Kỹ thuật nhân giống nuôi trồng nấm đùi gà

Các bước tiến hành - Chuẩn bị thiết bị, dụng cụ Nồi Autoclave, tủ ấm, tủ cấy vô trùng; Bếp gas hoặc bếp từ, lò vi sóng; Nồi nấu môi trường; Cốc thủy tinh, ống đong, ống nghiệm, chai thủ

QUY TRÌNH KỸ THUẬT NHÂN GIỐNG NẤM ĐÙI GÀ TẠI HÀ TĨNH

(

Phần I: THÔNG TIN CHUNG

Cơ quan tác giả: Công ty cổ phần sản xuất và phát triển nấm Việt Nam

1. Nguồn gốc xuất xứ: Từ kết quả dự án Ứng dụng KHCN nâng cao năng lực

sản xuất giống nấm tại Hà Tĩnh”

2. Phạm vi áp dụng: Trên cả nước

Phần II: QUY TRÌNH KỸ THUẬT

I.Giới thiệu chung về Nấm Đùi Gà:

Nấm đùi gà là loại Nấm Sò (Bào Ngư) lớn nhất trong giống nấm Sò, xuất xứ vùng địa Trung Hải, Bắc Phi Quả thể dày,thịt trắng, mũ nhỏ mau nâu, tuổi thọ dài.Thuộc chi pleurotus, họ pleurotaceae, bộ Agaricales, lớp Hymenomycetes, ngành phụ Basidiomycotina, giới nấm Fungi

Đặc điểm chính của nấm đùi gà:

Quả thể nấm đùi gà mọc chùm hoặc mọc đơn, màu trắng ngà, cuống nấm to, dài khoảng 5-10cm, mũ nấm khi còn non lồi phẳng, đường kính mũ nấm rộng khoảng 3-8 cm Quả thể có thể hình thành ở nhiệt độ từ 10-16 độ C, điều kiện nuôi trồng tốt nhất vào mùa đông (từ tháng 12 đến tháng 2 dương lịch) Nuôi trong nhà lạnh

có thể trồng quanh năm

II Quy trình nhân giống nấm đùi gà cấp 1:

1 Nguyên liệu: công thức định lượng cho 1 lít môi trường nhân giống

Khoai tây: 200g, Đường glucose: 20g, Agar: 20g

Nước cất: 1 lít ; pH = 7,0

Ngoài những thành phần trên một số môi trường thường bổ sung thêm một số nguyên tố khoáng: K, P, Mg…dưới dạng muối vô cơ, các thành phần này bổ sung

với liều lượng khoảng 1-3g/ lít môi trường, cũng có khi bổ sung thêm vào môi trường tỉ lệ nhỏ các loại vitamin, kháng sinh…

2 Các bước tiến hành

- Chuẩn bị thiết bị, dụng cụ

Nồi Autoclave, tủ ấm, tủ cấy vô trùng; Bếp gas ( hoặc bếp từ, lò vi sóng); Nồi nấu môi trường; Cốc thủy tinh, ống đong, ống nghiệm, chai thủy tinh, đũa thủy tinh; Cân kỹ thuật; Máy đo pH, giấy đo pH; Phễu, giá rót môi trường, rổ, vợt, vải lọc, dao cắt; Bông không thám nước, giấy báo, nilon, dây cao su

- Chuẩn bị nguyên liệu

Nước cất

Khoai tây: loại tốt, không bị hư hỏng, không nảy nầm

- Chuẩn bị hóa chất

Agar; Đường Glucose ( hoặc Sachrose); Muối khoáng, vitamin, kháng sinh (nếu cần bổ sung)

3 Pha chế môi trường cấp I

Tạo môi trường dinh dưỡng nhân giống nấm cấp I từ hỗn hợp các thành phần theo công thức hỗn hợp trên

Sau khi tạo hỗn hợp môi trường xong, phân môi trường vào các ống nghiệm và đậy bằng nút bông không thấm nước

*Thao tác thực hiện:

Bước 1: Kiểm tra lại các dụng cụ, nguyên liệu cần thiết

Bước 2: Chiết chất dinh dưỡng từ khoai tây

Khoai tây gọt vỏ, rửa sạch, cắt thành khối có kích thước 1-2cm2

Cân chính xác 200g khoai tây đã cắt thành hình khối cho vào nồi nấu môi trường

Đổ 600ml nước cất vào nồi và đun sôi trên bếp ga (hoặc bếp từ)

Đun cho đến khi khoai tây hơi mềm: dùng dũa bẻ đôi khối khoai tây, đến khi khối khoai tây gãy đôi là được

Lọc qua rổ thu dịch lọc

Bước 3: Chuẩn bị dung dịch nước đường

Đặt cân về vị trí cân bằng, đầy dủ ánh sáng

Điều chỉnh cân về vị trí cân bằng

Cân chính xác 20g đường glucose cho vào cốc thủy tinh

Đong 100ml nước cất cho vào cốc đã có đường

Khấy tan đường

Bước 5: Nấu môi trường

Cân 20g agar cho vào dung dịch khoai tây

Khấy cho agar hòa tan

Thêm nước cất cho đến khi thể tích đúng 1000ml

Đun sôi môi trường 3-5 phút (lưu ý: khi nấu agar phải khuấy đều, để agar không bị lắng dưới đáy, dễ bị khét)

Thêm dung dịch nước đường vào, ta thu được môi trường cấp I

Bắt xuống, để nguội

Bước 6: Phân phối môi trường vào ống nghiệm hoăc chai thủy tinh

Đổ môi trường cấp I vào các cốc có miệng để dễ rót vào ống nghiệm, chai

Dùng phễu phân nhanh môi trường vào các ống nghiệm hoặc chai thủy tinh: đối với ống nghiệm lượng môi trường chiếm khoảng 1/5 ống nghiệm (6-7 ml/1 ống nghiệm), đối với chai thủy tinh từ 5-10 ml, nấu đổ vào ống nghiệm thì phễu được

cố định trên một giá đỡ

Bước 7: Làm nút bông cho ống nghiệm, chai thủy tinh đã có môi trường

Lấy một lượng bông vừa đủ: sao cho nút bông sau khi làm xong không quá chắt hay quá lỏng, phần nút bông trong ống nghiệm tròn đều, phần ngoài không bị xơ Bước 8: Chuyển các ống nghiệm, chai thủy tinh có môi trường vào nồi khử trùng

4 Khử trùng môi trường cấp I

Mục đích khử trùng là để tiêu diêt hoàn toàn các nguồn tạp nhiễm trong môi

trường, môi trường sau khi hấp khử trùng xong phải đảm bảo vô trùng tuyệt đối và không làm giảm chất lượng môi trường

Thiết bị thường áp dụng là nồi hấp Autoclave 1210C/25 phút Sau khi hấp thanh trùng kết thúc môi trường đang còn ở trạng thái lỏng ta tiến hành làm thạch nghiêng ngay

*Cách tiến hành:

-Bước 1: Bó ống nghiệm đã có môi trường thành các bó nhỏ: khoảng 7-10 ống nghiệm/bó

-Bước 2: Buộc đầu nút bông các bó ống nghiệm, miệng chai thủy tinh bằng giấy báo hoặc giấy nilon để hạn chế sự thấm nước vào nút bông trong quá trình hấp khử trùng

-Bước 3: Xếp môi trường vào các dụng cụ đưa vào nôi Autoclave hấp khử trùng 1210C/25 phút

-Bước 4: Lấy môi trường ra khỏi nồi và tiến hành làm thạch nghiêng

Dùng que gỗ mỏng đặt lên trên một mặt phẳng có thể dùng giá nghiêng đã được thiết kế cho tạo môi trường thạch nghiêng

Lấy từng ống môi trường sau khi đẫ khử trùng còn nóng đặt nghiêng trên que gỗ nghiêng 1 góc 40-450

Cứ tiến hành cho đến hết các ống môi trường còn lại

Hình 2.4 Làm thạch nghiêng

-Bước 5: Để nguội môi trường trong khoảng thời gian 1-2 giờ

-Bước 6: Kiểm tra vô trùng môi trường trước khi sử dungj trong nhân giống:các ống, chai môi trường sau khi đông rắn ta tiến hành chyển vào tủ ấm ở nhiệt độ 35- 370C ít nhất sau 7 ngày, kiểm tra nếu môi trường không thấy có mặt các vi sinh vật mọc trong môi trường, màu môi trường không thay đổi thì môi trường đạt yêu cầu Các ống nghiệm, chai môi trường được đặt vào tủ lạnh, nhiệt độ 2-100C để dùng dần

5 Cấy chyền giống nấm cấp I

Cấy chuyền giống nấm cấp I là quá trình chuyển giống nấm từ các ống giống gốc sang các ống nghiệm, chai thủy tinh chứa môi trường cấp I đã được vô trùng

và thao tác cấy chuyền được thực hiện trong điều kiện vô trùng

a Kiểm tra phòng cấy, tủ cấy và dụng cụ cấy giống

Trước khi tiến hành thao tác cấy chuyền giống yêu cầu: phòng cấy phải được khử trùng nhằm hạn chế sự xâm nhập nguồn tạp nhiễm vào giống nấm trong quá trình cấy chuyền

-Phòng cấy: phải luôn sạch sẽ, vì vậy cần phải:

Quét dọn lau sạch sàn, xung quanh tường bằng nước sạch trước và sau mỗi lần cấy giống

Bậc quạt thông gió

-Tủ cấy:

Dùng bông thấm cồn lau sạch tủ bên trong, ngoài tủ

Phủ màn tối kín tủ

Bật đèn tử ngoại, quạt trong thời gian 15-30 phút

Lấy màn che khỏi tủ

Tắt đèn tử ngoại sau thời gian 15-30 phút để đẩy hết khí ozon ra khỏi tủ

Bật đèn sáng

Tiến hành cấy giống:

Dụng cụ cấy: các dụng cụ sử dụng trong phòng cấy giống (bình tam giác, que cấy, panh cấy, kéo…) được bao gói và hấp khử trùng ở nhiệt độ 160-1700C, sau khi khử trùng xong phải để vào vị trí sạch sẽ nếu chưa sử dụng ngay

Cấy chuyền từ ống gốc sang môi trường cấp I

Cách cấy chuyền giống được thực hiện theo các bước sau:

-Bước 1: Mang bảo hộ: áo bluse, khẩu trang

-Bước 2: Khử trùng tay: dùng bông thấm cồn lau từ khủy tay đến các ngón tay, kẽ tay

-Bước 3: Kiểm tra lại các ống (chai) giống gốc và các ống (chai) môi trường cấp I

và dùng bông thấm lau cồn xung quanh các ống ( chai) giống và ống (chai) môi trường trước khi đưa vào tủ

-Bước 4: Chuyển bộ dụng cụ cấy giống, đèn cồn, bình tam giác có chứa cồn, khay đựng dụng cụ cấy vào tủ cấy và bố trí sao cho tiện trong quá trình thao tác trong tủ

-Bước 5:Ngồi vào vị trí và vệ sinh tay lại một lần nữa bằng cồn và đợi cho tay khô hết cồn

-Bước 6: Đốt đèn cồn để đèn cồn cháy tự do trong thời gian 2-3 phút, ngọn lửa đèn cồn không nên để quá lớn hoặc quá nhỏ, nên cao từ 3-4cm

-Bước 7: Khử trùng lại các dụng cụ cấy bằng cách nhung vaò cồn và đốt trực tiếp trên ngọn lửa đèn cồn, thao tác lặp lại 2-3 lần, sau đó để nguội

-Bước 8: Mở nút bông và giữ nút bông của ống gốc và ống môi trường bằng kẽ tay

út và áp út, hơ miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn, chỉ mở quanh ngọn lửa đèn cồn và ở tư thế nằm ngang, quay miệng về hướng ngọn lửa

-Bước 9: Dùng que cấy chuyển một mẫu giống từ ống giống gốc sang ống (chai) môi trường cấp I

b)Chuyển mẫu giống gốc

a) Lấy giống gốc

c)Chuyển giống gốc vào môi trường

-Bước 10: Hơ miệng ống nghiệm trên ngọn lửa đèn cồn và hơ nhanh nút bông của ống môi trường và đậy nút bông lại

-Bước 11: Thao tác cứ tiến hành cho đến khi hết lượng giống trong ống giống gốc Trung bình một ống giống gốc như vậy ta cấy được khoảng 30-40 ống giống cấp I -Bước 12: Dùng giấy báo bọc đầu nút bông của ống giống lại

-Bước 13: Ghi tên loại giống, ngày giờ cấy

-Bước 14: Xếp các ống giống cấp I trên các giá và chuyển toàn bộ vào phòng nuôi sợi để trên các giàn kệ nuôi sợi giống

-Bước 15: Vệ sinh tủ cấy và phòng cấy sau khi cấy giống xong

2.4.Nuôi sợi giống nấm cấp I

Kiểm tra điều kiện phòng nuôi

Phòng sạch sẽ không có bụi bẩn, rác thải, không bị ẩm mốc

Phòng càng ít ánh sáng càng tốt,khô thoáng, có đầy đủ hệ thống điện

Có hệ thống điều chỉnh nhiệt độ khi cần, thường nhiệt độ thích hợp cho việc nuôi sợi ở nấm Linh Chi là 260C +_2 và thời gian ăn kín ống nghiệm là 10 +_1

Chọn nhiễm và phân lập giống nấm cấp I

Tốc độ sinh trưởng và phát triển hệ sợi nấm cấp I của nấm Linh Chi sẽ phụ thuộc vào trạng thái sinh lý, chất lượng, độ tuổi giống đem nhân giống cũng như thành phần môi trường và điều kiện nuôi sợi Sau thời gian nhất định có những ống giống sợi nấm phát triển mạnh, ăn kín toàn bộ bề mắt thạch, sợi nấm ăn khỏe và có một màu đồng nhất, với những ống như vậy ta sử dụng trực tiếp hoặc chuyển sang bảo quản Tuy nhiên cũng có những ống giống không đạt yêu cầu:

Bị nhiễm vi sinh vật khác

Sợi nấm bị thoái hóa hay lão hóa

Sợi sinh trưởng kém

Giống cấp I thường nhiễm các loại:

Nhiễm khuẩn: Trên môi trường thạch có những vết trắng đục như sữa

Nhiễm mốc: Trên môi trường xuất hiện những chấm nhỏ nhiều màu, sợi giống nấm không phát triển được

Nguyên nhân giống nấm bị nhiễm:

+ Hấp khử trùng môi trường không tốt: Môi trường đã khử trùng, để ở nhiệt độ bình thường trong khoảng 3-4 ngày có hiện tượng nhiễm khuẩn là do nồi hấp bị hỏng hoặc chế độ khử trùng không đảm bảo

+ Ống gốc bị nhiễm: Tất cả các ống cấp I được cấy từ ống giống này đều bị nhiễm

+ Do thao tác cấy: Trong khi cấy các ống nghiệm để gần ngọn lửa đèn cồn sẽ làm cho giống chết, thạch bị chảy ra và rất dễ nhiễm khuẩn

+ Có thể do tủ cấy không đảm bảo vô trùng hoặc phòng cấy không thường xuyên khử trùng

+ Có thể bị lây nhiễm từ ngoài vào trong quá trình nuôi sợi Việc lây nhiễm này chủ yếu là do phòng nuôi sợi, ống nghiệm, nút bông bị ẩm và bị nhiễm bẩn… Một số biểu hiện của sợi nấm bị thoái hóa?:

+ Sợi nấm co lại không phát triển, hệ sợi nấm dày, màu sợi nấm mờ

+ Tơ tiết có màu từ trắng chuyển sang vàng trong

+ Sợi nấm đổi màu: bình thường sợi nấm màu trắng chuyển sang màu tối, xám tro, màu nâu

+ Thời gian ăn kín ống nghiệm quá lâu

III Quy trình nhân giống nấm đùi gà cấp 2 :

1. Nguyên vật liệu:

Giống cấp II có thể áp dụng nhiều công thức khác nhau, nhưng tất cả đều là môi trường xốp với nguyên liệu chính: thóc, ngũ cốc, mùn cưa, cám gạo, bột ngô Đối với linh chi, môi trường nhân giống cấp II là môi trường dạng hạt

2. Tiến hành:

+ Thóc luộc

+ Bột nhẹ (CaCO3): 1%

- Các bước tiến hành

Chuẩn bị thiết bị, dụng cụ, nguyên liệu và hoá chất

* Thiết bị, dụng cụ:

– Nồi Autoclave hoặc hệ thống nồi thanh trùng

– Máy trộn nguyên liệu

– Bếp gas công nghiệp, nồi luộc, que khuấy

– Quạt công nghiệp

– Chai thủy tinh 500m1, chai nhựa, nắp nhựa, thau nhựa, rổ

– Cân đồng hồ, ẩm kế

– Bông không thấm nước, dây cao su, giấy báo, giấy nilon

* Nguyên liệu

– Nước sạch: pH: 7,0

– Thóc tẻ: có chất lượng tốt, không mốc, không bị sâu mọt đục phá,

– Mùn cưa từ các loại gỗ mềm, không có tinh dầu, hoá chất, để nhân giống nên chọn mùn cưa cao su, bồ đề là tốt nhất

Ngoài ra còn chuẩn bị một số phụ gia bổ sung: cám gạo, bột ngô

* Hoá chất

– Vôi sống: hàm lượng CaO > 60%

– Cồn công nghiệp

– Bột nhẹ: có chất lượng tốt, pH<9

– Phân vô cơ: urê, DAP, MgSO4, chất khoáng…

Chuẩn bị môi trường nhân giống nấm cấp II

* Chuẩn bị môi trường nhân giống theo công thức (tạo môi trường nhân giống cấp

II từ nguyên liệu thóc)

Bước 1: Xử lý nguyên liệu thóc

– Cân khối lượng thóc cần làm đổ vào thau nhựa

– Rửa nhiều lần bằng nước sạch để loại bỏ bụi, đất và các hạt thóc lép

– Ngâm thóc trong nước sạch 12 – 16 giờ, để thóc ngâm nước

– Thóc sau khi ngâm, tiến hành đãi, rửa sạch để khử hết mùi chua

– Cho thóc vào nấu và tiến hành luộc, khi vỏ trấu mở khoảng 1/3, kiểm tra không còn lõi trắng ở giữa là đạt yêu cầu

– Vớt thóc ra các dụng cụ chứa để thoát nước như: rá, rổ,… và để cho bay hết hơi nước (có thể dùng quạt để hơi nước bay nhanh hơn), độ ẩm còn khoảng 70 – 75%

là được

* Chú ý khi luộc thóc: trong quá trình luộc phải thường xuyên khuấy trộn để độ nở các hạt thóc đồng đều nhau

Bước 2: Khi trộn bột nhẹ vào thóc đã luộc

– Cân chính xác lượng thóc và bột nhẹ theo tỉ lệ công thức

– Trộn đều để bột nhẹ bám vào vỏ hạt thóc đồng đều bằng tay hoặc bằng máy trộn – Kiểm tra độ ẩm: 65- 70% là đạt yêu cầu

Bước 3: Phân phối thóc đã phối trộn vào các chai thủy tinh hoặc chai nhựa

Thóc được đổ vào các chai thủy tinh hoặc chai nhựa, lượng thóc cho vào mỗi chai

từ 300 — 350g (hình 2.7)

Bước 4: Tiến hành làm nút bông (hình 2.8)

– Lấy một lượng bông vừa đủ với miệng chai

– Tạo đầu nút bông tròn

– Đưa vào cổ chai: phần bông trong cổ chai khoảng 3 – 4cm, phần bông bên ngoài khoảng 1–2 cm

Bước 5: Đậy nắp chai môi trường

Dùng nắp nhựa đậy kín miệng chai, hoặc dùng túi nilon, giấy báo bọc kín dùng nút bông để chống hút ẩm trong quá trình hấp khử trùng (hình 2.9)

Bước 6: Chuyển các chai môi trường vào nồi hấp khử trùng

3 Khử trùng môi trường nhân giống nấm cấp II

Để khử trùng môi trường cấp II, người ta thường sử dụng nồi Autoclave hoặc hệ thống nồi hơi (nếu sản xuất quy mô lớn) Sử dụng nhiệt của hơi nước bão hòa để khử trùng môi trường, chế độ khử trùng: áp suất 1,2-1,5 atm, thời gian 90-120 phút

Khi hấp xong, chuyển các chai giống vào phòng chờ, xêps lên bàn hoặc các giàn

kệ, mở ngay bao nilon hoặc nắp đậy ra khỏi chai giống để nút bông khô một cách

tự nhiên Để ngụi sau thời gian khoảng 24-48 giờ mới tiến hành cấy giống cấp I vào

4 Cấy chuyền giống nấm cấp II

- Kiểm tra phòng cấy, tủ cấy và dụng cụ cấy giống

Trước khi tiến hành thao tác cấy chuyền yêu cầu: phòng cấy, tủ cấy, dụng cụ cấy phải được khử trùng nhằm hạn chế sự xâm nhiễm nguồn tạp nhễm vào giống nấm trong quá trình cấy chuyền

Phòng cấy: yêu cầu phải sạch sẽ, vì vậy phải quét dọn, lau sạch sàn và xung quanh tường bằng nước sạch (có thể xông focmol để khử trùng trước đó vài ngày), bật quạt thông gió, điều hòa (nếu có)

Tủ cấy: phải vô trùng tuyệt đối Cách tiến hành:

Dùng bông thấm cồn lau sạch tủ bên trong, ngoài tủ

Phủ màn tối kín tủ

Bật đèn tử ngoại, quạt trong thờigian 15-30 phút

Lấy màn che ra khỏi tủ

Tắt đènt tử ngoại đợi sau thời gian 15-30 phút, để đẩy hết khí ozon ra khỏi tủ

Bật đèn sáng

Tiến hành vào làm việc

*Chú ý: Khi sử dụng đèn tử ngoại:

Trong thời gian bật đèn tử ngoại, không được làm việc trong phòng

Không được nhìn trực tiếp vào đèn khi đang bật

Đúng thời gian bật, tắt đèn tử ngoại theo quy định mới được vào làm việc

Dụng cụ cấy: Các dụng cụ sử dụng trong cấy giống (bình tam giác, que cấy đầu bẹp, panh cấy, kéo, giấy bạc…) được bao gói và khử trùng khô ở nhiệt độ 160-1700C, thời gian 1,2-2 giờ, hoặc hấp khử trùng hơi nước trong nồi Autoclave, dụng

cụ sau khử trùng xong phải để vào vị trí sạch sẽ nếu chưa sử dụng ngay

4 Cấy chuyền giống từ giống cấp I sang môi trường nhân giống cấp II

Quá trình cấy chuyền giống thực hiện tương tự các bước giống như việc cấy

chuyền giống gốc sang ống môi trường cấp I

Thứ tự theo các bước sau:

-Bước 1: Mang bảo hộ: áo bluse, khẩu trang

-Bước 2: Khử trùng tay: dùng bông thấm cồn lau từ khủy tay đến các ngón tay, kẽ tay

-Bước 3: Kiểm tra lại các ống giống cấp I và các chai môi trường nhan giống cấp II (chai giống không bị bể)