Tìm hiểu ảnh hưởng của ba và naa lên sự tạo chồi và rễ trong nuôi cấy in-vitro cây cẩm chướng dianthus telstar purple picotee

Header Page of 166 ĐẠI HỌC QUỐC GIA TP.HCM TRƯỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN VŨ THỊ NHẪM TÌM HIỂU ẢNH HƯỞNG CỦA BA VÀ NAA LÊN SỰ TẠO CHỒI VÀ RỄ TRONG NUÔI CẤY IN-VITRO CÂY CẨM CHƯỚNG DIANTHUS ‘TELSTAR PURPLE PICOTEE’ Chuyên ngành: Sinh lý thực vật Mã số: 60 42 30 LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: TS NGUYỄN DU SANH Tp HCM, năm 2011 Footer Page of 166 Header Page of 166 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, với lòng biết ơn sâu sắc em xin gởi lời cảm ơn chân thành đến: • Cố GS TS Mai Trần Ngọc Tiếng, người thầy sáng lập nên Bộ môn Sinh lý Thực vật cho em có hội học tập chuyên ngành • Thầy TS Nguyễn Du Sanh, người tận tình hướng dẫn, truyền đạt cho em kiến thức kinh nghiệm vô quý báu, quan tâm, động viên, giúp đỡ em suốt thời gian học tập làm luận văn • Thầy PGS TS Bùi Trang Việt, cô PGS TS Võ Thị Bạch Mai, cô PGS TS Trương Thị Đẹp, thầy PGS.TS Nguyễn Minh Châu, cô PGS.TS Nguyễn thị Quỳnh, thầy TS Nguyễn Hữu Hổ, cô TS Lê Thị Thủy Tiên giảng dạy cho em kiến thức quý báu • Qúy thầy cô Bộ môn Sinh lý Thực vật: cô TS Trần Thanh Hương, thầy Th.s Phan Ngô Hoang, thầy Th.s Đỗ Thường Kiệt, cô Th.s Trịnh Cẩm Tú, cô Th.s Trần Thị Thanh Hiền dẫn, tạo điều kiện thuận lợi cho em trình học tập làm luận văn • Các bạn học cao học khóa 19 bên cạnh, chia sẻ, giúp đỡ thời gian học tập làm luận văn Cảm ơn em Phước giúp đỡ thời gian thực luận văn • Cảm ơn anh chị Trạm thực nghiệm Huấn luyện & Thực nghiệm Nông nghiệp-Trung tâm Khuyến nông Tp HCM tạo điều kiện thuận lợi giúp đỡ thời gian học tập làm luận văn • Con xin cảm ơn cha mẹ gia đình động viên, tạo điều kiện tốt cho học tập hoàn thành luận văn Xin chân thành cảm ơn Tp Hồ Chí Minh, tháng 11 năm 2011 Vũ Thị Nhẫm Footer Page of 166 Header Page of 166 MỤC LỤC Trang CÁC CHỮ VIẾT TẮT v DANH MỤC CÁC BẢNG vi DANH MỤC CÁC HÌNH viii DANH MỤC CÁC ẢNH ix MỞ ĐẦU CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ 1.1.1 Vị trí phân loại 1.1.2 Đặc điểm hình thái phân bố 1.1.3 Một số kết nghiên cứu cẩm chướng Dianthus 1.2 Sự phát sinh hình thái thực vật 1.2.1 Định nghĩa 1.2.2 Phát sinh quan trực tiếp 1.2.2.1 Sự hình thành chồi chồi nách 1.2.2.2 Sự hình thành chồi bất định 1.2.2.3 Sự hình thành rễ bất định 1.2.3 Phát sinh quan gián tiếp 1.2.3.1 Sự tạo mô sẹo 1.2.3.2 Sự hình thành chồi rễ gián tiếp 1.2.2 Vai trò chất điều hòa sinh trưởng thực vật 10 1.2.2.1 Auxin 10 1.2.2.2 Cytokinin 12 1.2.2.3 Sự tương tác auxin cytokinin 13 1.2.2.4 Giberelin 15 1.2.2.5 Acid abscisic 16 1.2.2.6 Etylen 17 1.2.2.7 Nước dừa 18 Footer Page of 166 Header Page of 166 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 19 2.1 Vật liệu 19 2.1.1.Vật liệu nuôi cấy 19 2.1.2.Vật liệu làm sinh trắc nghiệm 20 2.1.3 Điều kiện thí nghiệm 20 2.2 Phương pháp 20 2.2.1 Khử trùng hột 20 2.2.2 Khảo sát tạo mô sẹo 21 2.2.3 Khảo sát tạo chồi 22 3.2.3.1 Tạo chồi từ mô sẹo 22 3.2.3.2 Tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ 23 3.2.3.3 Tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi đỉnh 24 2.2.4 Khảo sát tạo rễ 25 2.2.4.1 Tạo rễ từ mô sẹo 25 2.2.4.2 Tạo rễ từ 25 2.2.4.3 Tạo rễ từ chồi in-vitro 25 2.2.5 Đưa vườn ươm 26 2.2.6 Quan sát hình thái giải phẫu 26 2.2.7 Đo cường độ hô hấp hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh 26 2.2.8 Xử lý thống kê 28 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết 30 3.1.1 Khử trùng hột 30 3.1.2 Khảo sát tạo mô sẹo 30 3.1.2.1 Tạo mô sẹo từ 30 3.1.2.2 Tạo mô sẹo từ mầm 34 3.1.2.3 Tạo mô sẹo từ khúc cắt trụ hạ diệp 36 Footer Page of 166 Header Page of 166 3.1.3 Khảo sát tạo chồi 37 3.1.3.1 Tạo chồi từ mô sẹo 37 3.1.3.2 Tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ 39 3.1.3.3 Tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi đỉnh 44 3.1.4 Khảo sát tạo rễ 46 3.1.4.1 Tạo rễ từ mô sẹo 46 3.1.4.2 Tạo rễ từ 47 3.1.4.3 Tạo rễ từ chồi in-vitro 49 3.1.5 Đưa vườn ươm 50 3.1.6 Quan sát hình thái giải phẫu 51 3.1.6.1 Quan sát hình thái giải phẫu trình tạo mô sẹo từ 51 3.1.6.2 Quan sát hình thái giải phẫu trình tái sinh chồi từ mô sẹo 52 3.1.6.3 Quan sát hình thái giải phẫu trình tạo rễ từ mô sẹo 53 3.1.6.4 Quan sát hình thái giải phẫu trình tạo rễ trực tiếp từ 53 3.1.6.5 Quan sát hình thái giải phẫu tạo rễ trực tiếp từ chồi in-vitro 55 3.1.7 Cường độ hô hấp hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh 56 3.1.7.1 Cường độ hô hấp hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh hình thành mô sẹo 56 3.1.7.2 Cường độ hô hấp hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh hình thành chồi từ mô sẹo 56 3.1.7.3 Cường độ hô hấp hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh tạo rễ từ mô sẹo 57 Footer Page of 166 Header Page of 166 3.2 THẢO LUẬN 59 3.2.1 Sự thay đổi hình thái sinh lý hình thành mô sẹo cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ 59 3.2.2 Sự thay đổi hình thái sinh lý tạo chồi cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ 63 3.2.3 Sự thay đổi hình thái sinh lý tạo rễ cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ 66 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 69 4.1 KẾT LUẬN 69 4.2 ĐỀ NGHỊ 69 Footer Page of 166 Header Page of 166 CÁC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 1,4-Dichlorophenoxy-acetic acid ABA : Abcisic acid BA : Benzyl adenin GA3 : Acid giberelic IAA : Indol-3-acetic acid IBA : Indol butyric acid MS : Murashige & Skoog NAA : α-naphthalen acetic acid TLT : Trọng lượng tươi cs : Cộng ND : Nước dừa Footer Page of 166 Header Page of 166 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Các môi trường khảo sát ảnh hưởng NAA BA lên khả tạo mô sẹo lá, mầm, khúc cắt trụ hạ diệp mầm cẩm chướng in-vitro tuần tuổi 21 Bảng 2.2 Các môi trường khảo sát ảnh hưởng BA lên khả tái sinh chồi từ mô sẹo tuần tuổi 22 Bảng 2.3 Các môi trường khảo sát ảnh hưởng NAA BA lên khả tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ 23 Bảng 2.4 Các môi trường khảo sát ảnh hưởng NAA BA lên khả tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi đỉnh 24 Bảng 2.5 Các môi trường khảo sát ảnh hưởng NAA lên khả tạo rễ từ mô sẹo tuần tuổi 25 Bảng 3.1 Kết khử trùng hột với Javel nồng độ khác 30 Bảng 3.2 Ảnh hưởng BA NAA lên thay đổi hình thái mẫu cấy cẩm chướng môi trường tạo mô sẹo khác theo thời gian nuôi cấy 31 Bảng 3.3: Ảnh hưởng BA NAA lên thay đổi hình thái mẫu cấy mầm cẩm chướng môi trường tạo mô sẹo khác theo thời gian nuôi cấy 34 Bảng 3.4: Ảnh hưởng BA lên khả tái sinh chồi từ mô sẹo tuần tuổi môi trường khác sau tuần nuôi cấy 37 Bảng 3.5: Ảnh hưởng BA NAA lên thay đổi hình thái khúc cắt thân mang chồi ngủ theo thời gian nuôi cấy 39 Bảng 3.6 Ảnh hưởng NAA BA lên tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ sau tuần nuôi cấy 43 Bảng 3.7 Ảnh hưởng NAA BA lên tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi đỉnh sau tuần nuôi cấy 44 Footer Page of 166 Header Page of 166 Bảng 3.8 Ảnh hưởng NAA lên tạo rễ từ mô sẹo tuần tuổi môi trường khác sau tuần nuôi cấy 46 Bảng 3.9 Ảnh hưởng NAA lên tạo rễ từ môi trường khác sau tuần nuôi cấy 47 Bảng 3.10 Ảnh hưởng NAA lên tạo rễ từ chồi in-vitro môi trường khác sau tuần nuôi cấy 49 Bảng 3.11 Cường độ hô hấp hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh hình thành mô sẹo môi trường MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA mg/l +15% ND (B4) theo thời gian 56 Bảng 3.12 Cường độ hô hấp hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật mô sẹo tuần tuổi môi trường tạo chồi MS½ + BA 1,5 mg/l +15% ND (A3) sau tuần nuôi cấy 57 Bảng 3.12 Cường độ hô hấp hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật mô sẹo tuần tuổi môi trường tạo rễ MS½+ NAA 0,2 mg/l (R2) sau tuần nuôi cấy 58 Footer Page of 166 Header Page 10 of 166 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Sự tương tác auxin cytokinin phát sinh hình thái 14 Hình : Sơ đồ ly trích chất điều hòa sinh trưởng thực vật 29 Hình 3: Sơ đồ nhân giống in-vitro cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ 68 Footer Page 10 of 166 Header Page 71 of 166 59 3.2.THẢO LUẬN 3.2.1 Sự thay đổi hình thái sinh lý hình thành mô sẹo cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ Để tạo mô sẹo nuôi cấy in-vitro, thường phải sử dụng chất kích thích sinh trưởng thực vật bổ sung vào môi trường nuôi cấy, quan trọng auxin cytokinin Tỷ lệ auxin/cytokinin thích hợp kích thích tạo mô sẹo tùy thuộc vào đối tượng thực vật nguồn gốc mẫu cấy Ở đơn tử diệp, thường sử dụng auxin nồng độ cao để tạo mô sẹo, không cần thiết phải bổ sung cytokinin, song tử diệp, để tạo mô sẹo thường sử dụng auxin kết hợp với cytokinin tỷ lệ thích hợp (Machakova cs, 2008) Với đối tượng cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ hai mầm, để tạo mô sẹo nuôi cấy in-vitro cần phải bổ sung vào môi trường nuôi cấy auxin cytokinin tỷ lệ thích hợp • Tạo mô sẹo từ cẩm chướng in-vitro tuần tuổi Mẫu cấy nuôi môi trường có nồng độ NAA 0,1mg/l kết hợp với BA nồng độ khác từ 0,5 mg/l đến 1,5 mg/l (môi trường B1, B2, B3) có hình thành mô sẹo kèm theo hình thành rễ (ảnh 3B1, 3B2, 3B3), tăng nồng độ BA lên 2mg/l môi trường MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA mg/l +15% ND (B4) mẫu cấy hình thành mô sẹo (ảnh 3B4) Từ kết thực nghiệm tạo mô sẹo từ cho thấy tỷ lệ auxin/cytokinin môi trường nuôi cấy ảnh hưởng đến phát sinh hình thái mẫu cấy, điều môi trường nuôi cấy có nồng độ NAA 0,1 mg/l không thay đổi BA thay đổi nồng độ khác nhau, BA có nồng độ khác mẫu cấy hấp thu khác làm thay đổi hàm lượng cytokinin nội sinh mẫu cấy, dẫn đến làm cân tỷ lệ auxin/cytokinin làm cho hình thái mẫu cấy thay đổi khác môi trường, thay đổi nồng độ BA từ 0,5 mg/l đến 1,5 mg/l có lẽ chưa đủ để ức chế hình thành rễ trình tạo mô sẹo mẫu cấy nên mẫu cấy vừa tạo mô sẹo vừa tạo rễ, tăng nồng độ BA lên mg/l có lẽ đủ để ức chế hình thành rễ đạt cân nội sinh cho hình thành mô sẹo, môi Footer Page 71 of 166 Header Page 72 of 166 60 trường MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA mg/l +15% ND (B4) hình thành mô sẹo mà không kèm theo hình thành rễ, có lẽ môi trường có tỷ lệ auxin/cytokinin thích hợp cho hình thành mô sẹo mẫu cấy Khi đo hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh cường độ hô hấp mẫu cấy theo thời gian (bảng 3.11) nhận thấy hoạt tính auxin mẫu ban đầu cao nhiều so với cytokinin, mẫu cấy hình thành mô sẹo đồng thời dễ hình thành rễ kèm theo nồng độ cytokinin (BA) bổ sung vào môi trường nuôi cấy không đủ để ức chế hình thành rễ Sau tuần nuôi cấy môi trường B4, giải phẫu giai đoạn thấy tế bào nhu mô gia tăng kích thước mạnh (ảnh 11A), gia tăng kích thước tế bào nhu mô tác động chủ yếu auxin; auxin tác động làm dãn vách tế bào đồng thời huy động nguyên liệu đến tế bào, làm tăng áp suất thẫm thấu đồng thời cảm ứng enzym tổng hợp vách làm tế bào tăng kích thước Thật vậy, đo hoạt tính chật điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh mẫu cấy sau tuần nuôi cấy thấy hoạt tính auxin tăng mạnh, hoạt tính cytokinin tăng, gia tăng auxin cytokinin nội sinh mẫu cấy mẫu cấy hấp thu auxin cytokinin ngoại sinh từ môi trường vào tổng hợp nội sinh mẫu cấy, làm thay đổi tỷ lệ nồng độ auxin/cytokinin nội sinh mẫu cấy, kích thích gia tăng kích thước hình thành mô sẹo Đến tuần thứ tuần thứ tương ứng với giai đoạn mô sẹo hình thành tăng sinh mạnh, hoạt tính auxin giảm nhẹ hoạt tính cytokinin tiếp tục tăng đến tuần thứ 3, điều phù hợp tăng trưởng mô sẹo chủ yếu phân chia tế bào, cytokinin tăng giúp kích thích phân chia tế bào với có mặt auxin Giberellin không thay đổi đáng kể hình thành mô sẹo, ABA giảm tuần sau nuôi cấy không thay đổi đáng kể tuần tiếp theo, có lẽ giberelin ABA vai trò quan trọng trình hình thành mô sẹo Khi đo cường độ hô hấp trình tạo mô sẹo mẫu cấy môi trường B4 thấy cường độ hô hấp mẫu cấy tăng dần theo thời gian, tế bào phân chia mạnh cần lượng cao để tạo chất, tạo thêm bào quan (Taiz Zeiger, 1991) Cường độ Footer Page 72 of 166 Header Page 73 of 166 61 hô hấp tế bào phân hóa thấp cường độ hô hấp tế bào phân chia (Mai Trần Ngọc Tiếng, 2002) Ở môi trường giống khác nồng độ NAA từ 0,1 mg/l tăng lên 0,2 mg/l (môi trường C1, C2, C3, C4) mẫu cấy hình thành nhiều rễ, điều cho thấy auxin (NAA) tác động đến hình thành rễ, hình thành rễ nhiều hay tùy thuộc vào tương tác auxin (NAA) cytokinin (BA) bổ sung vào môi trường nuôi cấy, cytokinin có vai trò kích thích phân chia tế bào, cản tạo rễ, trừ nồng độ yếu (kích thích tạo rễ gián tiếp qua vai trò kích thích phản phân hóa phân chia tế bào) (Bùi Trang Việt, 2000) Do đó, môi trường có nồng độ BA thấp từ 0,5 mg/l đến mg/l hình thành mô sẹo rễ hình thành nhiều (ảnh 3C1, 3C2), môi trường có nồng độ BA từ 1,5 mg/l đến mg/l mẫu cấy gia tăng kích thước mạnh, hình thành mô sẹo không hình thành rễ (ảnh 3C3, 3C4), có lẽ nồng độ NAA 0,2 mg/l kết hợp với BA 1,5 mg/l BA mg/l đủ để ức chế hình thành rễ không thích hợp cho hình thành mô sẹo Từ kết thí nghiệm mẫu cấy cẩm chướng cho thấy, tỷ lệ kết hợp nồng độ auxin (NAA) nồng độ cytokinin (BA) ngoại sinh bổ sung vào môi trường nuôi cấy có ảnh hưởng khác lên phát sinh hình thái mẫu cấy • Tạo mô sẹo từ mầm cẩm chướng in-vitro tuần tuổi Mẫu cấy mầm nuôi cấy môi trường giống mẫu cấy lá, thay đổi hình thái mẫu cấy mầm khác so với mẫu cấy lá, điều cho thấy auxin (NAA) cytokinin (BA) tác động lên quan khác khác (lá mầm (tử diệp) khác với lá) Mẫu cấy mầm nuôi môi trường có nồng độ NAA 0,2 mg/l kết hợp với BA nồng độ khác từ 0,5 mg/l đến mg/l (ảnh 4C1, 4C2, 4C3, 4C4) hình thành mô sẹo rễ nhiều so với mẫu cấy Sự hình thành mô sẹo rễ mầm nhiều lá chứa chất hữu từ quang hợp hormon, mầm (tử diệp) có chứa chất dự trữ hormon đồng thời có khả quang hợp tổng hợp chất hữu chất cần thiết cung cấp cho tăng Footer Page 73 of 166 Header Page 74 of 166 62 trưởng tế bào, gặp môi trường có tỷ lệ nồng độ auxin/cytokinin thích hợp hình thành mô sẹo rễ nhiều so với mẫu cấy Ở môi trường có nồng độ NAA 0,1 mg/l kết hợp với BA nồng độ khác từ 0,5 mg/l đến mg/l, hầu hết mẫu cấy có khả tạo mô sẹo (ảnh 4B1, 4B2, 4B3, 4B4), có lẽ kết hợp tỷ lệ auxin/cytokinin không thích hợp hình thành mô sẹo mẫu cấy Trong môi trường khảo sát tạo mô sẹo từ mầm, không chọn môi trường thích hợp để tạo mô sẹo môi trường tạo mô sẹo kèm theo hình thành rễ, có lẽ tỷ lệ auxin/cytokinin môi trường không thích hợp để hình mô sẹo • Tạo mô sẹo từ khúc cắt trụ hạ diệp cẩm chướng in-vitro tuần tuổi Khúc cắt trụ hạ diệp không tạo mô sẹo chuyển dần sang màu nâu sau tuần nuôi cấy môi trường khảo sát, điều phối hợp tỷ lệ nồng độ auxin/cytokinin môi trường nuôi cấy không phù hợp để tạo mô sẹo đặc tính sinh lý mẫu cấy trụ hạ diệp khó tạo mô sẹo trụ hạ diệp có vai trò vận chuyển, chứa chất dinh dưỡng, chất hữu hormon khó tạo mô sẹo tạo mô sẹo cần hormon, chất hữu chất cần thiết khác giúp cho phản phân hóa phân chia tế bào Qua kết thí nghiệm khảo sát hình thành mô sẹo từ vật liệu khác bao gồm: lá, mầm, trụ hạ diệp mầm cẩm chướng in-vitro tuần tuổi cho thấy tạo mô sẹo phụ thuộc vào kết hợp auxin NAA cytokinin BA môi trường nuôi cấy nguồn gốc mẫu cấy, điều phù hợp với quan điểm song tử diệp, tạo mô sẹo cần có kết hợp auxin cytokinin môi trường nuôi cấy tỷ lệ thích hợp (Machakova cs, 2008), nguồn gốc mẫu cấy có khả định tạo mô sẹo (Mahmood cs, 2010), có lẽ diện chất điều hòa sinh trưởng thực vật nội sinh loại mẫu cấy khác có đáp ứng khác hình thành mô sẹo Footer Page 74 of 166 Header Page 75 of 166 63 3.2.2 Sự thay đổi hình thái sinh lý tạo chồi cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ • Tạo chồi từ mô sẹo Trong môi trường khảo sát tạo chồi từ mô sẹo môi trường MS½ + BA 1,5 mg/l +15% ND (A3) có khả tái sinh chồi từ mô sẹo tốt (bảng 3.4, ảnh 6) Khi đo hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật cường độ hô hấp mô sẹo môi trường tái sinh chồi A3 cho thấy hoạt tính cytokinin tăng mạnh sau tuần nuôi cấy hoạt tính auxin, giberelin, ABA giảm, điều cho thấy cytokinin có tác động tái sinh chồi từ mô sẹo nồng độ thích hợp, cường độ hô hấp tăng mạnh để cung cấp lượng cho việc hình thành chồi Ở môi trường không bổ sung BA hay có nồng độ BA thấp 0,5 mg/l khả tái sinh chồi nồng độ BA môi trường nuôi cấy thấp không đủ kích thích mô sẹo biệt hóa tạo chồi, tăng nồng độ BA lên mg/l đến 1,5 mg/l mô sẹo tạo chồi số chồi tăng tăng nồng độ BA môi trường nuôi cấy, nồng độ BA tăng lên mg/l mô sẹo không tạo chồi nồng độ BA mg/l cao gây độc cho tế bào làm cho mô sẹo không vào đường biệt hóa tạo chồi • Tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ Trong nuôi cấy in-vitro, để kích thích chồi nách phát triển tạo thêm nhiều chồi mới, người ta thường bổ sung vào môi trường nuôi cấy cytokinin riêng rẽ hay kết hợp auxin cytokinin để kích thích gia tăng chồi nách, Clitoria ternatea chồi nách nuôi cấy môi trường bổ sung mg/l BA kết hợp với 0,25 mg/l NAA tạo 5,21 chồi/mẫu sau tuần nuôi cấy (Rout, 2004) Đối với khúc cắt thân mang chồi ngủ cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ in-vitro tuần tuổi nuôi môi trường có bổ sung NAA BA nồng độ khác (bảng 3.6, ảnh 7) thấy tạo chồi nhiều hay chủ yếu phụ thuộc vào nồng độ cytokinin (BA) ngoại sinh bổ sung vào môi trường nuôi cấy, tăng nồng độ BA lên số chồi tăng tăng cao số chồi giảm Footer Page 75 of 166 Header Page 76 of 166 64 xuống tạo nhiều chồi nhỏ không tăng trưởng Ngoài ra, tạo chồi tùy thuộc vào nồng độ auxin (NAA) ngoại sinh bổ sung vào môi trường nuôi cấy, nồng độ auxin thích hợp (NAA 0,1 mg/l) tương tác với cytokinin (BA) tạo cân phân chia gia tăng kích thước tế bào tạo chồi khỏe mạnh, nồng độ auxin cao (NAA 0,2 mg/l) kích thích hình thành mô sẹo số chồi giảm Trong môi trường khảo sát tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ môi trường tạo nhiều chồi sau tuần nuôi cấy MS½+ BA mg/l +15% ND (A2) tạo 5,69 chồi/mẫu, môi trường MS½+ BA 1,5 mg/l +15% ND (A3) tạo 5,89 chồi/mẫu môi trường MS½+ NAA 0,1 mg/l + BA 1,5 mg/l +15% ND (B3) tạo 5,52 chồi/mẫu (bảng 3.6, ảnh 7A2, 7A3, 7B3), nồng độ BA bổ sung vào môi trường nuôi cấy từ mg/l đến 1,5 mg/l thích hợp để nhân chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’, điều phù hợp với kết tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ số giống cẩm chướng khác D caryophyllus tạo 7,4 chồi/mẫu, D chinensis tạo 13,2 chồi/mẫu, D barbatus tạo 10,2 chồi/ mẫu nuôi cấy môi trường bổ sung NAA 0,5 mg/l kết hợp với BA mg/l (Pareek cs, 2004) Trong thí nghiệm tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ thấy môi trường bổ sung BA nồng độ khác từ 0,5 mg/l đến mg/l (môi trường A1, A2, A3, A4), cụm chồi hình thành gặp tượng thủy tinh thể tượng thủy tinh thể biểu rõ tăng nồng độ BA lên môi trường nuôi cấy BA nhiều hấp thu nước mạnh, điều phù hợp với kết nghiên cứu tượng thủy tinh thể cẩm chướng Dianthus caryophyllus, tăng nồng độ BA lên môi trường nuôi cấy số chồi tăng theo, chiều cao chồi giảm, đồng thời tỷ lệ chồi bị thủy tinh thể tăng theo (Kharrazi cs, 2011) Thủy tinh thể tạo nhiều nước không bình thường ảnh hưởng xấu đến chồi thân thảo thân gỗ nhân giống vô tính in-vitro Khi bổ sung NAA 0,1 mg/l vào môi trường nuôi cấy có nồng độ BA từ 0,5 mg/l đến mg/l (môi trường B1, B2, B3, B4) thấy tượng thủy tinh thể giảm, có Footer Page 76 of 166 Header Page 77 of 166 65 thể mẫu cấy hấp thu auxin vào làm thay đổi tỷ lệ nồng độ auxin/cytokinin nội sinh cảm ứng enzym hoạt động đồng thời lôi kéo chất dinh dưỡng cần thiết tạo cân tăng trưởng làm giảm tượng thủy tinh thể Khi tăng nồng độ NAA lên 0,2 mg/l kết hợp với BA nồng độ khác từ 0,5 mg/l đến mg/l (môi trường C1, C2, C3, C4) mô sẹo hình thành nhiều gốc cụm chồi số chồi tạo giảm so với môi trường NAA (môi trường A1, A2, A3) môi trường có bổ sung NAA 0,1 mg/l (môi trường B1, B2, B3, B4), điều cho thấy auxin (NAA) có tác động đến hình thành mô sẹo, có lẽ nồng độ NAA 0,2 mg/l cao khúc cắt thân mang chồi ngủ nên kích thích hình thành mô sẹo nồng độ cao auxin kích thích tạo mô sẹo (Bùi Trang Việt, 1998) Qua thí nghiệm tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ cho thấy tỷ lệ nồng độ auxin/cytokinin ngoại sinh bổ sung vào môi trường nuôi cấy định chiều hướng phát sinh hình thái mẫu cấy • Tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi đỉnh Các chồi đỉnh mầm cẩm chướng in-vitro tuần tuổi nuôi cấy môi trường có bổ sung NAA 0,1 mg/l kết hợp với BA có nồng độ từ 0,5 mg/l đến mg/l (môi trường B1, B2, B3, B4) (bảng 3.7, ảnh 8) Sau tuần nuôi cấy thấy tăng nồng độ BA lên số chồi tăng, chiều cao giảm, môi trường MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA 1,5 mg/l +15% ND (B3) tạo nhiều chồi (25,26 chồi) chồi ngắn nhỏ, tăng nồng độ BA lên mg/l số chồi giảm xuống, điều phù hợp với báo cáo trước số giống cẩm chướng, giống khác nồng độ auxin cytokinin tối ưu cho tạo chồi khác Qua thí nghiệm khảo sát tạo chồi từ mô sẹo, tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ, tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi đỉnh thấy vật liệu khúc cắt thân mang chồi đỉnh nuôi cấy môi trường MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA mg/l +15% ND (B2) thích hợp để nhân chồi số chồi tạo nhiều (11,36 chồi/mẫu) tăng trưởng tốt Footer Page 77 of 166 Header Page 78 of 166 66 Nhìn chung, môi trường nuôi cấy có bổ sung cytokinin đưa đến kết tạo thành cụm chồi, số lượng chồi hình thành tùy thuộc vào nồng độ cytokinin Tuy nhiên có bất lợi định việc điều chỉnh nồng độ để cảm ứng tạo nhiều chồi chồi tạo trở lên nhỏ, kéo dài đến kích thước định để tách cho hình thành rễ, tạo bất thường 3.2.3 Sự thay đổi hình thái sinh lý tạo rễ cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ • Tạo rễ từ mô sẹo Trong môi trường khảo sát tạo rễ từ mô sẹo môi trường MS½ + NAA 0,2 mg/l +15% ND (R2) có khả tạo rễ từ mô sẹo tốt (bảng 3.8, ảnh 14) Khi đo cường độ hô hấp hoạt tính chất điều hòa sinh trưởng thực vật mô sẹo môi trường tạo rễ R2 sau tuần nuôi cấy (bảng 3.13) cho thấy hoạt tính auxin tăng, hoạt tính ABA giảm, hoạt tính cytokinin giberelin không thay đổi đáng kể, điều cho thấy auxin có tác động hình thành rễ từ mô sẹo nồng độ thích hợp, cường độ hô hấp mô sẹo tăng trình hình thành rễ nhu cầu lượng chất cần thiết cho hình thành rễ tăng cao hô hấp tế bào tăng Ở môi trường không bổ sung NAA có nồng độ NAA thấp 0,1 mg/l không tạo rễ nồng độ NAA môi trường nuôi cấy thấp không đủ kích thích mô sẹo biệt hóa tạo rễ, môi trường nồng độ NAA tăng lên 0,5 mg/l mô sẹo tạo rễ giảm nồng độ NAA 0,5 mg/l cao làm giảm khả tạo rễ từ mô sẹo tăng nồng độ NAA lên mg/l gây độc cho tế bào làm cho mô sẹo không biệt hóa tạo rễ Qua thí nghiệm tạo rễ từ mô sẹo cho thấy tái sinh rễ từ mô sẹo tùy thuộc vào nồng độ auxin (NAA) bổ sung vào môi trường nuôi cấy • Tạo rễ từ Lá cẩm chướng in-vitro tuần tuổi nuôi cấy môi trường có nồng độ NAA từ mg/l đến mg/l (bảng 3.9, ảnh 9) xuất rễ sau tuần nuôi cấy, Footer Page 78 of 166 Header Page 79 of 166 67 riêng môi trường R0 xuất rễ chậm (10 ngày sau nuôi cấy) Khi tăng nồng độ NAA môi trường nuôi cấy từ 0,1 mg/l đến 0,5 mg/l số rễ tăng, tăng nồng độ NAA lên mg/l số rễ giảm xuống, môi trường tạo rễ môi trường có nồng độ NAA 0,1 mg/l có chiều dài rễ dài nhất, điều cho thấy nồng độ NAA môi trường nuôi cấy tác động đến hình thành rễ mẫu cấy Qua theo dõi hình thành rễ từ lá, thấy vị trí chỗ vết cắt cuống chỗ bị thương nơi rễ xuất nhiều sớm nhất, sau vị trí gân Quan sát giải phẫu hình thành rễ từ thấy đầu cuống gân có bó mạch, rễ xuất phát từ tế bào libe bó mạch, tế bào phân chia hình thành sơ khởi rễ, sau sơ khởi rễ kéo dài để hình thành rễ • Tạo rễ từ chồi in-vitro Các chồi in-vitro nuôi cấy môi trường có nồng độ NAA từ mg/l đến mg/l (bảng 3.10), xuất rễ sau tuần nuôi cấy Khi tăng nồng độ NAA từ mg/l đến 0,2 mg/l số rễ tăng, tăng nồng độ NAA lên 0,5 mg/l đến mg/l số rễ tạo giảm rễ có nhiều lông tơ Kết thí nghiệm phù hợp với tạo rễ từ chồi in-vitro cẩm chướng D caryophyllus, nồng độ NAA tối ưu kích thích tạo rễ giống khác tùy thuộc vào loài thực vật Nồng độ NAA kích thích tạo rễ cao D caryophyllus mg/l, tăng nồng độ NAA lên 1,5 mg/l đến 2,5 mg/l số rễ tạo giảm (Ali cs, 2008), Dianthus ‘telstar purple picotee’ nồng độ NAA kích thích tạo rễ nhiều từ chồi in-vitro 0,2 mg/l NAA Như phát sinh hình thái chồi, rễ, tạo mô sẹo vai trò chất điều hòa sinh trưởng thực vật quan trọng, đặc biệt vai trò auxin cytokinin Sử dụng auxin, cytokinin riêng rẽ hay phối hợp auxin cytokinin môi trường nuôi cấy định phát sinh hình thái mẫu cấy, phát sinh hình thái phụ thuộc vào nguồn gốc mẫu cấy Cây cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ nhân giống in-vitro theo sơ đồ sau: Footer Page 79 of 166 Header Page 80 of 166 68 Hột Khử trùng Javel 25%, phút Cây in-vitro Môi trường tạo mô sẹo MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA mg/l +15% ND Lá - Khúc cắt thân mang chồi ngủ - Khúc cắt thân mang chồi đỉnh Môi trường tạo cụm chồi MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA mg/l +15% ND Mô sẹo Môi trường tái sinh chồi MS½ + BA1,5 mg/l +15% ND Cụm chồi Cụm chồi Môi trường tạo rễ MS½ + NAA 0,2 mg/l +15% ND Cây Vườn ươm Hình 3: Sơ đồ nhân giống in-vitro cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ Footer Page 80 of 166 Header Page 81 of 166 69 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 KẾT LUẬN Qua kết khảo cứu tạo mô sẹo, tạo chồi, tạo rễ môi trường khác nhận thấy • Môi trường MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA mg/l +15% nước dừa thích hợp cho tạo mô sẹo từ • Môi trường MS½ + BA 1,5 mg/l +15% nước dừa thích hợp cho tái sinh chồi từ mô sẹo (12,7 chồi/mẫu) môi trường MS½ + NAA 0,1 mg/l + BA mg/l +15% nước dừa thích hợp cho tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ (5,52 chồi/mẫu) khúc cắt thân mang chồi đỉnh (11,36 chồi/mẫu) sau tuần nuôi cấy, tạo nhiều chồi tăng trưởng tốt • Môi trường MS½ + NAA 0,2 mg/l thích hợp cho tạo rễ từ mô sẹo (5,23 rễ/mẫu) tạo rễ từ chồi in-vitro (5,86 rễ/mẫu), môi trường MS½ + NAA 0,5 mg/l tạo nhiều rễ từ (17,00 rễ/mẫu) sau tuần nuôi cấy 4.2 ĐỀ NGHỊ Trong tương lai, có điều kiện, khảo sát điều kiện trồng cẩm chướng Dianthus ‘telstar purple picotee’ in-vitro vườn ươm để sinh trưởng tốt cho nhiều hoa Footer Page 81 of 166 Header Page 82 of 166 70 CÁC TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt Nguyễn Thị Lý Anh, Lê Hải Hà, Vũ Hoàng Hiệp (2005), “Ảnh hưởng xử lý ethylmethane sulphonate in- vitro cẩm chướng”, Tạp chí Khoa học Phát triển 2009, Trường ĐH Nông nghiệp Hà Nội, 7(2), pp 130-136 Phạm Hoàng Hộ (1972), Sinh học thực vật NXB Trung tâm học liệu Nguyễn Thị Ngọc Hương (2009), Tìm hiểu phát sinh hình thái chồi rễ nuôi cấy in-vitro nhàu (Morinda citriforlia L.), Luận văn thạc sĩ sinh học, Trường đại học Khoa học Tự nhiên Trần Thanh Hương, Bùi Trang Việt, Feng Teng-Yung (2009), “Vai trò chất điều hòa tăng trưởng thực vật hình thành rễ bất định từ khúc cắt mang chồi vài giống chuối”, Tạp chí phát triển KH&CN, Tập 12, số 09-2009 Võ Thị Bạch Mai (2004), Sự phát triển chồi rễ, NXB Đại học Quốc Gia Tp HCM Trịnh Ngọc Nam (2007), Công nghệ sinh học thực vật, Trường đại học Công nghiệp Tp HCM Mai Trần Ngọc Tiếng (2001), Thực vật cấp cao, NXB Đại học Quốc Gia Tp HCM Mai Trần Ngọc Tiếng, Nguyễn Thị Ngọc Lang, Đặng Vĩnh Thanh, Nguyễn Du Sanh, Bùi Trang Việt (1980), “Kích thích tố giâm cành Phần II: chế tạo rễ bất định”, Thông báo khoa học, ĐH Tổng hợp Tp HCM, số 4, pp.85-92 Bùi Trang Việt (1998), Sinh lý thực vật đại cương, Phần 3: Phát triển, NXB Đại học Quốc Gia Tp HCM 10 Bùi Trang Việt (2000), Sinh lý thực vật đại cương, Phần 2: Phát triển, NXB Đại học Quốc Gia Tp HCM 11 Bùi Trang Việt (2002), Sinh lý thực vật đại cương, Phần 1: Dinh dưỡng, NXB Đại học Quốc Gia Tp HCM Footer Page 82 of 166 Header Page 83 of 166 71 12 Bùi Văng Thế Vinh, Chu Thị Bích Phượng, Đỗ Đăng Giáp, Thái Xuân Du, Dương Tấn Nhật (2011), “ Tái sinh chồi trực tiếp từ mẫu cấy dầu mè ‘Jatropha curcas L.’ ”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, (1), pp.1-7 13 Vũ Văn Vụ, Vũ Thanh Tâm, Hoàng Minh Tấn (2003), Sinh lý học thực vật NXB Giáo Dục 14 Vụ Văn Vụ (1999), Sinh lý thực vật ứng dụng, NXB Giáo Dục Tài liệu tiếng nước 15 Abdellatrf E and Khalaphallah M M (2008), “Influence of growth regulaters on callus induction from hypocotyls of medium staple cotton (Gossypyum hirsutum L.) cultivarbarac B-67”, J.Soil.Nature, 2(1), pp.17-22 16 Ali A , Afrasiab H., Naz S., Rauf M and Iqbal J (2008), “An efficient protocol for in vitro propagation of carnation (Dianthus caryophyllus)” Pak J Bot., 40(1): 111-121 17 Bohidar s., Thirunavoukkarasu M., Rao T (2004), “Effect of plant growth regulators on in vitro micropropagation of ‘Garden Rue’ (Ruta graveolens L.)”, International Journal of Integrative Biology, (1), 36 18 Can E., Çeliktas N., Hatipoglu R (2008), “Effect of auxin type and concentrations in different media on the callus induction and shoot formation of crested wheatgrass (Agropyron cristatum (L.) Gaertn)”, Biotechnol & Biotechnol eq 22/2008/3, pp 782-786 19 Cristea V., Brummer A., Jarda A., Miclăuş M (2010), “In vitro culture initiation and phytohormonal influence on Dianthus henteri – a Romanian endemic species”, Romanian Biotechnological Letters, 15(1) 20 Danial G H., Yousif A N and Omar M S (2009), “Clonal propagation of Dianthus Caryophyllus L through tissues culture”, The 2nd Kurdistan Conference on Biological Sciences, 12(1), pp 91-95 21 Dielen, Lecouvet V., Dupont V., Kinet S J M (2001), “In vitro control of floral transition in tomato (Lycopersition esculetum), the model for Footer Page 83 of 166 Header Page 84 of 166 72 autonomously flowering plants, using the late flowering uniflora mutant”, J Exp Bot, 52, pp 715-723 22 George E F (2008), Plant propagation by Tissue Culture, 3rd edition, vol the Background, Springer 23 Gopitha K., Bhavani A.L., and Senthilamnickam J (2010), “Effect of the different auxins and cytokinins in callus induction, shoot, root regeneration in sugarcane”, International Journal of Pharma and Bio Sciences, 1(3) 24 Fleet C.M Sun T (2005), “A DELLAcate balance: the role of gibberellin in plant morphogenesis”, Current Opinion in Plant Biology, 8, pp.77–85 25 Karami O (2008), “Induction of Embryogenic Callus and Plant Regeneration in Carnation (Dianthus caryophyllus L.)”, OnLine Journal of Biological Sciences, (4): pp.68-72 26 Lewis D R., Negi S., Sukumar P., Muday G K (2011), “Ethylene inhibits lateral root development, increases IAA transport and expression of PIN3 and PIN7 auxin efflux carriers”, Development, 138 (16), pp 3458-3495 27 Li H Q., Gou J., Huang Y W., Yliang C., Liu Z H., Potrykus I., Kaelas P J (1998), “Regeneration of casava plant via shoot organogenesis”, Plant cell reports, 17, pp 410-414 28 Machakova I., Zazimalova E., George E F (2008), “Plant Growth regulators I: introduction; auxin, their Analogues and Inhibitors”, Plant propagation by Tissue Culture, 3rd edition, vol the Background, pp.175-205 29 Mahmood M., Normi R Subramaniam S (2010), “Optimization of suitable auxin application in a recalcitrant woody forest plant of Eurycoma longifolia (Tongkat Ali) for callus induction”, African Journal of Biotechnology, 9(49), pp 8417-8428 30 Megre D., Kondratovics U., Dokane K (2007), “Simultanous graft union and advantitious root formation during vegetative propagation in elepidote rhododendrons”, Acta universitalis latviensis, 723, pp 155-162 Footer Page 84 of 166 Header Page 85 of 166 73 31 Moshkov I E., Novikova G V., Hall M A George E F (2008), “Plant growth regulators III: gibberellins, ethylene, abscisic acid, their analogues and inhibitors; miscellaneous compounds ”, Plant propagation by Tissue Culture, 3rd edition, vol the Background, pp.227-283 32 Molnar Z., Virag E., Ordog V (2011), “Natural substances in tissue culture media of higher plants”, Acta Biologica Szegediensis 55 (1), pp 123-127 33 Negi S., Sukumar P., Liu X., Cohen J D., and Muday G K (2010), “Genetic dissection of the role of ethylene in regulating auxin-dependent lateral and advention root information in tomato”, The plant journal, 61, pp 3-15 34 Pareek A., Kantia A., Kothari S L (2004), “In vitro cloning of ornamental species of Dianthus”, Indian Journal of Biotechnology, 3, pp 263-266 35 Robert H S Friml J (2009), “Auxin and other signals on the move in plants”, Nature Chemical Biology, 5, pp.325-332 36 Rout G R (2004), “Effect of cytokinins and auxins on micropropagation of Clitoria ternatea L.”, Boil.lett, 41 (1), pp 21-26 37 Rubluo A Barroso M L (1992), “In vitro morphogenetic responses and cytokinin – auxin interaction for callus production in pepper”, Anales inst Biol Univ.Nac Auton Maxico Ser.Bot., 63 (2), pp 195-201 38 Staden J V., Zazimalova E George E F (2008), “Plant growth regulators II: cytokinins, their analogues and antagonists”, Plant propagation by Tissue Culture, 3rd edition, vol the Background, pp.205-226 39 Taiz L Zeiger E (1991), Plant physiology 3rd edition, Sinauer Associates 40 Wang, D.Y., Wergin W.P., and Zimmerman H (1984), “Somntic embryogenesis and plant regeneration from immature embryos of strawberry”, HortSience, 19, pp 71-72 41 Welander M and Snygg J O (1986), “Effect of Applied and Endogenous Auxin on Callus and Root Formation of In Vitro Shoots of the Apple”, The Swedish University of Agricultural Sciences, Department of Horticultural Science, Sweden Footer Page 85 of 166 ... hoa kiểng nước ta Đề tài Tìm hiểu ảnh hưởng BA NAA lên tạo chồi rễ nuôi cấy in-vitro cẩm chướng Dianthus telstar purple picotee ” thực nhằm mục đích tìm hiểu ảnh hưởng hai chất điều hòa sinh... CÁC ẢNH Ảnh 1: Cây cẩm chướng Dianthus telstar purple picotee Ảnh 2: Hột cẩm chướng (A), cẩm chướng in-vitro tuần tuổi (B), cẩm chướng in-vitro tuần tuổi (C, D) nẩy mầm từ hột 19 Ảnh. .. gian nuôi cấy 39 Bảng 3.6 Ảnh hưởng NAA BA lên tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi ngủ sau tuần nuôi cấy 43 Bảng 3.7 Ảnh hưởng NAA BA lên tạo chồi từ khúc cắt thân mang chồi đỉnh