Nghiên cứu trích ly và chuyển đổi màu hạt điều màu (bixa orellana l ) thành norbixin tạo chế phẩm bột norbixin tan trong nước

Mặt khác do cấu trúc hóa học của bixin có nhóm ester nên có thể chuyển đổi bixin và norbixin trong hạt điều màu thành muối natri hoặc kali của norbixin để tăng khả năng hòa tan trong nướ

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NÔNG LÂM TP HCM

******************

TRẦN THỊ HÀ

NGHIÊN CỨU TRÍCH LY VÀ CHUYỂN ĐỔI MÀU HẠT

CHẾ PHẨM BỘT NORBIXIN TAN TRONG NƯỚC

LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

ĐẶT VẤN ĐỀ

Thế kỷ XX đã chứng kiến thời kỳ hoàng kim của phẩm màu tổng hợp dùng

để tạo màu cho thực phẩm Ưu điểm chính của màu tổng hợp là tiện dụng, bền màu

và giá rẻ nhưng thời gian gần đây xuất hiện ngày càng nhiều báo cáo về tác hại của chúng đối với sức khỏe người tiêu dùng Một số màu tổng hợp gây ngộ độc, rối loạn tiêu hoá, thậm chí là ung thư, một số khác được cho là gây rối loạn thần kinh, Vì vậy màu tự nhiên ngày càng nhận được sự quan tâm nhiều hơn đặc biệt là trong hai

thập kỷ gần đây, trong đó có màu annatto chiết từ hạt điều màu (Bixa orellane L.)

Annatto là màu tự nhiên đã được sử dụng rộng rãi từ lâu trong các món ăn truyền thống của nhiều dân tộc trên thế giới Trong công nghiệp thực phẩm, annatto là màu

tự nhiên quan trọng thứ hai đứng sau caramel và được CODEX công nhận là màu thực phẩm và màu dược phẩm an toàn Annatto gồm hai hợp chất tạo màu chính là bixin và norbixin Bixin chiếm khoảng 80 % chất màu tổng số, tồn tại tự nhiên

trong hạt điều màu ở dạng đồng phân 9’–cis–bixin, đồng phân này cho màu cam và không tan trong dầu thực vật Còn đồng phân trans–bixin cho màu đỏ, tan trong dầu

thực vật và thường thấy trong các loại chế phẩm màu annatto Riêng norbixin tan một phần trong nước ở pH cao cho màu vàng đến cam Như vậy, tuy chiếm tỷ lệ lớn trong tổng số sắc tố tồn tại tự nhiên trong hạt điều màu nhưng cả bixin và norbixin đều khó tan trong nước nên màu annatto nguyên thủy không tiện dụng Mặt khác do cấu trúc hóa học của bixin có nhóm ester nên có thể chuyển đổi bixin và norbixin trong hạt điều màu thành muối natri hoặc kali của norbixin để tăng khả năng hòa tan trong nước, từ đó tăng tính tiện dụng của chế phẩm màu annatto

Ở Việt Nam, cây điều màu được canh tác hoặc mọc hoang dại ở Nam Bộ, Tây Nguyên và một số tỉnh miền Trung, chủ yếu để thu hoạch hạt dùng tạo màu cho thực phẩm Sản phẩm thương mại liên quan đến cây điều màu phần lớn là hạt khô hoặc là thành phần trong bột cà ri (chiếm khoảng 50 % khối lượng) Hiện đã có một

số tác giả trong nước điều tra, nghiên cứu về thành phần hóa học và quy trình trích

ly để sản xuất chế phẩm màu từ hạt điều màu nhưng vẫn chưa có một quy trình công nghệ sản xuất nào có thể triển khai ở quy mô công nghiệp

Nhằm góp phần xây dựng quy trình sản xuất đơn giản, hiệu quả và dễ triển khai thực tế cho ra chế phẩm bột norbixin tan trong nước, tiện sử dụng cho nhiều sản phẩm thực phẩm, chúng tôi chọn đề tài “Nghiên cứu trích ly và chuyển đổi màu

hạt điều màu (Bixa orellana L.) thành norbixin tạo chế phẩm bột norbixin tan trong

nước” với các mục tiêu sau:

1 khảo sát ảnh hưởng của một số yếu tố đến hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu hạt điều màu thành norbixin, và

2 thử nghiệm tạo chế phẩm bột norbixin tan trong nước để phối màu cho thực phẩm

Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn của đề tài:

– Ý nghĩa khoa học: kết quả của đề tài sẽ cung cấp thông tin về

+ tính chất hòa tan của các hợp chất màu có trong hạt điều màu, và

+ cơ chế chuyển đổi qua lại giữa các dẫn xuất màu annatto

– Ý nghĩa thực tiễn: kết quả của đề tài là cơ sở để xây dựng quy trình công

nghệ chế biến hạt điều màu hiệu quả cao Chế phẩm sản xuất ra có tính tiện dụng vì có khả năng hòa tan tốt trong nước, giúp gia tăng giá trị và tạo cơ hội biến điều màu thành cây công nghiệp có giá trị hơn ở Việt Nam

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 Cây điều màu (Bixa orellana L.)

Tên khoa học: Bixa orellana L

Hệ thống phân loại thực vật (Chengaiah et al., 2010):

Giới (Regnum): Thực vật (Plantae) Ngành (Division): Thực vật có hoa (Angiospermae) Lớp (Class): Hai lá mầm (Eudicots)

Bộ (Ordo): Cẩm quỳ (Malvales)

Họ (Familia): Điều màu (Bixaceae) Chi (Genus): Điều màu (Bixa)

Loài (Species): Bixa orellana Linn

1.1.2 Đặc điểm thực vật học

Cây điều màu mọc nhiều ở vùng nhiệt đới, lá xanh quanh năm, có thể sống tới 50 năm Thân cây dạng cây bụi hoặc gỗ nhỏ, có nhiều cành, chiều cao 3 – 10 m (Srivastava et al., 1999) Lá đơn, mềm, nhẵn, hình ba cạnh, đầu nhọn, hình tim ở

gốc, nhọn ở chóp, dài khoảng 12 cm, rộng 7 cm hoặc hơn; cuống phình ở đỉnh, dài

3 – 4 cm Hoa khá lớn, màu tía hoặc trắng, mọc thành chùy ngắn ở đầu ngọn Quả dạng nang, hình tim, bao bọc bởi gai cứng, quả mọc thành chùm, màu đỏ tím, mở bằng hai van, mỗi mảnh nang chứa nhiều hạt, khi chín có màu đỏ tươi đến nâu Số lượng hạt trong mỗi quả có thể tới 50 hạt, hạt có dạng gần lập phương, tập trung trên một cuống ngắn, cuống hạt nở ra thành một cái áo hạt ngắn màu đỏ, xung quanh hạt có lớp áo hạt dạng sáp màu đỏ Quả non có vỏ màu xanh thẫm, mềm, hạt

ở trong màu đỏ tươi, ướt, mềm và trơn Khi già vỏ quả chuyển màu xanh hơi vàng, hạt phía trong cứng, khó bóp, màu đỏ thẫm Khi chín vỏ quả sẽ khô và nứt ra làm các hạt ở trong khô theo và rơi tự do xuống đất, do đó rất dễ phát tán để phát triển thành cá thể mới (Đỗ Tất Lợi, 2006)

Hình 1.1 Cây, hoa, trái, hạt và bột điều màu (Bixa orellana L.) (Venugopalan et

al., 2011) Cây điều màu cho nhiều hạt khi nhận được đầy đủ ánh nắng mặt trời với

0C đến 44 0C và lượng mưa hàng năm yêu cầu

800 – 1 500 mm Thời gian cây cho thu hoạch kéo dài từ 20 đến 25 năm (Venugopalan et al., 2011)

1.1.3 Nguồn gốc, phân bố và sản lượng canh tác

Cây điều màu có nguồn gốc ở Trung và Nam Mỹ, hiện được trồng nhiều ở các nước nhiệt đới Các nước đóng góp sản lượng lớn gồm có Peru, Brazil, Bolivia, Colombia, Ecuador, Jamaica, Mexico, Puerto Rico và Dominica Cây điều màu du nhập vào Ấn Độ và khu vực Đông Nam Á từ thế kỷ 17 bởi người Tây Ban Nha đưa tới để làm chất nhuộm màu thực phẩm Sau đó được du nhập vào Hoa Kỳ và Châu Phi Một số nước Châu Âu như Anh, Đan Mạch, Thụy Điển, Na Uy cũng đã thuần hóa thành công loài cây này nhưng chúng phát triển kém hơn so với vùng nhiệt đới Loại cây này cũng được trồng ở Hawaii và một số đảo thuộc khu vực biển Thái

Bình Dương

Ở Việt Nam cây điều màu được nhập nội để trồng vào thời kỳ Pháp thuộc, hiện nay loài cây này mọc hoang dại hoặc được trồng rải rác ở vùng đồng bằng Nam Bộ, Tây Nguyên và miền Trung để thu hoạch hạt, làm cảnh hoặc làm thuốc (Võ Văn Chi, 1969) Loại cây này có thể trồng vào bất kỳ thời điểm nào trong năm

và thường ra hoa vào năm thứ 3, vào đầu mùa mưa (khoảng tháng 4, tháng 5), cho thu hoạch hạt vào khoảng tháng 10, tháng 11

Năm 1983, sản lượng annatto toàn cầu chỉ đạt 3 000 tấn hạt khô nhưng đến nay đạt khoảng 14 500 tấn với giá trung bình 1 100 USD/tấn Theo nhiều báo cáo khác nhau, sản lượng hạt dao động trong khoảng 300 – 600 kg/ha tuỳ tuổi cây, điều kiện khí hậu và chế độ canh tác Châu lục đóng góp sản lượng annatto nhiều nhất là châu Mỹ, khu vực Nam Mỹ có Brazil là nước sản xuất nhiều nhất tới 5 000 tấn; Peru xuất khẩu 4 000 tấn với khách hàng lớn nhất là Nhật Bản; nước có sản lượng ít hơn là Ecuador Khu vực Trung Mỹ có các nước Dominicana, Honduras, Colombia, Bolivia, Guatemala và Costa Rica Vùng Carribean gồm có Jamaica, Tobago và Trinidad Còn khu vực Bắc Mỹ chỉ có đại diện là Mexico Châu Phi đóng góp nhiều nhất là Kenya, hàng năm nước này xuất khẩu 1 500 tấn hạt khô và chế phẩm, ngoài

ra phải kể đến Nam Phi, Zimbabwe và Ivory Coast Các nước có sản lượng ít hơn là

Ấn Độ, Sri Lanka, Philippine, Thổ Nhĩ Kỳ và Angola Mỹ là nước nhập khẩu annatto nhiều nhất (3 000 tấn/năm), kế sau là châu Âu (2 500 tấn/năm) trong đó Anh chiếm tỷ lệ nhiều nhất và Đan Mạch là nước chế biến màu annatto hàng đầu châu Âu, đứng thứ ba về nhập khẩu annatto là Nhật Bản (1 500 tấn/năm) (ITC, 1993; Venugopalan et al., 2011)

1.1.4 Thành phần hóa học trong hạt điều màu

Kết quả phân tích cho thấy hạt điều màu chứa 40 – 45 % cellulose; 3,5 – 5,5

% sucrose; 0,3 – 0,9 % tinh dầu; 3 % dầu không bay hơi; và 13 – 16 % protein (The Raintree Group, 1997) Nhìn chung, hàm lượng các sắc số annatto trong hạt điều màu khoảng 5 % đối với loài có quả hình bán cầu, 3 – 3,58 % đối với quả hình nón, còn quả hình oval chỉ có 1,5 – 2 % (ITC, 1993; Mantovani et al., 2013) Màu

annatto là hỗn hợp của 8 sắc tố thuộc nhóm carotenoid, trong đó quan trọng nhất là

cis–bixin (ester monomethyl của acid dicarboxylic norbixin), một phần trans–bixin

và cis–norbixin Bixin chiếm khoảng 80 % tổng số chất màu trong annatto

(McKeown và Mark, 1962; Aparnathi và Sharma, 1991; Venugopalan et al., 2011) Ngoài bixin và norbixin, các sắc tố còn lại với tỷ lệ nhỏ đã được xác định từ dịch trích ly annatto gồm 5 apocarotenoid (C30 và C32), 8 diapocarotenoid (C19, C22, C24,

và C25) và một dẫn xuất carotenoid (C14) (Mercadante et al., 1999) Ngoài các sắc tố vừa nêu, hạt điều màu còn chứa alpha– và beta–carotene, methyl 9'z–apo–6'–lycopenoate cùng một số thành phần khác như cryptoxanthin, lutein, zeaxanthin, cryptoxanthin, methylbixin, tannin, saponin, dầu ethereal, hợp chất tương tự dầu mustard, mono– và sesquiterpene bixaghanene, bixein, bixol, crocetin, ellagic acid, ishwarane, isobixin, phenylalanine, salicylic acid, threonine, tomentosic acid và tryptophan (Hallagan et al., 1995; Mercadante et al., 1995; The Raintree Group, 1997; Smiths và Wallin, 2006; Venugopalan et al., 2011)

Giá cả của hạt và chế phẩm annatto dựa trên hàm lượng chất màu (bixin, norbixin hoặc cả hai) Hạt xuất xứ từ Jamaica chứa khoảng 3 % bixin nên có giá gấp đôi một số loại hạt của Ấn Độ hàm lượng dưới 2 % Hạt từ vùng Caribbean có màu

Theo Amaral et al (2009), màu annatto chỉ nằm ở lớp áo hạt (Hình 1.2) nên khi trích ly không cần thiết phải nghiền hạt Năm 2006, Nobre et al đã so sánh và thấy rằng hàm lượng annatto trích nguyên hạt và hạt nghiền mịn cho kết quả không khác biệt Trích ly nguyên hạt còn có ưu điểm hơn đó là hạn chế tạp chất lẫn với chất màu, gây khó khăn và tốn kém cho công đoạn tinh sạch tiếp theo

Theo khảo sát của Bùi Thị Mỹ Lệ (2012), hàm lượng màu trong hạt điều màu tăng dần trong quá trình sinh trưởng và phát triển của hạt Do đó, hạt điều màu chín

có hàm lượng màu cao nhất

Hình 1.2 Hạt điều màu khô nguyên hạt (trái) và bổ đôi (phải)

1.2 Phẩm màu annatto

1.2.1 Danh pháp, cấu tạo của bixin và norbixin

Màu annatto có bản chất là carotenoid, gồm hai thành phần tạo màu chính là bixin và norbixin, công thức cấu tạo của bixin là C25H30O4 (Mw = 394,5) và norbixin là C24H28O4 (Mw = 380,5) Ở trong hạt điều màu, chất màu bixin tồn tại ở

dạng đồng phân cis với tên đầy đủ là methyl (9–cis)–hydrogen–6,6'–diapo–Ψ,Ψ– carotenedioate Còn cis–norbixin tên đầy đủ là 6,6'–diapo–Ψ,Ψ–carotenedioic acid

(Haque, 2011) Mạch carbon của bixin và norbixin có các nối đôi xen kẽ đều đặn giữa các nối đơn Như vậy, norbixin là một hợp chất dicarboxylic có hai gốc carboxyl tự do còn bixin là methyl ester của acid norbixin, nên bixin chỉ còn một

nhóm carboxyl tự do (Hình 1.3)

Hình 1.3 Cấu trúc phân tử của cis–norbixin (a) và cis–bixin (b) (Magestea et al.,

2012)

1.2.2 Tính chất hóa lý

Bixin cho màu đỏ đến cam, phân tử kém phân cực nên không tan trong nước,

có thể tan trong dầu và dung môi hữu cơ như chloroform, ethyl acetate, acetone, Norbixin cho màu cam pha vàng, phân tử phân cực mạnh hơn, không tan trong nước ở pH thấp, tan tốt trong kiềm, tan ít trong dung môi hữu cơ (Scotter, 2009)

Do có nhiều nối đôi trong mạch carbon nên cả bixin và norbixin đều dễ bị biến đổi khi tiếp xúc trực tiếp với ánh sáng cường độ cao trong thời gian dài (Emerton và Choi, 2008) Najar et al (1988) đã chứng minh ánh sáng là nhân tố gây thoái hóa annatto mạnh nhất Norbixin bị kết tủa trong môi trường pH thấp (khoảng dưới 5,5); khi norbixin kết tủa thường tạo phức bền với protein, tinh bột và một số thành phần khác và tạo ra sự đồng đều màu sắc trong sản phẩm, đồng thời ngăn chặn hiện tượng trôi màu (Scotter, 2009) Annatto rất bền trong môi trường kiềm (Lê Thị Anh Đào và ctv, 2000) Tương tự như các hợp chất carotenoid khác, do có nhiều nối đôi trong phân tử nên annatto dễ bị oxy hóa, nhất là khi ở dạng bột do bề mặt tiếp xúc lớn hoặc khi đã phối chế vào thực phẩm mặc dù một số thực phẩm có

gum cashew, gum arabic và maltodextrin (hoặc hỗn hợp của chúng) thì ít bị oxy hóa hơn (Barbosa et al., 2005) Hoạt tính chống oxy hóa của annatto trong một số trường hợp còn mạnh hơn BHA và BHT (Scotter, 1999) Nhiều tác giả đã công bố nghiên cứu về hoạt tính chống oxy hóa của annatto như Kiokias và Gordon (2003), Cardarelli et al (2008), Vasu et al (2010), Santos et al (2011) và Garcia et al (2012)

Trong nhóm carotenoid, annatto là nhóm màu gần như duy nhất vẫn giữ màu khi thay đổi các dạng cấu trúc hóa học (Hình 1.4) Ở điều kiện nhiệt độ và pH nhất định, bixin bị thủy phân thành norbixin hoặc xà phòng hóa thành muối kali hoặc natri của norbixin Ở nhiệt độ thấp hơn 50 0C, bixin và norbixin khá ổn định, nhưng

từ 50 0C trở lên, đồng phân cis–bixin dễ biến thành trans–bixin ổn định hơn

(Scotter, 2009), rồi từ đó có thể phân hủy tạo một số sản phẩm, trong đó có chất màu vàng C17 với tên đầy đủ là polyene 4,8–dimethyltetradecahexaenedioc acid monomethyl ester (sắc tố McKeown) và metaxilen (Preston và Rickard, 1980; Lê Thị Anh Đào và ctv, 2000) (Hình 1.5)

Muối Na +

hoặc K+

của cis-norbixin

cis-norbixin

Acid hóa (hoặc trung hòa)

Thủy phân (xà phòng hóa)

Hình 1.5 Phản ứng sinh sắc tố McKeown và metaxilen (Lê Thị Anh Đào và ctv,

2000)

1.2.3 Độc tính, liều thu nạp ADI và lượng sử dụng trong thực phẩm

Theo Cơ quan quản lý thuốc và thực phẩm Mỹ (FDA), hồ sơ độc tính của hạt annatto và dịch trích ly của nó đã được khảo sát đầy đủ để sử dụng làm phụ gia thực phẩm Annatto được ghi rõ trong hệ thống Food Chemical Codex (mã số 73.30, 73.1030 và 73.2030) và được xác định là an toàn (Generally Recognized as Safe – GRAS) đối với người khi sử dụng qua nguồn thực phẩm có chứa annatto Chế phẩm màu annatto được cộng đồng châu Âu cũng như hệ thống INS (International Numbering System for Food Additives) đánh số trong hệ thống E number là E160b (Scotter, 2009)

Theo khuyến cáo của FAO JECFA (Joint FAO/WHO Expert Committee on Food Additives) năm 2006, lượng norbixin sử dụng hàng ngày (ADI) là 0 – 0,6 mg/kg thể trọng đối với norbixin và muối kali hoặc natri của nó Hiện chỉ số ADI của E160b đang trong tiến trình đánh giá lại dưới sự bảo trợ của các công ty phẩm màu trên quy mô toàn cầu Lý do là chỉ số ADI hiện tại dựa trên đánh giá ban đầu ở nồng độ annatto khá thấp (Downham và Collins, 2000)

Theo Lê Thị Anh Đào và ctv (2002), lượng sử dụng màu annatto trong thực phẩm chỉ khoảng 1 – 10 ppm; còn theo tác giả Emerton và Choi (2008), hàm lượng

10 – 50 ppm là phổ biến đối với bơ, phô mai, cá xông khói, snack và đồ tráng miệng Cơ quan quản lý tiêu chuẩn và an toàn thực phẩm Ấn Độ cho phép giới hạn hàm lượng annatto tối đa trong sản phẩm thực phẩm là 200 ppm (Balaswamy et al., 2012)

1.2.4 Ứng dụng của phẩm màu annatto trong ngành thực phẩm

Ở Bắc Mỹ và châu Âu, người ta dùng màu annatto để nhuộm màu bơ, phô mai (màu cam của phô mai cứng, màu đỏ của phô mai Edam Hà Lan, …) Chúng được dùng để tạo màu cho nước xốt, thịt lợn quay ở Trung Quốc Còn ở Việt Nam, màu này được dùng trong món cà ri, bột bánh, gà quay mật ong và các loại mì, bún nước, Ở Mexico, annatto được trộn với một số gia vị khác tạo thành một loại gia

vị màu đỏ gạch gọi là achiote paste và adobo, rất được người dân Mexico ưa chuộng Họ thường dùng achiote chung với giấm để ướp thịt hoặc phối chế nước

xốt Do có nguồn gốc thực vật nên annatto thích hợp để chế biến các món ăn chay

Hình 1.6 Phô mai và snack sử dụng màu norbixin (Biocon del Peru, 2013)

Phẩm màu E160b thường được dùng để tạo màu thức ăn và đồ uống thành màu đỏ hoặc vàng tới vàng cam đậm Các loại thực phẩm thường được ứng dụng phẩm màu này là margarine, snack, dầu salad, đồ uống, kẹo thạch, kẹo cứng và ngũ cốc nảy mầm, Tùy thuộc vào phương pháp sản xuất, E160b chia làm hai loại dựa trên tính tan, loại tan trong dầu và loại tan trong nước Chế phẩm annatto tan trong dầu thường được dùng để tạo màu cho thực phẩm nhiều dầu như bơ, margarine / shortening, phô mai, bánh ngọt, bánh quy, bỏng ngô và snack, nước xốt, hay đồ tráng miệng dạng kem Annatto dạng nhũ có lợi thế hơn khi sử dụng cho phô mai, kem, món soup, kẹo và sản phẩm từ sữa Màu annatto tan trong pH acid có thể dùng cho nước ép, rượi mùi, thạch trong suốt và món tráng miệng dạng sệt Trước kia chế phẩm annatto tan trong nước chỉ được ứng dụng để sản xuất phô mai nhưng nay đã

mở rộng ra nhiều dòng sản phẩm khác Do chế phẩm annatto tan trong nước dạng

truyền thống không tan trong pH thấp nên không thể dùng cho thực phẩm dạng lỏng trong suốt có tính acid như đồ uống không có thịt quả (Prabhakara Rao et al., 2002), nhưng lại rất thích hợp cho thực phẩm dạng rắn và bán rắn như vỏ xúc xích, xúc xích, pudding, tương cà, tương ớt, ngũ cốc ăn sáng, món tráng miệng chứa bơ sữa, độn chocolate, cá xông khói và thức ăn cho vật nuôi (Smiths và Wallin, 2006)

Hầu hết các nhà sản xuất đều lưu ý rằng khi sử dụng annatto cần phải quan tâm đến độ bền của nó Annatto thích hợp để chế biến thực phẩm có sử dụng nhiệt nhưng ở nhiệt độ quá cao trong thời gian dài sẽ làm phân hủy chất màu do đó nên

bổ sung annatto vào cuối quy trình sản xuất Khả năng hòa tan và độ pH cũng ảnh hưởng đến sắc màu của annatto Trong thực phẩm nhiều dầu như đồ ăn nhẹ hoặc phô mai, annatto cho màu vàng hơn so với thực phẩm nhiều nước Nếu annatto kết

tủa trong thực phẩm, độ hòa tan giảm hoặc pH giảm thì sắc đỏ sẽ mạnh hơn

1.2.5 Chế phẩm norbixin dùng làm phụ gia thực phẩm

Hình 1.7 Chế phẩm norbixin dạng bột, lỏng và sệt (Oriental super–mart, 2013;

Orchard Valley, 2013) Phẩm màu annatto chiếm tới 70 % tổng sản lượng màu tự nhiên toàn cầu và riêng tại Brazil là 90 % (Veríssimo, 2003) nhưng nước xuất khẩu chế phẩm annatto nhiều nhất lại là Mỹ bởi vì Brazil chỉ sản xuất để phục vụ nhu cầu nội địa, đôi khi còn nhập thêm để đáp ứng đủ nhu cầu.Có tới 70 % lượng chế phẩm nhập vào các

trường, norbixin được cung cấp dưới dạng lỏng, nhũ, bột hoặc cao sệt Để đạt mục đích tăng cường độ bền màu cho thực phẩm cần thời gian bảo quản dài hoặc phải phơi sáng, người ta thường trộn chung annatto với màu tự nhiên khác như màu củ nghệ tumeric hoặc màu ớt paprika Chế phẩm annatto dạng cao sệt (oleoresin) bảo quản được lâu hơn so với dạng bột (Balaswamy et al., 2006) Bảng 1.1 mô tả phương pháp sản xuất ba loại chế phẩm norbixin dạng bột theo phân loại của FAO

≈ 80 %

Bixin được trích bằng dung môi hữu cơ, loại dung môi rồi kết tinh thành dạng bột Thêm kiềm loãng vào bột thu được, đun nóng để thủy phân sắc tố rồi làm nguội Lọc dịch, sau đó acid hóa để tủa norbixin Lọc tủa, rửa, sấy và nghiền, cuối cùng thu được bột norbixin

≈ 40 %

Cọ xát hạt điều màu trong dung dịch kiềm nguội (KOH hoặc NaOH) để tách sắc tố Thêm kiềm vào huyền phù thu được, đun nóng để hòa tan sắc tố rồi làm nguội Loại chất béo và sáp Lọc dịch, acid hóa để kết tủa norbixin Lọc, rửa tủa, sấy khô rồi nghiền thành bột

Annatto

G

Thu norbixin

bằng kiềm loãng,

sấy khô (không

qua công đoạn

acid hóa)

Tối thiểu 15

% norbixin, mong muốn

≈ 20 %

Cọ xát hạt điều màu trong dung dịch kiềm nguội (KOH hoặc NaOH) để tách sắc tố Thêm kiềm vào huyền phù thu được, đun nóng để hòa tan sắc tố rồi làm nguội Loại chất béo và sáp Lọc dịch, sau đó sấy phun hoặc sấy khay Có thể thêm K2CO3

1.2.6 Quy định về chế phẩm phụ gia norbixin

Phụ lục 24 trong Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực phẩm – phẩm màu (QCVN 4–10:2010/BYT) quy định cụ thể về quy chuẩn kỹ thuật và phương pháp thử đối với cao annatto (thực tế là chế phẩm norbixin) Quy chuẩn quy định

hàm lượng màu tổng số tối thiểu trong chế phẩm là 35 % khối lượng tính theo norbixin Còn hàm lượng kim loại nặng cho phép như trong Bảng 1.2

Bảng 1.2 Yêu cầu về độ tinh khiết đối với chế phẩm phụ gia annatto

Tên kim loại Giới hạn tối đa

phẩm được vi gói bền màu gấp 10 lần so với chế phẩm truyền thống bixin – sucrose trong điều kiện không ánh sáng

Satyanarayana et al (2006) sử dụng kỹ thuật sấy phun để tạo ra hai chế phẩm bột norbixin, chế phẩm tan trong nước và chế phẩm ổn định trong dung dịch acid Tác giả dùng hai loại chế phẩm phối màu cho một số thực phẩm chế biến từ rau và trái cây

Trong luận văn thạc sĩ của mình, Silva (2007) cũng ứng dụng phương pháp sấy phun với chất mang maltodextrin để sấy khô dịch trích ly hạt điều màu bằng dung môi KOH 0,1 N và NH4OH 0,5 N Ngoài ra Silva còn trích dẫn một số nghiên cứu của các tác giả khác như Batista (1994) và Pimentel (1995) cũng dùng maltodextrin làm chất độn để sấy phun muối kali hoặc natri norbixinate Kết luận cuối cùng tác giả đưa ra là trước khi áp dụng sấy phun nên dùng maltodextrin để cô đặc dịch trích norbixin

1.3.3 Sấy thăng hoa

Mendes (2012) nghiên cứu sử dụng gum cashew làm chất mang để sấy thăng hoa và sấy phun dịch trích ly từ hạt điều màu Kết quả cho thấy gum cashew không thích hợp để vi gói riêng lẻ, trong khi đó hỗn hợp gum cashew / gum arabic tỏ ra hiệu quả hơn nhưng vẫn chưa bằng nghiệm thức sử dụng chất mang là 100 % gum arabic Hơn nữa, phương pháp sấy thăng hoa cũng cho ra sản phẩm vi gói annatto ít

bị thoái hóa nhất trong số các nghiệm thức nghiên cứu

1.4 Một số phương pháp trích ly norbixin

1.4.1 Phương pháp trích ly bằng dung môi vô cơ

Phương pháp trích ly norbixin bằng dung môi kiềm liên quan mật thiết đến

cơ chế phản ứng xà phòng hóa liên kết ester trong phân tử bixin Phản ứng xảy ra khi có mặt hơi nước hoặc anion OH– trong dung dịch Dưới đây là cơ chế phản ứng với xúc tác kiềm (NaOH hoặc KOH) do Campbell et al (2009) và McMurry (2012)

mô tả

Trước tiên anion hydroxide (OH–) ái nhân gắn vào (hoặc “tấn công”) nguyên

tử carbon ái điện tử của nhóm carbonyl trong phân tử ester Sản phẩm trung gian có tên là orthoester

Tiếp theo alkoxide bị đẩy ra để giải phóng nhóm carboxyl

Alkoxide mang tính kiềm mạnh hơn base liên hợp với nhóm carboxyl nên quá trình chuyển proton diễn ra nhanh hơn Sản phẩm cuối cùng thu được là acid carboxyl và alcohol

Phương trình phản ứng tổng quát như sau:

Giai đoạn đầu của quá trình trích ly màu norbixin từ hạt điều màu bằng dung môi kiềm (NaOH hoặc KOH) thường kết hợp với khuấy cơ học ở nhiệt độ thường

để trích ly bixin và norbixin Sau đó bổ sung kiềm (nếu cần) rồi nâng nhiệt độ để xà phòng hóa bixin thành norbixin hoặc muối norbixinate (Hình 1.8), nhiệt độ xà phòng hóa thường không quá 70 0C(Preston và Rickard, 1980) Bước tiếp theo có thể là cô đặc dịch trích ly hoặc kết tủa norbixin bằng acid để thu được chế phẩm

2006) Đã có rất nhiều tác giả nghiên cứu về phương pháp trích ly màu norbixin bằng dung môi kiềm, tiêu biểu như Dendy (1966), Silva (2007), Silva et al (2009),

và Nachtigall et al (2009)

Ngoài dung môi kiềm, một số công trình cũng dùng nước làm dung môi trích

ly norbixin, có thể kể đến công trình của Tống Thị Việt Hà (2011), Parvin et al (2011) và Sinha et al (2013) Tuy nhiên hiệu suất không cao do phân tử norbixin kém phân cực nên khó tan trong dung môi nước, trong công bố của Parvin et al chỉ

có 8,93 % norbixin trong hỗn hợp màu trích ly được bằng dung môi nước

Hình 1.8 Phản ứng chuyển đổi qua lại giữa các dạng sắc tố annatto (Silva, 2007) 1.4.2 Phương pháp định lượng bằng quang phổ hấp thụ phân tử UV – Vis

Đã có nhiều công bố của các tác giả khác nhau dùng phương pháp quang phổ hấp thụ phân tử UV – Vis để định lượng màu annatto Bảng 1.3 liệt kê một số công

trình tiêu biểu liên quan đến định lượng cis–norbixin

Bixin và đồng phân iso của nó có độ hấp thụ cực đại tại bước sóng khoảng

500 nm và 470 nm trong chloroform, trong khi đó sắc tố thoái hóa màu vàng lại hấp thụ cực đại tại 404 nm và 428 nm trong chloroform, nhưng lại không hấp thụ ở bước sóng 500 nm (McKeown và Mark, 1962) Sử dụng phương pháp định lượng của McKeown và Mark (1962) dựa trên độ hấp thụ tại 500 nm và 404 nm không chỉ thu được kết quả về hàm lượng màu annatto tổng số mà còn biết được hàm lượng bixin (Parimalan et al., 2011) Phương pháp này đến nay đã được khá nhiều tác giả

sử dụng trong công trình của mình như Scotter et al (1998), Giridhar và Parimalan (2010), Parimalan et al (2011) và Mahendranath et al (2011ab)

Bảng 1.3 Hệ số và bước sóng hấp thụ tối đa của cis–norbixin trong các dung môi

468 chloroform 2470 Rodriguez–amaya (1988)

473 chloroform + 0,5

% acid acetic 2620

Reith và Gielen (1971); Smith (1983)

Phương pháp quang phổ đủ để xác định hàm lượng màu annatto và có độ

và các chất nhũ hóa không ảnh hưởng đến kết quả phép đo quang phổ (Bareth et al., 2002; Silva, 2007; Scotter, 2009)

Hình 1.9 Phổ hấp thụ của bixin và norbixin trong chloroform (Silva, 2007)

FAO JECFA cũng đưa phương pháp đo quang phổ hấp thụ phân tử vào Chuyên luận định lượng tổng chất màu tan trong nước bằng phương pháp quang phổ (FAO JECFA Monographs 1 – Vol 4 – Quy trình 1) Các điều kiện cụ thể đối với norbixin như sau:

– dung môi là dung dịch KOH 0,5 %;

– đo độ hấp thụ quang tại λmax ~ 482 nm; và

– độ hấp thụ riêng tại 482 nm: A1%

1cm = 2870

Một chú ý quan trọng và thú vị liên quan đến phép đo độ hấp thụ của bixin trong dung môi chloroform đó là bixin thoái hóa nhanh chóng khi đựng trong cuvet thạch anh (Levy và Rivadeneira, 2000) Hơn nữa, bước sóng cần đo đối với annatto lớn hơn 300 nm cho nên trong quá trình thí nghiệm chỉ có cuvet thủy tinh (Hellma

6030 OG) được sử dụng

1.5 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước

1.5.1 Nghiên cứu trong nước

Ở Việt Nam, tác giả có nhiều công bố liên quan đến màu annatto nhất là Đào Hùng Cường và Phan Thảo Thơ Năm 2008, nhóm tác giả chủ trì đề tài cấp nhà nước “Nghiên cứu thành phần và phản ứng chuyển hóa hợp chất hóa học của hạt điều nhuộm miền Trung, Tây Nguyên” Kết quả chính của đề tài đạt được là:

– Thời điểm thu hoạch hạt điều màu để tách chất màu norbixin trong hạt lớn nhất 2,4 % là vào đầu tháng thứ 3 kể từ khi cây ra quả (tháng 11 hàng năm)

Tỷ lệ hạt điều / nước trích ly tốt nhất là 5/80; thời gian ngâm cho hiệu quả tối

ưu là 24 h ở 100 0C

– Thời điểm thu hoạch hạt điều để tách chất bixin trong hạt lớn nhất là vào đầu tháng thứ 6 kể từ khi cây ra quả (tháng 2 hàng năm) Chiết tách bixin tốt nhất 19,8 % từ hạt điều nhuộm bằng ethyl acetate ở nhiệt độ 80 0C; tỷ lệ rắn / lỏng

là 1/18 trong thời gian 10 giờ

Năm 2005, Lưu Đàm Cư cùng cộng sự có đề cập đến hạt điều màu trong đề tài “Nghiên cứu chiết tách chất nhuộm màu thực phẩm từ kinh nghiệm sử dụng thực vật của đồng bào dân tộc thiểu số” Tuy nhiên do phạm vi đề tài quá rộng và mang tính điều tra là chính nên chưa có nhiều kết quả chuyên sâu về annatto

Năm 1995, tác giả Ngô Thị Thuận và cộng sự đã hoàn thành đề tài cấp nhà nước “Xây dựng quy trình công nghệ tách chiết, tổng hợp các chất màu thực phẩm” Nhóm tác giả tiến hành nghiên cứu chất màu trên nhiều đối tượng thực vật trong đó

có hạt điều màu

Tác giả Lê Thị Anh Đào và ctv (2000) đã đạt được kết quả về thông số trích

ly bằng dung môi hữu cơ (dung môi cồn thực phẩm 960, nhiệt độ trích 30 0C, tỷ lệ dung môi / hạt là 5/1 (v/w), chia làm 4 lần trích, mỗi lần 30 phút) Còn đối với dung môi vô cơ, nồng độ KOH tối ưu là 0,1 M với tỷ lệ dung môi / hạt là 12/1 (v/w)

1.5.2 Nghiên cứu ngoài nước

Có rất nhiều công trình được công bố ở các nước trên thế giới về phẩm màu

Brazil, Peru, Ấn Độ, Mỹ, Anh và Nhật Bản, Có thể nhận thấy các hướng nghiên cứu chủ yếu gồm có: trích ly, nghiên cứu tính chất của bixin và norbixin, biến đổi hoặc vi gói annatto, phối chế vào thực phẩm, phương pháp phân tích hàm lượng màu trong chế phẩm và thực phẩm, Riêng hướng nghiên cứu trích ly bằng dung môi vô cơ cũng đạt được nhiều thành tựu đáng ghi nhận

Năm 2007, Santos so sánh hai quy trình sản xuất chế phẩm annatto, một là dùng dầu thực vật để tạo chế phẩm tan trong dầu và hai là dùng dung môi kiềm để tạo chế phẩm tan trong nước Sau khi so sánh hiệu quả kinh tế và phân tích chất lượng của hai loại chế phẩm thu được, tác giả kết luận có thể dùng cả hai phương pháp này để sản xuất thương mại chế phẩm annatto ở Brazil

Năm 2009, Nachtigall et al công bố nghiên cứu về phản ứng xà phòng hóa màu annatto Tác giả kết luận nồng độ KOH là yếu tố quan trọng nhất ảnh hưởng đến phản ứng xà phòng hóa bixin thành norbixin Kết quả của Nachtigall et al tương đồng với thực tế sản xuất khi các nhà sản xuất thường dùng nồng độ kiềm cao để phản ứng xà phòng hóa bixin diễn ra thuận lợi Việc nâng nhiệt độ quá cao

và kéo dài thời gian trích ly là không cần thiết và gây lãng phí lớn cho quá trình sản xuất do hai yếu tố này ít ảnh hưởng đến phản ứng xà phòng hóa

Cùng trong năm 2009, Silva et al đã hoàn thành nghiên cứu về các yếu tố ảnh hưởng đến phản ứng xà phòng hóa carotenoid trong hạt annatto Nhóm tác giả cho rằng nếu muốn thu bixin thì nên dùng dung dịch kiềm loãng (KOH 0,6 %) ở nhiệt độ thường, còn nếu muốn sản phẩm là màu tan trong nước thì nên dùng kiềm nồng độ cao (KOH 4 %) kèm với nhiệt độ cao khoảng 60 0C để phản ứng xà phòng hóa bixin thành muối kali của norbixin diễn ra thuận lợi

Tuy nhiên, thiếu sót của hai công bố năm 2009 là chưa tiến hành thí nghiệm tối ưu hóa các thông số của quá trình phản ứng để tìm ra mối quan hệ chính xác hơn rồi từ đó đưa ra chế độ phản ứng thích hợp nhất nhằm đạt được hiệu suất trích ly cao

Chương 2 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 Nội dung nghiên cứu

1 Khảo sát và tối ưu hóa nồng độ hỗn hợp dung môi thích hợp để trích ly và

chuyển đổi màu thành norbixin

2 Khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi / nguyên liệu và điều kiện ủ (nhiệt

độ, thời gian) đến quá trình trích ly và phản ứng chuyển đổi màu thành norbixin

3 Khảo sát loại acid và nồng độ thích hợp để kết tủa norbixin tự do

5 Khảo sát tỷ lệ chất trợ tan thích hợp để phối trộn tạo chế phẩm bột norbixin tan trong nước

6 Đánh giá chất lượng và khả năng ứng dụng của chế phẩm bột norbixin

2.2 Thời gian và địa điểm nghiên cứu

Đề tài đã được thực hiện từ tháng 5/2013 đến tháng 10/2013 tại PTN Khoa Thực phẩm – Môi trường – Điều dưỡng, ĐH Công nghệ Đồng Nai

2.3 Vật liệu, hoá chất và trang thiết bị

2.3.1 Đối tượng nghiên cứu

Quả điều màu chín hình oval được mua ngẫu nhiên ở huyện Vĩnh Cửu, Đồng Nai Sau khi tách vỏ, loại tạp chất và hạt lép, hạt non, đem sấy khô hạt bằng tủ sấy ở nhiệt độ 40 0C đến khi độ ẩm đạt khoảng 10 % theo khuyến cáo của Mantovani et

al (2013) Hạt khô thu được đem trộn thật đều để đồng nhất rồi chia ra thành nhiều phần, mỗi phần 200 g hạt trong các túi PE dán kín miệng, sau đó lưu trữ ở điều kiện

không ánh sáng, nhiệt độ khoảng 6 – 8 0C Lượng mẫu thu thập một lần là 25 kg hạt khô, đủ dùng cho toàn bộ quá trình thí nghiệm

Hình 2.1 Hạt điều màu trước (trái) và sau khi sấy (phải) 2.3.2 Dụng cụ và thiết bị

– Bể nước ổn nhiệt Memmert WNB 14; Germany

– Bể rửa siêu âm Elmasonic S 60H, Elma; Germany

– Cân điện tử Sartorius TE612; Germany

– Cân điện tử Sartorius TE124S; Germany

– Cuvet thủy tinh Hellma 6030 OG, Hellma; Germany

– Máy quang phổ Spectrophotometers Genesis 20, Thermo Scientific, USA – Máy khuấy từ gia nhiệt Barnstead/Thermolyne SP131320–33; USA

– Máy sấy ẩm hồng ngoại Sartorius MA 150; Germany

– Máy ly tâm Hettich EBA 20; Germany

– Micropipet eppendorf 10 – 100 μL và 100 – 1000 μL, Eppendorf; Germany

– Tủ sấy Memmert 100 – 800; Germany

2.3.3 Hóa chất

– Acetone 99,7 %; VN–Chemsol Co., Ltd.; Việt Nam

– Amonia 25 ~ 28 %; Guangdong Guanghua Chemical Factory; China

– Chloroform 99 %; Guangdong Guanghua Chemical Factory; China

– CH3COOH 99,5 %; Guangdong Guanghua Sci–Tech Co., Ltd.; China

– Đường saccharose 99,9 %; CTCP đường Biên Hòa; Việt Nam

– Ethanol 99,5%; VN–Chemsol Co., Ltd.; Việt Nam

– HCl 36 ~ 38 %; Xilong Chemical; China

– HCOOH 88 %; Xilong Chemical; China

– H3PO4 85 %; Guangdong Guanghua Sci–Tech Co., Ltd.; China

– H2SO4 96 ~ 98 %; Guangdong Guanghua Chemical Factory; China

– KOH 86 %; Guangdong Guanghua Chemical Factory; China

– Methanol 99,5 %; Guangdong Guanghua Sci–Tech Co., Ltd.; China

– Na2CO3 99,8 %; Xilong Chemical; China

– NaOH 96 %; Guangdong Guanghua Sci–Tech Co., Ltd.; China

2.4 Phương pháp và bố trí thí nghiệm

2.4.1 Bố trí thí nghiệm

2.4.1.1 Xác định tính chất nguyên liệu hạt điều màu

Mục đích: Xác định tính chất ban đầu của vật liệu nghiên cứu, kiểm tra độ đồng nhất của mẫu nhằm chuẩn hóa nguyên liệu đầu vào cho việc xây dựng quy trình Các tính chất khảo sát gồm có: số lượng hạt trong một đơn vị khối lượng, độ

ẩm, hàm lượng tro và hàm lượng màu annatto tổng số

a Xác định độ ẩm của hạt nguyên liệu

Mục đích: xác định độ ẩm của hạt nguyên liệu

Phương pháp tiến hành như mô tả trong Mục 2.4.2.1

Tiến hành: hạt được nghiền thành bột mịn sau đó đem sấy bằng hai phương pháp, phương pháp sấy khay và sấy hồng ngoại Sau đó so sánh kết quả của hai phương pháp để xác định khả năng dùng máy sấy hồng ngoại để thay thế phương pháp sấy khay

Thông số thí nghiệm:

+ khối lượng hạt (2g), và

+ nghiền hạt thành bột mịn, rây lọt hoàn toàn qua sàng kích thước lỗ 1,7 mm

b Xác định hàm lượng tro tổng số của hạt điều màu

Thông số thí nghiệm: khối lượng hạt (2 g)

Phương pháp tiến hành như mô tả trong Mục 2.4.2.1

c Xác định hàm lượng màu annatto tổng số

Mục đích: làm cơ sở đánh giá chất lượng hạt nguyên liệu và tính hiệu suất thu hồi

Phương pháp thực hiện như mô tả trong Mục 2.4.2.1

Kết quả hàm lượng màu annatto tổng số được dùng làm cơ sở cho việc đánh

giá hiệu suất trích ly và hiệu suất thu hồi chất màu norbixin

2.4.1.2 Thí nghiệm 1: Lựa chọn dung môi phù hợp cho quá trình trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin

Mục đích: xác định loại dung môi và nồng độ tối ưu của các thành phần dung

môi để đạt được hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin cao nhất

a Thí nghiệm 1a: Lựa chọn hỗn hợp dung môi

Mục đích: tìm hỗn hợp dung môi phù hợp để quá trình trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin đạt hiệu suất cao

Bố trí thí nghiệm: thí nghiệm được bố trí theo kiểu ngẫu nhiên 1 yếu tố, 3 lần lặp lại

Yếu tố cố định:

+ khối lượng hạt điều màu (5 g) (Mahendranath et al., 2011a),

+ thời gian khuấy trích (30 phút) ở tốc độ 100 v/p ở nhiệt độ phòng (Hyman et al., 1990),

+ thời gian ủ (30 phút) (Nachtigall et al., 2009),

+ nhiệt độ ủ (60 0C) (Preston và Rickard, 1980), và

+ tỷ lệ dung môi / nguyên liệu (6/1, v/w) (Pimentel, 1995; Nachtigall et al., 2009; Silva et al., 2009)

Yếu tố khảo sát: các hỗn hợp dung môi được kiềm hóa bằng NaOH 0,5 M (Nachtigall et al., 2009; Silva et al., 2009), gồm có:

Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất trích ly norbixin (%)

Hỗn hợp dung môi cho hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin cao nhất sẽ được chọn để thiết kế và tiến hành các thí nghiệm tiếp theo

Cách tiến hành: thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ trong Hình 2.2

Hình 2.2 Sơ đồ quy trình trích ly để khảo sát dung môi

b Thí nghiệm 1b: Thăm dò ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hiệu suất trích

ly và chuyển đổi màu thành norbixin

Mục đích: thăm dò ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến hiệu suất trích ly và

chuyển đổi màu thành norbixin

Phương pháp: bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên 1 yếu tố, 3 lần lặp lại

Yếu tố cố định:

+ nồng độ ethanol (300),

+ khối lượng hạt điều màu (5 g),

+ thời gian khuấy trích (30 phút), tốc độ 100 v/p ở nhiệt độ phòng,

+ thời gian ủ (30 phút),

+ nhiệt độ ủ (60 0C), và

+ tỷ lệ dung môi / nguyên liệu (6/1, v/w)

Yếu tố khảo sát: nồng độ NaOH khác nhau 0,3; 0,4; 0,5; 0,6 và 0,7 M (Silva, 2007)

Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất trích ly norbixin (%)

Cách tiến hành: thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ trong Hình 2.2

Nồng độ NaOH cho hiệu suất cao nhất sẽ được chọn làm yếu tố cố định để tiến hành thí nghiệm thăm dò tiếp theo Khoảng nồng độ NaOH có hiệu suất cao nhất sẽ được chọn để thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng

c Thí nghiệm 1c: Thăm dò ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất trích

ly và chuyển đổi màu thành norbixin

Mục đích: thăm dò ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin (%)

Phương pháp: bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên 1 yếu tố, 3 lần lặp lại

Yếu tố cố định:

+ nồng độ NaOH (0,5 M theo kết quả Thí nghiệm 1b);

+ khối lượng hạt điều màu (5 g);

+ thời gian khuấy trích (30 phút), tốc độ 100 v/p ở nhiệt độ phòng;

+ thời gian ủ (30 phút);

+ nhiệt độ ủ (60 0C), và

+ tỷ lệ dung môi / nguyên liệu (6/1, v/w)

Yếu tố khảo sát: nồng độ ethanol khác nhau 10, 30, 50, 70 đến 900

Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất trích ly norbixin (%)

Cách tiến hành: thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ trong Hình 2.2

Khoảng nồng độ ethanol cho hiệu suất cao nhất sẽ được chọn để thiết kế thí

nghiệm tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng

d Thí nghiệm 1d: Tối ưu hóa nồng độ dung môi

Phương pháp: bề mặt đáp ứng 2 yếu tố kiểu thiết kế có tâm (Central Composite Design – CCD)

Nội dung: thí nghiệm hai yếu tố được bố trí và xử lý theo phần mềm JMP 9.0.2, thí nghiệm được bố trí theo hướng xây dựng bề mặt đáp ứng (response surface design) trong đó mối quan hệ giữa các yếu tố khảo sát (factor) và các chỉ tiêu theo dõi (response) được thể hiện dưới dạng mặt cong (bề mặt đáp ứng – response surface) Nhằm có thể xác định được quan hệ giữa các yếu tố khảo sát với chỉ tiêu theo dõi, từ đó xác định giá trị của yếu tố khảo sát mà tại đó chỉ tiêu theo dõi đạt giá trị tốt nhất (tối thiểu hoặc tối đa)

Yếu tố cố định:

+ khối lượng hạt điều màu (5 g),

+ thời gian khuấy trích (30 phút), tốc độ 100 v/p ở nhiệt độ phòng,

+ thời gian ủ (30 phút), và

+ nhiệt độ ủ (60 0C)

Yếu tố khảo sát: khoảng khảo sát nồng độ hai thành phần dung môi NaOH

và ethanol dựa theo kết quả Thí nghiệm 1b và 1c

Cách tiến hành: thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ trong Hình 2.2

Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất trích ly norbixin (%)

2.4.1.3 Thí nghiệm 2: Ảnh hưởng của tỷ lệ dung môi / nguyên liệu và điều kiện

ủ đến hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin

Mục đích: chọn tỷ lệ dung môi / nguyên liệu và chế độ ủ (nhiệt độ và thời gian) tốt nhất gồm để quá trình trích ly cũng như phản ứng xà phòng hóa xảy ra

+ nồng độ dung môi (kết quả Thí nghiệm 1d),

+ khối lượng hạt điều màu (5 g),

+ thời gian khuấy trích (30 phút), tốc độ 100 v/p ở nhiệt độ phòng,

+ thời gian ủ (30 phút), và

+ nhiệt độ ủ (60 0C)

Yếu tố khảo sát: tỷ lệ dung môi / nguyên liệu là 4/1; 6/1; 8/1; 10/1, 12/1 và 14/1 (v/w)

Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất trích ly norbixin (%)

Cách tiến hành: thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ trong Hình 2.2

Tỷ lệ dung môi / nguyên liệu cho hiệu suất trích ly norbixin cao nhất sẽ được chọn làm yếu tố cố định trong hai thí nghiệm thăm dò tiếp theo Khoảng giá trị tỷ lệ dung môi / nguyên liệu cho hiệu suất cao sẽ được chọn để thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng

b Thí nghiệm 2b: Thăm dò ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin

Mục đích: thăm dò ảnh hưởng của nhiệt độ ủ đến hiệu suất trích ly và chuyển

đổi màu thành norbixin (%)

Phương pháp: bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên 1 yếu tố, 3 lần lặp lại

Yếu tố cố định:

+ khối lượng hạt điều màu (5 g),

+ nồng độ dung môi (kết quả Thí nghiệm 1d),

+ tỷ lệ dung môi / nguyên liệu (kết quả Thí nghiệm 2a),

+ thời gian khuấy trích (30 phút), tốc độ 100 v/p ở nhiệt độ phòng, và

+ thời gian ủ (30 phút)

Yếu tố khảo sát: nhiệt độ ủ 30, 40, 50, 60, 70 và 80 0C

Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất trích ly norbixin (%)

Nhiệt độ ủ cho hiệu suất cao nhất sẽ được chọn để tiến hành thí nghiệm thăm

dò tiếp theo Khoảng nhiệt độ lớn nhất sẽ được chọn để thiết kế thí nghiệm tối ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng

c Thí nghiệm 2c: Thăm dò ảnh hưởng của thời gian ủ đến hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin

Mục đích: thăm dò ảnh hưởng của thời gian ủ đến hiệu suất trích ly và chuyển đổi màu thành norbixin (%)

Phương pháp: bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên 1 yếu tố, 3 lần lặp lại

Yếu tố cố định:

+ khối lượng hạt điều màu (5 g),

+ nồng độ dung môi (kết quả Thí nghiệm 1d),

+ tỷ lệ dung môi / nguyên liệu (kết quả Thí nghiệm 2a),

+ thời gian khuấy trích (30 phút), tốc độ 100 v/p ở nhiệt độ phòng, và

+ nhiệt độ ủ (kết quả Thí nghiệm 2b)

Yếu tố khảo sát: thời gian ủ 10, 20, 30, 40 và 50 phút

Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất trích ly norbixin (%)

Khoảng nhiệt độ ủ cho hiệu suất cao sẽ được chọn để thiết kế thí nghiệm tối

ưu hóa bằng phương pháp bề mặt đáp ứng

d Thí nghiệm 2d: Tối ưu hóa tỷ lệ dung môi / nguyên liệu và điều kiện phản ứng xà phòng hóa

Phương pháp: bề mặt đáp ứng 3 yếu tố kiểu thiết kế có tâm (Central Composite Design – CCD)

Nội dung: thí nghiệm hai yếu tố được bố trí và xử lý theo phần mềm JMP 9.0.2, thí nghiệm được bố trí theo hướng xây dựng bề mặt đáp ứng (response surface design) trong đó mối quan hệ giữa các yếu tố khảo sát (factor) và các chỉ tiêu theo dõi (response) được thể hiện dưới dạng mặt cong (bề mặt đáp ứng – response surface) Nhằm có thể xác định được quan hệ giữa các yếu tố khảo sát với chỉ tiêu theo dõi, từ đó xác định giá trị của yếu tố khảo sát mà tại đó chỉ tiêu theo dõi đạt giá trị tốt nhất (tối thiểu hoặc tối đa)

Yếu tố cố định:

+ khối lượng hạt điều màu (5 g),

+ thời gian khuấy trích (30 phút), tốc độ 100 v/p ở nhiệt độ phòng, và

+ nồng độ dung môi (kết quả Thí nghiệm 1d)

Yếu tố khảo sát: khoảng khảo sát tỷ lệ dung môi / nguyên liệu, nhiệt độ (0C)

và thời gian ủ (phút) dựa theo kết quả Thí nghiệm 2a, 2b và 2c

Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất trích ly norbixin (%)

2.4.1.4 Thí nghiệm 3: Khảo sát thể tích acid HCl đậm đặc để kết tủa norbixin

+ hàm lượng norbixin trong dịch trích (0,2 %), và

+ khối lượng dịch trích dùng cho một đơn vị thí nghiệm (5 g)

Yếu tố khảo sát: thể tích acid HCl 36 % là 0,2; 0,25; 0,3; 0,35; 0,4; 0,45; 0,5; 0,55; 0,6 và 0,65 mL

Chỉ tiêu theo dõi: hiệu suất thu hồi norbixin tự do (%)

Cách tiến hành: thí nghiệm được tiến hành theo sơ đồ trong Hình 2.3 (xem thêm Mục 2.4.2.1) Acid đặc được nhiễu từ từ theo thành ống ly tâm (Haque, 2011)

Tỷ lệ thể tích acid HCl đậm đặc cho hiệu suất thu hồi norbixin tự do cao nhất

sẽ được chọn làm công thức kết tủa norbixin

Hình 2.3 Sơ đồ quy trình thí nghiệm kết tủa norbixin

2.4.1.5 Thí nghiệm 4: Khảo sát tỷ lệ chất trợ tan phù hợp để tạo chế phẩm bột norbixin tan trong nước

a Thí nghiệm 4a: Khảo sát khả năng hòa tan của bột tủa norbixin trong nước

ở pH khác nhau

Mục đích: tìm pH thích hợp để hòa tan bột tủa norbixin

Phương pháp: bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên 1 yếu tố, 3 lần lặp lại

Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ norbixin hòa tan trong nước (%)

Giá trị pH thích hợp để hòa tan bột tủa norbixin sẽ là cơ sở để chọn chất trợ

tan tạo chế phẩm norbixin dạng bột

Cách tiến hành: hòa tan bột tủa norbixin trong nước cất có giá trị pH khác nhau với tốc độ khuấy 100 v/p Sau khi ly tâm loại bột chưa tan, đo độ hấp thụ của dịch pha loãng bằng dung môi KOH 0,5 % của mỗi mẫu ở bước sóng 482 nm để xác định hàm lượng norbixin đã hòa tan trong nước (FAO JECFA, 2006) Từ đó tính được tỷ lệ hòa tan của norbixin dựa trên hàm lượng norbixin có trong 0,1 g bột tủa ban đầu

b Thí nghiệm 4b: Khảo sát tỷ lệ chất trợ tan Na 2 CO 3

Mục đích: chọn tỷ lệ khối lượng chất trợ tan Na2CO3 thích hợp để phối chung với bột tủa norbixin tạo chế phẩm bột norbixin dễ hòa tan trong nước

Phương pháp: bố trí thí nghiệm ngẫu nhiên 1 yếu tố, 3 lần lặp lại

Yếu tố cố định:

+ khối lượng bột tủa norbixin (0,1 g) chứa 44,25 % norbixin, độ ẩm 7,6 %, với kích thước hạt lọt hoàn toàn qua sàng kích thước lỗ 0,08 mm;

+ thể tích pha loãng là 25 mL, tương ứng nồng độ norbixin 0,04 % w/v;

+ khuấy 100 v/p trong 5 phút (Barbosa et al., 2005)

Yếu tố khảo sát: tỷ lệ khối lượng chất trợ tan Na2CO3 so với bột tủa norbixin (0,5/1; 0,8/1; 1/1; 1,2/1; 1,5/1 và 2/1)

Chỉ tiêu theo dõi: tỷ lệ norbixin hòa tan trong nước (%)

Tỷ lệ khối lượng chất trợ tan thích hợp sẽ được chọn để xây dựng công thức

điều chế chế phẩm bột norbixin tan trong nước

Cách tiến hành: trộn chung bột Na2CO3 với bột tủa norbixin (cả hai đã nghiền mịn lọt hoàn toàn qua sàng 0,08 mm) theo các tỷ lệ đã định rồi hòa tan trong nước cất ở tốc độ khuấy 100 v/p trong 5 phút Sau khi ly tâm loại bột chưa tan, đo

độ hấp thụ của dịch pha loãng của mỗi mẫu ở bước sóng 482 nm để xác định hàm lượng norbixin đã hòa tan trong nước (FAO JECFA, 2006) Từ đó tính được tỷ lệ hòa tan của norbixin dựa trên hàm lượng norbixin có trong 0,1 g bột tủa ban đầu

2.4.1.6 Thí nghiệm 5: Đánh giá chất lượng của chế phẩm bột norbixin

a Thí nghiệm 5a: Xác định hàm lượng màu norbixin trong chế phẩm bột norbixin

Mục đích: kiểm tra hàm lượng màu norbixin để đánh giá chất lượng chế phẩm

Phương pháp: theo phương pháp của FAO JECFA, mô tả trong FAO JECFA Monographs 1 – Vol 4 – Quy trình 1

Thông số thí nghiệm: khối lượng mẫu phân tích 0,1 g

b Thí nghiệm 5b: Định lượng hàm lượng kim loại nặng trong chế phẩm bột norbixin

Mục đích: kiểm tra độ tinh khiết phù hợp tiêu chuẩn “QCVN 4–10: 2010/BYT – Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về phụ gia thực phẩm – Phẩm màu” Ba loại kim loại nặng cần phân tích là arsen (dưới 3 mg/kg), chì (dưới 2 mg/kg) và thủy ngân (dưới 1 mg/kg)

Cách tiến hành: gửi mẫu phân tích tại Trung tâm kỹ thuật tiêu chuẩn chất lượng 3, Biên Hòa, Đồng Nai

c Thí nghiệm 5c: Đánh giá khả năng hòa tan trong nước

Mục đích: kiểm tra khả năng hòa tan của chế phẩm trong nước

Cách tiến hành: sử dụng phương pháp của Santos (2003) do Barbosa et al (2005) trích dẫn

2.4.1.7 Thí nghiệm 6: Ứng dụng chế phẩm bột norbixin để phối màu sữa chua

Mục đích: chọn nồng độ norbixin thích hợp để phối màu cho thực phẩm có tính acid là sữa chua

Phương pháp phân tích cảm quan cho điểm theo TCVN 3215–79 (xem Mục 2.4.2.3)

Phương pháp xác định độ ẩm của hạt nguyên liệu bằng tủ sấy

Lấy chén sấy ẩm đem sấy ở 105 0C cho đến khối lượng không đổi (sau khi để nguội và cân lại, kết qủa giữa hai lần cân liên tiếp không cách nhau quá 0,5 mg) Để nguội trong bình hút ẩm và đem cân bằng cân phân tích chính xác đến 0,1 mg

Cho vào cốc cân khoảng 2 g hạt điều màu đã nghiền nhỏ (lọt hoàn toàn qua sàng kích thước 1,7 mm)

Cho tất cả vào tủ sấy ở 105 0C, sấy khô cho đến khối lượng không đổi (120 phút kể từ khi đạt nhiệt độ yêu cầu)

Để nguội trong bình hút ẩm và cân bằng cân phân tích

Độ ẩm theo phần trăm (X %) được tính bằng công thức:

100

x

1

2 1

G G

G G X





Trong đó:

G: khối lượng của chén sau khi sấy đến khối lượng không đổi (g),

G1: khối lượng của chén và mẫu trước khi sấy (g), và

G2: khối lượng chén và mẫu sau sấy tới khối lượng không đổi (g) Sai lệch giữa kết quả hai lần xác định song song không được lớn hơn 0,5 % Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 lần xác định song song, tính chính xác đến 0,01 % (10TCN 592 – 2004, Bộ NoN và PTNT)

Phương pháp xác định độ ẩm của nguyên liệu bằng máy sấy hồng ngoại

Chọn nhiệt độ sấy 105 0C, thời gian sấy để ở chế độ tự động, máy sẽ sấy cho đến khi hết lượng ẩm cần xác định trong mẫu

Cho khoảng 2 – 3 g bột nghiền từ hạt (lọt hoàn toàn qua sàng kích thước 1,7 mm) trải đều trên bề mặt đĩa sấy

Đậy nắp máy, máy sẽ tự động ghi nhận và hiển thị kết quả % ẩm trên màn hình

Ghi nhận kết quả sau khi máy báo kết thúc

Tiến hành 2 lần lấy kết quả trung bình (TCVN 3700–90)

Phương pháp xác định hàm lượng tro tổng số của hạt điều màu

Cân chính xác khoảng 2 g hạt đã được trộn đều vào chén nung

Đặt chén nung lên bếp điện trong tủ hút để than hoá mẫu

Cho chén vào lò nung ở nhiệt độ 600 0C trong 2 giờ 30 phút (đến khi tro trắng)

Lấy chén ra khỏi lò, để nguội 40 phút trong bình hút ẩm rồi cân khối lượng Tiếp tục nung và cân cho đến khi chén có khối lượng không đổi

Tính kết quả (X %):

X (%) =

) (

100 ) (

2

2 1

W W

W W

Sai lệch cho phép giữa hai lần thí nghiệm không được quá 0,2 % Kết quả cuối cùng là trung bình cộng của 2 lần thí nghiệm được làm tròn đến 0,01 %

(TCVN 7038:2002)

Phương pháp xác định hàm lượng màu annatto tổng số trong hạt điều màu

5 g hạt điều màu nguyên hạt được trích kiệt hai lần bằng dung môi chloroform với tỷ lệ hạt / dung môi mỗi lần là 1/10 (w/v), đậy kín beaker và khuấy hỗn hợp trích ly 100 vòng/phút trong 3 giờ (Mahendranath et al., 2011a) Hỗn hợp trích ly sau đó được ly tâm thu dịch, chất rắn còn lại được đem trích ly tiếp lần 2 Trộn lẫn hỗn hợp 2 lần trích, đem lọc qua vải mịn Đuổi dung môi trong dịch lọc thu được trong bóng tối ở nhiệt độ 45 0C Lượng sệt thu được đem hòa tan lại bằng

10 mL chloroform, cân khối lượng dung dịch này

Cân khoảng 0,1 g dịch mẫu pha loãng trong 100 mL chloroform Đo độ hấp thụ ở bước sóng 500 và 404 nm bằng cuvet thủy tinh dày 1 cm, mẫu đối chứng là chloroform nguyên chất Tổng số annatto (%) trong mẫu được tính theo công thức của McKeown và Mark (1962):

Trong đó:

A500: độ hấp thụ tại bước sóng 500 nm,

A404: độ hấp thụ tại bước sóng 404 nm, V: thể tích pha loãng cuối cùng (100 mL), và W: khối lượng dịch mẫu (0,1 g)

Phương pháp xác định hàm lượng norbixin

Để xác định hàm lượng norbixin trong bột màu hoặc dịch trích ly, chúng tôi tiến hành theo hướng dẫn trong Chuyên luận định lượng tổng chất màu tan trong nước bằng phương pháp quang phổ (FAO JECFA Monographs 1 – Vol 4 – Quy trình 1), với các điều kiện như sau:

– dung môi: dung dịch KOH 0,5 %;

– đo độ hấp thụ quang tại λmax ~ 482 nm; và

– độ hấp thụ riêng A1%

1cm = 2870

Quy trình 1 là quy trình dùng cho những hợp chất màu tan trong nước

Nguyên tắc: mật độ quang của một dung dịch màu được đo tại λmax và hàm lượng của hợp chất đó được tính dựa vào giá trị hệ số hấp thụ của dung dịch chuẩn, giá trị này được suy ra từ phổ của dung dịch chuẩn đó

Dụng cụ cần thiết:

– máy đo UV – Vis với độ chính xác cao (± 1 %), đo mật độ quang trong vùng 350 – 700 nm với độ rộng khe 1 nm, và

– cuvet thủy tinh bề dày 1 cm

Quy trình thực hiện: cân chính xác 0,25 g (± 0,02 g) mẫu (W) Hòa tan bằng nước cất hoặc dung môi phù hợp rồi chuyển vào bình định mức 1 L, định mức đến vạch Pha loãng bằng nước cất hoặc dung môi phù hợp đến nồng độ mong muốn tùy vào độ đậm đặc của dung dịch Dùng nước cất hoặc dung môi làm mẫu trắng, đo độ

hấp thụ của dịch pha loãng (A)

Hàm lượng chất màu (%) = 100 x (A / A1%

1cm) x (F / W) Trong đó:

A: độ hấp thụ của dung dịch pha loãng,

Phương pháp đánh giá hiệu suất thu hồi norbixin tự do từ dịch trích ly

Để đánh giá hiệu suất thu hồi norbixin từ dịch trích ly bằng cách trung hòa hoặc acid hóa, trước tiên bổ sung acid vào 5 g dịch trích ly, đợi lắng trong 1 giờ (Hyman et al., 1990) rồi ly tâm để thu kết tủa norbixin, rửa tủa rồi hòa tan kết tủa bằng dung môi KOH 0,5 % đến khối lượng bằng với khối lượng dịch trích ly ban đầu (5 g) Pha loãng dịch hòa tan bằng KOH 0,5 % để đo độ hấp thụ tại bước sóng

482 nm (FAO JECFA, 2006) Tỷ số phần trăm giữa độ hấp thụ của dịch hòa tan kết tủa so với độ hấp thụ của dịch trích ly ban đầu chính là tỷ lệ thu hồi norbixin trong dịch trích ly ban đầu

2.4.2.2 Phương pháp tính hiệu suất trích ly và hiệu suất thu hồi norbixin

– Hiệu suất trích ly norbixin:

HStrích ly (%) = (m1 × 100) / m0Trong đó: + m1: khối lượng norbixin trích ly được, và

+ m0: khối lượng chất khô của nguyên liệu ban đầu

– Hiệu suất thu hồi norbixin:

HSthu hồi (%) = (m1 × 100) / m Trong đó: + m1: khối lượng norbixin trích ly được, và

+ m: khối lượng annatto tổng số trong nguyên liệu

2.4.2.3 Phương pháp tiến hành thí nghiệm

Phương pháp đánh giá khả năng hòa tan

Khả năng hòa tan trong nước của chế phẩm bột norbixin được đánh giá theo phương pháp của Santos (2003) do Barbosa et al (2005) trích dẫn Khuấy nhẹ hỗn dịch bột trong nước (0,4 % w/v) tới khi thành dung dịch đồng nhất Thời gian cần thiết để bột tan hết được ghi nhận Bột được coi là tan tốt khi thời gian cần thiết không quá 5 phút

Phương pháp phối chế tạo màu cho sữa chua

Phương pháp chuẩn bị sữa chua dựa theo mô tả của Parvin et al (2011) Trước tiên sữa tươi được đun sôi vài lần, vừa đun và khuấy để giảm 20 – 25 % thể