Sàng lọc hiệu năng cao đã được ứng dụng trong hai thập kỷ qua và đã trở thành một phương pháp tiêu chuẩn để phát hiện thuốc mới trong nghành công nghiệp dược phẩm. Vì vậy, mục tiêu của chuyên đề là tìm hiểu: “Quy trình tổng quát sàng lọc thuốc hiệu năng cao”.
ĐH Y Dược TP.HCM Khoa Dược CHUYÊN ĐỀ HẾT MÔN SINH HỌC PHÂN TƯ Tên chuyên đề: QUY TRÌNH TỔNG QUÁT SÀNG LỌC THUỐC HIỆU NĂNG CAO Học viên TH: Lớp: GVHD: TP.HCM - 2016 .1 Dẫn nhập Với tình hình bệnh tật ngày tăng diễn biến phức tạp, nhu cầu thuốc sử dụng tăng theo Nhiều bệnh xuất mà đến chưa có thuốc điều trị, với tình hình kháng thuốc trở thành vấn đề thách thức nhà nghiên cứu dược phẩm chuyên gia y tế Việc nghiên cứu thuốc từ ý tưởng ban đầu trình phức tạp, trung bình cần 10 đến 15 năm tốn khoảng tỷ USD Phương pháp sàng lọc để tìm kiếm thuốc mới, phát triển từ phương pháp truyền thống hay gọi phương pháp sàng lọc hiệu thấp (low-throughput screening – LTS) với hiệu thấp, hợp chất thời điểm, phương pháp sàng lọc hiệu cao (high-throughput screening – HTS) liên quan đến hệ thống robot hoàn toàn tự động, cho phép thử nghiệm số lượng lớn hợp chất cho mục đích khác ngày Hiện nay, HTS có khả sàng lọc 100.000 mẫu ngày So với phương pháp nghiên cứu thuốc truyền thống, HTS cho thấy nhiều ưu vượt trội như: đơn giản, nhanh, chi phí thấp, hiệu cao HTS giúp đẩy nhanh trình tìm kiếm hợp chất có tác dụng sinh học, bao gồm phương pháp tiếp cận thư viện hàng chục ngàn hợp chất, sử dụng xét nghiệm sinh hóa hổ trợ hệ thống tự động hóa, bao gồm xét nghiệm thu nhỏ, sử dụng phát xạ huỳnh quang, cộng hưởng từ hạt nhân hay phương pháp phân tích liệu lớn Sàng lọc hiệu cao ứng dụng hai thập kỷ qua trở thành phương pháp tiêu chuẩn để phát thuốc nghành công nghiệp dược phẩm Vì vậy, mục tiêu chuyên đề tìm hiểu: “Quy trình tổng quát sàng lọc thuốc hiệu cao” .2 Tổng quan 2.1 Khái niệm HTS ứng dụng công nghệ dược phẩm: HTS trình sàng lọc thử nghiệm số lượng lớn điều biến sinh học quan phản ứng lại kích thích với mục tiêu xác định Mục đích HTS để đẩy nhanh phát hoạt chất có tác dụng sinh học, bao gồm cách tiếp cận thư viện hợp chất bao gồm hàng chục ngàn hợp chất thử nghiệm với mục tiêu cụ thể cách sử dụng xét nghiệm sinh học định lượng thông qua việc sử dụng hệ thống tự động hóa, xét nghiệm thu nhỏ, sử dụng phát xạ huỳnh quang, cộng hưởng từ hạt nhân, phân tích liệu quy mô lớn Hiện nay, kỹ thuật sàng lọc hiệu cao (HTS) việc tìm kiếm thuốc ngày phát triển rộng rãi HTS ứng dụng để sàng lọc hợp chất hóa học, gen, protein chuổi peptid Có nhiều mục tiêu thử nghiệm Trong đó, thụ thể màng tế bào, chủ yếu protein-G chiếm 45%, enzyme chiếm 28%, kích thích tố 11%, ion-kênh 5%, thụ hạt nhân 2% cuối DNA 2%, khác 7% HTS đóng vai trò thiết yếu trình phát triển thuốc HTS cho phép đánh giá nhanh chóng dược lực số lượng lớn hoạt chất Kết nối thư viện hợp chất với đa dạng hoá chất với HTS cho thấy tiềm lớn phát hoạt chất, để thành công kỹ thuật phụ thuộc vào nhiều yếu tố: số lượng chất lượng mục tiêu xác nhận, số lượng đa dạng hợp chất sưu tập, kịp thời kiểm tra khả hiệu sử dụng xét nghiệm Xác định phân tử tiềm tốt cách sử HTS hạn chế tối đa khoảng thời gian phát hoạt chất Hầu hết công ty dược phẩm công nghệ sinh học sử dụng sàng lọc hiệu cao (HTS) chức trung tâm trình phát triển thuốc Ngày tăng mục tiêu điều trị xác nhận phát thông qua tiến nghiên cứu gen người, ngày nhiều hợp chất hóa học sản xuất thông qua HTS [1] 2.2 Ưu điểm HTS Giảm thiểu chi phí nghiên cứu, giảm chất thải khảo nghiệm cách cho phép việc sử dụng xử lý mẫu song song phương thức phát Ngăn chặn suy giảm nguồn cung cấp hợp chất, làm giảm lượng thuốc thử sử dụng Để bao quát thu nhỏ khảo nghiệm tiến hành dựa hệ thống liên quan đến đĩa với mật độ cao khối lượng nhỏ Dễ dàng tự động hóa, kỹ thuật có độ nhạy cao để thực dòng chảy liên tục Áp dụng sở công nghệ sinh học, nghiên cứu tế bào, không thực nghiệm động vật, người, không bị ràng buột vấn đề đạo đức nghiên cứu 2.3 Các hệ HTS: 2.3.1 Phân loại theo Ricardo Macarrón and Robert P Hertzberg [10] Kiểu sàng lọc Low-throughput Số lượng Ví dụ mẫu thử/ ngày 500 Thử nghiệm mô hình động vật, xét nghiệm thông qua trung gian trao đổi chất screening CYP, kết hợp với LC/MS/MS 500- 10.000 Khảo nghiệm kỹ thuật chụp ảnh Medium throughput kính hiển vi phát huỳnh quang tế bào, xét screening nghiệm để xác định hoạt tính xúc tác enzyme oxy tiêu thụ High-throughput 10.000-100.000 screening Ultra-high Phân tích ức chế phát huỳnh quang thuộc enzyme >100.000 Thử nghiệm β-lactamase di động throughput screening 2.3.2 Phân loại theo Oliver Kayser and Heribert Warzecha [8] 2.3.2.1 Thế hệ thứ Throunghput: bắt đầu xuất từ năm 1993 với đĩa có 96 giếng Đến năm 2000 sử dụng đĩa có 1536 giếng (bội số 96) Số lượng mẫu từ 50.000 -200.000 Thể tích giếng từ 100 – 200 µl giảm xuống 2,5 – 10 µl Công cụ sản xuất Phát triển KT khảo nghiệm Sàng lọc HTS II Công cụ sản xuất Phát triển KT khảo nghiệm Sàng lọc HTS I Sàng lọc ngược Thẩm định sàng lọc Mục tiêu Thư viện mẫu > 1,500,000 Sàng lọc ngược Thẩm định sàng lọc Danh sách trọng tâm 10,000 – 50,000 Tìm chất định hướng Tối ưu hóa chất định hướng Quá trình thực hiện: Khảo nghiệm Điều chỉnh PP khảo nghiệm Sàng lọc HTS Tối ưu hóa chất định hướng 2.3.2.2 Thế hệ thứ hai Efficacy: kích thước thư viện mẫu từ 200,000 đến 1,500,000 mẫu, phát triển từ năm 2001 -2006, số lượng giếng đĩa lên tới 9600 giếng/đĩa, thể tích mẫu 0,2 µl Nhưng phải đối mặt với số vấn đề kỹ thuật chẳng hạn độ nhạy cảm với nồng độ Dimethylsulfoxide hạn chế pha chế thể tích nhỏ yêu cầu giám sát bốc Sơ đồ thực hiện: Mục tiêu Công cụ sản xuất Phát triển PP khảo nghiệm Sàng lọc HTS Sàng lọc ngược Tìm chất định hướng Tối ưu hóa chất định hướng 2.3.2.3 Thế hệ thứ ba Flexibility: xuất từ năm 2007 đến nay, số lượng mẫu thực từ 1,500,000 mẫu trở lên Hình 2.1 Các hệ HTS [7] Nội dung Quy trình tổng quát sàng lọc thuốc hiệu cao dựa công nghệ sinh học phân tử gồm bước sau: 3.1 Xác định mục tiêu thử nghiệm [2] Mục tiêu thử nghiệm thành phần cụ thể tồn sẵn có tế bào bệnh lý cấu trúc phân tử mà chịu trách nhiệm bệnh; Mục tiêu thử nghiệm receptor, enzyme, axit nucleic, hormon, kênh ion… Mục tiêu thử nghiệm phụ thuộc vào bệnh mà nhà nghiên cứu quan tâm Hiện nay, thụ thể bắt cặp với protein-G (G protein-coupled receptor - GPCR) họ lớn xác định mã hóa 600 gen xác định Trong thể người, GPCR chịu trách nhiệm cho khoảng 30 bệnh bao gồm đái tháo nhạt, nhược giáp, cường giáp, viêm võng mạc sắc tố, số rối loạn sinh sản chí ung thư Khoảng 150 họ thụ thể bắt cặp với protein-G (GPCRs) tìm thấy thể người có chức chưa rõ 3.1.1 Đặc điểm mục tiêu thử nghiệm: [11] • Các mục tiêu thử nghiệm phân tử sinh học, thông thường loại protein protein dạng đơn giản dạng phức hợp • Các phân tử sinh học có vị trí đặc biệt để gắn với phân tử khác (thường phân tử nhỏ có cấu trúc đặc biệt) Những phân tử nội sinh bên thể chất bên thể phân tử hóa học (thuốc) • Cấu trúc phân tử sinh học thay đổi phân tử sinh học liên kết với phân tử nhỏ thay đổi cấu trúc thường thuận nghịch • Sau có thay đổi cấu trúc phân tử sinh học phản ứng sinh lý khác xảy gây điều chỉnh trạng thái tế bào, mô, quan thể • Các phản ứng sinh lý gây thay đổi cấu trúc phân tử sinh học đóng vai trò quan trọng việc điều trị bệnh • Các biểu hiện, hoạt động cấu trúc phân tử sinh học thay đổi theo thời gian trình bệnh lý • Các phân tử nhỏ liên kết với phân tử sinh học thuốc 3.1.2 Các loại mục tiêu thử nghiệm: Có 483 mục tiêu thử nghiệm sử dụng, có thụ thể (45%), enzyme (28%), hormon (11%), chưa rõ (7%), kênh ion (5%) thụ thể nhân (2%) AND (2%) (Drews, 2000) Hình 3.1 Các loại mục tiêu thử nghiệm 3.1.3 Mục đích việc xác định mục tiêu thử nghiệm: Tùy vào xu hướng tìm kiếm thuốc phân tử nhỏ mà việc xác địch mục tiêu thử nghiệm có mục đích khác nhau: 3.1.3.1 Sàng lọc dựa vào mục tiêu thử nghiệm (Target-base Screening) Xác định mục tiêu thử nghiệm tảng sàng lọc dựa vào mục tiêu thử nghiệm Hầu hết thuốc làm việc cách gắn vào mục tiêu cụ thể Vì vậy, muốn tìm kiếm loại thuốc thật sự, điều cần phải làm tìm mục tiêu Bước tìm phân tử nhỏ mà gắn với mục tiêu này, tốt cụ thể tốt Quy trình dường có tính đổi khoa học mà cộng đồng nghiên cứu dược phẩm mơ ước nhiều thập kỷ Với nỗ lực to lớn, số chí thành công việc đưa loại thuốc theo cách (ví dụ mercaptopurine cimetidine) Tuy nhiên nhiều nhà khoa học lĩnh vực này, đặc biệt nhà sinh học phân tử nhà quản lý trẻ, thấy bùng nổ loại thuốc chống lại bệnh tật trước chữa Nhưng ngày nay, hầu hết bệnh đó, điều mà thực bùng nổ chi phí để tìm phát triển loại thuốc Sàng lọc dựa vào mục tiêu thử nghiệm nhiều nhiều câu hỏi Mặc dù xu hướng chắn dẫn đến nhiều thành công nhiên thất bại nhiều so với dự kiến phương thức tuyệt vời in vitro lại tai hại lâm sàng thiếu hiệu độc tính bất ngờ 3.1.3.2 Sàng lọc kiểu hình (Phenotypic Screening) [6] Sàng lọc kiểu hình loại sàng lọc sử dụng nghiên cứu tìm kiếm thuốc để xác định chất phân tử nhỏ, peptide, RNAi để can thiệp làm thay đổi kiểu hình tế bào quan Hầu hết sàng lọc kiểu hình ngày thực tế bào Một lần nữa, phải ý thức tế bào gần giống với mô quan Và tế bào phòng thí nghiệm-thường làm dòng tế bào ung thư không chết, thao tác để bắt chước bệnh - hoạt động hoàn toàn khác biệt so với tế bào bình thường Tuy nhiên, tế bào sàng lọc kiểu hình có nhiều lợi so với sàng lọc sinh hóa Một lợi lớn tế bào, mục tiêu điều kiện sinh học bình thường nó: diện khoang thực tế bào, nồng độ thật đường điều hòa trao đổi cách hoàn chỉnh Một lợi thứ hai tế bào chứa nhiều mục tiêu Ngược lại, sáng lọc sinh hóa kiểm tra mục tiêu biết đến vào thời điểm nhiều năm để thiết lập thử nghiệm cho protein thứ hai Một lợi thứ ba sàng lọc kiểu hình thành công xác định tiền chất, mà không cần phải chuyển đổi sang hoạt chất tế bào chủ tế bào vi khuẩn Tiền chất không thực thử nghiệm sinh hóa Trong trường hợp sử dụng sàng lọc kiểu hình để tìm hoạt chất, việc xác định xác định mục tiêu hữu dụng Đầu tiên, xây dựng SAR dựa cách đo xét nghiệm sinh hóa cho kết tốt bạn loại trừ tất biến thể gây xuyên qua tế bào, mục tiêu gắn kết, phân chia tế bào Thứ hai, cấu trúc 3D mục tiêu có sẵn, mô hình phân tử hỗ trợ SAR Thứ ba, biết mục tiêu giúp việc tìm độc tính đường mô hình người động vật Thứ tư, khó khăn để có chấp thuận quan công ty hợp chất mà mục tiêu Trong trường hợp sử dụng sàng lọc kiểu cách để tìm mục tiêu mới, vai trò việc xác định mục tiêu hiển nhiên Cách tiếp cận để tìm kiếm mục tiêu trở thành lựa chọn hợp lý ba lý Trước tiên, tăng khả tăng để đọc nhiều kiểu hình phức tạp Thứ hai, phương pháp để xác định mục tiêu trở nên ngày hiệu Và thứ ba, mục tiêu tìm thấy thông qua sàng lọc kiểu hình có nhiều khả thành công Hình 3.2 Hai phương pháp xác định mục tiêu thử nghiệm 10 3.1.4 Phương pháp xác định mục tiêu thử nghiệm Có nhiều phương pháp để xác định mục tiêu thuốc lĩnh vực dựa phát triển nhanh chóng kỹ thuật sinh học phân tử, kính hiển vi, tự động hóa tin học Không có phương pháp hay hướng dẫn áp dụng cho tất mục tiêu 3.1.5 Thẩm định mục tiêu thử nghiệm: [5] Thẩm định mục tiêu trình bản, hoàn toàn bước đầu để tìm thuốc Thẩm định mục tiêu thuốc giúp nhiều không để nghiên cứu phát triển thuốc mà cung cấp nhìn sâu sắc chế bệnh sinh mục tiêu liên quan đến bệnh Về bản, trình thẩm định mục tiêu bao gồm sáu bước sau: Phát phân tử sinh học quan tâm Đánh giá tiềm phân tử sinh học mục tiêu Thiết kế xét nghiệm sinh học để đo lường hoạt động sinh học Xây dựng sàng lọc hiệu cao Thực sàng lọc để tìm hits Đánh giá hits Các mục tiêu thuốc phải thẩm định thực nghiệm theo mô hình hoạt động Thẩm định trực tiếp liên kết liệu với hiệu lâm sàng (ví dụ: thí nghiệm tế bào/ mô người) Những nghiên cứu chức áp dụng quy trình can thiệp làm thay đổi cấu trúc gen (gene knockdown hay knockout) Ở In vitro nghiên cứu chuyển hóa tế bào sử dụng để phát hay điều chỉnh đặc điểm mục tiêu đường mà mục tiêu tham gia Cuối cùng, cần đánh giá mối liên quan mục tiêu cụ thể với bệnh mô hình động vật Giả sử chức di truyền chuột người tồn mô hình bệnh thích hợp quy trình can thiệp làm thay đổi cấu trúc gen (knockout hay transgenic) động vật sử dụng để thẩm định mục tiêu Tuy nhiên, invivo việc thẩm định mục tiêu người không rủi ro Trong đó, số mô hình hứa hẹn hiệu sử dụng người, số mô hình khác cho thấy khác biệt lớn Hơn nữa, số bệnh 11 bị hạn chế có loài linh trưởng, hầu hết nghiên cứu chuyển hóa động vật thực loài gặm nhấm Chuyển sang tìm kiếm thuốc thật sự, interleukin (IL) -2-cảm ứng tyrosine kinase (ITK) khái niệm mẻ điều trị bệnh viêm da ITK tác động cách chọn lọc mô bệnh Nó diện chủ yếu tế bào T tăng lên da thương tổn từ bệnh nhân với viêm da RNA silencing áp dụng xu hướng để thẩm định mục tiêu tiếp tục nghiên cứu in vivo (tức quy trình can thiệp thay đổi cấu trúc gen knockout ITK chuột) Hơn nữa, chất ức chế SMOL xác định chắn vai trò kinase mô hình bệnh tật Đánh giá Druggability Các phương pháp để đánh giá druggability protein bao gồm phương pháp tìm hiểu trình tự liên quan đến protein cấu trúc 3D protein Những mục tiêu thuốc biết cấu trúc 3D tìm thấy sở liệu mục tiêu thuốc tiềm (http: //www.dddc.ac.cn/pdtd/) Biết cấu trúc 3D thuận lợi để đánh giá mục tiêu thuốc cho phép dự đoán điểm gắn liên kết tiềm cho SMOL, việc dự đoán thực công cụ tìm kiếm druggability dựa cấu trúc cung cấp EMBL-EBI (https://www.ebi.ac.uk/chembl/drugebility) Bên cạnh dự ðoán druggability, ðánh giá SMOL mục tiêu tiềm nãng gồm phân tích mặt xúc tác và/hoặc chức nãng phân tích vấn đề chọn lọc so với protein khác với điểm gắn tương tự 3.2 Thành lập thư viện sàng lọc [9]: 3.2.1 Đĩa thử nghiệm Các đĩa thử nghiệm (microplate) biết đến với nhiều tên khác microtiter plate (MTP) multiwell có nghĩa đĩa với nhiều giếng Đĩa tìm vào năm 1951 thiết bị nhỏ xếp 8x12 Đĩa đúc gồm 96 giếng thực vào năm 1963 Các đĩa sử dụng phổ biến vào cuối năm 1960s Đến năm 1990s, đĩa có nhiều định dạng hình dạng khác Năm 1996, Hiệp hội sàng lọc sinh học phân tử (SBS) đề xuất tiêu chuẩn hóa kích thước đĩa với khoảng cách từ trung tâm đến trung tâm giếng mm mỏng 96 giếng, chân bên 127,76 x 12 85.47 mm chiều cao tiêu chuẩn giếng 14,35 mm Năm 2003, Tiêu chuẩn SBS ANSI chấp thuận Các đĩa tảng cho nghiên cứu phân tích sinh học, xét nghiệm chẩn đoán lâm sàng HTS ngày Các đĩa sử dụng ngày nay: Bảng 3.1 Định dạng, kích thước thể tích sử dụng đĩa Loại đĩa Định Khoảng cách Bội số Thể tích sử dạng trung tâm (mm) 96 dụng (µL) 96 x 12 9.0 x 96 100 – 300 384 thể tích bình thường 16 x 24 4.5 x 96 – 100 384 thể tích thấp 16 x 24 4.5 x 96 – 10 1536 32 x 48 2.25 16 x 96 – 10 3456 48 x 72` 1.5 36 x 96 0.2 – Đĩa 384 giếng (thể tích bình thường) loại đĩa sử dụng phổ biến (2005) để sàng lọc dự kiến tiếp tục đến năm 2008 Tuy nhiên, đến năm 2008 sử dụng đĩa 1536 giếng 384 giếng thể tích thấp dự kiến vượt qua mỏng 96 giếng Và vào năm 2008, nhiều sáu số 10 người dùng sử dụng kết hợp đĩa 384 (thể tích bình thường) hay 384 giếng (thể tích thấp) mỏng 1536 cho thử nghiệm họ Chỉ có 5% sử dụng đĩa 3456 giếng khoảng 10% định dạng khác (chủ yếu hệ thống vi lỏng) 3.2.2 Cơ chế phân phối chất lỏng vào đĩa Hiện có bảy chế phân phối sử dụng ứng dụng sàng lọc tự động: 3.2.2.1 Air-dispalement Bơm pit tông không khí chế phân phối sử dụng phổ biến pipet Những hệ thống dựa pit tông cán piston vận hành giữ lại ống tiêm, hình trụ đầu khóa rắn với nhiều lõi Chuyển động pit tông khỏi ống tiêm làm cho chất lỏng hút vào đảo ngược hướng pít tông làm chất lỏng bị tống (phân phối) Trong hệ thống dịch chuyển khí (airdispalement) chất lỏng không chạm vào pit tông, có khoảng không khí chất lỏng pit tông Trong hệ thống bơm pit tông tích cực khoảng cách không khí pít tông chất lỏng phân phối, toàn khoảng 13 không khí phần lớn thay hệ thống chất lỏng không trộn lẫn với chất lỏng mà phân phối Cơ chế phân phối dịch chuyển khí sử dụng phần lớn 96- 384 kênh pipetters 3.2.2.2 Tool pin Tool pin dựa di chuyển giọt chất lỏng mà bám chặt vào đầu đinh ghim (pin) Diện tích bề mặt đầu xác định thể tích giọt, khoảng tương đương với thể tích di chuyển Công cụ Pin đại diện cho phương pháp phân phối tiếp xúc, đòi hỏi phải có sức căng bề mặt để loại bỏ giọt từ mũi đầu ghim Bên cạnh ghim chất rắn, có loại khác rãnh, khe ghim với lõi mao quản rổng để giữ chất lỏng mà phân phối Sự phân phối khác pin từ lâu vấn đề thường công nhận xác [Hệ số biến thiên (CV)] pin pha chế phía cao Sự thay đổi khác pin chất phủ bề mặt đầu trục pin) Công cụ pin không phù hợp với khối lượng lớn 500 nL khối lượng phân phối tối thiểu khoảng nL 3.2.2.3 Nhu động (Peristaltis pump) Bơm nhu động hoạt động theo chế liên quan đến ống nén kẹp hình trụ quay với mái chèo bề mặt cố định Khi xi lanh quay, mái chèo di chuyển dọc theo ống nén làm cho chất lỏng chạy dọc theo ống 3.2.2.4 Solenoid-syringe Trong phân phối solenoid-syringe, ống tiêm sử dụng để hút mẫu Việc hút chất lỏng xảy thông qua van mở Một vòi phun đầu dùng lần sử dụng cho van để hướng dòng điều chỉnh kích thước giọt Áp lực mở van tạo giọt chất lỏng có kích thước nanolit Kiểm soát xác thời gian mở van cho phép điều chỉnh thể tích phân phối Thông thường hệ thống bao gồm 1-8 solenoid-syringe để dẫn lưu chất lỏng Mỗi solenoid-syringe có khả phân phối cách độc lập chất lỏng / thể tích khác Solenoid- syringe chủ yếu sử dụng để phân phổi khoảng nL-50 L, thể tích phân phối xác tùy thuộc vào dung tích bơm tiêm kích thước lỗ vòi phun 3.2.2.5 Capillary Sipper Cơ chế phương pháp nhúng mảng gồm 96 384 mao quản thủy tinh polyamide vào mỏng nguồn, mao quản làm đầy 14 mao dẫn phân phối (phóng chất lỏng) vào mỏng đích cách sử dụng áp lực suất đến từ phía sau mao quản Thể tích phân phối xác định thể tích mao quản kỹ thuật sử dụng Ưu điểm kỹ thuật đơn giản; phận chuyển động bơm tiêm không pha loãng mẫu trình truyền 3.2.2.6 Piezoelectric Piezoelectric thường bao gồm ống mao quản thủy tinh hay thạch anh nối với máy áp điện Một đầu mao mạch mở kéo dài vào đầu nhỏ đầu gắn vào hệ thống chất lỏng (bơm tiêm hay hồ chứa) Khi chế áp điện kích hoạt thông qua xung điện cảm ứng sóng nén tạo giọt có kích thước nanolit từ đầu mao quản Sử dụng điện áp cụ thể cho phép phân phối điều chỉnh thể tích xác đến nanolit 3.2.2.7 Acoustic Transducer Các thiết bị phân phối theo chế phân phối không tiếp xúc (tức phóng thích giọt chất lỏng từ nguồn mà yếu tố phân phối không xâm nhập vào nguồn tiếp xúc với chất nền) Kỹ thuật tạo giọt chất lỏng phạm vi thể tích từ 0,1 pL đến mL Những ưu điểm chế không ô nhiễm chéo chất thải 15 Hình 3.3 Kỹ thuật phân phối chất lỏng [3] 3.2.3 Kỷ thuật phân phối ứng dụng xử lý chất lỏng HTS 3.2.3.1 Sự thêm vào hàng loạt thuốc thử tế bào Bổ sung số lượng lớn thuốc thử yêu cầu thử nghiệm sinh hóa tế bào có 2-5 thành phần giống với Các khoảng thể tích thử nghiệm thể tích thêm vào cho định dạng đĩa đưa bảng 3.2 Thông thường tất giếng nhận thành phần tương tự; Tuy nhiên, phân phối hàng cột chọn điều chỉnh khác 16 Bảng 3.2 Tổng thể tích thử nghiệm thể tích thêm vào loại đĩa Loại đĩa Tổng thể tích thử nghiệm Thể tích thêm vào (µL) (µL) 96 25 – 300 – 100 384 thể tích bình thường 10 – 100 – 50 384 thể tích thấp – 20 0.5 – 1536 – 10 0.5 – Hiện có loại phân phối thuốc thử số lượng lớn: (1) 96- 384 đầu dựa chế phân phối air-displacement - có khả hút phân phối vào tất giếng đĩa lúc Nếu nguồn thuốc thử cần hút đĩa (không phải hồ chứa chung), phân phối theo mô hình thuốc thử cụ thể mỏng (2) 8, 16 24 đầu dựa chế phân phối nhu động, syringesolenoid solenoid-pressure bottle Chất lỏng thường cung cấp từ hồ chứa chai đầu phân phối cố định vòi phun có đường kính phù hợp với thể tích phân phối mong muốn Chúng ta thay đổi đầu / vòi phun có dung tích khác (ví dụ thấp) Các thiết bị thường phân phối vào cột hàng thời điểm di chuyển ngang xuống mỏng Nhiều đầu nhóm lại phân phối song song với nhau, với đầu/chất lỏng phân phối riêng biệt phân phối cho thuốc thử thành phần thử nghiệm riêng biệt 3.2.3.2 Compound Reformatting phân phối Nanolite Compound Reformatting việc chuyển giao hợp chất (mẫu) từ kho thư viện mỏng Những mẫu dự trữ, hòa tan 100% DMSO, bảo quản mỏng 96 384 giếng mà thường gọi "bản mỏng mẹ" Những mỏng thử nghiệm mỏng pha loãng thường gọi "bản mỏng con" Sự phân phối thể tích thấp (