Xác định trình tự gen E6 và L1 của HPV và gen EBNA-1 của EBV để ứng dụng trong chuẩn đoán ung thư cổ tử cung và vòm mũi họn

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC - HOÀNG VĂN MẠNH XÁC ĐỊNH TRÌNH TỰ GEN E6 VÀ L1 CỦA HPV VÀ GEN EBNA-1 CỦA EBV ĐỂ ỨNG DỤNG TRONG CHUẨN ĐOÁN UNG THƯ CỔ TỬ CUNG VÀ VÒM MŨI HỌNG Chuyên ngành: Công nghệ sinh học Mã số: 60.42.80 LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC PGS.TS Lê Thanh Hoà Thái Nguyên - 2011 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Ala Alanine bp Base pair BL Burkitt’s Lymphoma CTC Cổ tử cung E Early region EBV Epstein-Barr Virus Gly Glycine gs-PCR Group-specific PCR HPV Human papilloma virus HP6 Hải Phòng (ký hiệu mẫu) L Late region LCL Lymphoblastoid LCR Long control region LMP Latent membrane protein MHC Major Histocompatibility Complex MT7 Miền trung (ký hiệu mẫu) NPC Nasopharyngeal carcinoma p53 Protein 53 PV Papilloma virus RB Retinoblast TR Terminal repeat ts-PCR Type- specific PCR UICC Universal Integrated Circuit Card UTBM Carcinoma VCA Viral capsid antigen VMH Vòm mũi họng WHO World Health Organization Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng luận văn Trang Bảng 1.1 Tình hình ung thư CTC giới (không tính Châu Phi) Bảng 2.1 Thành phần số lượng thành phần tham gia phản ứng multiplex-PCR HPV-16/HPV-18 38 Bảng 2.2 Chu trình nhiệt độ phản ứng multiplex-PCR HPV16/HPV18 39 Bảng 2.3 Thành phần số lượng thành phần tham gia phản ứng PCR gen E6 cua HPV-16 39 Bảng 2.4 Chu trình nhiệt độ phản ứng PCR gen EBNA-1 40 Bảng 2.5 Thành phần phản ứng nối sản phẩm PCR vào vector tách dòng (pCR2.1TOPO) 43 Bảng 2.6 Thành phần phản ứng cắt plasmid tái tổ hợp bằng enzym EcoRI 47 Bảng 2.7 Thành phần phản ứng tạo DNA sợi đơn 49 Bảng 2.8 Chu trì nh nhiệt của phản ứng giải trì nh tự 49 Bảng 3.1 Kết truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi gen E6 mẫu PK12 56 Bảng 3.2 Kết truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi gen L1 mẫu PS16 57 Bảng 3.3 Kết truy cập Ngân hàng gen sử dụng chuỗi nucleotide gen EBNA-1 EB17, EB18, EB19 EB20 64 Bảng 3.4 Kết xác định phân týp chủng EBV qua phân tích acid amin tại vị trí 487 EBNA-1 66 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình luận văn Trang Hình 1.1 Bản đồ phân bố dịch tễ theo độ tuổi người có khả nhiễm ung thư cổ tử cung châu lục Hình 1.2 Cơ chế nhiễm HPV (Human papilloma virus) ung thư cổ tử cung Hình 1.3 Mối quan hệ phả hệ nguồn gốc 101 Papillomavirus dựa so sánh chuỗi nucleotid gene capsid L1 11 Hình 1.4 Human Papillomavirus chụp kính hiển vi điện tử 12 Hình 1.5 Cấu trúc phân tử hệ gene HPV -16 13 Hình 1.6 Quá trình nhân lên HPV 15 Hình 1.7 Sơ đồ minh họa trình tiến triển EBV thể bị nhiễm 27 Hình 1.8 Cấu trúc hệ gene EBV dạng khép lại thành mạch vòng (a) dạng mạch thẳng (b) 29 Hình 2.1 Sơ đồ quy trình nghiên cứu phân tích gene EBNA-1 virus EBV E6 virus HPV16 L1 HPV18 34 Hình 2.2 Cấu trúc vector pCR2.1-TOPO® (Invitrogen) 43 Hình 3.1 Kết kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm 51 Hình 3.2 Kiểm tra sản phẩm multiplex-PCR sử dụng lúc cặp mồi (E6F-E6R HP18F-HP18R) với khuôn DNA tổng số mẫu PS16, PK12, PK11, PK10 52 Hình 3.3 Kiểm tra sản phẩm tách dòng đoạn gen E6 mẫu PK12 (bản A) đoạn gen L1 mẫu PS16 (bản B) 53 Hình 3.4 Hình ảnh giản đồ (chromatogram) phần trình tự gen E6 mẫu PK12 (HPV-16) 54 Hình 3.5 Hình ảnh giản đồ (chromatogram) phần trình tự gen L1 mẫu PS16 (HPV18) 54 Hình 3.6 Trình bày chuỗi gen E6 typ HPV-16 55 Hình 3.7 Trình bày chuỗi gen L1 typ HPV-18 55 Hình 3.8 Kết bước đầu phát HPV16/HPV18 phương pháp đa mồi multiplex-PCR 59 Hình 3.9 Kết kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm EBV 61 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.10 Kết kiểm tra sản phẩm PCR điện di gen EBNA-1 61 Hình 3.11 Hình ảnh giản đồ (chromatogram) phần trình tự gen EBNA-1 63 Hình 3.12 Kết chuỗi gen EBNA-1 EB17 thu nhận sau giải trình tự 63 Hình 3.13 So sánh phần trình tự acid amin EBNA-1 13 chủng nghiên cứu 65 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Danh mục ký hiệu, chữ viết tắt Danh mục bảng Danh mục hình ĐẶT VẤN ĐỀ Chƣơng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 UNG THƢ CỔ TỬ CUNG VÀ HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV) 1.1.1 Dịch tễ học ung thư cổ tử cung 1.1.1.1 Trên giới 1.1.1.2 Tình hình ung thư cổ tử cung Việt Nam 1.1.1.3 Các yếu tố có nguy ung thư CTC 1.1.1.4 Human papilloma virus bệnh ung thư cổ tử cung 1.1.2 Phân loại đặc tính sinh học Papilloma virus 1.1.2.1 Phân loại Papilloma virus 1.1.2.2 Đặc tính sinh học Human Papillomavirus 12 1.1.2.3 Quá trình nhân lên HPV 14 1.1.2.4 Cơ chế gây ung thư cổ tử cung HPV 16 1.1.3 Chẩn đoán ung thư CTC 17 1.1.3.1 Chẩn đoán tế bào học 17 1.1.3.2 Chẩn đoán dựa phân tích mRNA 19 1.1.3.3 Định týp HPV sinh học phân tử 19 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.1.4 Tầm quan trọng việc nghiên cứu sinh học phân tử xây dựng phương pháp PCR chẩn đoán nhanh HPV gây ung thư cổ tử cung Việt Nam 21 1.2 UNG THƢ VÒM MŨI HỌNG VÀ EPSTEIN-BARR VIRUS (EBV) 22 1.2.1 Dịch tễ học ung thư vòm mũi họng 22 1.2.1.1 Tình hình nghiên cứu giới 22 1.2.1.2 Tình hình nghiên cứu Việt Nam 23 1.2.2 Đặc tính sinh học Epstein-Bar virus (EBV) 24 1.2.2.1 Phát virus Epstein - Barr ung thư VMH 24 1.2.2.2 Đặc điểm phân loại cấu trúc EBV 25 1.2.2.3 Sự nhân lên, tàng nhiễm khả gây ung thư EBV… 26 1.2.2.4 Sinh học phân tử xếp hệ gene EBV 28 1.2.2.5 Gene sản phẩm gene EBNA-1 29 1.2.3 Tầm quan trọng việc nghiên cứu sinh học phân tử xây dựng phương pháp PCR chẩn đoán sớm EBV ung thư vòm mũi họng Việt Nam 30 CHƢƠNG 2: ĐỐI TƢỢNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 33 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 33 2.2 Dụng cụ, trang thiết bị nghiên cứu hoá chất nghiên cứu 33 2.2.1 Dụng cụ, trang thiết bị 33 2.2.2 Hoá chất 33 2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 34 2.4 Quy trình nghiên cứu 35 2.4.1 Lấy mẫu bảo quản 35 2.4.2 Kỹ thuật tách chiết DNA tổng số 35 2.4.3 Quy trình phản ứng PCR kiểm tra sản phẩm PCR 37 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 2.4.3.1 Thiết kế mồi……………………………………………… 37 2.4.3.2 Quy trình phản ứng PCR 38 2.4.3.3 Kỹ thuật phát sản phẩm PCR 40 2.4.3.4 Tinh sản phẩm PCR 41 2.4.4 Phương pháp tạo dòng sản phẩm PCR 42 2.4.4.1 Tạo vectơ tái tổ hợp 42 2.4.4.2 Chuyển nạp…………………………………… …………… 43 2.4.4.3 Chọn lọc vi khuẩn tái tổ hợp 44 2.4.4.4 Tách DNA plasmid tái tổ hợp 45 2.4.4.5 Kiểm tra DNA tái tổ hợp 47 2.4.5 Giải trình trình tự xử lý số liệu 48 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 51 3.1 Kết thu nhận, giải trình trình tự xác định gen E6 HPV-16 L1 HPV-18 51 3.1.1 Kết kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm 51 3.1.2 Kết thực phản ứng Multiplex-PCR phát HPV-16 HPV-18 52 3.1.3 Kết tách dòng giải trình tự sản phẩm HPV-16 HPV-18 từ mẫu kiểm tra 53 3.1.4 Kết giải trình tự thu nhận chuỗi gen E6 HPV-16 chuỗi gen L1 HPV-18 54 3.1.5 Kết truy cập Ngân hàng gen xác định chuỗi gen E6 HPV16 L1 HPV18 56 3.1.6 Kết bước đầu phát HPV-16 HPV-18 phương pháp đa mồi multiplex-PCR 59 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 3.2 Kết thu nhận, giải trình trình tự xác định gen EBNA – EBV 60 3.2.1 Kết kiểm tra DNA tổng số từ mẫu bệnh phẩm 60 3.2.2 Kết thực phản ứng PCR 61 3.2.3 Kết giải trình tự thu nhận chuỗi gen EBNA-1 EBV 62 3.2.4 Kết truy cập Ngân hàng gen xác định chuỗi gen EBNA-1 EBV 63 3.2.5 Kết xác định phân týp EBV qua phân tích vị trí acid amin số 487 EBNA-1 thu nhận với chuỗi gen tương ứng chủng Việt Nam giới 64 CHƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 69 4.1 KẾT LUẬN 69 4.2 KIẾN NGHỊ 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn ĐẶT VẤN ĐỀ Hiện nay, giới Việt Nam, ung thư (cancer) nguyên nhân gây tỷ lệ tử vong cao người, chiếm khoảng 12% tổng số trường hợp tử vong hàng năm giới, đứng thứ sau tỷ lệ tử vong bệnh lí tim - mạch ngày có xu hướng gia tăng Bệnh ung thư không phát sớm điều trị kịp thời dẫn đến nguyên nhân gây tử vong, chưa có phương pháp điều trị đặc hiệu Bệnh xảy lứa tuổi, hai giới (nam nữ) tất mô, quan thể Đặc biệt, ung thư cổ tử cung (CTC) ung thư vòm mũi họng (VMH) hai số loại ung thư có tỷ lệ tử vong cao Việt Nam quốc gia phát triển khu vực Trong đó, ung thư CTC đứng thứ số ung thư nguyên nhân gây tử vong cao cho phụ nữ Việt Nam [1], [9] Bên cạnh đó, ung thư VMH loại ung thư phổ biến người loại hay gặp ung thư vùng tai mũi họng nước vùng Đông nam Á phía nam Trung Quốc [23], [56] Nguyên nhân gây ung thư phức tạp, liên quan đến thể địa, tập quán, thói quen môi trường sống Trong đó, số yếu tố coi liên quan chặt chẽ với việc gây ung thư như: yếu tố vật lí (phóng xạ), hóa chất độc, gốc tự đặc biệt ngày phát vai trò virus tiến triển ung thư Các công trình nghiên cứu gần chứng minh virus nguyên nhân gây hai loại ung thư người Nhiều nghiên cứu phát diện HPV (Human papilloma virus) 95% trường hợp ung thư cổ tử cung [62], HPV coi nguyên nhân gây bệnh ung thư CTC [9] Các nghiên cứu mối liên quan Epstein-Barr Virus (EBV) ung thư VMH cho thấy biểu kháng nguyên virus giai đoạn bệnh, vai trò quan trọng EBV bệnh học trình sàng lọc chẩn đoán điều trị, theo dõi tiên lượng bệnh [24] Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read data error !!! can't not read ... TÀI LIỆU 1.1 UNG THƢ CỔ TỬ CUNG VÀ HUMAN PAPILLOMA VIRUS (HPV) 1.1.1 Dịch tễ học ung thư cổ tử cung 1.1.1.1 Trên giới 1.1.1.2 Tình hình ung thư cổ tử cung Việt Nam 1.1.1.3... dựng phương pháp PCR chẩn đoán nhanh HPV gây ung thư cổ tử cung Việt Nam 21 1.2 UNG THƢ VÒM MŨI HỌNG VÀ EPSTEIN-BARR VIRUS (EBV) 22 1.2.1 Dịch tễ học ung thư vòm mũi họng 22 1.2.1.1 Tình... thư cổ tử cung (CTC) ung thư vòm mũi họng (VMH) hai số loại ung thư có tỷ lệ tử vong cao Việt Nam quốc gia phát triển khu vực Trong đó, ung thư CTC ứng thứ số ung thư nguyên nhân gây tử vong cao