Thiết kế mồi PCR bằng PrimerBLAST PCR Template: Khuôn của phản ứng PCR. Nhập trình tự khuôn của phản ứng PCR. Có thể nhập mã số nhận dạng của trình tự, GI hoặc nhập trình tự dưới dạng dữ liệu FASTA. Ta có thể tải file trình tự lên. Độ dài trình tự khuôn không quá 50kb. Giới hạn: xác định vị trí của mồi xuôi và mồi ngược, phụ thuộc vào vị trí đoạn gen mà ta muốn nhân lên.
Trang 1BÁO CÁO THỰC HÀNH TIN SINH HỌC
Bài 9: THIẾT KẾ MỒI
1 PCR và thiết kế mồi
1.1 Kỹ thuật PCR
Quá trình sao chép DNA trong tế bào
Kỹ thuật PCR (polymerase chain reaction):
◦ PCR là một kỹ thuật phổ biến trong sinh học phân tử nhằm nhân bản (tạo ra nhiều bản sao) một đoạn DNA trong ống nghiệm mô phỏng bộ máy sinh tổng hợp DNA của tế bào sống
Trang 2◦ Phản ứng PCR gồm nhiều chu kỳ lăp lại nối tiếp nhau Mỗi chu kỳ gồm 3 bước như sau :
▪ Bước 1: (Biến tính tách đôi sợi DNA, denaturation):
Giai đoạn này được thực hiện ở nhiệt độ cao hơn nhiệt độ nóng chảy của phân tử (94 –
95 0C) trong vòng 30 giây đến 1 phút, làm cho phân tử DNA mạch kép tách thành 2 mạch đơn Chính 2 mạch đơn này đóng vai trò là mạch khuôn cho sự tổng hợp 2 mạch
bổ sung mới
▪ Bước 2: (bắt cặp, annealing):
Trong bước này ở nhiệt độ được hạ thấp hơn nhiệt độ nóng chảy (Tm) của các primer, cho phép các primer bắt cặp với mạch khuôn Trong thực nghiệm nhiệt độ này dao động trong khoảng 55 – 65 0C Tùy thuộc vào Tm của các primer mà thời gian bắt cặp kéo dài
Trang 3từ 30 – 60 giây
▪ Bước 3: (kéo dài, elongation – extension):
Nhiệt độ được tăng lên 72 0C giúp cho DNA polymerase hoạt động tốt nhất Dưới tác động của DNA polymerase, các nucleotide lần lượt gắn vào primer theo nguyên tắc bổ sung với mạch khuôn Thời gian của giai đoạn này tùy thuộc vào độ dài của trình tự DNA khuếch đại, thường kéo dài từ 30 giây đến vài phút Sự khuếch đại này có thể được tính như sau: Tổng lượng DNA khuếch đại = m * 2^n
m: Là số bản sao của chuỗi mã hóa
n: Là số chu kỳ
Như vậy, qua một chu kỳ nhiệt, một DNA đích đã được nhân bản thành hai bản sao; và nếu chu kỳ này được lặp đi lặp lại liên tục 30 đến 40 lần thì từ một DNA đích đã nhân bản được thành 230 đến 240 bản sao, tức là đến hàng tỷ bản sao
Mồi (Primer) là những đoạn nucleotide ngắn, có khả năng bắt cặp bổ sung với một mạch của đoạn DNA khuôn và nhờ hoạt động của DNA polymerase đoạn primer này được kéo dài để hình thành mạch mới
Mồi được thiết kế dựa vào 2 vùng trình tự đã được biết, nằm ở hai đầu của đoạn gen cần khuếch đại
1.2 Thiết kế mồi cho PCR
Primer là chìa khóa quan trọng cho sự thành công hay thất bại của một thí nghiệm PCR Nếu primer được thiết kế một cách chính xác thì thí nghiệm sẽ mang lại kết quả về sự khuếch đại của một mảnh DNA đơn Việc lựa chọn primer cần tuân thủ theo một số nguyên tắc sau:
Chiều dài của đoạn mồi:
Độ dài của đoạn mồi khoảng từ 18-30 Nu, chiều dài tối ưu là 18-22 bp
Độ dài này là đủ dài cho độ đặc hiệu thích hợp và đủ ngắn để mồi để liên kết một cách dễ dàng với khuôn ở nhiệt độ ủ
Độ đặc hiệu: Phụ thuộc vào chiều dài của mồi, trình tự mồi và khuôn PCR
◦ Đoạn gene cần khuếch đại không nên lớn hơn 3kb và chiều dài lý tưởng là nhỏ hơn 1kb
◦ Runs: Những mồi với những dải dài liên tiếp của 1 base duy nhất nói chung nên tránh vì nó có thể gắn mồi không đặc hiệu
Các đoạn mồi không nên chứa hơn 4 Nu giống nhau xếp liên tiếp
◦ Repeats: 1 đoạn lặp lại là 1 trình tự 2 Nu xuất hiện nhiều lần liên tiếp, nó có thể gây nên gắn mồi không đặc hiệu
Số lượng tối đa của đoạn lặp lại 2 Nu có thể chấp nhận là 4 lần lặp lại
◦ Cross Homology:
Để tăng độ đặc hiệu của mồi ta cần phải thiết kế mồi tránh các đoạn tương đồng Các mồi được thiết kế cho 1 trình tự phải không nhân lên các đoạn gen khác trong hỗn hợp Mồi được thiết kế và sau đó sử dụng BLAST để kiểm tra độ đặc hiệu
Tỷ lệ G-C:
Tỷ lệ G-C lý tưởng trong đoạn mồi vào khoảng 40 – 60 % để nhiệt độ bắt cặp của đoạn
Trang 4mồi là không quá thấp
Nhiệt độ biến tính (Tm -Melting temperature) của mồi:
Nhiệt độ nóng chảy (Tm) là nhiệt độ mà tại đó một nửa DNA sợi kép sẽ phân tách thành sợi đơn và thể hiện độ bền của sợi kép
Nhiệt độ nóng chảy của mồi trong khoảng 52-58 oC thường tạo ra sản phẩm kết quả tốt nhất Nhiệt độ nóng chảy cao hơn 65 oC có xu hướng cho sản phẩm thứ cấp
Tỷ lệ G-C trong trình tự ảnh hưởng quan trọng đến Tm:
Tm = 2 * (A+T) + 4 * (G+C)
◦ Nhiệt độ nóng chảy Tm phụ thuộc vào: chiều dài của primer, thành phần base của mồi (tỷ lệ G-C), nồng độ base, nồng độ muối trong phản ứng PCR
Tm được tính bằng cách sử dụng thuyết nhiệt động học (the nearest neighbor
thermodynamic theory) là phương pháp tốt hơn tốt nhất hiện nay để ước lượng nó
◦ Công thức tính Tm của mồi:
Melting Temperature Tm(K) = {ΔH/ΔS + R * ln(C)},
Or Melting Temperature Tm(oC) = {ΔH/ΔS + R * ln(C)} – 273.15
Trong đó:
▪ ΔH (kcal/mole) : H is the Enthalpy Enthalpy is the amount of heat energy possessed by substances ΔH is the change in Enthalpy In the above formula the ΔH is obtained by adding up all the di-nucleotide pairs enthalpy values of each nearest neighbor base pair
ΔH là độ biến thiên Entanpi
▪ ΔS (kcal/mole) : S is the amount of disorder a system exhibits is called entropy ΔS is change in Entropy Here it is obtained by adding up all the di-nucleotide pairs entropy values of each nearest neighbor base pair An additional salt correction is added as the Nearest Neighbor parameters were obtained from DNA melting studies conducted in 1M Na+ buffer and this is the default condition used for all calculations
ΔS là độ biến thiên Entropi
ΔS (salt correction) = ΔS (1M NaCl )+ 0.368 * N * ln([Na+])
Where:
N is the number of nucleotide pairs in the primer ( primer length -1)
[Na+] is salt equivalent in mM
[Na+] calculation: [Na+] = Monovalent ion concentration + 4 * free Mg2+
◦ Nhiệt độ nóng chảy của 2 mồi không nên cách nhau quá xa, vì nếu sự chênh lệch nhiệt độ lớn thì primer có Tm cao hơn sẽ bắt cặp không đặc hiệu, còn primer có Tm thấp hơn sẽ không thể lai được với DNA
Trang 5Độ chênh lệch Tm giữa 2 mồi không quá 5 oC.
Nhiệt độ gắn mồi (Ta - Annealing Temperature):
◦ Nhiệt độ nóng chảy của mồi là ước lượng độ bền vững của lai DNA-DNA và quan trọng trong việc xác định nhiệt độ ủ Nhiệt độ ủ (Ta) quá cao sẽ tạo ra không đủ cặp lai mồi-khuôn dẫn đến sản lượng sản phẩm PCR thấp Ta quá thấp có thể có thể dẫn đến sản phẩm không đặc hiệu gây ra bởi một số lượng lớn các sai lệch cặp base
Sức chịu đựng không tương xứng đã được tìm thấy có ảnh hưởng mạnh nhất đến độ đặc hiệu của PCR
◦ Annealing Temperature-Ta = 0.3 * Tm(primer) + 0.7 * Tm(product) – 14.9
Trong đó:
Tm(primer) = Melting Temperature of the primers: Nhiệt độ nóng chảy của mồi
Tm(product) = Melting temperature of the product: Nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm PCR
◦ Nhiệt độ gắn mồi (Ta) tối ưu thấp hơn Tm khoảng 5oC
Optimum Annealing Temperature (Ta Opt): Ta Opt = 0.3 * (Tm of primer) + 0.7 * (Tm
of product) - 14.9
Trong đó:
Tm of primer: Nhiệt độ nóng chảy của cặp mồi-khuôn có độ ổn định kém hơn
Tm of product: Nhiệt độ nóng chảy của sản phẩm PCR
Độ bền đầu 3' của mồi:
◦ là giá trị ΔG lớn nhất của 5 Nu cuối của đầu 3'
ΔG càng âm (năng lượng tự do càng thấp) đoạn trình tự càng bền, dễ tạo cấu trúc bậc 2
ΔG đầu 3' ít âm sẽ làm giảm sự bắt cặp sai lầm (mismatch – bắt cặp không đặc hiệu) Gía trị ΔG đầu 3' được chấp nhận -9 < ΔG < -4 Kcal/mole
◦ GC Clamp: Sự hiện diện của thành phần base G-C trong 5 base cuối của đầu 3' của mồi giúp tăng cường liên kết đặc hiệu ở đầu 3' bởi vì liên kết mạnh giữa base G – C
Số lượng G-C trong 5 Nu cuối đầu 3' không nên lớn hơn 3 vì nó sẽ dẫn đến khả năng bắt cặp sai cao (mispriming)
Khả năng hình thành cấu trúc thứ cấp của mồi:
◦ Hairpins: Cấu trúc cặp tóc được hình thành bởi sự tương tác nội phân tử trong mồi và nên tránh vì nó sẽ làm ảnh hưởng đến sự bắt cặp giữa mồi và khuôn
▪ Định nghĩa ΔG:
ΔG = ΔH – TΔS
Năng lượng tự do Gibbs là tiêu chuẩn để đánh giá lượng sản phẩm có thể chiết suất từ một quá trình hoạt động ở áp suất không đổi Nó là thước đo của sự tự động của phản
Trang 6Độ bền của cấu trúc kẹp tóc thường được biểu diễn bằng giá trị ΔG của nó, là năng lượng cần thiết để phá vỡ cấu trúc bậc 2
Gía trị ΔG càng âm thể hiện sự bền vững của cấu trúc kẹp tóc mà ta không mong muốn
Sự xuất hiện của cấu trúc cặp tóc ở đầu 3' là ảnh hưởng xấu nhất đến phản ứng
Gía trị ΔG tối ưu ở đầu 3' là > -2 kcal/mol và ΔG của mồi > -3 kcal/mol
◦ Self Dimer:
Tự dimer của 1 mồi được hình thành bởi các tương tác nội phân tử giữa hai mồi cùng loại (same sense), tại vị trí mà trình tự bổ sung với chính nó (homologous) Nói chung lượng mồi được sử dụng trong PCR lớn hơn nhiều so với lượng gen mục tiêu Khi các mồi hình thành dimer nội phân tử sẽ dễ hơn nhiều để lai với DNA mục tiêu, chúng làm giảm năng suất sản phẩm
Tự dimer ở đầu 3' tối ưu với giá trị ΔG khoảng -5 kcal/mol và tự dimer nội bộ với một
ΔG khoảng -6 kcal / mol nói chung được chấp nhận
◦ Cross Dimer:
Dimer ngang của mồi được hình thành bởi tương tác nội phân tử giữa các mồi xuôi và mồi ngược tại các vị trí trình tự bổ sung (homologous)
Tạo dimer ngang ở đầu 3' tối ưu với giá trị ΔG khoảng -5 kcal/mol và tạo dimer ngang trong nội bộ với một ΔG khoảng -6 kcal / mol nói chung được chấp nhận
2 Thiết kế mồi PCR
21 Giới thiệu chương trình Primer-BLAST
Công cụ Primer-BLAST của NCBI là 1 chương trình sử dụng để thiết kế và kiểm tra độ đặc hiệu của mồi
Chương trình này là chương trình online miễn phí thiết kế dựa trên chương trình Primer3 kết hợp với BLAST, không phải chương trình chuyên dụng để thiết kế mồi nên thiết kế mồi có thể không hiệu quả bằng các chương trình chuyên dụng Nhưng NCBI có 1 CSDL toàn diện, đa dạng nên khả năng kiểm tra độ đặc hiệu của mồi bằng BLAST rất hiệu quả
Trang 7 Khuôn của phản ứng PCR:
Ta có gen MT-ND1 nằm từ vị trí 3,307 đến 4,262 trên DNA ty thể (956 bp)
( http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/NC_012920.1?report=genbank&from=3307&to=4262 ) Gen MT-ND1 mã hóa cho 1 protein ND1(NADH-ubiquinone oxidoreductase chain 1) có kích thước 36 kDa gồm 318 amino acid
MT-ND1 là 1 trong 7 tiểu đơn vị mã hóa của DNA ty thể mã hóa cho enzym NADH dehydrogenase (ubiquinone)
Protein ND1 là một tiểu đơn vị của NADH dehydrogenase (ubiquinone), nằm ở màng trong ty thể và là phức hợp lớn nhất trong năm phức hợp của chuỗi vận chuyển điện tử Các biến thể của gen MT-ND1 có liên quan đến Hội chứng MELAS (bệnh não, cơ, tăng axit lactic giả tai biến mạch máu não từng thời kỳ - Mitochondrial encephalomyopathy, lactic acidosis, and stroke-like episodes), Hội chứng Leigh (viêm não tuỷ hoại tử bán cấp - Leigh's syndrome – LS), Teo thị Leber (Leber’s hereditary optic neuropathy – LHON) và tăng chỉ số BMI ở người lớn
( https://en.wikipedia.org/wiki/MT-ND1 )
Trang 82.2 Thiết kế mồi bằng Primer-BLAST
PCR Template: Khuôn của phản ứng PCR
◦ Nhập trình tự khuôn của phản ứng PCR Có thể nhập mã số nhận dạng của trình tự, GI hoặc nhập trình tự dưới dạng dữ liệu FASTA
Ta có thể tải file trình tự lên
Trang 9Độ dài trình tự khuôn không quá 50kb.
◦ Giới hạn: xác định vị trí của mồi xuôi và mồi ngược, phụ thuộc vào vị trí đoạn gen mà ta muốn nhân lên
Primer Parameters: Các thông số của mồi
◦ Nếu kiểm tra độ đặc hiệu của mồi đã biết ta nhập cặp mồi vào khung theo chiều trình tự từ đầu 5' → đầu 3'
◦ Kích thước sản phẩm PCR: Nếu không có yêu cầu ta để mặc định từ 70 – 1000
Kích thước sản phẩm PCR thường nhỏ hơn 1000 bp, không vượt quá 3kb Đối với
qPCR, chiều dài gen đích là khoảng 100 bp và đối với PCR chuẩn là gần 500 bp
Chiều dài sản phẩm PCR = Vị trí cuối của mồi ngược – Vị trí đầu của mồi xuôi + 1 Product length = (Position of antisense primer - Position of sense primer) + 1
◦ Số lượng các mồi trả về
◦ Nhiệt độ nóng chảy Tm của mồi: GTNN - GT tối ưu – GTLN – Độ chênh lệch tối đa Tm giữa 2 mồi
Tm của mồi thường có giá trị từ 52 – 56 oC
Độ chênh lệch Tm giữa 2 mồi càng nhỏ càng tốt, và không vượt quá 5 oC
Mặc định của chương trình từ 57 – 63 là hơi cao Ta có thể điều chỉnh cho phù hợp
Exon/intron selection: Lựa chọn exon/intron
◦ Exon junction span: Trùm qua vị trí nối giữa các exon
▪ No preference: Nếu ta không cần quan tâm đến trình tự exon và intron trong khuôn
▪ Primer must span an exon-exon junction: Mồi phải trùm qua 1 vị trí nối giữa các exon
Trong trường hợp ta cần phải nhân lên DNAc, để chắc chắn chỉ nhân lên các đoạn exon
ta phải đặt thông số của mồi bám qua vị trí nối của 2 exon
▪ Primer may not span an exon-exon junction: Mồi có thể không bám vào vị trí nối giữa các exon
Mồi bám vào exon hay intron đều được
◦ Exon junction match: Phù hợp với vị trí nối giữa các exon: Khi ta cần mồi bám vào vị trí nối giữa 2 exon
Số lượng base tối thiểu bám vào exon bên 5' - Số lượng base tối thiểu bám vào exon bên 3'
◦ Intron inclusion: Bao gồm cả intron
Với tùy chọn này, chương trình sẽ cố gắng tìm các cặp mồi được phân cách bởi ít nhất một intron trên ADN hệ gen tương ứng, sử dụng so sánh mRNA-genomic DNA của NCBI Điều này làm cho dễ dàng phân biệt giữa sản phẩm khuếch đại từ mRNA và DNA genomic, các sản phẩm nhân lên từ DNA là dài hơn do sự hiện diện của một
intron
◦ Giới hạn độ dài intron: GTNN – GTLN
Trang 10 Primer Pair Specificity Checking Parameters: Các thông số kiểm tra độ đặc hiệu của mồi
Dùng để kiểm tra độ đặc hiệu của mồi
◦ Specificity check: Kích hoạt tính năng tìm kiếm các cặp mồi đặc hiệu cho mẫu PCR được dự đoán
◦ Search mode: Chế độ tìm kiếm:
▪ Automatic: Tự động
▪ User guided: Chỉ dẫn của người dùng
▪ No user guidance: Không có hướng dẫn sử dụng
◦ Database: CSDL
▪ Refseq mRNA: Trình tự chuẩn mRNA
▪ Refseq representative genomes: Trình tự chuẩn genome đại diện
▪ nr
▪ Refseq RNA (refseq_rna): Trình tự chuẩn RNA
▪ Genome (reference assembly from selected organisms): Trình tự chuẩn ghép từ genome của các loài sinh vật được chọn
▪ Custom: Mặc định
▪ Genome (chromosomes from all organisms): Genome (từ tất cả các sinh vật)
◦ Exclusion: Loại trừ
▪ Exclude predicted Refseq transcripts (accession with XM, XR prefix): Loại trừ các bản sao của các trình tự chuẩn được dự đoán
▪ Exclude uncultured/environmental sample sequences: Loại trừ các trình tự mẫu môi trường
◦ Organism: Tên loài sinh vật
◦ Entrez query: Truy vấn Entrez
để giới hạn cơ sở dữ liệu tìm kiếm cho mồi đặc hiệu
◦ Primer specificity stringency: Tính chính xác độ đặc hiệu của mồi
Mồi phải có ít nhất: 2 tổng số lần bắt cặp không đặc hiệu đến các mục tiêu ngoài ý muốn,
trong đó ít nhất: 2 bắt cặp không đặc hiệu trong: 5 base cuối của đầu 3'
Bỏ qua các mục tiêu có: 6 hoặc nhiều hơn các bắt cặp không đặc hiệu đến mồi
◦ Max target size: Kích cỡ mục tiêu lớn nhất
◦ Splice variant handling: Chỉnh lý biến thể nối
Cho phép mồi để khuếch đại các biến thể nối mRNA ( yêu cầu trình tự mRNA chuẩn như khuôn đầu vào PCR)
Trang 11 Các thông số nâng cao:
◦ Các thông số kiểm tra độ đặc hiệu của mồi:
▪ Số lượng tối đa của các trình tự mục tiêu BLAST
▪ Giá trị mong đợi (E) BLAST
Dự kiến số lượng cơ hội phù hợp trong một mô hình ngẫu nhiên
Trang 12Giá trị E cao kiểm tra độ đặc hiệu chính xác hơn Gía trị E thấp hơn rút ngắn thời gian tìm kiếm
▪ Word size BLAST
▪ Số lượng cặp mồi tối đa để sàng lọc
▪ Số lượng mục tiêu tối đa để hiển thị (cho thiết kế mồi mới)
▪ Số lượng mục tiêu tối đa để hiển thị (cho mồi được thiết kế sẵn)
▪ Số lượng mục tiêu tối đa trên 1 trình tự: Số lượng tối đa của mục tiêu PCR (trình tự được khuếch đại) để được tìm thấy trên bất kỳ trình tự đơn trong
cơ sở dữ liệu tìm kiếm
◦ Các thông số mồi:
▪ Tm sản phẩm PCR: GTNN – GT tối ưu – GTLN
▪ Chiều dài mồi: GTNN – GT tối ưu – GTLN
▪ Thành phần G-C của mồi (Tỷ lệ %): GTNN – GTLN
▪ GC clamp
▪ Max Poly-X: (Runs) Độ dài tối đa cho phép của 1 dãy lặp lại 1 Nu
Gía trị tối đa bằng 4
▪ Max 3' Stability: Độ ổn định của đầu 3'
▪ Max GC in primer 3' end: Số lượng G-C tối đa ở đầu 3'
▪ Secondary Structure Alignment Methods: Phương pháp so sánh cấu trúc thứ cấp
- Use Thermodynamic Oligo Alignment: Sử dụng so sánh nhiệt động học oligo
- Use Thermodynamic Template Alignment (warning: search may be very slow with this option on): Sử dụng so sánh nhiệt động học mẫu (Phương pháp tìm kiếm chậm)
Tùy chọn “Use Thermodynamic Oligo Alignment” chỉ dẫn Primer3 để sử dụng mô hình
so sánh nhiệt động học (thay thế cho so sánh cấu trúc bậc 2 truyền thống) để tính xu hướng của các oligo tạo thành cấu trúc cặp tóc và dimer Trong khi tùy chọn "Use
Thermodynamic Template Alignment" chỉ dẫn Primer3 để sử dụng mô hình so sánh nhiệt động học để tính xu hướng của các oligo bám vào các vị trí không mong muốn trong trình tự khuôn
▪ TH: Max Template Mispriming: (For thermodynamic alignment model only): Tỷ lệ gắn mồi không đặc hiệu tối đa: của 1 mồi (Prime) và cặp mồi (Pair)
▪ TH: Max Self Complementarity: (For thermodynamic alignment model only): Tỷ lệ tự bổ sung tối đa: ở bất kỳ vị trí nào của mồi (Any) và ở đầu 3' của mồi (3')
▪ TH: Max Pair Complementarity: (For thermodynamic alignment model only): Tỷ lệ bổ sung tối đa giữa 2 mồi: ở bất kỳ vị trí nào trên mồi (Any) và
ở đầu 3' của mồi (3')
▪ TH: Max Primer Hairpin: (For thermodynamic alignment model only): Tỷ
lệ hình thành cấu trúc kẹp tóc tối đa ở mồi