gian đến khối lượng sản phẩm chiết trong quá trình chiết phân lập lá cây keo gai lần lượt với các dung môi hexane, chloroform, ethyl acetate và methanol với tỷ lệ rắn/lỏng là 10g/100ml chúng tôi nhận thấy: Thời gian chiết thích hợp tương ứng với các dung môi lần lượt là 4 giờ, 4 giờ, 5 giờ và 3 giờ

Tỷ lệ % khối lượng sản phẩm chiết ra từ dung môi ethyl acetate là

lớn nhất (17.074%), từ dung môi chloroform là bé nhất (2.445%)

Các dịch chiết đã khảo sát đều có màu Tiến hành pha loãng các dịch chiết và đo UV-VIS để xác định khoảng bước sóng hấp thụ của từng dịch chiết, tạo điều kiện ứng dụng rộng rãi hơn Phổ hấp thụ

UV-VIS của các mẫu chiết được trình bày ở hình 3.6 và 3.7

0.000 0.05 0.15 0.25 0.35 0.45 0.55 0.65 0.75 0.800

nm

A

0.00 0.1 0.3 0.5 0.7 0.9 1.1 1.3 1.50

nm

A

Hình 3.6 Phổ hấp thụ phân tử của dịch chiết hexane (trái) và dịch

chiết chloroform (phải)

550.0 560 580 600 620 640 660 680 700.0 0.00

0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4 1.6 1.8 2.0 2.10

nm

A

400.0 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600.0 0.00

0.1 0.3 0.5 0.6 0.8 0.9 1.1 1.3 1.40

nm

A

Hình 3.7 Phổ hấp thụ phân tử của dịch chiết ethyl acetate (trái) và

dịch chiết methanol (phải)

Nhận xét: Dịch chiết hexane có màu vàng, phổ hấp thụ phân

tử của dịch chiết hexane có bước sóng cộng hưởng từ 430 nm đến

470 nm, λmax = 444 nm Dịch chiết chloroform có màu xanh lục nhạt, phổ hấp thụ phân tử có bước sóng cộng hưởng 660 - 680 nm, λmax =

668 nm Dịch chiết ethyl acetate có màu xanh đen, phổ hấp thụ phân

tử của dịch chiết có bước sóng cộng hưởng 660 - 670 nm, λmax = 666

nm Dịch chiết methanol có màu xanh lục đậm, phổ hấp thụ phân tử của dịch chiết có bước sóng cộng hưởng 400 - 480 nm, λmax = 414

Nhận xét: Bằng phương pháp GC–MS đã định danh được 23

cấu tử trong dịch chiết hexane từ lá cây keo gai, chủ yếu là những

cấu tử có độ phân cực yếu đến không phân cực, bao gồm alkane, ankene, arene, alcohol, andehyt, ketone, các acid hữu cơ và ester của chúng, hợp chất dị vòng chứa oxi Cấu tử có hàm lượng lớn nhất là

tử trong dịch chiết chloroform từ lá cây keo gai, chủ yếu là những cấu tử

có độ phân cực yếu đến không phân cực, bao gồm alkane, alkene, terpene, alcohol, andehyt, acid và ester, hợp chất dị vòng chứa oxi Cấu

tử có hàm lượng lớn nhất là oxirane, heptadecyl- (18,27%)

3.4.3 Dịch chiết ethyl acetate

Kết quả xác định thành phần hóa học bằng GC–MS dịch chiết ethyl acetate của lá keo gai được thể hiện trên sắc ký đồ hình 3.10 Kết quả phân tích định danh thành phần hóa học của lá keo gai trong dịch chiết ethyl acetate thể hiện ở bảng 3.10

Hình 3.10 Sắc kí đồ GC–MS dịch chiết ethyl acetate

Bảng 3.10 Thành phần hóa học trong dịch chiết ethyl acetate