BÁO CÁO VI SINH VI KHUẨN CLOSTRIDIUM BOTULINUM TRONG ĐỒ HỘP

Thực phẩm đóng hộp có trên thị trường và ngày càng được nhiều người sử dụng. Là một trong những thực phẩm thường được dự trữ. Nếu khi mua và sử dụng đồ hộp không cẩn thận, con người có thề bị ngộ độc do ăn phải mầm bệnh phát triển trong loại thực phẩm này. Ngộ độc thường được ghi nhận là do bị nhiễm độc tố vi khuẩn Clostridium Botulinum có trong đồ hộp, còn gọi là ngộ độc Botulism, có thể gây tử vong, gây phá hủy hệ thần kinh. Bệnh ngộ độc Botulism là bệnh nhiễm độc do độc tố xâm nhập vào thực phẩm, phát triển và sinh ra độc tố. Người ăn phải thức ăn có độc tố sẽ bị nhiễm độc. Còn vi khuẩn thường không gây ra bệnh vì nó không sinh sản được trong cơ thể người.Vi khuẩn Clostridium Botulinum lần đầu tiên được công nhận và cô lập năm 1896 bởi Emile van Ermengem từ nơi chế biến thịt đùi lợn dính líu vào một ổ dịch Botulism. Các cô lập ban đầu được dặt tên là Botulinus baciluss. Tuy nhiên, cô lập từ các ổ dịch tiếp theo luôn luôn tìm thấy là những dạng bào tử kỵ khí, do đó, Bengston đề xuất sinh vật được đặt vào chi Clostridium.C. botulinum phân bố khắp nơi trong đất. Đặc biệt những nơi như đất vườn, nghĩa trang, nơi chăn nuôi gia súc, gia cầm. Trong các loại rau quả, kể cả mật ong cũng có thể chứa loại khuẩn này. Chúng cũng có trong ruột của các động vật nuôi trong nhà, ruột cá, đôi khi có cả trong ruột người. Do vi khuẩn này có nhiều trong tự nhiên nên rất dễ nhiễm vào thực phẩm trong quá trình sản xuất, chế biến, vận chuyển và bảo quản. Vì vậy, để việc sử dụng đồ hộp cũng như các loại thực phẩm khác một cách an toàn, nhóm sẽ tìm hiểu về vi khuẩn C. Botulinum và việc hình thành độc tố botulin trong đồ hộp của vi khẩn này.  

MỞ ĐẦU

Thực phẩm đóng hộp có trên thị trường và ngày càng được nhiều người sử dụng Là một trong những thực phẩm thường được

dự trữ Nếu khi mua và sử dụng đồ hộp không cẩn thận, con người

có thề bị ngộ độc do ăn phải mầm bệnh phát triển trong loại thực phẩm này Ngộ độc thường được ghi nhận là do bị nhiễm độc tố vi

khuẩn Clostridium Botulinum có trong đồ hộp, còn gọi là ngộ độc

Botulism, có thể gây tử vong, gây phá hủy hệ thần kinh Bệnh ngộ độc Botulism là bệnh nhiễm độc do độc tố xâm nhập vào thực phẩm, phát triển và sinh ra độc tố Người ăn phải thức ăn có độc tố sẽ bị nhiễm độc Còn vi khuẩn thường không gây ra bệnh vì nó không sinh sản được trong cơ thể người

Vi khuẩn Clostridium Botulinum lần đầu tiên được công nhận và

cô lập năm 1896 bởi Emile van Ermengem từ nơi chế biến thịt đùi lợn dính líu vào một ổ dịch Botulism Các cô lập ban đầu được dặt tên là Botulinus baciluss Tuy nhiên, cô lập từ các ổ dịch tiếp theo luôn luôn tìm thấy là những dạng bào tử kỵ khí, do đó, Bengston đề

xuất sinh vật được đặt vào chi Clostridium.

C botulinum phân bố khắp nơi trong đất Đặc biệt những nơi

như đất vườn, nghĩa trang, nơi chăn nuôi gia súc, gia cầm Trong các loại rau quả, kể cả mật ong cũng có thể chứa loại khuẩn này Chúng cũng có trong ruột của các động vật nuôi trong nhà, ruột cá, đôi khi

có cả trong ruột người Do vi khuẩn này có nhiều trong tự nhiên nên rất dễ nhiễm vào thực phẩm trong quá trình sản xuất, chế biến, vận chuyển và bảo quản

Vì vậy, để việc sử dụng đồ hộp cũng như các loại thực phẩm

khác một cách an toàn, nhóm sẽ tìm hiểu về vi khuẩn C Botulinum

và việc hình thành độc tố botulin trong đồ hộp của vi khẩn này

I.TỔNG QUAN VỀ CLOSTRIDIUM BOTULINUM:

1 Giới thiệu:

 Vực (domain): Bacteria

 Ngành (phylum): Firmicutes

 Lớp (class): Clostridia

 Bộ (ordo):

Clostridiales

 Họ (familia): Clostridiaceae

 Chi (genus): Clostridium

 Loài(species): C.Botulinum

Clostridium botulinum là vi khuẩn Gram dương, hình que, kị khí

tuyệt đối (phát triển trong môi trường không có oxy), hầu hết không

di chuyển Dưới ảnh hưởng của nhiệt độ cao và các yếu tố môi

trường bất lợi, vi khuẩn chuyển thành các bào tử hình oval rất bền vững Vi khuẩn phát triển thuận lợi ở 3-43°C Ở nhiệt độ thích hợp, không có oxy, ẩm ướt và pH acid yếu ( pH> 4,6), bào tử biến đổi lại thành vi khuẩn và phát triển, tiết ra độc tố botulin

C botulinum có khả năng sinh nhiều loại độc tố nhưng quan

trọng nhất là độc tố thần kinh Có 7 loại độc tố thần kinh kí hiệu từ A đến G, trong đó những độc tố loại A, B, E, F gây bệnh ở người còn những độc tố loại C, D chỉ gây bệnh trên động vật Bản thân vi

khuẩn và bào tử không gây ra bệnh mà bệnh là do độc tố của nó sinh ra, gây liệt thần kinh

Sự tăng trưởng của vi khuẩn có thể được ngăn chặn bởi acid cao,

tỷ lệ của đường hòa tan cao, nồng độ oxy cao, độ ẩm thấp hoặc lưu trữ dưới nhiệ độ 38o F

C botulinum có thể được chia thành 4 nhóm khác nhau dựa trên

đặc điểm sinh hóa và sinh lí:

*Nhóm C.botulinum I bao gồm:

- Chủng độc tố loại A

-Những biến dạng thủy phân protein của độc tố loại B và F

-Những kiểu độc tố kép AB, AF, BF

Đặc điểm chính: những thanh hơi cong với long roi có thanh nhung rải rác, sản xuất bào tử với khả năng chịu nhiệt cao, độ pH tối thiểu có thể ức chế hoạt động của vi khuẩn này trong nước là

0,94-4,6 Các chủng thuộc nhóm I không gây ảnh hưởng đến thần kinh và

vì vậy ít được chú ý hơn trong vấn đề bảo quản lạnh Tuy nhiên bào

tử bền nhiệt có thể dẫn đến các vấn đề trong việc xử lý các thực phẩm cần qua gia nhiệt do các bào tử này quá bền vững và an toàn đối với vi khuẩn

*Nhóm C.botulinum II bao gồm:

- Chủng độc tố loại E

-Những biến dạng không thủy phân protein nhưng phân giải đường của độc tố loại B và F

Đặc điểm: bao gồm những thanh thẳng với long roi có lông

nhung rải rác, pH tối thiểu để ức chế hoạt động của vi khuẩn trong nước là 0,97-5 Là nguy cơ tiềm ẩn trong các thực phẩm đông lạnh Chúng không phân giải các protein tự nhiên, có thể sinh trưởng và tạo độc tố ở nhiệt độ 3 độ C và tạo bào tử có mức kháng nhiệt thấp Các chủng này có khả năng chống chịu với tác động ức chế của muối khá tốt Khả năng tăng trưởng và tạo độc tố ở giới hạn nhiệt độ thấp của các chủng II không cao, và sẽ tiếp tục giảm nếu có thêm những yếu tố bất lợi ảnh hưởng đến tăng trưởng

*Nhóm C.botulinum loại III bao gồm:

-Những độc tố loại C và D

-Những biến dạng nói chung là không có thủy phân protein

Đặc điểm: thanh thẳng với lông roi có lông nhung rải rác, sản xuất bào tử với khả năng chịu nhiệt trung gian Thường gây bệnh ở động vật và chim

* Nhóm V loại IV bao gồm:

- Thủy phân protein của chủng độc tố loại G

Đặc điểm: tương tự nhóm III, vai trò của chúng trong ngộ độc thực phẩm vẫn chưa được hiểu rõ Các chủng thuộc nhóm này và một số loài clostridia không tạo độc tố đã được gộp chung và tạo nên một loài mới là Clostridium argentinens

2 Cấu trúc:

a Cấu trúc tế bào:

Trên tiêu bản nhuộm gram, vi

khuẩn bắt màu Gram dương, có hình

dạng thẳng hoặc hơi cong, kích thước

chiều rộng 0,3-0,7 µm, chiều dài

3,5-7,0 µm Sinh bào tử, bào tử thường to

hơn chiều ngang của tế bào

b Cấu trúc phân tử:

Bộ gen của Clostridium botulinum là 3.886.916 bp,trong đó G +

khoảng 28,2 % ,ngoài ra còn có một plasmid 16,334 bp

Toxin được tổng hợp từ một chuỗi polypeptid có trọng lượng phân tử gần 150.000 dalton Ở cấu trúc này phân tử độc tố có hoạt lực tương đối thấy, nhưng khi bị một số enzym của vi khuẩn và

trypsin tách ra thành hai chuỗi nặng (100.000 dalton) và nhẹ

(50.000 dalton) nối với nhau bằng cầu nối sunfur có gắn một phân tử Zn

II PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CLOSTRIDIUM BOTALINUM:

1/ Phương pháp truyền thống

1.1/ Thiết bị và vật liệu

- Tủ lạnh

- Giấy thấm khô

- Đèn cồn

- Dụng cụ vô trùng

- Cối và chày vô trùng

- Pipet có nút và bông gòn vô khuẩn

- Ống nghiệm vô trùng

- Que cấy

- Tủ ấm, 35± 1°C và 26± 1°C

- Bình vô khuẩn bảo quản mẫu dự trữ

- Giá đựng ống nghiệm

- Kính hiển vi

- Đĩa petri vô trùng 15100 mm

- Ống ly tâm

- Máy li tâm lạnh tốc độ cao

- Ống tiêm vô trùng 1 hoặc 3 ml với kích cỡ 25cm, 1cm, 6cm để tiêm vào chuột

- Chuột (khoảng 12-20g)

1.2/ Môi trường, dụng cụ, hóa chất

- Pepton đệm bufer pepton water (BPW)

- Iron suphide Agar (ISA)

- Perfringns selective Agar (shahidi ferguson ferfringns, SPF)

- Môi trường dịch thể TPGY hay với trypsin (TPGYT)

- Môi trường dịch thể gan băm hay môi trường thịt chín (hoặc nước luộc thịt)

- Môi trường thạch- lòng đỏ trứng-gan- thịt bê hay thạch- lòng

đỏ trứng yếm khí

- Dung dịch cồn- odine (iodine 4% cồn 70%)

- Dung đệm phosphate vô trùng, pH=6,2

- Dung dịch nước muối vô trùng

- Dung dịch NAOH 1N

- Dung dịch HCl 1N

- Dung dịch trypsin (difco, 1:250)

- Thuốc nhuộm Gram, tím kết tinh hay xanh methylene

1.3/ Quy trình phân tích

a Chuẩn bị mẫu trước khi phân tích

- Mẫu được giải đông ở nhiệt độ không quá 45°C và được phân tích ngay sau khi giải đông

- Cân 25g mẫu trong túi PE vô trùng, bổ sung 225ml dung dịch đệm phosphat và đồng nhất mẫu

- Pha loãng nồng độ theo dãy thập phân (10-1, 10-2, 10-3,…)

- Mẫu được xử lý ở nhiệt độ 70-80°C trong 20 phút để diệt bớt tế bào sinh dưỡng của cơ thể vi sinh vật khác

b Tiến hành cấy

- Cấy vào đĩa petri đã vô trùng 1ml dịch mẫu đã được pha loãng

- Tiếp tục cho vào 20-25ml môi trường ISA đã được ủ ẩm ở 45°C vào đĩa, lắc đều

- Đĩa đã được cấy mẫu đem ủ ở 37°C trong 24-48h trong các bình kị khí

c Thu thập kết quả

- Quan sát, ghi nhận khuẩn lạc nghi ngờ (khuẩn lạc có tần

số xuất hiện nhiều nhất) tiến hành quan sát tế bào dưới kính hiển vi và test sinh hóa, đếm tổng số khuẩn lạc

C1. Test sinh hóa

Tính chất của các chủng:

- tính chất sinh hóa: lên men các loại đường và sinh khí

F

B,E, F

C, D

G

-Lên men

Succarose

-Lên men

Trehalose

- hình thể: trực khuẩn 2 đầu tròn, nhiều lông quang thân, không sinh vỏ

- Nha bào: bầu dục nằm gần đầu vi khuẩn

- Nuôi cấy: kị khí tuyệt đối, môi trường 35-37°C, pH trong khoảng 6-7

- Môi trường đặc nuôi cấy: khuẩn lạc nhỏ, chắc, hình đậu, hình sợi

- Môi trường lỏng nuôi cấy: đục đều môi trường cặn ở đáy

- Môi trường thạch máu nuôi cấy: có vòng tan máu

C2 Quan sát tế bào

 Lấy tế bào:

- Cho 1 giọt nước lên tâm lam kính, sau đó dùng que cấy lấy khuẩn lạc trong đĩa petri bôi lên chổ giọt nước và dàn đều

có đường kính 2cm

- Cố định tế bào: hơ lam kính trên ngọn lửa đèn cồn (chú ý không để nóng quá và hơ mặt dưới lam kính tránh để tế bào tiếp xúc trực tiếp ngọn lửa vì có thể chết tế bào cần quan sát), để diệt bớt hoặc ức chế một số tế bào

 Tiến hành nhuộm:

- Nhỏ dung dịch thuốc nhuộm tím Violet lên tế bào, khoảng 15s đi rửa bằng nước cất (chú ý rửa nước cho trôi theo một chiều đồng thời không dội trực tiếp lên chỗ tế bào) đến khi nước rửa không còn màu tím thì dừng lại

- Để khô tự nhiên hoặc có thể hơ nhẹ trên ngọn lửa đèn cồn

- Tiếp tục cho Liugon vào tế bào vi khuẩn, tương tự sau 15s đem rửa và làm khô (mục đích để cho tế bào bắt màu tím bền hơn)

- Sau đó nhỏ cồn 90° vào, dùng để tẩy màu vì cồn có thể thấm vào trong tế bào khi đó một số tế bào có màu tím và một số không có màu tím, tương tự cũng tiến hành rửa và làm khô

- Cuối cùng nhuộm đỏ Fuchin, mục đích phân biệt vi khẩn

G+(có màu tím) và vi khuẩn G-(có màu đỏ)

 Tiến hành quan sát dưới kính hiển vi:

- Tế bào Clotridium có hình que dạng vùi trống, bắt màu tím

ở một đầu

- Quan sát kĩ hơn về hình thái, xem có tế bào đang ở giai đoạn sinh sản không

1.4/ Sơ đồ phân tích

Ủ trong bình kín ở 37°C trong 24-48h

Đổ lớp ISA thứ 2 khi lớp thứ nhất đã đông đặc

Đồng nhất và pha loãng mẫu theo dãy thập phân (10-1,10-2,10-3, ) rồi tiến hành xử lý mẫu ở 80°C

Cấy 1ml mẫu vào đĩa petri, đổ 10-15ml môi

trường ISA ở 45°C lắc đều

 Công thức tính:

CFU

Trong đó:

A: Tổng số khuẩn lạc đếm được trên đĩa

V: Thể cấy vào mỗi đĩa

d: nồng độ pha loãng tương ứng

1.5/ Kiểm tra độc tố của C.botulinum

a) Thí nghiệm trên chuột

- Chuẩn bị thức ăn cho chuột và tẩm ướt dịch khuẩn

- Tiến hành quan sát, nếu chuột không có triệu chứng gì thì

khẳng định ngay chuột có khả năng kháng botulin, hay nói cách khác C.botulinum không gây độc hại đến sức khỏe, còn nếu có

những triệu chứng như lông xù lên, thở mạnh từng hồi, liệt và yếu dần rồi chết thì ta tiến hành kiểm tra xem chuột chết phải do độc tố botulin không

b) Tiến hành kiểm tra

- Chuẩn bị mẫu: lấy dịch ruột của con chuột chết để tiến hành kiểm tra

- Tiến hành thực hiện như mục 1.3

* Nếu kết quả quan sát được giống với khuẩn lạc C.botulinum thì khẳng định chuột chết là do độc tố botulin

Đếm tất cả các khuẩn lạc màu đen có đường kính

>0.5 mm

Tính kết quả

* Nếu kết quả không giống thì có thể chuột chết là do nguyên

nhân khác

Khuẩn lạc C.botulinum 48 tiếng Xuất hiện kết tủa bao quanh khuẩn lạc

2/ Phương pháp sử dụng môi trường Trypticase Peptone Glucose Yeast Extract với Trypin (TPGYT)

2.1/ Chuẩn bị mẫu

Mẫu là thực phẩm đóng hộp còn nguyên có đánh số thứ tự mẫu Đối với thực phẩm rắn và lỏng, cho vào cối vô trùng, thêm một lượng dung dịch đệm phosphate rồi nghiền bằng chày vô trùng Hay

có thể gắp từng mẫu nhỏ thực phẩm cho vào môi trường tăng sinh nhờ cặp ghép vô trùng Cấy trực tiếp thực phẩm mẫu lỏng vào môi trường nuôi cấy bằng pipet Chuẩn bị các mẫu dự trữ, sau khi nuôi cấy, chuyển từng phần mẫu dự trữ vào bình đựng mẫu dự trữ và bình đựng mẫu vô trùng để sử dụng các test khi cần thiết

2.2/ Phát hiện tế bào vi khuẩn:

* Tăng sinh:

- Chuẩn bị 4 ống nghiệm vô trùng (có nút bông), cho vào mỗi ống 1 ống Durham

- Loại bỏ oxi trong môi trường tăng sinh bằng hơi nước trong

10-15 phút và làm lạnh nhanh

- Cấy vào hai ống nghiệm chứa môi trường thịt chín 1-2 gam thực phẩm rắn hay 1-2ml thực phẩm lỏng (cho 15ml môi trường tăng sinh) Ủ ở 35°C

- Cho vào hai ống nghiệm môi trường TPGYT thay thế được vi khuẩn nghi ngờ là chủng không phân hủy protein chứa các kháng nguyên B, E hay F

- Lưu ý: Phải cho mẫu thực phẩm chìm vào bên dưới bề mặt môi trường Sau 5 ngày ủ, kiểm tra canh trường vi khuẩn, kiểm tra độ đục của môi trường, sự tạo khí, hay sự phân hủy cơ chất của thịt Lưu ý mùi tạo thành, kiểm tra canh trường vi khuẩn dưới kính hiển vi bằng cách chuẩn bị và quan sát vết bôi dịch vi khuẩn nhuộm Gram (hay giọt ép dưới kính hiển vi đối pha có độ phân giải cao, hay

nhuộm đơn với tím kết tinh hay xanh methylene dưới kính hiển vi nền sáng) Kiểm tra hình thái vi khuẩn và lưu ý tế bào điển hình của C.botulinum số lượng tìm thấy, mức độ bào tử hóa và vị trí của bào

tử trong tế bào Cũng thời điểm này, kiểm tra vi khuẩn về khả năng tạo toxin, thông thường toxin được tạo ra với nồng độ lớn nhất sau 7 ngày ủ, ủ thêm 10 ngày nữa để phát hiện ra bào tử tổn thương do chậm phát triển thành tế bào dinh dưỡng trước khi hấp nước ở áp suất cao để loại bỏ môi trường này Để phân lập giống thuần, bảo quản canh trường tại thời điểm tạo nhiều bào tử nhất ở 4°C

* Phân lập giống thuần

- Có thể phân lập nhanh các vi khuẩn C.botulunum từ hệ vi sinh vật hỗn hợp trong môi trường tăng sinh hay mẫu thực phẩm ban đầu nếu quá trình bào tử xảy ra tốt

- Tiền xử lý mẫu để cấy ria: thêm vào ống nghiệm vô trùng có nút bông chứa 1-2ml canh trường vi khuẩn một thể tích tương ứng cồn tuyệt đối đã được lọc vô trùng, lắc đều và ủ nhiệt trong phòng trong 1 giờ Để phân lập vi khuẩn, lấy 1-2ml mẫu đã dự trữ cho vào ống nghiệm có nút bông, thêm một thể tích tương ứng cồn tuyệt đối

đã lọc vô trùng, lắc đều và ủ ở nhiệt độ phòng trong 1 giờ Hay cách khác, có thể đun 1 hay 2ml môi trường tăng sinh có chứa vi khuẩn ở 80°C trong 10-15 phút để tiêu diệt tế bào sinh dưỡng Không xử nhiệt với các vi khuẩn C.botulinum không phân hủy protein

- Cấy mẫu đã xử lý: xử lý que cấy vòng cấy 1 hay 2 vòng cấy chứa đầy dịch mẫu đã xử lý theo một trong hai cách trên môi trường thạch-lòng đỏ trứng-gan thịt bê hay thạch-lòng đỏ trứng yếm khí để tách khuẩn lạc phát triển riêng lẻ Nếu có thể pha loãng đến mức có thể cho các khuẩn phát triển dính vào nhau sau khi ủ Ủ các đĩa khô trước khi đem ủ nhằm tránh các vi khuẩn dính vào nhau sau khi ủ Ủ các đĩa ở 35°C trong 48 giờ trong điều kiện yếm khí

* Chọn các khuẩn lạc vi khuẩn C.botulinum điển hình

- Chọn: chọn lấy mẫu 10 khuẩn lạc điển hình của vi khuẩn

C.botulinum phát triển độc lập Những khuẩn lạc này có đặc điểm gỗ cao hay dẹt, nhân hay xù xì Chúng thường phát triển và phân bố dàn trải và có mép không đều Trên bề mặt trứng thì chúng có bề mặt óng ánh khi kiểm tra dưới ánh sáng chiếu lệch góc Những vùng óng ánh này trông giống như lớp ngọc trai, theo trước và sau đường viền không đều của khuẩn lạc Bên cạnh vùng ngọc trai của khuẩn lạc C.botulinum loại C, D và F thường được bao quanh bởi một vòng kết tủa rộng (2-4mm), màu vàng Các loại khuẩn lạc A và B thường

có vùng kết tủa nhỏ hơn

- Cấy khuẩn lạc vào môi trường dịch thể: sử dụng que cấy vòng

để cấy khuẩn lạc C.botulinum loại E vào môi trường TPGY, các khuẩn lạc sinh ra các toxin khác vào môi trường gan băm hay môi trường thịt chín Sau đó đem ủ trong 5 ngày, kiểm tra sự tạo thành toxin

- Phân lập giống thuần: cấy ria lại các chủng loại toxin lên môi trường thạch lòng đỏ trứng Ủ một đĩa ở 35°C trong điều kiện yếm khí, còn đĩa kia ủ ở 35°C trong điều kiện hiếm khí Nếu khuẩn lạc điển hình của C.botulinum phát triển trên đĩa thạch đã yếm khí và không phát triển trên đĩa hiếu khí thì giống có thể đã thuần Nếu không phân lặp được C.botulinum từ ít nhất trong các khuẩn lạc đã chọn thì có nghĩa là mật độ của chúng trong hệ vi sinh vật hỗn hợp

có thể thấp Tiếp tục cấy chuyền liên tiếp vào môi trường tăng sinh

có thể làm tăng số lượng của chúng lên đủ để cho phép phân loại được Bảo vệ giống thuần ở trạng thái bào tử trong tủ lạnh, trên các hạt thủy tinh, đông lạnh hay đông khô

2.3/ Phát hiện độc tố botulin

Chuẩn bị mẫu: Lấy 1 phần mẫu để phát hiện tế bào vi khuẩn C.botulinum sống, một phần khác để kiểm tra độc tính Bảo quản phần mẫu còn lại trong tủ lạnh Ly tâm các mẫu chứa chất rắn lơ lửng trong điều kiện và sử dụng phần lỏng để phân tích độc tính Chiết mẫu thực phẩm rắn với một thể tích tương ứng của dung dịch trong đệm gel-phosphate pH=6,2 Tẩm ướt chất đệm vào mẫu thực phẩm bằng cối và chày đã làm sạch Ly tâm mẫu đã giã trong điều kiện lạnh và sử dụng phần lỏng để phân tích độc tính

* Xác định độc tính của mẫu thực phẩm hay môi trường vi khuẩn

- Xử lý với Trypsin: nếu có mặt các độc tố của các vi khuẩn

không phân hủy protein trong mẫu thực phẩm thì cần phải kích hoạt bằng Trypsin để xác định Vì vậy cần xử lý phần lỏng của mẫu rắn