Nghiên cứu quy trình vi nhân giống lan hồ điệp mãn thiên hồng (doritaenopsip)

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH – KTNN NGUYỄN THỊ THANH THỦY NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH VI NHÂN GIỐNG LAN HỒ ĐIỆP MÃN THIÊN HỒNG (DORITAENOPSIP) KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý thực vật Hà Nội, 2016 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS TS Nguyễn Văn Mã, TS La Việt Hồng – Khoa Sinh KTNN Trường Đại học Sư phạm Hà Nội tận tình hướng dẫn, giúp đỡ suốt trình thực đề tài Tôi xin cảm ơn tới Ban Giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN trường ĐHSP Hà Nội tạo điều kiện để hoàn thành khóa luận Trong thời gian thực đề tài nhận giúp đỡ tận tình cô Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật giúp đỡ, đóng góp ý kiến để hoàn thành đề tài khóa luận, nhân xin gửi lời cảm ơn Cảm ơn gia đình bạn bè động viên, góp ý cho qua trình học tập hoàn thành đề tài Hà Nội,25 tháng 04 năm 2016 Sinh viên Nguyễn Thị Thanh Thủy LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các số liệu, kết nghiên cứu khóa luận trung thực chưa công bố Hà Nội, 25 tháng 04 năm 2016 Sinh viên Nguyễn Thị Thanh Thủy MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN LỜI CAM ĐOAN MỞ ĐẦU 1 Lí chọn đề tài Mục đích nghiên cứu Nội dung nghiên cứu Ý nghĩa đề tài NỘI DUNG CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu lan Hồ điệp 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái 1.1.3 Điều kiện sinh thái 1.2 Tình hình sản xuất lan Hồ điệp giới nước 1.2.1 Tình hình sản xuất hoa giới 1.2.2 Tình hình sản xuất hoa lan nước 1.3 Tình hình nghiên cứu lan Hồ điệp giới nước 10 1.3.1 Tình hình nghiên cứu giới 10 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 11 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 13 2.1 Thời gian địa điểm nghiên cứu 13 2.2 Vật liệu thực vật 13 2.2.1 Trang thiết bị dụng cụ 13 2.2.2 Môi trường nuôi cấy 13 2.2.3 Điều kiện nuôi cấy in vitro 13 2.3 Phương pháp nghiên cứu 14 2.3.1 Tạo vật liệu khởi đầu 14 2.3.2 Tái sinh nhân nhanh chồi in vitro lan Hồ điệp mãn thiên hồng 15 2.3.3 Ra rễ tạo in vitro hoàn chỉnh 16 2.3.4 Rèn luyện in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 17 2.4 Phân tích thống kê liệu thực nghiệm 17 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 18 3.1 Tạo vật liệu khởi đầu 18 3.2 Tái sinh nhân nhanh chồi in vitro lan Hồ điệp mãn thiên hồng 20 3.2.1 Tái sinh nhân nhanh chồi in vitro từ mảnh 20 3.2.2 Nhân nhanh chồi lan Hồ điệp mãn thiên hồng in vitro từ đốt thân 22 3.3 Ra rễ tạo lan Hồ điệp mãn thiên hồng in vitro hoàn chỉnh 24 3.4 Rèn luyện in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 26 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO 30 PHỤ LỤC 34 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 3.1 Kết tạo vật liệu khởi đầu từ cành hoa 18 Bảng 3.2 Ảnh hưởng BAP NAA đến trình tái sinh 20 nhân nhanh chồi bất định từ mô 20 Bảng 3.3 Ảnh hưởng BAP đến trình nhân nhanh chồi in vitro 22 từ đốt thân lan Hồ điệp mãn thiên hồng sau tuần nuôi cấy 22 Bảng 3.4 Ảnh hưởng BAP nước dừa đến trình nhân nhanh chồi in vitro từ đốt thân lan Hồ điệp mãn thiên hồng sau tuần nuôi cấy 23 Bảng 3.5 Ảnh hưởng NAA đến rễ tạo hoàn chỉnh lan Hồ Điệp in vitro sau tuần nuôi cấy 25 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 3.1 Tạo vật liệu khởi đầu 19 Hình 3.2 Quá trình tạo mô sẹo hình thành chồi từ mô 21 Hình 3.3 Nhân nhanh chồi in vitro lan Hồ điệp mãn thiên hồng từ đốt thân 24 Hình 3.4 Cây lan Hồ điệp in vitro rễ 26 Hình 3.5 Hình ảnh rèn luyện lan Hồ điệp mãn thiên hồng 26 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT NAA: Napthlacetic acid BAP: 6-Benzyl amino purin MS: Murashige Skoog Nxb: Nhà xuất Tp.HCM: Thành phố Hồ Chí Minh MỞ ĐẦU Lí chọn đề tài Hoa lan, họ thực vật có hoa đa dang nhất, bao gồm 25000 loài 800 chi xác định [40] Chiếm 8% thương mại hoa giới [28] Nó không đòi hỏi diện tích trồng lớn lại cho giá trị kinh tế cao Lan hồ điệp (Phalaenopsis) thuộc họ Orchidaceae, giống lan yêu thích giới [29] Chính màu sắc đa dạng, kiểu dáng khác lạ tạo nét đẹp sang trọng trang nhã cho hoa lan đặc biệt bền bỉ lâu tàn đặc trưng hoa lan tôn thêm giá trị cho loài hoa quý Lan hồ điệp (Phalaenopsis) đem lại hiệu kinh tế cao dạng hoa cắt cành trồng chậu [37] Có nhiều nước khu vực thành công với công nghệ trồng hoa lan Hồ điệp (Phalaenopsis) xuất như: Thái Lan, Đài Loan, Trung Quốc [7] Theo thống kê trung tâm nghiên cứu hoa, cảnh – Viện Nghiên cứu Rau quả, năm 2008 trở quy mô sản xuất lan Hồ điệp thương mại tăng lên đáng kể tăng dần qua năm diện tích, số lượng, mức độ đầu tư: Diện tích toàn miền bắc trước năm 2005 1.200m2 23.000 cây, năm 2012 diện tích toàn miền bắc tăng lên 24.100m2 333.000 Tuy lượng cung không đủ cầu phải nhập 230.000 từ Trung Quốc Đài loan Nhu cầu giống lan thương mại Việt Nam cao thực tế phương thức sản xuất hoa lan Hồ Điệp miền Bắc Việt Nam chủ yếu hình thức nhập con, nhỡ có cành hoa chờ hoa nở để tiêu thụ Như việc sản xuất giống Việt Nam hạn chế, không chủ động nguồn giống sản xuất số lượng chủng loại Lan hồ điệp đơn thân, việc nhân giống tự nhiên gặp nhiều khó khăn Để sản xuất lan Hồ điệp theo quy mô công nghiệp, bắt buộc phải nhân giống đường vô tính thông qua nuôi cấy mô Trên giới có nhiều tác giả thành công nhân giống vô tính lan Hồ điệp Trước đây, nghiên cứu thường tập trung vào lai tạo giống mới, số lượng kích thước hoa, có 100.000 giống lai sản xuất công nghiệp bao gồm lan Hồ điệp mãn thiên hồng (Doritaenopsip Queen Beer “ Red Sky” giống lai Doritis pulcherrima Phalaenopsis Meteor [36] Lan Hồ điệp mãn thiên hồng loài đánh giá cao sắc đẹp lẫn thời gian chơi hoa Cây phong lan Mãn thiên hồng (Doritaenopsis sp.) loài có giá trị kinh tế cao nước lẫn nước [32] Tuy nhiên, giống lan Hồ điệp lai thường khó nhân giống vô tính không đồng [37] Các phương pháp in vitro số loài thuộc chi thường sử dụng mẫu đỉnh chồi [31], cành hoa cắt đốt [39], đầu rễ [41], mảnh [32], nuôi cấy lớp tế bào biểu bì [37], hoa [45] nhằm cung cấp lượng giống cho thị trường Sử dụng mảnh có nguồn gốc từ tái sinh từ cành hoa không gây ảnh hưởng đến mẹ [38], [42] Vì tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu quy trình vi nhân giống lan Hồ điệp mãn thiên hồng (Doritaenopsip)” Mục đích nghiên cứu Nhân nhanh lan Hồ điệp mãn thiên hồng in vitro từ mảnh đốt thân bắt nguồn từ cành hoa Nội dung nghiên cứu - Tạo vật liệu khởi dầu lan Hồ điệp mãn thiên hồng - Tái sinh nhân nhanh chồi in vitro từ mô - Nhân nhanh chồi lan Hồ điệp mãn thiên hồng in vitro từ đốt thân - Ra rễ tạo lan Hồ điệp mãn thiên hồng in vitro hoàn chỉnh - Rèn luyện in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên 3.2.2 Nhân nhanh chồi lan Hồ điệp mãn thiên hồng in vitro từ đốt thân Các nghiên cứu thường thực tạo chồi in vitro thông qua hình thành PLB Tuy nhiên, PLB có xu hướng sinh trưởng phát triển chậm so với chồi phát sinh trực tiếp (Wagner et al, 2007) Ảnh hưởng BAP Kết nghiên cứu ảnh hưởng BAP đến trình nhân nhanh chồi in vitro từ đốt thân lan Hồ điệp thể bảng 3.3 Bảng 3.3 Ảnh hưởng BAP đến trình nhân nhanh chồi in vitro từ đốt thân lan Hồ điệp mãn thiên hồng sau tuần nuôi cấy CT Số chồi/mẫu Số lá/thân Chiều cao T1 2,00a 4,25a (cm) 2,13b T2 2,25a 3.25a 0,93a T3 6,75b 2,00b 0,75a T4 4,00a 4,00a 1,37ab LSD 2.33 1,04 0,85 Trong cột, chữ số khác thể khác biệt có ý nghĩa thống kê với α=0,05 Kết cho thấy, BAP có ảnh hưởng rõ rệt đến trình nhân nhanh chồi in vitro Trong hiệu môi trường nuôi cấy T3 (8 mg/l BAP) sau tuần nuôi cấy xuất chồi sau tuần nuôi cấy cho hệ số chồi cao 6,75 (hình 3.3B) Tuy nhiên, chiều cao chồi tái sinh lại thấp nhất, đạt 0,75 (cm) Chiều cao gây khó khăn cho trình thao tác nuôi cấy Đối với môi trường T1 (2,5 mg/l BAP), T2 (5mg/l BAP), số chồi/mẫu thấp hơn, 2,00 2,25 (hình 3.3) có số lá/thân (4,25 lá/thân, 2,13 cm) cao so với chồi nuôi môi trường T3 (2,00) 22 Ảnh hưởng BAP kết hợp nước dừa Nước dừa sử dụng rộng rãi nuôi cấy mô, ảnh hưởng tới sinh trưởng đặc trưng khác sinh trưởng (Baque et al, 2011) Nước dừa nguồn dinh dưỡng dồi cung cấp nguồn đạm (từ nhiều loại axit amin, axit hữu cơ), cacbonhydat (glucoza, fructoza, sucrose) Ngoài nước dừa chứa số chất điều hòa sinh trưởng, biết đến zenatin (Arditti, 1992) Hiệu nước dừa trình tái sinh chồi in vitro thường tăng cường môi trường có bổ sung cytokinin Trong nghiên cứu này, nước dừa 10% bổ sung vào môi trường chứa BAP (2,5; 5,0; 8,0; 10,0 mg/l) Kết thể bảng 3.4 Bảng 3.4 Ảnh hưởng BAP nước dừa đến trình nhân nhanh chồi in vitro từ đốt thân lan Hồ điệp mãn thiên hồng sau tuần nuôi cấy CT Số chồi/mẫu Số lá/thân a 5,00 b Chiều cao (cm) 2,25b T1 3,00 T2 3,75a 2,75a 1,30a T3 9,00b 2,50a 0,92a T4 6,5c 4,00c 1,50ab LSD 1,24 0,86 0,92 Trong cột, chữ số khác thể khác biệt có ý nghĩa thống kê với α=0,05 Phân tích bảng 3.4 cho thấy môi trường T3 (8 mg/l BAP + 10% nước dừa), cho số chồi hình thành nhiều (9,00 chồi) (hình 3.3C), nhiên chiều cao chồi lại thấp (0,92 cm) so với công thức lại Trong đó, môi 23 trường T1 (10mg/l BAP + 10% nước dừa) cho số chồi/mẫu thấp đạt chồi/mẫu chiều cao chồi đạt 2,25 cm Chiều cao chồi in vitro công thức T4 giúp thao tác nuôi cấy trở nên thuận lợi so với công thức lại Vậy bổ sung nước dừa 10% vào môi trường nuôi cấy làm tăng khả hình thành chồi, phát triển chiều cao so với môi trường không bổ sung nước dừa Điều phù hợp với nghiên cứu Parisa (2014) Nguyễn Thị Sơn cộng (2014) Hình 3.3 Nhân nhanh chồi in vitro lan Hồ điệp mãn thiên hồng từ đốt thân A: nhân nhanh chồi công thức BAP 2,5mg/l; B: nhân nhanh chồi công thức BAP 8mg/l; C: nhân nhanh chồi công thức BAP 8mg/l +10% nước dừa 3.3 Ra rễ tạo lan Hồ điệp mãn thiên hồng in vitro hoàn chỉnh Ra rễ tạo hoàn chỉnh giai đoạn cuối nuôi cấy mô Rễ phận quan trọng Nó có tác dụng hút nước, muối khoáng chất dinh dưỡng cung cấp cho sinh trưởng phát triển Do đó, việc tạo in vitro hoàn chỉnh ta phải quan tâm đến rễ cây, tìm môi trường có bổ sung nồng độ chất điều hòa sinh trưởng thích hợp cho tạo phát triển rễ 24 Theo Phillips Chilton (1991), cytokinin có chức kích thích phát triển chồi bên, auxin có vai trò pha kéo dài tế bào Một vài tác giả cho việc bổ sung NAA ức chế khả kích thích tái sinh mầm ngủ (Arditti Ernst, 1993), số khác lại cho việc phối hợp NAA BAP kích thích tạo chồi (Tokuhara Mii, 1993; Tisserat Jones, 1999; Roy Banerjee, 2003; Phillips Chilton, 1991) Tỉ lệ nồng độ auxin cytokinin khác kích thích thành lập mô khác (mô sẹo, rễ, chồi) Trong nghiên cứu này, sử dụng NAA với nồng độ khác đến khả rễ Bảng 3.5 Ảnh hưởng NAA đến rễ tạo hoàn chỉnh lan Hồ Điệp in vitro sau tuần nuôi cấy Công thức NAA (mg/l) Chiều dài (cm) ĐC 0,0 - R1 0,5 1,00 R2 1,0 2,00 R3 1,5 1,50 R4 2,0 - Kết bảng 3.5 cho thấy môi trường bổ sung NAA 1,0 mg/l có hiệu tạo rễ cho chồi in vitro với chiều dài rễ 2,0 cm, có màu xanh, tròn to (hình 3.4 R2) Đối với công thức R1, R3 chiều dài rễ ngắn hơn, kích thước bé số lượng rễ nhiều so với R2 2; rễ/ (hình 3.4 R1,R3) Cây không hình thành rễ công thức đối chứng ½ MSo công thức R4 (2mg/l NAA) Như không bổ sung chất điều hòa sinh trưởng bổ sung với nồng độ cao ức chế rễ 25 Hình 3.4 Cây lan Hồ điệp in vitro rễ 3.4 Rèn luyện in vitro thích nghi với điều kiện tự nhiên Rèn luyện tự nhiên giai đoạn đưa in vitro đảm bảo tiêu chuẩn rễ, thân, thích nghi dần với điều kiện tự nhiên Ở giai đoạn này, cần có loại giá thể chế độ chăm sóc phù hợp Vì phòng thí nghiệm có điều kiện nhiệt độ, ánh sáng, môi trường thích hợp cho phát triển Việc đưa in vitro từ phòng thí nghiệm điều kiện tự nhiên công việc quan trọng Cho khỏi bình nuôi cấy, rửa thạch để không bị nhiễm nấm mốc khuẩn gây ảnh hưởng cho phát triển Cây trồng giá thể xơ dừa sấy khô cho mầm bệnh, xơ dừa + than, than (hình 3.5) Hình 3.5 Hình ảnh rèn luyện lan Hồ điệp mãn thiên hồng 26 Để phòng với nhiệt độ thích hợp 22 - 25oC từ - 10 ngày có che phủ nilon cho thích nghi dần với điều kiện bên Tưới bình tưới dạng phun sương với dung dịch 1/10 MS lít nước, - lần/ ngày, sau đưa môi trường tự nhiên Sau tuần theo dõi giá thể than cho sức sống cao đạt 95% so với công thức khác cho tỷ lệ sống với 80 - 85% 27 SƠ ĐỒ TỔNG QUÁT QUÁ TRÌNH NHÂN GIỐNG LAN HỒ ĐIỆP MÃN THIÊN HỒNG Cành hoa lan Hồ điệp mãn thiên hồng Chồi tái sinh (sau 8-10 tuần tuổi) Đốt thân Lá Tái sinh nhân nhanh chồi in vitro lan Hồ điệp mãn thiên hồng Ra rễ tạo in vitro hoàn chỉnh Rèn luyện thích nghi với điều kiện tự nhiên 28 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Các kết thu cho thấy: - Tạo vật liệu khởi đầu công thức xử lý sơ + Javen 10% phút cho khả khử trùng tốt - Ở môi trường ½ MS có bổ sung BAP 10 mg/l NAA mg/l thích hợp cho việc tái sinh nhân nhanh chồi bất định từ mô - Khả nhân nhanh chồi từ đốt thân lan Hồ điệp mãn thiên hồng phù hợp nồng độ BAP 8mg/l nước dừa có bổ sung nước dừa - Ở nồng độ NAA 1mg/l lan Hồ điệp mãn thiên hồng có khả rễ tốt tạo in vitro hoàn chỉnh - Cây rèn luyện trồng giá thể than cho khả thích nghi cao so với hai giá thể lại xơ dừa, than + xơ dừa KIẾN NGHỊ - Sử dụng hóa chất khác để tìm phương pháp khử trùng mẫu tốt cho tỉ lệ sống cao - Sử dụng phận khác lan Hồ điệp mãn thiên hồng để làm vật liệu nghiên cứu - Kết hợp BAP với chất điều hòa sinh trưởng khác để tìm môi trường tạo PLB khả nhân nhanh cho hệ số chất lượng chồi tốt - Nghiên cứu giai đoạn sau nuôi cấy in vitro giai đoạn vườn ươm với giá thể khác để biết khả sinh trưởng loại giá thể 29 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt [1] Phạm Hoàng Hộ (2001), Cây cỏ Việt Nam, 3, trang 960 – 962, Nxb Trẻ, Tp HCM [2] Phan Thúc Huân (2005), Hoa lan cảnh vấn đề sản xuất kinh doanh xuất khẩu, NXB Phương Đông [3] Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lý học thực vật, Nxb Đại học Quốc Gia Hà Nội [4] Võ Thị Bạch Mai (1996), Nhân giống vô tính số loài lan Hồ Điệp (Phalaenopsis sp.), Luận Án Phó Tiến Sĩ, Đại Học Quốc Gia Tp HCMTrường Đại học Khoa học Tự Nhiên [5] Nguyễn Công Nghiệp (2000), Trồng hoa lan, NXB Trẻ, tr 17 – 268 [6] Cung Hoàng Phi Phượng, Nguyễn Văn Hiếu, Nguyễn Quốc Thiện, Dương Hoa Xô Bước đầu ứng dụng hệ thống nuôi cấy ngập chìm tạm thời giống lan Hồ Điệp lai – Phalaenopsis hybrid Trung tâm công nghệ sinh học TP Hồ Chí Minh, 2007 [7] Nguyễn Thị Sơn cộng (2014), Nhân dòng vô tính lan Hồ điệp Phalaenopsis sogo yukidyan, Tạp chí Khoa học Phát triển 2014, tập 12, số 8: 1283-1293 [8] Hoàng Ngọc Thuận (2005), Nghiên cứu phát triển nghề trồng hoa việt nam Ý kiến tham luận hội thảo khoa học liên ngành nông lâm ngư y học trang 1-4 [9] Bùi Trang Việt (2000), Sinh lý thực vật đại cương, Đại học Quốc Gia Thành phố Hồ Chí Minh [10] Ngô Quang Vũ, Hoa cảnh, NXB thành phố Hồ Chí Minh 30 Tài liệu tiếng Anh [24] Arditti, (1992), Fundamentals of orchid biology – John wiley and sons Inc., New Yord, USA [25] Arditti, J., Earnst R, (1993), Micropropagation of orchids, New York: Wiley :467–520 [26] Chen, W.S., Liu, H.Y., Liu, Z.H., Yang, L., Chen, W.H, (1994), Gibberellin and temperature influence carbohydrate content and flowering in Phalaenopsis Physiol Plant 90:391–395 [27] Chou, C.C., Chen, W.S., Huang, K.L., Yu, H.C., Liao, L.J, (2000), Changes in cytokinin level of Phalaenopsis leaves at high temperature Plant Physiol Biochem 38:309–314 [28] Chugh S, Guha S, Rao IU, (2009), Micropropagation of or- chids: A review on the potential of different explants Scien- tia Horticulturae 122(4):507-520 [29] Griesbach, R J., 2002, Development of Phalaenopsis orchids for the Mass-Market p: 458-463 [30] Hackett W P et al, (1973), Adventitiousbud formation on Phalaenopsip nodes as a propagation method Univ Calif Ext Serv Flower Rep March 4-5 [31] Intuwong O, Sagawa Y, (1974) Clonal propagation of Phalaenopsis by shoot tip culture Am Orchid Soc Bull 43:893-889 [32] Kano K, (1971), The possibility of vegetative propagation by leaf segment culture in Phalaenopsis and Vanda Abstr Jpn Soc Hortic Sci Autumn Meet, 270-271 [33] K Thammasiri, 2015, Corrent status of Orchid production in ThaiLand ISHS Acta Horticulturae 1078 II International Orchid Symposium 31 [34] Lee, N., Lee, J.H, (1996), Changes in carbohydrates in Phalaenopsis flower induction and inflorescence development J Chinese Soc Hort Sci 42:262–275 [35] Murashige T and Skoog F, (1962), “A revised medium for rupid growth and bioassays with tobacco tissue culture”, Physiol Plant 15: 473 – 479 [36] Park S.Y, Murthy H.N, Paek K.Y., (2003), Protocorm-like body induction and subsequent plant regeneration from root tips cultures of Doritaenopsis Plant Sci 164:919-923 [37] Park S.Y, Yeung E.C, Chakrabarty D, Paek K.Y, (2002), An efficient direct induction of protocorm-like bodies from leaf subepidermal cells of Doritaenopsis hybrid using thin-section culture, Plant Cell Rep 21:46-51 [38] Park S.Y, Murthy H.N, Hahn E.J, Paek K.Y, (2000), In vitro seed germination of Calanthe sieboldi, an endangered orchid species J Plant Biol 43:158-161 [39] Reisinger DM, Ball EA, Arditti J, (1976), Clonal propagation of Phalaenopsis by means of flower-stalk node cultures Orchid Rev 84:45–52 [40] Samira Samarfard, Mihdzar A Karid, Saleh B Kadzimin, Seyedali Favanfar, Halimi M Saud, (2013), Genetic Stability of In vitro Multiplied Phalaenopsis gigantea Protocorm-like Bodies as Affected by Chitosan, Not Bot Horti Agrobo, 2013, 41(1):177-183 [41] Tanaka M, Senda Y, Hasegawa A, (1976), Plantlet formation by root-tip culture in Phalaenopsis Am Orchid Soc Bull 45:1022-1024 [42] Tanaka M, (1992), Micropropagation of Phalaenopsis spp In: Bajaj YPS (ed) High-tech and micropropagation Biotechnology in agriculture and forestry, 20:246-268 32 [43] Tokuhara, K and M Mii, 1993, Micropropagation of Phalaenopsis and Doritaenopsis by cultur- ing shoot tips of flower stalk buds Plant Cell Rep 13:7–11 [44] Tse et al, 1971, Adventitious shoot formation on Phalaenopsis nodes, Am Orchirds Soc Bull 40: 807-810 [45] Wagner WA Maguire I, Carvalho VS, (2007), In vitro propagation and plantlet regeneration from Doritaenopsis purple gem ‘Ching Hua’ flower explants Hortscienc 42(5):1256-1258 33 PHỤ LỤC Môi trường nuôi cấy Môi trường sử dụng nuôi cấy MS cải tiến (Murashige Skoog, 1962): Thành phần Khoáng đa lượng Khoáng vi lượng Sắt EDTA Vitamin Nồng độ (mg/l) NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 MnSO4.4H2O 23,3 ZnSO4.7H2O 8,6 H3PO3 6,2 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Na2.EDTA 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 Myo-Inositol 100 Thiamin (B1) 0,5 Nicotinic acid 0,5 Pyridoxine (B6) 0,5 Glycine Các chất điều hòa sinh trưởng thực vật sử dụng: BAP, NAA (mg/l) 34 Các thành phần khác: Đường sucrose: 30 g/l Agar: g/l Môi trường điều chỉnh pH=5,8 ± 0,05 (bằng NaOH 1N HCl 1N) trước hấp khử trùng nồi hấp khử trùng 117oC, 1atm 15 phút (đối với dụng cụ thí nghiệm, dụng cụ thủy tinh không chứa môi trường khử trùng 121oC, 1atm 15 phút) 35 Một số hình ảnh làm thí nghiệm Hình 1: Thao tác trình nuôi cấy Hình 2: Thao tác bốc cấy vô trùng 36 ... sinh nhân nhanh chồi in vitro lan Hồ điệp mãn thiên hồng 3.2.1 Tái sinh nhân nhanh chồi in vitro từ mảnh Lan Hồ điệp mãn thiên hồng loại lan đơn thân, nhân giống phương pháp sử dụng đỉnh chồi nhân. .. lan Hồ điệp mãn thiên hồng - Tái sinh nhân nhanh chồi in vitro từ mô - Nhân nhanh chồi lan Hồ điệp mãn thiên hồng in vitro từ đốt thân - Ra rễ tạo lan Hồ điệp mãn thiên hồng in vitro hoàn chỉnh... chồi in vitro lan Hồ điệp mãn thiên hồng 20 3.2.1 Tái sinh nhân nhanh chồi in vitro từ mảnh 20 3.2.2 Nhân nhanh chồi lan Hồ điệp mãn thiên hồng in vitro từ đốt thân 22 3.3 Ra rễ tạo lan