Nghiên cứu thu thập và lưu trữ nguồn gen của cây thất diệp nhất chi hoa (paris polyphylla sm )

Mục tiêu nghiên cứu Thu thập được một số cây Thất diệp nhất chi hoa ở một số miên núi phía Bắc Việt Nam Bước đầu sử dụng được kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu định loại mẫu câ

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN

TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM

NÔNG LỆ THÙY

NGHIÊN CỨU THU THẬP VÀ LƯU TRỮ

NGUỒN GEN CÂY THẤT DIỆP NHẤT CHI HOA

(PARIS POLYPHYLLA SM.)

Chuyên ngành: Di truyền học

Mã số: 60.42.01.21

LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC

Người hướng dẫn khoa học: TS VŨ THỊ THU THỦY

THÁI NGUYÊN - 2016

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan số liệu và kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chưa được sử dụng để bảo vệ cho bất kỳ một học vị nào

Tác giả

NÔNG LỆ THÙY

LỜI CẢM ƠN

Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Thị Thu Thủy đã tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và tạo mọi điều kiện giúp đỡ để tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Tôi xin chân thành cảm ơn GS.TS Chu Hoàng Mậu, Ban lãnh đạo Trường Đại học sư phạm Thái Nguyên, Ban chủ nhiệm khoa Sinh học và các thầy cô giáo, cán bộ của Khoa, sự giúp đỡ tận tình của TS Nguyễn Thị Thu Ngà, KTV Trần Thị Hồng đã giúp tôi hoàn thành công trình nghiên cứu này

Tôi xin trân trọng cảm ơn sự hỗ trợ về kinh phí của đề tài NCKH cấp Bộ

MỤC LỤC

Trang Trang bìa phụ

Lời cam đoan i

Lời cảm ơn ii

Mục lục iii

Danh mục các bảng v

MỞ ĐẦU 1

1 Đặt vấn đề 1

2 Mục tiêu nghiên cứu 2

3 Nội dung nghiên cứu 2

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 3

1.1 Đặc điểm chung về cây Thất diệp nhất chi hoa 3

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại 3

1.1.2 Đặc điểm nông sinh học 4

1.1.3 Thành phần hóa học và công dụng 5

1.1.4 Một số bài thuốc sử dụng cây Thất diệp nhất chi hoa 7

1.2 Một số phương pháp định danh thực vật 8

1.3 Một số phương phương pháp lưu trữ và bảo tồn giống cây trồng 10

1.3.1 Bảo tồn nội vi( in – situ) 11

1.3.2 Bảo tồn ngoại vi (Ex – situ) 12

1.3.3 Bảo tồn giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro 13

1.3.3.1 Cơ sở lý luận của phương pháp bảo quản và nhân giống in vitro 13

1.3.3.2 Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy in vitro 15

1.3.3.3 Các đường hướng trong nhân giống in vitro 18

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 22

2.1 Vật liệu nghiên cứu 22

2.1.1.Vật liệu 22

2.1.2.Hóa chất, thiết bị 22

2.2 Phương pháp nghiên cứu 23

2.2.1.Phương pháp thu thập mẫu 23

Thu thập mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa trong tự nhiên, mô tả và chụp ảnh 23

2.2.2.Phương pháp bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa tại Thái Nguyên 23

2.2.3 Phương pháp phân lập gen rpoC1 23

2.2.4 Phương pháp nuôi cấy in vitro 24

2.2.5.Phương pháp xử lí số liệu 26

2.3 Địa điểm tiến hành thí nghiệm 26

Chương 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 27

3.1 Kết quả thu thập mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa tại một số tỉnh miền núi phía Bắc của Việt Nam 27

3.1.1.Đặc điểm mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập tại huyện Bình Gia- Lạng Sơn 27

3.1.2 Đặc điểm mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập tại huyện Quản Bạ- Hà Giang 29

3.1.3 Đặc điểm mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập tại huyện Sa Pa- Lào Cai 30 3.2 Kết quả phân tích gen rpoC1 của cây Thất diệp nhất chi hoa 32

3.3 Kết quả nghiên cứu bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa trồng tại tỉnh Thái Nguyên34 3.4.Kết quả bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa in vitro 37

3.4.1 Kết quả khử trùng mẫu 37

3.4.2 Kết quả thăm dò môi trường nảy mầm và phát sinh hình thái của các mẫu nghiên cứu 42

KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 46

TÀI LIỆU THAM KHẢO 47

NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT

ĐHST Điều hòa sinh trưởng

IAA Indole - 3 - acetic - acid

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 3.1 Mẫu cây thu được tại huyện Bình Gia - Lạng Sơn 27

Bảng 3.2 Số lượng mẫu Thất diệp nhất chi hoa thu tại Hà Giang 29

Bảng 3.3 Số lượng mẫu Thất diệp nhất chi hoa thu tại Sa Pa 31

Bảng 3.4 Tên loài và mã số trình tự gen rpoC1 33

Bảng 3.5 Ảnh hưởng của giá thể tới tỉ lệ sống của cây Thất diệp nhất chi hoa 35

Bảng 3.6 Đặc điểm sinh trưởng của cây Thất diệp nhất chi hoa trong phòng sinh trưởng tại Thái Nguyên 36

Bảng 3.7 Kết quả khử trùng hạt cây Thất diệp nhất chi hoa 38

Bảng 3.8 Kết quả khử trùng lá cây Thất diệp nhất chi hoa 40

Bảng 3.9 Kết quả khử trùng củ Thất diệp nhất chi hoa 41

Bảng 3.10 Ảnh hưởng của các chất ĐHST đến hệ số nảy mầm của củ 44

DANH MỤC HÌNH

Hình 1.1 Hình thái cây Bảy lá một hoa 3

Hình 3.1 Cây Thất diệp nhất chi hoa tại Hồng Phong - Bình Gia - Lạng Sơn 28

Hình 3.2 Mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa tại xã Hội Hoan, huyện Bình Gia 28

Hình 3.3 Mẫu củ thu được tại Quản Bạ - Hà Giang 29

Hình 3.4 Quả và hạt cây Thất diệp nhất chi hoa thu tại Hà Giang 30

Hình 3.5 Cây Thất diệp nhất chi hoa tại Sa Pa 31

Hình 3.6 Cây Thất diệp nhất chi hoa trong phòng sinh trưởng của cây in vitro tại Thái Nguyên 37

Hình 3.7 Kết quả điện di sản phẩm nhân gen rpoC1 32

rpo ất diệp nhất chi hoa 34

ệt Nam 34

Hình 3.9 Mẫu hạt sạch cây Thất diệp nhất chi hoa cấy trên môi trường MS cơ bản 39

Hình 3.10 Mẫu sạch khử trùng củ Thất diệp nhất chi hoa 42

Hình 3.11 Ảnh hưởng của chất ĐHST đến sự phát sinh hình thái mô lá 43

Hình 3.12 Mẫu sạch từ củ cây Thất diệp nhất chi hoa trên môi trường MS có bổ sung thêm các chất kích thích sinh trưởng 44

Hình 3.13 Mẫu củ bật chồi có bổ sung BAP 0,5mg/l + Than hoạt tính 45

Hình 3.14 Mẫu củ bật chồi bổ sung BAP 0.5mg/l 45

MỞ ĐẦU

1 Đặt vấn đề

Thất diệp nhất chi hoa có tên khoa học là Paris polyphylla Sm., hay còn

gọi là cây Bảy lá một hoa, độc cước liên, thiết đăng đài, chi hoa đầu, tảo hưu,

thảo hà xà…[9] Chi Paris gồm 27 loài phân bố rộng khắp ở Châu Âu và Châu

Á trong đó tập trung nhiều nhất ở Trung Quốc Chi Paris gồm các loài từ 03lá đến 11 lá Loài Paris Polyphylla có 13 giống [52]

Tại Việt Nam, cây Thất diệp nhất chi hoa được phát hiện tại các vùng núi Cúc Phương (Ninh Bình), Sapa (Lào Cai), Đà Bắc (Hòa Bình), Hà Giang, Lạng Sơn, Lai Châu… Cây Thất diệp nhất chi hoa được Pectelot phát hiện đầu tiên vào năm 1934 tại Sapa với nhiều loài khác nhau [9] Theo y học cổ truyền, cây Thất diệp nhất chi hoa có tác dụng thanh nhiệt, giải độc, trị rắn cắn, trị viêm tuyến vú, trị sốt rét, trị ho lâu ngày [9] Trong những năm gần đây, cây Thất diệp nhất chi hoa còn được phát hiện có tác dụng diệt khuẩn, kháng viêm mạnh,

ức chế các virus, tăng cường chức năng của tuyến thượng thận, an thần, trấn tĩnh, chống ho Đặc biệt, cây có tác dụng ức chế tế bào ung thư phổi và ung thư

dạ dày, kéo dài tuổi thọ cho người bệnh [11], [42], [43], [46]

Với nhiều tác dụng chống lại bệnh nên cây Thất diệp nhất chi hoa đang là đối tượng được thu mua và khai thác với số lượng lớn Bên cạnh đó, nạn phá rừng làm nương rẫy dẫn đến giảm khả năng tái sinh và phân bố của cây Thất diệp nhất chi hoa trong tự nhiên bị thu hẹp

Theo phân hạng về độ góc bảo tồn, cây Thất diệp nhất chi hoa được xếp hạng EN A1 c,d, và cấp đánh giá ở mức hiếm (R) Cây cũng được khuyến cáo khai thác, sử dụng hợp lí và cần thiết phải lưu giữ và bảo vệ nguồn gen [6]

Việc lưu giữ và bảo tồn giống cây trồng có thể được thực hiện bằng nhiều

cách khác nhau như: bảo tồn tại chỗ, bảo tồn chuyển chỗ và bảo tồn in vitro

Công tác tái sinh và nhân giống vô tính cây Thất diệp nhất chi hoa đã được thực

hiện tại một số tỉnh miền núi phía bắc Việt Nam như: Hà Giang, Sơn La, Lai Châu Tuy nhiên, kết quả tái sinh cây chưa được như mong muốn

Trên cơ sở đó chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu thu thập và lưu

trữ nguồn gen của cây Thất diệp nhất chi hoa (Paris polyphylla Sm.) nhằm

bảo tồn nguồn gen và phục vụ cho công tác phục tráng giống sau này

2 Mục tiêu nghiên cứu

Thu thập được một số cây Thất diệp nhất chi hoa ở một số miên núi phía Bắc Việt Nam

Bước đầu sử dụng được kỹ thuật sinh học phân tử trong nghiên cứu định loại mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa

Lưu trữ được một số mẫu cấy Thất diệp nhất chi hoa trong phòng sinh

trưởng và nuôi cấy in vitro

3 Nội dung nghiên cứu

Nghiên cứu đặc điểm và thu thập mẫu của Thất diệp nhất chi hoa ở một

số địa phương miền núi phía Bắc Việt Nam

Phân lập và xác định trình tự nucleotit của gen rpoC1

Nghiên cứu một số chỉ tiêu sinh lý, sinh trưởng của cây Thất diệp nhất chi

hoa trong phòng sinh trưởng cây in vitro của phòng công nghệ tế bào tại trường

Đại học sư phạm Thái Nguyên

Nghiên cứu bảo tồn cây Thất diệp nhất chi hoa bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Đặc điểm chung về cây Thất diệp nhất chi hoa

1.1.1 Nguồn gốc và phân loại

Cây Thất diệp nhất chi hoa có tên khoa

học là Paris polyphylla Sm., hay còn gọi là

Bảy lá một hoa, độc cước liên, thiết đăng đài,

chi hoa đầu, tảo hưu, thảo hà xà [9]

Theo trung tâm dữ liệu thực vật

Việt Nam, cây Thất diệp nhất chi hoa

được phân loại thuộc giới thực vật; ngành

thực vật có hoa, mộc lan, hạt kín; lớp một

lá mầm; bộ củ nâu; họ trọng lâu; chi Paris

[54] Chi này gồm có 27 loài, loài Paris

Polyphylla gồm 13 giống có dị thảo từ 3 - 11 lá [52]

Cây Thất diệp nhất chi hoa được tìm thấy đầu tiên ở độ cao 1500 - 3000m tại dãy núi Hymalaya (Ấn Độ) và được Smith miêu tả lần đầu vào năm 1813 [9] Trên thế giới, cây phân bố ở Trung Quốc (bao gồm An Huy, Phúc Kiến, Quảng Đông, Giang Tây, Tứ Xuyên ), Ấn Độ, Nepal và Myanma [25]

Tại Việt Nam, cây Thất diệp nhất chi hoa được tìm thấy ở các vùng núi Cúc Phương (Ninh Bình), Sapa (Lào Cai), Đà Bắc (Hòa Bình), Hà Giang, Lạng Sơn, Lai Châu… Cây Thất diệp nhất chi hoa được Pectelot phát hiện đầu tiên vào năm 1934 tại Sapa với nhiều loài khác nhau [9] Theo nghiên cứu của Pectelot, ở nước ta ít nhất có 5 loài khác nhau, trong đó có 3 loài được mô tả khá kĩ

Loài thứ nhất có tên khoa học là Paris delavayi Franch Cây của loài

Paris delavayi Franch có thân gầy, cao chừng 1m, cành lá khoảng 2/3 phía trên

thân Lá dài chừng 20cm, rộng khoảng 3,5cm, có 3 gân xuất phát từ cuống lá,

Hình 1.1 Hình thái cây Bảy lá một hoa [60]

khoảng 2cm, phiến lá hình mác dài, đầu lá và cuống lá nhọn Cánh tràng hình sợi Lá đài nhỏ hơn lá thật, dài khoảng 4 - 4,5cm, rộng khoảng 8mm Thường thấy mọc ở độ cao khoảng 1.400m đến 1.800m, trong những rừng ẩm ở Sapa (Lào Cai) Loài này ra hoa vào tháng 4, kết quả vào tháng 6 hoặc tháng 7 [9]

Loài thứ 2 có tên khoa học Paris hainanensis Loài này có thân cây to,

cao chừng 0,80m Lá tập trung thành vành, gồm 6 lá, ở vào khoảng 2/3 ở phía trên thân Lá dài khoảng 20cm, rộng khoảng 12cm Đầu lá nhọn, hình ba cạnh dài 1cm Cuống lá dài tới 7cm, phiến lá hình trứng rộng, hơi không đối xứng

Lá đài khoảng 5cm, rộng khoảng 2cm Cánh tràng hình sợi, dài gấp 2 lần lá đài

Loài Paris hainanensis ra hoa vào tháng 4, đậu quả vào tháng 6, loài này hay

gặp hơn ở những vùng rừng ẩm, thấp quanh Sapa, độ cao chừng 1500m [9]

Loài thứ 3 được gọi là Paris fargessi Franch Thân của loài này cao

chừng 1m đến 1,3m Vành lá cũng ở khoảng 2/3 phía trên thân, gồm 5 lá Cuống

lá dài khoảng 5 - 5,5cm, phiến lá hình bầu dục, phía cuống hình tim, đầu lá nhọn, lá có 5 gân Lá đài hình mác, dài khoảng 6cm, rộng khoảng 1,2cm Cánh tràng hình sợi, ngắn hơn lá đài Cây ra hoa vào tháng 4, kết quả vào tháng 6 So

với các loài trên, loài Paris fargessi Franch hiếm hơn [9]

Trong số 2 loài Paris chưa xác định được tên, có một loại cao tới 2,5m

Petelot phát hiện thấy 2 cây nhỏ trên đường từ Sapa (Lào Cai) đến Bình lư (Tam Đường – Lai Châu) [9] Loại thứ 2 được phát hiện ở độ cao 400m vùng núi Ba

Vì (Hòa Bình) và trên bờ suối có nhiều bóng rợp, khoảng giữa từ Hà Nội đến Hòa Bình [9]

1.1.2 Đặc điểm nông sinh học

Cây Thất diệp nhất chi hoa là một loại cây nhỏ, sống lâu năm Cây thường mọc hoang ở những khe núi ẩm ướt, có độ cao trên 600m và ưa bóng, hoặc dọc theo các bờ khe suối, trên đất ẩm nhiều mùn Phần thân trên mặt đất, lụi hàng năm vào cuối thu Thân rễ mang 1 - 2 chồi ngủ tồn tại qua mùa

đông và mọc lại vào giữa mùa xuân năm sau Trong tự nhiên, thường chỉ những cây lớn có chiều dài thân rễ trên 5cm mới thấy có hoa, quả [25]

Cây Thất diệp nhất chi hoa ưa nơi có khí hậu mát, ít gió, nhưng không chịu được úng Cây chưa được trồng trên quy mô lớn mà chỉ ở phạm vi các vườn cây thuốc tại một số địa phương theo phương thức nhân giống bằng hạt hoặc bằng thân

rễ Theo đó, hàng năm vào khoảng tháng 10 - 11, người ta thu quả chín, đem gieo trong vườn ươm hoặc phơi khô để đến mùa xuân năm sau mới reo Mỗi cây chỉ có một hoa, mỗi hoa chỉ có ít hạt nên hệ số nhân giống bằng hạt không cao Thân rễ Thất diệp nhất chi hoa có nhiều đốt chứa mắt ngủ, có thể tách từng đoạn để trồng Thời vụ trồng chủ yếu là mùa xuân và mùa thu [25]

Theo Đỗ Tất Lợi, ở Việt Nam cây Thất diệp nhất chi hoa được mô tả là những cây có thân rễ ngắn, dài chừng 5 - 15cm, đường kính 2,5 - 5cm rất nhiều đốt, khó bẻ, vết bẻ trông như có bột, màu vàng trắng hay xám vàng Từ thân rễ nổi lên mặt đất một thân mọc thẳng đứng cao tới 1m, phía gốc có một số lá thoái hóa thành vẩy, bao lấy thân Giữa thân có một tầng lá mọc vòng, gồm 3-10

lá, nhưng thường là 7 lá Cuống lá dài 2,5 - 3cm, phiến lá hình mác rộng, dài 15- 21cm, rộng 4 - 8cm Đầu phiến lá nhọn, mép lá nguyên, hai mặt lá nhẵn, mặt dưới màu xanh nhạt, đôi khi có màu tím nhạt Hoa mọc đơn độc ở đỉnh cành, cuống hoa dài 15 - 30cm Số cánh tràng bằng số lá đài, hình sợi rủ xuống, màu vàng nâu Chiều dài của cánh tràng bằng hay ngắn hơn chiều dài của lá đài Nhụy màu đỏ tím, bầu thường gồm 3 ngăn Quả mọng, màu tím đen Ở Sapa, cây ra hoa vào các tháng 3, 4, 5 và tạo quả vào các tháng 10 - 11 [9]

Người ta thường dùng thân rễ với tên Tảo hưu Có thể thu hái Tảo hưu quanh năm, nhưng tốt nhất là vào thu đông, tảo hưu được đào về rửa sạch và phơi khô [9]

1.1.3 Thành phần hóa học và công dụng

Bộ phận làm thuốc của cây Thất diệp nhất chi hoa là thân rễ Theo đông y, Tảo hưu có vị ngọt, hơi cay, tính bình, không độc Tác dụng chủ yếu của Tảo hưu là thanh nhiệt, giải độc, điều trị rắn độc cắn, trị viêm tuyến vú,

trị sốt rét, trị ho lao, trị ho lâu ngày, trị hen xuyễn Nếu dùng ngoài da thì đắp lên những nơi sưng đau [9]

Các công trình nghiên cứu y học hiện đại đã tìm thấy trong cây Thất diệp nhất chi hoa có chất glicozit Đặc biệt loại glucozit có lợi cho sức khỏe được kể đến như tinh chất saponin (gọi là paridin C16H28O7) và tinh chất paristaphin (C38H64O18) [9], [32]

Ở Nepal, Devkota (2005) đã cô lập được 6 hợp chất từ Paris polyphylla

Các hợp chất là: przewalskinone B, polyphyllin C, polyphyllin D, saponin-1, stigmasterol và stigmasterol-3-O-P-D-glucoside [33] Theo đó, nghiên cứu của Lee và cộng sự (2005), hợp chất polyphylin D của cây Thất diệp nhất chi hoa có thể được sử dụng trong điều trị ung thư vú [40] Một số nghiên cứu khác cũng cho thấy, các hợp chất saponin của cây Thất diệp nhất chi hoa gây ức chế sự tăng trưởng của khối u của bệnh ung thư phổi trên chuột thử nghiệm và gây độc đối với các dòng tế bào ung thư của người như dòng tế bào ung thư dạ dày [41], hay các dòng tế bào ung thư phổi A549 [42] Dòng tế bào ung thư đại tràng (LoVo và W-116), dòng tế bào ung thư thực quản (ECA 109) hay các bệnh ung thư đường tiêu hóa nói chung [50]

Năm 2008, Deng và cộng sự đã đánh giá hoạt tính kháng nấm của

saponin từ cây Thất diệp nhất chi hoa với Cladosporium cladosporioides và loài

Candida Kết quả cho thấy, saponin có hoạt tính kháng nấm Hoạt tính này được

đem so sánh với một số thuốc thương mại, từ đó đưa ra một giải pháp thay thế hữu hiệu cho các loại thuốc tổng hợp [32]

Năm 2005, Wang đã nghiên cứu thấy 2 hợp chất steroid là dioscin và polyphyllin D có tiềm năng là tác nhân chống lại ký sinh trùng Dactylogyrus [50]

Năm 2012, Li và cộng sự đã phân lập được bốn hợp chất saponin steroid

mới đó là parisyunnanasides G-J và 3 hợp chất đặc biết của Paris polyphylla

var Yunnanensis là padelaoside B, pinnatasterone, và 20-hydroxyecdyson Tất

cả các hợp chất trên được đánh giá có khả năng gây độc chống lại tế bào ung thư bạch cầu CCRF của người [41]

Ngoài ra, cây Thất diệp nhất chi hoa còn có tác dụng trong điều trị các rối loạn về da liễu [9], hoạt động co cơ tử cung trên chuột thí nghiệm [36], hoạt động diệt tinh trùng có hiệu quả ở chuột, thỏ và người Vì vậy, có thể sử dụng

làm thuốc tránh thai [9] Wang (2005) cho rằng Paris polyphylla var yunanensis

ở dạng thô có thời gian làm đông máu nhanh hơn so với Paris polyphylla

chinensis và chứng tỏ thành phần saponin 6 (một nhóm pennogennin) trong

những loài này là thành phần chính trong thuốc dùng để cầm máu [50]

1.1.4 Một số bài thuốc sử dụng cây Thất diệp nhất chi hoa

Hiệu quả làm thuốc của cây Thất diệp nhất chi hoa đã được thực hiện với nhiều bài thuốc quý được sử dụng trong dân gian để chữa rắn cắn, ho hen Sau đây xin giới thiệu một số bài thuốc hay bằng cách sử dụng cây Thất diệp nhất chi hoa để điều trị như:

* Chữa rắn độc cắn: Dùng 6g bột cây Thất diệp nhất chi hoa sắc uống 1

lần và uống 2 đến 3 lần trong một ngày Hoặc có thể sắc 20g cây Thất diệp nhất chi hoa lấy nước uống trong ngày Nếu dùng thân rễ tươi thì giã nát, sau đó trộn với rượu trắng đắp vào chỗ bị rắn cắn, cách chữa này không kể liều lượng [59]

* Chữa sốt cao co giật, quai bị, sởi: Trộn 4g bột khô của cây Thất diệp

nhất chi hoa với 12g bạc hà và 8g thiên hoa phấn sắc lấy nước uống Chia làm 3 lần uống trong ngày sẽ chữa được sốt cai, co giật, quai bị, sởi

* Chữa trẻ nhỏ kinh sài, chân tay co giật: Dùng bột Thất diệp nhất chi

hoa để uống, uống 4-5 lần/ ngày, mỗi lần 0,5 - 1g [59]

* Chữa lòi dom: Mài củ cây Thất diệp nhất chi hoa trộn với dấm rồi bôi

trực tiếp nước thuốc vào hậu môn, sau đó dùng gạc băng lại Ngày làm 2 - 3 lần

sẽ khỏi bệnh lòi dom [59]

* Chữa ho, hen suyễn lâu ngày: Sắc 15g Thất diệp nhất chi hoa lấy

nước uống; hoặc hầm với thịt gà hay phổi lợn để ăn [59]

* Chữa các loại mụn độc sưng thũng: Thất diệp nhất chi hoa trộn với

dấm, giã nát, đắp lên chỗ sưng đau Làm đến khi khỏi bệnh [59]

1.2 Một số phương pháp định danh thực vật

Việt Nam là đất nước có hệ sinh thái đa dạng, ở đó số loài thực vật cũng

vô cùng phong phú Để mô tả, xếp loại hay định tên cho thực vật người ta phải dùng nhiều phương pháp phân loại khác nhau Có 2 nhóm phương pháp chủ yếu

đó là phương pháp truyền thống và phương pháp phân loại phân tử Các phương pháp truyền thống cần phải kể đến như: hình thái so sánh, giải phẫu so sánh, cổ thực vật học, hóa sinh học

Sử dụng phương pháp hình thái so sánh, người nghiên cứu sẽ dựa vào đặc điểm hình thái, nhất là hình thái cơ quan sinh sản Những thực vật càng gần nhau thì càng có nhiều đặc điểm hình thái giống nhau Hiện nay, ngoài những đặc điểm hình thái bên ngoài, người ta còn dùng cả những đặc điểm vi hình thái (micromorphologie), tức là hình thái cấu trúc của tế bào, của mô, kể cả cấu trúc siêu hiển vi, để phân loại [61]

Với phương pháp giải phẫu so sánh, đây là phương pháp chính xác và khách quan cho phép xác lập mối quan hệ thân cận không những của các nhóm lớn (như lớp, bộ, họ) mà còn cả các nhóm nhỏ (giống, loài ) và quan hệ chủng loại Ví dụ: cây 2 lá mầm phân biệt với cây 1 lá mầm bởi cấu tạo và sự sắp xếp của mô dẫn truyền trong thân Phương pháp này bổ sung thêm cho phương pháp hình thái so sánh [61]

Phân loại theo phương pháp cổ thực vật học, người nghiên cứu dựa vào các mẫu hóa đá của thực vật để tìm quan hệ thân thuộc, tìm nguồn gốc của các nhóm thực vật [57]

Những nghiên cứu về bào tử và phấn hoa, đặc biệt di tích của phấn hoa trong các thời đại địa chất đã giúp xác định thành công quan hệ họ

hàng của một số thực vật và góp phần vào việc xây dựng hệ thống chủng loại phát sinh [61]

Theo phương pháp hóa sinh học, các loài gần nhau thường chứa những hợp chất hoá học giống nhau Ví dụ, các loài thuốc lá chứa nicotin, các loài họ Hoa môi chứa tinh dầu Phương pháp này có ý nghĩa thực tiễn rất lớn, nó cho

ta hướng tìm những hợp chất cần thiết trong các loài gần gũi nhau [61]

Phương pháp phát triển cá thể, dựa trên cơ sở của qui luật phát triển cá thể: Trong quá trình phát triển, mỗi cá thể đều lặp lại những giai đoạn (những hình thức) chủ yếu mà tổ tiên nó đã trải qua Theo dõi quá trình phát triển lịch

sử của cây để xét đoán quan hệ nguồn gốc của nó [61]

Ngày nay, khoa học hiện đại ngày càng phát triển, các phương tiện nghiên cứu về định loại sinh vật khá nhanh chóng và chính xác nhờ phương pháp phân loại học phân tử Theo đó, phân loại học phân tử là phương pháp phân loại sinh vật ở mức độ phân tử thông qua các dẫn liệu so sánh hóa sinh của các phân tử lớn như DNA, RNA, protein [56]

Hiện nay, phân loại sinh học phân tử đã và đang trở thành khoa học mũi nhọn trong phân loại học, bổ sung cho phân loại học truyền thống những phương pháp nghiên cứu mới và đặc biệt phân loại hoàn toàn khác với những phân loại đã dùng trước đây Một số phương pháp thường dùng hiện nay như:

so sánh hàm lượng và thành phần protein, so sánh trình tự gen lục lạp, trình tự rRNA [56]

Đa số hệ gen lục lạp thường tồn tại ở dạng vòng kép, lớn Hệ gen lục lạp chỉ chứa khoảng 100 gen, đặc biệt với thực vật ở cạn các gen gần như là giống nhau, chúng mã hóa cho 4 loại RNA ribosom, 30 - 31 tRNA, 21 loại protein ribosom và 4 tiểu đơn vị của RNA polymerase [49]

Hệ gen lục lạp có một phần nhỏ chứa những đoạn trình tự bảo thủ, khó

bị đột biến, và gần như không biến đổi trong quá trình tiến hóa Do vậy, nhiều nhà khoa học đã sử dụng các đoạn gen này ở các loại thực vật khác nhau để làm chỉ thị định danh thực vật Các vùng gen trong hệ gen lục lạp

được sử dụng trong công nghệ mã vạch DNA hiện nay như atpF-atpH, gen matK, gen rbcL, gen rpoC1, vùng xen psbK-psbI, vùng xen trnH-psbA

và vùng gen nhân ITSAB [49]

rpoC1 là một gen mã hóa cho tiểu phần của

Gen rpoC1 rất bảo thủ mức độ đột biến trong trình tự nucleotit của gen có

thể phân biệt được loài này với loài kia, hay xác định được quan hệ họ hàng với

các loại nghiên cứu Theo Kwon - Lee KH và cs (2010) cho rằng gen rpoC1 có

thể là một marker quan trọng để phân biệt nhân sâm trồng và nhân sâm hoang

dại [39] Phân tích trình tự gen rpoC1 cho phép xác định sự khác biệt giữa các chủng C Raciborskii [37] Trên GenBank hiện nay đã có 10 trình tự gen rpoC1

của lúa [56]

Ở cây Thất diệp nhất chi hoa các công trình nghiên cứu về gen rpoC1 công bố còn khá hạn chế Theo Do và cs (2014) phân lập gen rpoC1 từ DNA của chi Paris polyphylla thu được gen có kích thước 2784bp trong đó gồm 2 exon và 1 intron [30] Theo Zhu và cs phân lập gen rpoC1 của chi Paris công

bố trên ngân hàng gen Bank có mã số GU178917 đến GU178922 Đều thu được

gen có kích thước giống nhau dài 487bp trong đó chứa 1 intron từ DNA nhằm

xác định loài của 10 loại paris đã lấy mẫu nghiên cứu [64]

Theo tổ chức Hệ thống dữ liệu mã vạch của sự sống (The Barcode of Life Data - viết tắt là BOLD) để tăng hiệu quả giám định loài cần kết hợp kết

quả của nhiều vùng gen trong đó có gen rpoC1 Ví dụ, như tổ hợp gen rpoC1 kết hợp với gen rpoB và gen matK hay sự kết hợp của rpoC1 với gen matK

và gen trnH-psbA; một tổ hợp khác là sự kết hợp của 5 gen bao gồm rbcL,

trnH, atpF-H, psbK-I, và gen matK cũng đã được thực hiện [62]

1.3 Một số phương phương pháp lưu trữ và bảo tồn giống cây trồng

Nam là một trong 16 nước có tính đa dạng sinh học cao trên thế giới nguồn tài nguyên đa dạng sinh học trong các ngành Nông nghiệp, Lâm nghiệp, Thủy sản

hàng năm cung cấp cho đất nước khoảng 2 tỷ đô la [9] Nguồn tài nguyên thiên nhiên quý giá về sinh giới này, có thể đáp ứng những nhu cầu hiện tại và tương lai của chúng ta trong quá trình phát triển về kinh tế, y tế Tuy nhiên thay vì bảo tồn nguồn tài nguyên này, thì trong thực tế hoạt động khai thác quá mức và bừa bãi nguồn tài nguyên quý giá này Nhiều loài hiện đã trở nên hiếm, một số loài đang có nguy cơ bị diệt vong Hiện nay, nguồn tài nguyên này đang suy thoái nhanh chóng [12] Nhiều báo cáo đã ghi nhận sự biến mất của các loài thực vật bị đe dọa ở Việt Nam trong đó có những loài cây thuốc quý có tên trong sách đỏ do tình trạng khai thác không có kế hoạch Khi các loài thực vật biến mất khỏi tự nhiên, đó là sự ra đi vĩnh viễn và nguồn gen không thể tái tạo được [6]

Theo số liệu điều tra của Viện Dược liệu năm 2000, Việt Nam có tới 3.800 cây thuốc thuộc khoảng 270 họ thực vật Các loài cây thuốc phân bổ khắp các vùng sinh thái ở Việt Nam Trong số đó, phần lớn các cây thuốc là mọc tự nhiên và khoảng 20% đã được gieo trồng Từ năm 1988, công tác bảo tồn nguồn gen cây thuốc đã được triển khai Tuy vậy, trong số 848 loài cây thuốc được xác định cần bảo tồn mới chỉ có 120 loài, dưới loài được bảo tồn trong các vùng và các cơ sở nghiên cứu

Để ngăn ngừa sự suy thoái đa dạng sinh học, Việt Nam đã tiến hành công tác bảo tồn đa dạng sinh học khá sớm Hai hình thức bảo tồn đa dạng sinh học phổ biến được áp dụng ở Việt Nam là: Bảo tồn nội vi hay nguyên vị (Insitu conservation) và bảo tồn ngoại vi hay chuyển vị (Exsitu conservation)

1.3.1 Bảo tồn nội vi( in – situ)

Bảo tồn nội vi bao gồm các phương pháp và công cụ nhằm mục đích bảo

vệ các loài, các chủng và các sinh cảnh, các hệ sinh thái trong điều kiện tự nhiên Tuỳ theo đối tượng bảo tồn để áp dụng các hình thức quản lý thích hợp Thông thường bảo tồn nguyên vị được thực hiện bằng cách thành lập các khu bảo tồn và đề xuất các biện pháp quản lý phù hợp

Bảo tồn tại chỗ hay bảo tồn nội vi (Insitu conservation) là hình thức bảo

tồn nguồn gen tại vùng chúng được trồng, được tồn tại trong điều kiện sinh thái

tự nhiên, có thể bảo tồn trong trang trại, bảo tồn trong vườn gia đình hoặc xây dựng các vườn quốc gia [12]

Bảo tồn nội vi là hình thức chủ yếu ở Việt Nam, phương pháp này thể hiện rõ rệt nhất là đã xây dựng và đưa vào hoạt động hệ thống một hệ thống rừng đặc dụng Theo số liệu thống kê đến 10/2006 – Cục kiểm lâm và viện điều tra quy hoạch rừng có 128 khu bảo tồn rừng Trong đó, có 30 Vườn quốc gia (VQG), 48 Khu dữ trữ thiên nhiên, 12 khu bảo tồn loài và sinh cảnh, 38 khu bảo

vệ cảnh quan, với tổng diện tích 2.400.092 ha, chiếm gần 7,24% diện tích tự nhiên trên đất liền của cả nước Như Khu bảo tồn vườn quốc gia Cúc Phương là khu bảo tồn được thành lập đầu tiên ở miền bắc, vườn quốc gia Ba Bể (Bắc Cạn), vườn quốc gia Hoàng Liên (Lào Cai) Tuy nhiên, sự đa dạng di truyền vẫn bị đe dọa [12]

1.3.2 Bảo tồn ngoại vi (Ex – situ)

Bảo tồn ngoại vi hay bảo tồn chuyển chỗ (ex-situ consertion) là một trong

những biện pháp quan trọng và có hiệu quả trong bảo tồn và phát triển đa dạng sinh học

Bảo tồn ngoại vi bao gồm các vườn thực vật, vườn động vật, các bể nuôi thuỷ hải sản, các bộ sưu tập vi sinh vật, các bảo tàng, các ngân hàng hạt giống,

bộ sưu tập các chất mầm, mô cấy Các biện pháp gồm di dời các loài cây, con

và các vi sinh vật ra khỏi môi trường sống thiên nhiên của chúng Mục đích của việc di dời này là để nhân giống, lưu giữ, nhân nuôi vô tính hay cứu hộ trong trường hợp: Nơi sinh sống bị suy thoái hay huỷ hoại không thể lưu giữ lâu hơn các loài nói trên, Dùng để làm vật liệu cho nghiên cứu, thực nghiệm và phát triển sản phẩm mới, để nâng cao kiến thức cho cộng đồng

Kỹ thuật bảo quản nguồn gen thực vật in vitro là một trong các phương

pháp bảo quản nguồn gen có vai trò quan trọng và là một bước tiến bộ vượt bậc

của khoa học kỹ thuật trong công tác nhân giống cây trồng Bảo quản in vitro

chỉ thực hiện trong không gian hẹp nhưng có thể lưu giữ được khối lượng lớn cá thể, điều kiện bảo quản hoàn toàn chủ động và là biện pháp hiệu quả đối với cây trồng nhân giống vô tính [12]

1.3.3 Bảo tồn giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Bảo tồn giống bằng kỹ thuật nuôi cấy in vitro từ lâu đã thành công trên

nhiều đối tượng cây trồng, đặc biệt kỹ thuật này có nhiều đặc tính ưu việt mà các loại hình khác không có được như: Có khả năng bảo quản giống đơn giản, cây có tỷ lệ phục tráng cao, tạo ra số lượng đồng đều không hạn chế, tiết kiệm chi phí và nâng cao hiệu quả kinh tế

1.3.3.1 Cơ sở lý luận của phương pháp bảo quản và nhân giống in vitro

Cơ sở lý luận của phương pháp nuôi cấy mô, tế bào in vitro là học thuyết

về tính toàn năng của tế bào Theo Haberland.G, nhà thực vật học người Đức, tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lượng thông tin di truyền của cơ thể, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đó đều có khả năng tái sinh và phát triển thành cá thể hoàn chỉnh [35]

Thực tế đã chứng minh được khả năng tái sinh một cơ thể thực vật hoàn chỉnh từ một tế bào riêng rẽ Hàng trăm loài cây trồng đã được nhân giống trên quy mô thương mại bằng cách nuôi cấy trong môi trường nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn [1] Morel là người đầu tiên đã thành công trong việc tái sinh và nhân nhanh giống lan quý

Cymbidium bằng phương pháp này [47] Trong một thời gian ngắn người ta có

thể thu được hàng triệu cá thể Nhờ vậy, mà hoa Cymbidium vốn đắt tiền đã có

giá thành hạ hơn và đáp ứng được nhu cầu tiêu dùng của nhiều người Ở Thái

Lan, 90% hoa lan thương mại được nhân bằng phương pháp nuôi cấy in vitro Thành công đối với họ Orchidaceae không những chỉ là bằng chứng mà còn mở

đường cho việc ứng dụng kỹ thuật này đối với các loài cây khác như cây ăn quả, cây lương thực, cây lâm nghiệp, cây thuốc, cây cảnh Ở nhiều nước trên thế

giới như Nhật Bản, Trung Quốc, Mỹ, đặc biệt ở Hà Lan đã sử dụng phương

-1010/năm [8] Các

lĩnh vực ứng dụng khác trong kỹ thuật in vitro cũng mang lại nhiều kết quả

trong việc cải tạo và phục tráng giống cây trồng

Quá trình phát sinh hình thái trong nuôi cấy in vitro thực vật thực chất là

kết quả của các quá trình phân hoá và phản phân hoá Tất cả các tế bào trong các

cơ quan khác nhau của cơ thể thực vật trưởng thành đều bắt nguồn từ tế bào phôi sinh Sự chuyển tế bào phôi sinh thành các tế bào chuyên hoá để đảm nhiệm các chức năng khác nhau được gọi là sự phân hoá tế bào Còn quá trình phản phân hoá thì ngược lại với qúa trình phân hoá, có nghĩa là tế bào đã phân hoá thành mô chức năng không hoàn toàn mất đi khả năng phân chia mà ở điều kiện thích hợp, chúng có thể trở về dạng phôi sinh và tái phân chia [1]

Trong nuôi cấy mô tế bào thực vật để thành công cần đảm bảo 3 yếu tố chính: Thứ nhất, bảo đảm điều kiện vô trùng Môi trường để nuôi cấy mô và tế bào thực vật có chứa đường, vitamin, muối khoáng rất thích hợp cho các loại nấm và vi khuẩn phát triển Do tốc độ phân bào của nấm và vi khuẩn lớn hơn rất nhiều so với tế bào thực vật, nếu trong môi trường nuôi cấy chỉ nhiễm một vài bào tử nấm hoặc vi khuẩn thì sau vài ngày đến một tuần, toàn bộ bề mặt môi trường và mô nuôi cấy sẽ phủ đầy một hoặc nhiều loại nấm và vi khuẩn Nên thí nghiệm phải bỏ đi và trong điều kiện này mô nuôi cấy sẽ không phát triển và chết dần Chính vì vậy, vô trùng tuyệt đối là điều kiện cần thiết đầu tiên để thành công trong nuôi cấy mô tế bào thực vật [5]

Thứ hai, chọn đúng môi trường và chuẩn bị môi trường đúng cách Trong hàng trăm loại môi trường do nhiều tác giả đề nghị cho nhiều loại cây và nhiều mục đích nuôi cấy khác nhau, về cơ bản có thể chia làm 3 loại, môi trường nghèo dinh dưỡng điển hình là môi trường White, Knop và Knudson C; Môi trường có hàm lượng dinh dưỡng trung bình điển hình như môi trường B5 của Gamborg và môi trường giàu dinh dưỡng như môi trường MS (Murashige – Skoog) Mỗi loại cây khác nhau, thích nghi với từng môi trường khác nhau Với những đối tượng

cây trồng mới chưa có tài liệu trước đó, cần thăm dò môi trường phù hợp trên từng đối tượng loại cây trồng Hiện nay môi trường MS được coi là môi trường thích hợp với nhiều loại cây do giàu và cân bằng về mặt dinh dưỡng [5]

Thứ 3, chọn mô cấy và xử lí mô cấy thích hợp trước và sau khi cấy Các

mô có thể sử dụng làm mô cấy như là thịt quả non, chồi nách, cuống hoa, đế hoa,

mô phân sinh , khi đặt vào môi trường nuôi cấy có chứa một chất sinh trưởng thích hợp đều có khả năng phân chia và phân hóa Sau khi cấy, mô cấy cần đặt trong điều kiện nhiệt độ và ánh sáng ổn định, tùy vào các mục đích nghiên cứu

mà có các chế độ chiếu sáng khác nhau Chẳng hạn, quá trình tạo mô sẹo có thể cần bóng tối hay ánh sáng, nhưng quá trình tái sinh và nhân giống vô tính nhất thiết phải có ánh sáng [5]

Vì vậy, cần thực hiện đúng các thao tác kỹ thuật và lựa chọn môi trường nuôi cấy phù hợp nhằm đạt kết quả cao trong nuôi cấy mô tế bào thực vật

1.3.3.2 Ứng dụng của kỹ thuật nuôi cấy in vitro

Nuôi cấy mô tế bào thực vật, thực chất là một phương pháp nhân giống

vô tính Đối với nhiều loài thực vật quý hiếm, có giá trị kinh tế và ý nghĩa sinh học khi gặp khó khăn trong vấn đề nhân giống hữu tính thì nhân giống vô tính

in vitro là công cụ vô cùng hữu ích Trên thực tế, có nhiều loài thực vật nhân

giống hữu tính bằng hạt có hệ số nhân cao nhưng vẫn tiến hành nhân giống vô

tính in vitro là do các phương pháp nhân giống hữu tính bằng hạt mặc dù cho hệ

số nhân giống cao, dễ bảo quản và vận chuyển nhưng với một số cây trồng, khi nhân giống bằng hạt sẽ cho ra các cây con không hoàn toàn giống bố mẹ cả về hình thái và thành phần hoá học [8] Sự không đồng nhất này gây ra khó khăn trong việc đưa cây vào sản xuất theo dây truyền công nghiệp vì các cây có chất lượng sản phẩm không đồng đều, làm giảm giá trị thương phẩm Đặc biệt, đối với nhiều cây dược liệu, việc nhân giống hữu tính gặp khó khăn như Ô dầu, Bạch truật có hạt nảy mầm chậm, hay với đan sâm hạt chín không đều và thời gian nảy mầm kéo dài, gây khó khăn cho việc sản xuất đại trà Một số cây gỗ khác có thời gian sinh trưởng kéo dài như Sơn thù và Đỗ trọng khi di thực về

trồng ở SaPa phải mất mười năm cây mới ra hoa, bộ phận làm thuốc của cây sơn thù là quả nhưng khi cây còn trẻ chỉ cho hoa đực vì vậy không có quả Các cây Tam thất, Nhân sâm, hoàng liên phải sử dụng hạt tươi mới nảy mầm nên thu hoạch đến đâu cần gieo ngay đến đó gây nhiều khó khăn cho sản xuất…[2] Mặt khác, phương pháp nhân giống truyền thống (chiết, giâm, ghép) vẫn còn nhiều nhược điểm như sự lây nhiễm bệnh qua nguyên liệu thường phổ biến và phức tạp, hệ số nhân thấp, việc sử dụng chính các bộ phận làm thuốc để nhân giống rất lãng phí, tốn kém

Việc không đồng nhất về chất lượng (hàm lượng các chất hoạt tính) trong nhân giống truyền thống sẽ dẫn đến hậu quả là nguyên liệu không ổn định, không đáp ứng được nhu cầu sản xuất Ví dụ: đối với các cây lấy tinh dầu, việc nhân giống bằng hạt dẫn tới sự phân ly không đều về hàm lượng các thành phần hoạt chất, cây cọ dầu khi nhân giống bằng hạt, hàm lượng tinh dầu ở cây con phân ly từ 0,5% đến 11,3%, hàm lượng lynalylacetat từ 11% đến 78%; cây Bạc hà nhân giống hữu tính có sự phân ly rất lớn về hàm lượng và thành phần tinh dầu [48]

Để khắc phục những nhược điểm trên, phương pháp nhân giống vô tính được áp dụng đã mang lại nhiều hiệu quả kinh tế và ý nghĩa sinh học lớn lao, nhân giống vô tính tạo ra các cây con đồng đều về mặt di truyền do duy trì được các tính trạng của cây mẹ nên có thể áp dụng sản xuất đại trà cho sản phẩm có chất lượng ổn định; rút ngắn thời gian từ khi trồng đến khi thu hoạch tạo điều kiện cho tăng vụ, tăng sản lượng đối với những cây có thời gian nảy mầm của hạt kéo dài…[3] Chính vì vậy, phương pháp nhân giống

in vitro ngày càng được khai thác và sử dụng một cách triệt để Có rất nhiều

loại cây trồng nói chung và cây thuốc nói riêng được nhân nhanh bằng

phương pháp này Ví dụ: Từ một cây D.floribunda bằng phương pháp nhân

giống thông thường chỉ tạo ra 8 - 10 cây con trong vòng một năm, nhưng cùng thời gian một năm với phương pháp nhân giống in vitro bằng cách sử

dụng chồi nách để nhân có thể tạo ra hàng vạn cây D.floribunda, hay tạo ra

26 vạn cây Cam thảo trong năm tháng [29]

Ở Việt Nam, Mai Thị Tân và cộng sự (1993) đã đạt được hệ số nhân

cho quả thu hoạch và nhân giống từ hạt Ứng dụng nhân nhanh in vitro cho

đối tựơng này, người ta có thể cung cấp được 500.000 cây con giống hệt nhau trong vòng một năm [48] Mai Xuân Lương, Nguyễn Văn Kết (1994)

dự tính hàng năm có thể thu được 76 cây giống khi nuôi cấy chồi của cây cẩm chướng [10]

Trong công tác giống cây trồng, vấn đề được quan tâm hàng đầu là chất lượng và số lượng giống Bằng phương pháp nuôi cấy đỉnh sinh trưởng, người ta

đã tạo ra được những giống cây hoàn toàn sạch virus Limasset và Cornel (1949)

đã chứng minh được rằng nồng độ virus trong thực vật giảm dần ở bộ phận gần đỉnh sinh trưởng Riêng đỉnh sinh trưởng thì hoàn toàn sạch virus Nguyên nhân của hiện tượng này là đỉnh sinh trưởng không có hệ thống mô dẫn làm cho virus

và vi sinh vật không có khả năng xâm nhập Đỉnh sinh trưởng là nơi sinh tổng hợp của auxin và auxin có tác dụng ức chế sinh sản của virus Qúa trình phân chia tế bào đỉnh sinh trưởng không kéo theo sự phân chia của virus [43]

Nuôi cấy mô tế bào chủ yếu được dùng để phục tráng và nhân nhanh theo các hướng vi nhân giống, sản xuất hạt giống nhân tạo và làm sạch bệnh Qua

nuôi cấy in vitro, tế bào được trẻ hoá thông qua quá trình phản phân hoá để trở

về trạng thái phôi sinh Từ đó cho ra đời những cây con có tuổi sinh lý trẻ hơn, làm sức sống của cây trồng tăng lên, dẫn đến tăng năng suất và chất lượng sản phẩm [12] Những kỹ thuật này, ở nước ngoài đã được áp dụng trên phần lớn cây trồng Đối với cây thuốc, giống địa hoàng, ở Trung Quốc, Hàn Quốc, bạch truật ở Nhật Bản… cũng đã thành công theo phương pháp này

Sở dĩ nuôi cấy in vitro có thể chủ động trong sản xuất do có những điểm khác biệt so với các phương pháp nhân giống truyền thống đó là, nhân giống in

vitro được thực hiện trên một môi trường đặc biệt, cung cấp đầy đủ các điều

kiện cho mô, tế bào nuôi cấy phát triển Môi trường nuôi cấy là yếu tố quan trọng quyết định đến kết quả của nuôi cấy mô tế bào

1.3.3.3 Các đường hướng trong nhân giống in vitro

Quá trình thực hiện, nhân giống in vitro sẽ tạo ra các dòng vô tính Theo

đó, dòng vô tính là một nhóm cá thể có kiểu gen tương tự nhau, chúng được

nhân bằng sinh sản vô tính Trong nuôi cấy in vitro, các dòng vô tính này sẽ

được tạo ra theo hai đường hướng chính: (i) Tái sinh cây trực tiếp từ đỉnh sinh trưởng, phôi, ngọn chồi, chồi nách; (ii) Tái sinh cây gián tiếp thông qua giai đoạn hình thành mô sẹo

Tái sinh trực tiếp từ mẫu nuôi cấy là quá trình phát động những điểm tồn tại sẵn có trong mô nuôi cấy phân chia và tái sinh thành cây Xét về nguồn gốc các cây này có thể phát sinh từ chồi đỉnh, chồi nách phá ngủ hoặc từ chồi mới phát sinh Các cây con này, được phát sinh từ các đỉnh sinh trưởng có bộ nhiễm sắc thể 2n, hoàn toàn đồng nhất về mặt di truyền và duy trì được các tính trạng của cây

mẹ Tái sinh trực tiếp cũng có thể xuất phát từ những tế bào không nằm trên đỉnh sinh trưởng đó là các đoạn thân, mảnh lá, cuống lá, mảnh hoa….Trong trường hợp này, các tế bào thường phân chia nhưng không hình thành các tế bào mô sẹo mà tạo thành các điểm sinh trưởng phụ sau đó tái sinh thành cây con Xác xuất biến dị

và đột biến thường cao hơn so với tái sinh từ ở trường hợp nói trên [22]

Nghiên cứu khả năng tái sinh chồi và cụm chồi trong nuôi cấy in vitro cây Hà thủ ô đỏ (Polygonum multiflorunb.) theo cách sử dụng những đoạn thân

mang một mắt của cây Hà thủ ô trưởng thành ngoài tự nhiên, đầu tiên đoạn thân

trong 30 giây, sau đó dùng NaClO 0,5% khử trùng trong 10 phút, rồi cấy trên môi trường MS cơ bản có bổ sung BAP 4mg/l và NAA 0,1mg/l nhằm kích thích đoạn thân tạo cụm chồi Các chồi đơn được tách

từ cụm chồi in vitro và tạo rễ trên môi trường MS có bổ sung NAA 0,5 mg/l Kết quả tạo ra những cây hà thủ ô con có đặc điểm giống cây mẹ từ nuôi cấy in

vitro chồi và cụm chồi [7]

Theo con đường tái sinh gián tiếp, mẫu cấy khi nuôi cấy trong môi trường thích hợp có chứa auxin và cytokinin có thể đem lại sự

không tổ chức đó chính là các tế bào mô sẹo Trong nuôi cấy, sự tăng sinh này có thể được duy trì nhiều hay ít là không hạn định, chỉ cần mô sẹo được cấy chuyển sang môi trường mới theo chu kỳ Tuy nhiên, tế bào mô sẹo khi cấy chuyển nhiều lần sẽ không ổn định về mặt di truyền Để tránh tình trạng này nên sử dụng các mô sẹo vừa mới phát sinh Nuôi cấy mô sẹo có vai trò vô cùng quan trọng trong công nghệ sinh học thực vật Tỷ lệ auxin và cytokinin trong môi trường có thể dẫn tới sự phát triển của ngọn, rễ hay phôi soma từ đó có thể tạo thành cây hoàn chỉnh Nuôi cấy mô sẹo cũng có thể được sử dụng để mở đầu nuôi cấy tế bào dịch huyền phù hay tạo ra hạt nhân tạo [7]

Để có thể thực hiện nuôi cấy có kết quả tốt, dù bằng con đường nào đi chăng nữa cũng cần chú ý tới các yếu tố ảnh hưởng tới nuôi cấy vì chính các yếu tố này quyết định đường hướng vô tính cũng như chất lượng của cây giống thu được

Nhân giống in vitro cây Mỏ quạ được tiến hành thông qua sự hình thành

mô sẹo, mô sẹo tạo phôi vô tính và cây con là một minh chứng của con đường tái sinh gián tiếp Theo đó, mô sẹo được hình thành trên môi trường MS bổ sung 2,4D nồng độ 0,5, 1,0 và 1,5 mg/l kết hợp với BAP Mô sẹo có khả năng phát sinh phôi vô tính, tạo cây con trên môi trường có sự kết hợp 2 BAP mg/l và NAA 0,05 và 0,1 mg/l [4]

Theo Nguyễn Thị Lý Anh và Đinh Thị Phòng (2007), quá trình nhân giống in

vitro bao gồm 5 bước [1]

Bước thứ nhất: Chọn lọc và chuẩn bị cây mẹ Trong bước này phải chọn cây

mẹ sạch bệnh, đặc biệt là bệnh virus và ở giai đoạn sinh trưởng mạnh Việc trồng các cây mẹ trong điều kiện môi trường thích hợp với chế độ chăm sóc và phòng trừ sâu bệnh hiệu quả trước khi cấy mẫu sẽ làm giảm tỷ lệ mẫu nhiễm, tăng khả năng sống, sinh trưởng của mẫu nuôi cấy

Bước thứ hai: Nuôi cấy khởi động, đây là giai đoạn khử trùng đưa các mẫu

vào nuôi cấy in vitro Các khâu chủ yếu của giai đoạn này như: Khử trùng bề mặt mẫu

vật, cấy mẫu vào ống nghiệm hoặc bình nuôi cấy có sẵn môi trường nhân tạo Yêu cầu ở giai đoạn này phải có tỷ lệ mẫu nhiễm thấp, tỷ lệ mẫu sống cao, mẫu sinh trưởng và phát triển tốt Sau một thời gian nhất định, từ mẫu nuôi cấy bắt đầu xuất hiện các cụm tế bào hoặc cơ quan (chồi, cụm chồi, rễ) hoặc các phôi vô tính có đặc tính gần như phôi hữu tính Sau một thời gian nhất định tuỳ thuộc vào loại cây, mẫu cấy đó được chuyển sang giai đoạn tiếp theo

Bước thứ ba: Bước nhân nhanh Khi mẫu cấy sạch đã được tạo ra, từ đó nhân lên thành các cụm chồi hoặc các phôi vô tính Giai đoạn này cần tạo ra tốc

độ nhân nhanh cao nhất trong điều kiện nuôi cấy Vì vậy, thành phần và điều kiện môi trường phải được tối ưu nhằm đạt được mục tiêu nhân nhanh

Quy trình cấy chuyển nhân nhanh thường diễn ra trong khoảng từ một đến hai tháng tháng tuỳ loại cây Tỷ lệ nhân nhanh sau mỗi lần cấy chuyển đạt khoảng 2 - 8 lần cấy chuyển Giai đoạn nhân nhanh chồi từ một vài chồi ban đầu không nên kéo dài quá lâu để tránh biến dị soma

Kết quả nhân nhanh chồi cây Chuối cho thấy, từ một chồi cây Chuối chọn lọc ban đầu người ta chỉ nên nhân khoảng 2000 đến 3000 chồi cây mới sau 7 - 8 lần cấy chuyển sẽ hạn chế được sự xuất hiện biến dị soma [20]

Các chồi nhân nhanh cần được chuyển sang môi trường tạo rễ để tái sinh thành cây hoàn chỉnh

Bước 4: Tạo cây in vitro hoàn chỉnh

Các chồi hình thành trong quá trình nuôi cấy có thể phát rễ tự sinh nhưng thông thường các chồi này phải được cấy chuyển sang một môi trường khác để kích thích tạo rễ Ở một số loài khác thì các chồi sẽ tạo rễ khi được chuyển trực tiếp ra đất Giai đoạn này trong vòng từ 2 - 8 tuần Sau khi cây đã được tái sinh hoàn chỉnh sẽ được đưa trở về điều kiện tự nhiên để sản xuất đại trà

Bước 5: Thích ứng cây in vitro ngoài điều kiện tự nhiên

Đây là giai đoạn đầu tiên chuyển cây từ điều kiện vô trùng trong phòng thí

nghiệm ra thích ứng với điều kiện môi trường ngoài tự nhiên Cây cần được chăm sóc cẩn thận để đạt tỷ lệ sống cao Giai đoạn này đòi hỏi từ 4 - 16 tuần tuỳ từng đối tượng nghiên cứu [1]

Hiện nay chưa có công trình nghiên cứu nào công bố nhân giống in vitro

thành công trên cây Thất diệp nhất chi hoa Tuy nhiên đã thành công trên nhiều đối tượng cây trồng khác nhau, trong đó có một số cây dạng thân củ, ví dụ như nghiên cứu của Nguyễn Quang Thạch và cs (2010) đã tạo được giống cây Khoai môn sọ từ kỹ thuật nuôi cấy in vitro theo cách: Khử trùng mẫu củ Khoai môn sọ bằng dung dịch HgCl2 0,1% trong 15 phút sau đó ngâm mẫu vào dung dịch Johson trong 15 phút Tạo tỷ lệ mẫu sạch bệnh đạt 66,67% - 88,67% Các mắt ngủ được cắt thành những tế bào lớp mỏng, nhân nhanh trên nền môi trường

MS có bổ sung TDZ 1,5mg/l cho hệ số nhân giống của các thí nghiệm tăng từ

8,07 đến 9,12 lần Cây Khoai môn sọ in vitro ra rễ hiệu quả trên môi trường MS

cơ bản [16]

Dựa trên những thành tựu nghiên cứu đã thành công bước đầu nghiên cứu

nhân giống in vitro cây Thất diệp nhất chi hoa tạo nền tảng nhằm phục vụ cho

quy trình nghiên cứu và tạo cây hoàn chỉnh

Chương 2 VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Vật liệu nghiên cứu

2.1.1 Vật liệu

Mẫu cây Thất diệp nhất chi hoa thu thập từ các tỉnh Lào Cai, Hà Giang, Lạng Sơn được sử dụng làm vật liệu nghiên cứu

C rpoC1-1f/rpoC1-3r do phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện

Công nghệ Sinh học Việt Nam cung cấp Cặp mồi có trình tự nucleotide như sau:

- Môi trường nuôi cấy cơ bản là môi trường MS (Murashige và Skoog, 1962) có bổ sung thạch agar (8,5g/lít), đường (30g/lít) và các chất kích thích sinh trưởng với nhiều nồng độ khác nhau, pH môi trường được điều chỉnh tới

2.1.2.2 Thiết bị

Box cấy, nồi hấp khử trùng, máy sấy, cân điện tử, bình tam giác có kích thước từ 250 đến 500ml, pipet, dụng cụ nuôi cấy…Các hóa chất và thiết bị cần thiết phục vụ cho quá trình nghiên cứu nuôi cấy mô tại phòng công nghệ tế bào thuộc khoa Sinh học, trường Đại học sư phạm Thái Nguyên

Các thí nghiệm phân lập gen, được tiến hành trên trang thiết bị của phòng Công nghệ DNA ứng dụng, phòng công nghệ tế bào thực vật và phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ gen, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam