Chương XIV CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC - MỘT CHIẾN LƯỢC KHÁNG U MỞ ĐẦU Áp dụng kỹ thuật chuyển gen hứa hẹn tuyệt vời việc cải thiện trị liệu kháng u Mục tiêu tổng quát việc chuyển gen điều trị bệnh tăng sản ung thư nâng cao khả thể để loại trừ khối u làm suy yếu khối u cách đặc hiệu Trong trường hợp có liên quan tới mô bình thường khác thể Trong chương trước đề cập trực tiếp tới cách tiếp cận phân tử, miễn dịch, hoạt hóa tiền thuốc kháng tạo mạch với tư cách chiến lược trị liệu kháng u Nhưng cách tiếp cận khác nghiên cứu đưa gen vào để làm tế bào mô bình thường kháng lại tác nhân hóa trị coi phương thức bảo vệ khỏi hiệu ứng phụ hóa trị ung thư Những hệ thống nghiên cứu cách sâu rộng cho mục đích hệ thống kháng đa thuốc glycoprotein –P (P-glycoprotein-P or multidrug resistance system – MDR), dạng kháng thuốc folat reductase (DHFR) O6 – alkylguanin – DNA- alkyltransferase [AGT]), hệ thống khác nghiên cứu kỹ lưỡng Nhìn chung, chiến lược trị liệu liên quan tới việc đưa vào làm biểu gen kháng thuốc quần thể tế bào tạo máu làm cho tác nhân hóa trị độc người nhận cho phép hóa trị kháng u hiệu ứng thông qua việc thuốc sử dụng tích cực làm giảm nhẹ hiệu ứng phụ liều không tăng dần Một ứng dụng liên quan tới chuyển gen kháng thuốc chọn lọc in vivo Trong chương lược qua chế phân tử hệ thống kháng thuốc này, chứng tiền lâm sàng lâm sàng hiệu ứng chúng việc hỗ trợ cải thiện hóa trị kháng u tương lai thách đố việc phát triển ứng dụng chuyển gen kháng thuốc tương lai Nhìn chung, hệ thống xác định đặc tính trước tiên tế bào nuôi cấy động vật có vú, marker khuếch đại chọn lọc Điều cung cấp cho hiểu biết ban đầu dược lý học phân tử tiềm chúng ứng dụng in vivo Việc ứng dụng công nghệ chuyển gen tế bào soma tế bào mầm cho phép đánh giá hệ thống môi trường in vivo (ở chuột số trường hợp khác động vật lớn hơn) Những ứng dụng đạt tiến TNLS với số báo cáo chuyển gen MDR lâm sàng vài thử nghiệm chuyển gen kháng thuốc khác xem xét CÁC HỆ THỐNG KHÁNG THUỐC Gen mdr - người mã hóa cho P – glycoprotein - bơm thoát dòng (efflux pump) nhận biết nhiều hợp chất thuốc kháng ung thư paclitaxel (Taxol), vincristin, doxorubicin, eposid actinomycin D để loại chúng khỏi tế bào Sản phẩm gen glycoprotein màng 170-kDa, làm trung gian cho việc phát sinh phản ứng phụ thuộc ATP P-glycoprotein có 12 vùng xuyên màng domain liên kết ATP Cơ chế thoát dòng (efflux) MDR chưa rõ rõ ràng có liên quan tới việc loại thuốc ưa lipid từ bên màng nguyên sinh (plasma membrane) (Hình 14.1) Vai trò MDR việc kháng lại tác nhân quan sát qua việc xuất khối u kháng thuốc biểu mức MDR Sự biểu MDR quan sát thấy tế bào tạo máu, đặc biệt tế bào tiền thân CD34+ MDR sau thể công cụ hữu hiệu với tư cách marker ưu khuếch đại chọn lọc tế bào nuôi cấy động vật có vú Do ủng hộ cho quan điểm sử dụng MDR để tránh khỏi độc tính thuốc Kiểu hình MDR liên quan tới gen MRP mã hóa cho protein kháng đa thuốc – glycoprotein màng Tuy nhiên, việc sử dụng MRP với tư cách gen kháng thuốc chọn lọc phải nghiên cứu sâu rộng Hình 14.1 Cách thức hoạt động MDR MDR glycoprotein màng làm trung gian cho thoát dòng phụ thuộc ATP nhiều thuốc có độc tính (vòng tròn nhỏ) Taxol, chúng tích tụ màng tế bào (Theo Colin L Sweeney R Scott Mclvor (2005) Cancer Gene Therapy Human Press Totowwa, New Jersey) O6- alkylguanin –DNA alkyltransferase (AGT) Các tác nhân methyl hóa DNA temozolomide tác nhân chloroethyl hóa 1,3-bis (2-chloroethyl)-1-niotrosourea (BCNU) mitozolomid gây nên alkyl hóa vị trí O6 guanin DNA sử dụng tác nhân hóa trị điều trị nhiều khối u Việc xử lý với tác nhân chloroethyl hóa gây nên độc tế bào có hình thành nhanh chóng liên kết chéo chuỗi guanin cải biến cytosin chuỗi bổ cứu Cơ chế gây độc tác nhân methyl hóa có liên quan tới cảm ứng làm đứt gãy nhiễm sắc thể sửa chữa không thích ứng hậu chép ATG hiểu O6-methylguanin-DNA-methyltransferase (MGMT), protein dùng để sửa chữa hư hỏng gây tác nhân alkyl hóa DNA AGT động vật có vú sửa chữa O6-methylguanin chuỗi kép, tác động nhóm alkyl hóa khác vị trí O6 guanin sửa chữa O4methylthymin ATG sửa chữa DNA alkyl hóa cách chuyển cân hóa học trực tiếp sản phẩm cộng alkyl (adduct) tới gốc cystein nội (Hình 14.2) Sự chuyển giao bất thuận nghịch dẫn đến bất hoạt protein AGT alkyl hóa nhờ trình có tên “tự sát” (suicide process) AGT người protein 21-kDa với 207 amino acid kết tinh thành tinh thể Các tế bào tổ tiên tạo máu tế bào tủy xương người có biểu AGT nội sinh với mức thấp, điều giải thích kiềm chế tủy có giới hạn liều tác nhân alkyl hóa hóa trị liệu Tuy nhiên, có nhiều khối u có hoạt tính AGT cao khiến cho chúng kháng mạnh với tác nhân alkyl hóa Hình 14.2 Sự hoạt động AGT Các tác nhân BCNU gây cải biến DNA (đường lượn sóng kép) cách alkyl hóa base guanine (Alk ) AGT (vòng tròn nhỏ) loại bỏ sản phẩm cộng alkyl hóa với phong cách cân hóa học – trình ức chế O – benzylguanin (BG), AGT thể đột biến kháng lại BG Theo Colin L Sweeney R Scott Mclvor (2005) Cancer Gene Therapy Human Press Totowwa, New Jersey) Hình 14.3 Sự hoạt động DHFR DHFR chuyển đổi dihydrofolat (DHF) thành tetrahydrofolat (THF) với diện + NADPH2 dạng khử nicotinamid adenin dinucleotid phosphat (NADP ) Phản ứng bị ức chế chất kháng folat methotrexat (MTX) Theo Colin L Sweeney R Scott Mclvor (2005) Cancer Gene Therapy Human Press Totowwa, New Jersey) Việc sửa chữa DNA AGT động vật có vú bị ức chế hợp chất không chứa base O6 –benzylguanine (BG); BG cạnh tranh trực tiếp với DNA alkyl hóa để gắn vào AGT, làm bất hoạt vĩnh viễn AGT người thông qua việc chuyển sản phẩm cộng benzyl BG tới vị trí acceptor cystein protein Khi cộng hợp với tác nhân alkyl hóa BG làm tăng độc tính tế bào dòng tế bào khối u người in vitro làm giảm tăng trưởng khối u mô hình ghép ngoại lai; TNLS vấn đề khảo sát Nhiều protein đột biến thiết lập làm tăng đề kháng với BG Những đột biến nằm cạnh vị trí tiếp nhận cystein amino acid 145 AGT người Đặc biệt đột biến vị trí 140 156 nghiên cứu kỹ Đột biến prolin vị trí 140 thành alanin (P140A) lysin (P140K) làm tăng đề kháng BG 25 lần 6000 lần so với AGT dạng hoang dã Sự thay glycin thành alanin vị trí 156 (G156A) làm tăng đề kháng lên 240 lần; đột biến kép prolin thành alanin vị trí 140 glycin thành alanin vị trí 156 (P140A/G156A) làm tăng sức đề kháng lên 1200 lần Khi đưa gen AGT thể đột biến vào dòng tế bào bảo vệ chúng khỏi độc tính tế bào gây kết hợp BG với tác nhân alkyl hóa DNA Dihydrofolat reductase (DHFR) Hệ thống kháng thuốc thứ phát triển dạng kháng thuốc đột biến DHFR Enzym xúc tác cho chuyển đổi phụ thuộc nicotinamid adenin- dinucleotid phosphat dihydrofolat thành tetrafolat (Hình 14.3) - tiền chất gần thành vô số chất chuyển hóa folat đáp ứng chất cho carbon (one - carbon donors) chuyển hóa tế bào, bao gồm sinh tổng hợp purin tổng hợp thymidylat de novo Các chất kháng folat methotrexat (MTX) trimetrexate chất ức chế liên kết chặt chẽ tương tự chất DHFR Các tế bào xử lý với thuốc làm ức chế sâu chuyển hóa tế bào tiếp sau hiệu ứng kháng tăng sinh MTX dùng tác nhân kháng u hiệu quả, đáng điều trị bệnh bạch cầu lympho cấp, u xương ác tính, bệnh carcinoma Ewing ung thư rau (choriocarcinoma) Tuy nhiên có độc tính lớn liên quan tới việc sử dụng MTX, đặc biệt gây độc cho đường tiêu hóa ức chế tủy Đề kháng tế bào MTX có liên quan tới khuếch đại gen DHFR, giảm vận chuyển thuốc thay đổi glutamyl hóa hay deglutamyl hóa nội bào thuốc Kích thích đồng thời gen với DHFR sử dụng rộng rãi phương thức công nghệ tế bào để biểu protein mức cao tế bào động vật có vú Sự diện dạng DHFR kháng thuốc chế khác, theo tế bào trở nên kháng antifolat Vấn đề gợi lên sớm từ nghiên cứu ức chế động học enzym chiết xuất từ số dòng tế bào khác thích nghi tăng trưởng nồng độ cao MTX Giả thuyết đột biến sau xác nhận giải trình tự dòng DNA bổ cứu DHFR (cDNA) mã hóa cho thay leucin thành arginin vị trí mã 22 phân lập từ dòng tế bào 3T6 kháng MTX biểu DHFR kháng thuốc Đột biến gen DHFR làm tăng đề kháng với MTX Điều khẳng định việc thâm chuyển plasmid biểu vào nhiều dòng tế bào động vật có vú nuôi cấy, điều chứng tỏ trình tự cải biến đảm nhiệm chức marker trội chọn lọc tương tự gen NEO EcoGPT vi sinh vật xác định đặc tính thời điểm Kể từ phân lập đột biến L22R chuột có nhiều nghiên cứu việc tạo xác định đặc tính DHFR kháng thuốc liên quan tới việc áp dụng gen kháng thuốc in vitro in vivo Các báo cáo đề cập tới việc phân lập cDNA từ dòng tế bào kháng thuốc, sàng lọc dạng kháng thuốc E.coli phát sinh đột biến định hướng vị trí Các nhà khoa học sử dụng chiến lược phát sinh đột biến bão hòa sở PCR với chọn lọc MTX tế bào động vật có vú phân lập 13 tái tổ hợp vị trí 22 31 gen DHFR chuột tạo nên kháng thuốc Do thiết lập hợp lý thay số vị trí trung tâm hoạt động DHFR người ta tạo nhiều dạng kháng thật với antifolat, có nghiên cứu thể đột biến kép Việc tạo biến thể xác định đặc trưng ức chế động học chúng giúp thấu hiểu mối quan hệ cấu trúc chức vị trí hoạt hóa DHFR, cung cấp cho công cụ tạo nên kháng thuốc lựa chọn quần thể tế bào đích nghiên cứu chuyển gen Nhìn chung có cân độ kháng thuốc mức hoạt hóa xúc tác thể biến thể DHFR đặc biệt Chẳng hạn thể đột biến L22R phân lập trước xác định có độ kháng cao với MTX (nồng độ ức chế 50% [IC50] tăng 2000 lần so với dạng hoang dã, bị tổn thương xúc tác đạt 1-2% mức hoạt tính dạng hoang dã Các nghiên cứu phát sinh đột biến mô tả số thể đột biến với cải biến tổ hợp kháng thuốc hoạt tính xúc tác biến thể L22Y chuột người Nói chung, việc kiểm tra đặc tính ức chế động học enzym thể đột biến mối liên quan tới đề kháng tế bào tạo sở thiết yếu cho việc áp dụng chúng hóa trị liệu chọn lọc in vivo BẢO VỆ ĐỘNG VẬT KHỎI ĐỘC TÍNH CỦA THUỐC IN VIVO: CÁC NGHIÊN CỨU TRÊN CHUỘT Các hệ MDR, AGT DHFR kiểm tra sâu rộng chuột với tư cách hệ thống mô hình động vật nhỏ tiềm biểu gen kháng thuốc tế bào tạo máu cho phép giải thoát độc tính liên quan tới việc sử dụng thuốc hóa trị liệu Những nghiên cứu tận dụng động vật chuyển gen biểu gen kháng thuốc việc ghép tủy tải nạp với retrovirus vào đối tượng tiếp nhận bình thường để hướng gen kháng thuốc biểu tế bào tạo máu Những kết từ nghiên cứu cho chứng tin cậy nguyên lý khái niệm biểu kháng thuốc, làm tăng đề kháng động vật tác nhân hóa trị liệu liên quan với việc áp dụng phương pháp chiến lược tăng cường liều giảm thiểu độc tính liều áp dụng tác nhân kháng u Việc sử dụng MDR với mục đích bảo vệ hóa học (chemoprotection) lần chứng minh thực nghiệm gen biểu chuột chuyển gen kháng lại nhiều tác nhân bao gồm Taxol daunomycin quan sát thấy động vật chuyển gen mà động vật cấy ghép tủy Các chiến lược tải nạp với retrovirus lên vào thời điểm sau sử dụng để chứng minh tải nạp biểu MDR tủy chuột làm tăng đáng kể độc tính máu chuột sử dụng Taxol bisantren Hanania cộng tác chứng minh chuyển gen vào tế bào tạo máu nhiều thực nghiệm cấy ghép, biểu gen tải nạp trì thông qua ghép đa tủy chuột Các nghiên cứu tải nạp gặp trở ngại giảm biểu MDR có ghép nối sai lệch từ MDRcDNA vec tơ Việc cấy ghép tủy tải nạp MDR liên quan tới rối loạn tăng sinh tủy số động vật Trong hệ AGT, so sánh với chuột cấy ghép với tủy tải nạp lacZ, Davis cộng báo cáo cải thiện đáng kể khả sống sót chuột chiếu xạ liều chí tử sau cấy ghép tế bào tiền thân tủy xương tải nạp với retrovirus mã hóa cho G156A AGT xử lý với BG BCNU Hơn nữa, việc xử lý với BG BCNU làm tăng tỷ lệ % tế bào tủy xương biểu G156A AGT sau 13 tuần cấy ghép từ 30-60% tăng đề kháng BG/BCNU tế bào hình thành quần thể tải nạp với G156 A sau 23 tuần cấy ghép so sánh với tế bào tải nạp với lacZ chuột không xử lý, điều chứng minh có chọn lọc in vivo tế bào tiền thân tủy xương biểu AGT kháng thuốc Việc bảo vệ khỏi hiệu ứng gây đột biến tiềm tàng xử lý với BG temozolomid Chinnasmy cộng chứng minh nhờ việc sử dụng AGT thể đột biến P140A/G156 Người ta quan sát thấy chuột xử lý với thuốc sau ghép tủy tải nạp giảm hình thành nhân nhỏ (micronucleus) tủy xương Liên quan tới việc áp dụng người tải nạp tế bào CD34+ người sơ cấp với vec tơ retrovirus mã hóa cho AGT thể đột biến G156A làm tăng đề kháng BG + BCNU thí nghiệm hình thành quần thể methylcellulose so với tế bào không tải nạp tế bào khởi đầu nuôi cấy dài hạn từ tế bào nguyên thủy tế bào tải nạp với vec tơ lacZ đối chứng Công trình chuyển gen dẫn dắt Isola Gorden hệ DHFR, động vật thiết lập có mang gen chuyển DHFR chuột L22R Sự chuyển gen DHFR vào tế bào tạo máu chứng minh Hock Miller phân tích in vitro William cộng tác chứng minh khả bảo vệ khỏi liều chí tử MTX đưa vào tủy tải nạp DHFR Corey cộng tác chứng minh có trì kháng thuốc tế bào tủy cấy ghép khẳng định có tải nạp retrovirus kháng thuốc tế bào gốc tạo máu tái định cư Nhiều DHFR kháng thuốc tiếp tục thử nghiệm (test) phát có khả bảo vệ khỏi độc tính MTX trimetrexat có biểu tế bào tạo máu Các nhà khoa học sử dụng hệ thống mô hình chuyển gen với tảng đồng thuận, cho phép điều kiện kiểm soát cách chặt chẽ tần số đặc tính tế bào kháng thuốc động vật tiếp nhận Mặc dầu có nhân tạo hóa cao việc làm cho tế bào biểu DHFR có chứa gen chuyển giống nhau, hệ thống cho phép lặp lại nhóm, thí nghiệm tạo thuận lợi cho việc xác định đặc tính huyết học dược lý kháng thuốc động vật tiếp nhận Các nhà khoa học khởi đầu chứng minh có kháng thuốc động vật nhận FVB/N ghép tủy chuyển gen L22R L22Y DHFR đồng thuận Việc cấy ghép với tủy chuyển gen L22R tạo đề kháng với MTX liều phân phối 4mg/kg Thật ngạc nhiên liều gây kiềm chế tủy mà gây độc đáng kể đường tiêu hóa chuột Sự bảo vệ hóa học điều kiện không liên quan với việc giảm mức thuốc định giá thí nghiệm dược động học Các nhà khoa học phát có gia tăng đáng kể chiều dài nhung mao động vật bảo vệ cách ghép tủy chuyển gen L22R DHFR có thâm nhập đáng kể tế bào chuyển gen DHFR vật cho vào ruột non động vật Một khả hấp dẫn nảy sinh từ kết đưa tủy kháng thuốc vào bảo vệ động vật khỏi độc tính đường tiêu hóa sử dụng MTX Cơ chế tế bào phân tử xảy bảo vệ bắt chéo khảo sát Việc sử dụng hệ thống chuyển gen sau cho phép nhà khoa học chứng minh tầm quan trọng tế bào tổ tiên kháng thuốc việc làm trung gian kháng thuốc sớm sau cấy ghép cho phép nhà khoa học xác định xác tăng liều dung nạp tối đa ghép tủy chuyển gen L22R L22Y DHFR (tăng 2-3 lần) Các nhà khoa học quan sát thấy có tăng đáng kể kháng thuốc động vật cấy ghép mức thấp (1% tế bào chuyển gen DHFR) Mặc dầu chế kháng thuốc động vật tiếp nhận chưa xác định, kết rõ với mức chuyển gen vừa phải (trên 1%) bảo vệ khỏi độc tính antifolat ÁP DỤNG CHUYỂN GEN KHÁNG THUỐC ĐỂ NÂNG CAO TRỊ LIỆU KHÁNG U Một mục đích việc chuyển gen kháng thuốc nâng cao dung nạp liều thể, tức làm giảm độc tính liều hữu (existent dose) hóa trị kháng u cho phép tăng cường liều Mặc dầu hoàn tất nhiều thí nghiệm động vật chứng minh có giảm độc tính sau chuyển gen kháng thuốc, nghiên cứu nhằm test khả áp dụng việc nâng cao tính kháng thuốc để cải thiện hiệu trị liệu kháng u hạn chế Zhao cộng tác chứng minh nâng cao khả tồn chuột có mang khối u vú EO771 cấy ghép với tủy tiếp cận biến thể serin - 31.DHFR retrovirus sau xử lý với MTX Hanania Deisseroth chứng minh hiệu việc xử lý Taxol với khối u vú 11A1 tải nạp với vec tơ nhạy cảm hóa học p53 chuột ghép tủy tải nạp MDR Hiệu AGT thể đột biến việc nâng cao hiệu hóa trị khối u test Koç cộng tác mô hình ghép ngoại lai ung thư kết tràng người SW460 chuột ghép tủy tải nạp với AGT thể đột biến G156A Khi quay vòng nhiều lần với BG BCNU chọn lọc tủy G156A tải nạp cuối nâng cao dung nạp thuốc chuột làm chậm lại đáng kể tăng trưởng u liều cao BG + BCNU, liều chí tử chuột tủy G156A Các nhà khoa học sử dụng liều dung nạp tăng với mức dự đoán đối tượng nhận tủy chuyển gen L22Y DHFR để test khả ứng dụng điều trị số khối u có tính nhạy cảm antifolate khác Trong hệ thống này, không phát thấy liều MTX tăng dần kháng lại cách hiệu ứng bệnh bạch cầu tủy mạn tính (CML) mô hình chuột 32Dp210 Trên thực tế, MTX gây hại sinh u Tuy nhiên, sử dụng trimetrexat liều cao làm chậm lại đáng kể khởi phát u khối u không nảy sinh trimetrexat phân phối đồng thời với tiền thuốc ức chế vận chuyển nucleosid có tên nitrobezylmercaptopurin-robosid phosphat (NBMPR-P), chất ức chế cứu hộ thymine nucleosid purin mà làm tăng hiệu lực antifolat Mặc dầu sau ngừng thuốc khối u xuất hiện, thí nghiệm chứng minh tính hữu dụng tiềm tàng MTX kháng lại antifolate phân phối tăng liều cách hợp lý có biểu DHFR kháng thuốc Vì việc kết hợp với antisense nhắm vào điểm dừng BCR/ABC oncogene CML Trường Đại học Minnesota khai thác cách tiếp cận trị liệu Các nhà khoa học thiết lập loại ung thư vú FVB/N (FVB/N mammary carcinoma –FMC) – dạng ung thư vú tồn dòng khối u da cấy ghép chuột FVB/N để thử nghiệm kết hợp với hệ thống ghép đồng thuận mô tả với việc sử dụng tủy chuyển gen DHFR Khối u FMC không bộc lộ nhạy cảm đáng kể MTX nồng độ cao mà đạt động vật ghép tủy chuyển gen động vật chuyển gen DHFR Tuy nhiên người ta quan sát thấy có nâng cao hoạt tính kháng u động vật xử lý với trimetrexat, đặc biệt phân phối đồng thời với NBMPR-P Với công trình khối u 32Dp210 FMC rõ ràng với khối u tính nhạy cảm với MTX việc sử dụng antifolat luân phiên trimetrexat kết hợp với chất ức chế vận chuyển nucleosid cách tiếp cận kháng u hiệu quả, đặc biệt áp dụng chế độ trị liệu mạnh mẽ để biểu DHFR kháng thuốc Có thể dự đoán tăng dần liều MTX tăng dần làm tăng hiệu ứng kháng lại khối u có tính nhạy cảm lớn với thuốc Các nghiên cứu kiểu thực hệ mô hình chuyển gen SỰ CHỌN LỌC IN VIVO CỦA TẾ BÀO BIỂU HIỆN GEN KHÁNG THUỐC Việc dự đoán hiệu chuyển gen vào tế bào tạo máu bị hạn chế hiệu động vật lớn người Tuy nhiên có nhiều hy vọng việc nâng cao hiệu chuyển gen thông qua việc sử dụng vec tơ xen kẽ (alteRNAte vector) vec tơ lentivirus hay vec tơ foamy virus thông qua tiếp xúc quy trình xử lý tế bào Một cách tiếp cận khác làm tăng trình diện tế bào tải nạp tuần hoàn chọn lọc in vivo thông qua việc ứng dụng chọn lọc dược lý học Trong nghiên cứu độc lập hệ MDR, Sorrentino cộng sự, Podda cộng thấy có tăng tế bào bạch cầu máu ngoại vi tải nạp MDR sau xử lý với Taxol, chứng minh tính hữu dụng việc chọn lọc thuốc để làm tăng trình diện tế bào biểu gen kháng thuốc Tuy nhiên, chọn lọc mức tế bào gốc tạo máu có khả ghép dài hạn ổn định chưa chứng minh nghiên cứu Một cách giải thích hợp lý việc thiếu chọn lọc mức tế bào gốc có biểu MDR nội sinh mức tương đối cao nhiều tế bào tạo máu nguyên thủy Khi đưa vào tế bào MDR thể đột biến kháng chất ức chế P-glycoprotein hoang dã chọn lọc tế bào gốc tải nạp tốt tế bào biểu nội sinh MDR dạng hoang dã Việc sử dụng gen DHFR cho việc chọn lọc in vivo dự đoán trước từ nhiều năm rồi, cách tiếp cận không mang lại thành quả, vấn đề giải tận Allay cộng chứng minh với antifolat (trong trường hợp trimetrexat) thân không gây hiệu ứng với tư cách trung gian gây độc tế bào gốc mà độc tính tế bào gốc có đươc phân phối đồng thời với NBMRP - P để ngăn ngừa cứu hộ nucleosid cứu độc tính antifolat Allay cộng tác sau lại tiếp tục khẳng định khả sử dụng cách tiếp cận dược lý học việc mở rộng tế bào tải nạp L22Y người theo cách làm ổn định lâu dài đối tượng nhận sơ cấp đối tượng nhận cấy ghép thứ cấp Các nhà khoa học khẳng định tính chọn lọc tế bào gốc biểu DHFR tương tự điều kiện dược lý học Allay cộng tác mô tả Tuy nhiên, điều kiện tin cậy chọn lọc in vivo tế bào gốc biểu DHFR từ khởi đầu cấy ghép (từ 0,1 đến 1%) chưa thiết lập Hệ AGT bật hệ thành công đạt chọn lọc in vivo AGT kháng thuốc chứng minh cho phép làm giầu tới 940 lần thành viên tế bào tổ tiên tủy tải nạp G156A cấy ghép vào chuột nonmyeloblat sau xử lý với BG BCNU – mức chọn lọc in vivo lớn mức quan sát thấy với gen kháng thuốc khác Ragg cộng tác, Sawai cộng tác báo cáo, dựa việc cấu trúc lại tế bào tạo máu đối tượng ghép thứ cấp nối tiếp chọn lọc in vivo mức tế bào gốc tạo máu có việc xử lý thuốc chuột ghép tủy tải nạp P140K Việc phân phối thuốc nghiên cứu gồm BG BCNU tuần lần, kéo dài 4-5 tuần BG temozolomid lần tuần, kéo dài 3-4 tuần Trái ngược với hệ AGT, chọn lọc tế bào gốc hệ DHFR đòi hỏi phải phân phối hàng ngày trimetrexat + NBMPR - P tuần với vài chu kỳ xử lý qua thời gian dài Sự khác hệ thống chỗ chế tác động chúng khác Đối với antifolat, chọn lọc dựa hiệu ứng kháng tăng sinh thu từ nhóm thâm thụt nucleotid purin thymidin, đòi hỏi phải có diện tiếp tục thuốc trình chọn lọc Đối với chất alkyl hóa BCNU, kết thu đơn giản cải biến DNA làm cho tăng sinh thuốc dẫn đến việc phát tín hiệu apoptosis tế bào bị chết, trừ hư hỏng sửa chữa AGT NGHIÊN CỨU THỬ NGHIỆM TRÊN ĐỘNG VẬT LỚN VÀ NGƯỜI Các nghiên cứu biểu chuyển gen kháng thuốc động vật lớn hạn chế, vấn đề thách đố tế bào, di truyền học dược lý học chuyển gen nghiên cứu rộng rãi Stead cộng báo cáo nghiên cứu chuyển gen DHFR retrovirus ex vivo chó, qua cho thấy bị hạn chế hiệu lực chuyển gen Trong nghiên cứu chuyển gen MDR khỉ đuôi sóc (marmoset), Hibino cộng báo cáo phát thấy tế bào tạo máu tải nạp sau cấy ghép 400 ngày, lại có (dưới 1%) tế bào bạch cầu hạt máu ngoại vi tải nạp không bảo vệ động vật kháng lại giảm bạch cầu cảm ứng docetaxel Việc cấy ghép dài hạn quan sát thấy khỉ rhesus truyền tủy tải nạp MDR Có tế bào tải nạp đạt mức khởi đầu cao sau lại rơi xuống mức thấp bổ sung cytokin Một báo cáo ex vivo chuyển gen MDR chó ghi nhận có tế bào máu ngoại biên tải nạp sau xử lý với taxol sau ngừng thuốc mức tế bào lại giảm xuống, nhiên trì tới 16 tháng Những kết cho thấy, tải nạp thành công tế bào gốc tạo máu nguyên thủy, chọn lọc cao xảy chủ yếu quần thể tế bào biệt hóa Có ngoại lệ quan sát thấy động vật lớn hệ AGT có tượng tăng ổn định tế bào dương tính AGT sau phân phối BCNU + BG Những kết tạo hy vọng cho việc áp dụng biểu chuyển gen kháng thuốc phương thức chọn lọc in vivo làm tăng trình diện tế bào tải nạp gen in vivo Sự thành công nghiên cứu chuyển gen MDR động vật tiền đề tiền lâm sàng cho việc thực thử nghiệm chuyển gen người (Bảng 14.1) Những thử nghiệm thiết kế để test trước tiên hiệu lực tải nạp retrovirus làm trung gian đưa gen chuyển vào quần thể tế bào tạo máu, sau xác định xem việc xử lý có bảo vệ bệnh nhân khỏi ức chế tủy hay không để có giải pháp thích hợp Hanania cộng báo cáo có tải nạp cao đơn vị hình thành quần thể bạch cầu hạt - đại thực bào (CFU-GM) Cowan cộng tác báo cáo có mức tương đối cao (9%) bạch cầu hạt mang dấu ấn MDR tồn sử dụng nhiều lần paclitaxel bệnh nhân ghép tủy tải nạp MDR, nhiên mức cuối bị hạ thấp dần Bảng 14.1 Các quy trình bảo vệ hóa học lâm sàng người Số OBA 9306-044 Người đứng đầu nghiên cứu Deisseroth Bệnh Ung thư buồng trứng Gen Tác nhân MDR-1 Paclitaxel 9306-051 Hesdorfter Ung thư tiến triển MDR-1 Paclitaxel 9309-054 O’Shaughnessy Ung thư vú MDR-1 Paclitaxel 9406-077 Deisseroth Ung thư vú MDR-1 Paclitaxel 9601-143 Cowan Ung thư vú MDR-1 Paclitaxel 9701-172 Cornetta U tế bào mầm MDR-1 Paclitaxel 9701-173 Croop U não MGMT CCNU 9705-187 Verfaillie Bệnh bạch cầu tủy mạn DHFR 9809-265 Gerson Các khối u đặc tiến triển MGMT Methotrexate BG, BCNU 0001-376 Bertino U lympho DHFR-CD 0005-400 Becker U lympho MDR-1 0104-466 Belant Ung thư phổi MnSOD Ghi chú: a = Được liệt kê Office of Biotechnology Activities 2003 b b = CCNU , lomustine c c = BG, BCNU b c Metho Paclitaxel E Tia xạ d= e= d e CD, cystidine deaminase MnSOD, manganese superoxite dismutase Một số nghiên cứu phát thấy dấu ấn tế bào mức thấp chí phát bệnh nhân áp dụng quy trình cải tiến tải nạp retrovirus Abonour cộng đạt chuyển gen MDR mức cao tế bào tạo máu báo cáo có tăng nhẹ trình diện tế bào tải nạp xử lý với Taxol Công trình xem cung cấp chứng tính khả thi chuyển gen vào tế bào tạo máu mở rộng thêm khái niệm chọn lọc in vivo với người Trong tất hệ kháng thuốc đề cập chương MDR có lợi cho ứng dụng lâm sàng Tuy nhiên, với MDR mục đích thao tác gen (cho phép hóa trị “hiếu chiến” làm giảm độc tính liều không tăng dần) chưa giải lâm sàng KẾT LUẬN VÀ CÁC NGHIÊN CỨU TRONG TƯƠNG LAI Các tế bào tạo máu có thời gian dài coi quần thể đích chủ chốt cho chuyển gen liệu pháp việc đưa vào gen kháng thuốc chiến lược chủ chốt, theo việc chuyển gen vào tế bào tạo máu áp dụng điều trị ung thư Những tiến đạt lĩnh vực tóm tắt chứng minh tiềm chiến lược hệ thống mô hình tiền lâm sàng thử nghiệm lâm sàng khởi đầu Khả làm cho động vật nhạy cảm với độc tính thuốc rõ ràng cần phải có kết hợp tác nhân hóa trị gen kháng thuốc Mức độ tăng dần liều áp dụng để nâng cao khả trị liệu kháng u phụ thuộc vào tăng thực tế liều dung nạp đạt thông qua biểu gen kháng thuốc Khả áp dụng tăng liều dung nạp thực nghiệm trực tiếp động vật mang u để nâng cao hiệu ứng kháng u liều dung nạp cao qua biểu gen kháng thuốc Các gen kháng thuốc áp dụng chọn lọc in vivo, việc mở rộng quần thể tế bào biểu gen kháng thuốc nhờ điều khiển tác nhân chọn lọc Khả áp dụng phương pháp phụ thuộc vào mức độ mở rộng tế bào biểu gen kháng thuốc đạt Tính chọn lọc mở rộng khả sử dụng chuyển gen kháng thuốc điều trị bệnh di truyền bệnh khác ung thư