Nghiên cứu sự sắp xếp của các DNA oligomer trên nhiễm sắc thể vi khuẩn và nấm men

coli là một protein dimer bất đối xứng....12 Hình 2.7 Tính bất đối xứng monomer cục bộ của phân tử DNA nhiễm sắc thể của một số vi khuẩn...18 Hình 2.8 DNA-walk trên các đoạn ở hai đầu củ

MỤC LỤC

DANH MỤC HÌNH x

DANH MỤC BẢNG xiv

DANH MỤC HÌNH PHỤ xv

DANH MỤC BẢNG PHỤ xvii

CÁC TỪ VIẾT TẮT xviii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU 1

1.1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI 1

1.2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU 2

1.3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU 2

1.4 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU 3

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU 4

1.6 Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU 4

1.7 TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU 4

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU 6

2.1 DNA 6

2.2 DNA OLIGOMER 7

2.3 CẤU TRÚC DNA NHIỄM SẮC THỂ 8

2.3.1 Nhiễm sắc thể tế bào sinh vật prokaryote 8

2.3.2 Nhiễm sắc thể tế bào sinh vật eukaryote 9

2.4 SỰ SAO CHÉP DNA NHIỄM SẮC THỂ 11

2.4.1 Sự sao chép DNA nhiễm sắc thể trong tế bào vi khuẩn 11

2.4.2 Sự sao chép DNA nhiễm sắc thể trong tế bào eukaryote 13

2.5 TÍNH BẤT ĐỐI XỨNG VÀ ĐỐI XỨNG CỦA DNA NHIỄM SẮC THỂ .14

2.5.1 Các định luật của Erwin Chargaff 14

2.5.2 Các phương pháp xác định tính bất đối xứng và đối xứng của DNA 14

2.5.3 Sự tuân thủ của DNA nhiễm sắc thể theo các định luật của Erwin Chargaff 17

i

2.6 TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE TRONG PHÂN TỬ DNA NHIỄM SẮC THỂ

VÀ CÁC MỐI LIÊN QUAN 21

2.6.1 Sự phân bố của các nucleotide trong phân tử DNA nhiễm sắc thể và vị trí điểm khởi đầu sao chép 21

2.6.2 Hai mạch sao chép DNA và các bộ máy sao chép 24

2.6.3 Sự thay đổi trình tự nucleotide nhiễm sắc thể bằng phương pháp tái tổ hợp sử dụng trình tự oligonucleotide sợi đơn và hiệu suất tái tổ hợp 25

2.6.4 Sự thay đổi trình tự nucleotide nhiễm sắc thể và các mối liên quan 26

2.6.5 Codon, sự sử dụng codon và mức độ biểu hiện gene 27

2.7 PHÂN LOẠI CÁC VI KHUẨN CÓ MỐI QUAN HỆ TIẾN HÓA GẦN 29

2.7.1 Phân loại nhờ các đặc điểm sinh, lý, hóa 29

2.7.2 Phân loại nhờ các trình tự 16S rDNA 30

2.7.3 Phân loại nhờ các trình tự bộ gene 33

2.7.4 Phân loại nhờ các dấu hiệu bộ gene 35

2.7.5 Phân loại nhờ tín hiệu tuần hoàn nucleotide 37

CHƯƠNG 3 MỤC TIÊU VÀ NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU 39

3.1 MỤC TIÊU NGHIÊN CỨU 39

3.1.1 Mục tiêu lý thuyết 39

3.1.2 Mục tiêu ứng dụng 39

3.2 NHIỆM VỤ NGHIÊN CỨU 39

CHƯƠNG 4 NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

4.1 NGUYÊN VẬT LIỆU 40

4.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40

4.2.1 Xác định nucleotide skew 41

4.2.2 Xác định tần suất xuất hiện của các oligomer trong một trình tự nucleotide sợi đơn 41

4.2.3 Xác định tần suất xuất hiện của các trimer trong các trình tự mang thông tin mã hóa protein của phân tử DNA nhiễm sắc thể theo vị trí các nucleotide của codon 42

4.2.4 Xác định sự sử dụng codon 43

4.2.5 Xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các vi khuẩn dựa trên trình tự 16S rDNA 44

ii

4.2.6 Xác định mật độ phân bố của các trimer trong một trình tự DNA sợi đơn

44

4.2.7 Xác định mối quan hệ tiến hóa giữa các vi khuẩn dựa trên mật độ phân bố của các trimer trong phân tử DNA nhiễm sắc thể 45

4.2.8 So sánh mức độ bất đối xứng trimer của các trình tự mang thông tin mã hóa protein của phân tử DNA nhiễm sắc thể trên cơ sở tần suất xuất hiện của các trimer mã hóa codon 45

4.2.9 Phương pháp Trimer-walk 48

CHƯƠNG 5 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ BÀN LUẬN 49

5.1 NGHIÊN CỨU SỰ SẮP XẾP CỦA CÁC OLIGOMER TRONG PHÂN TỬ DNA NHIỄM SẮC THỂ 49

5.1.1 Bước đầu tìm hiểu sự phân bố của các nucleotide trong phân tử DNA nhiễm sắc thể 49

5.1.2 Nghiên cứu sự sắp xếp của các nucleotide trong các trình tự mang thông tin mã hóa protein của phân tử DNA nhiễm sắc thể 67

5.1.3 Nghiên cứu sâu về sự phân bố của các trimer mã hóa codon trong các trình tự sense và antisense của phân tử DNA nhiễm sắc thể 76

5.1.4 Nghiên cứu sự phân bố của các trimer trong các trình tự không mã hóa protein của phân tử DNA nhiễm sắc thể 98

5.2 ỨNG DỤNG SỰ PHÂN BỐ CỦA CÁC TRIMER TRONG BỘ GENE ĐỂ PHÂN LOẠI CÁC VI KHUẨN CÓ MỐI QUAN HỆ TIẾN HÓA GẦN 109

5.2.1 Tính đặc trưng loài của mật độ phân bố của các trimer trong phân tử DNA nhiễm sắc thể 110

5.2.2 Ứng dụng mật độ phân bố của các trimer trong bộ gene để phân loại các vi khuẩn có mối quan hệ tiến hóa gần 111

CHƯƠNG 6 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 121

6.1 KẾT LUẬN 121

6.2 KIẾN NGHỊ 121

CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 123

TÀI LIỆU THAM KHẢO 124

PHỤ LỤC 137

iii

DANH MỤC HÌNH

Hình 2.1 Thành phần hóa học của DNA 7

Hình 2.2 Các liên kết hydrogen giữa các nucleotide bổ sung trong phân tử DNA 7

Hình 2.3 Ảnh chụp nhiễm sắc thể của tế bào vi khuẩn E coli 9

Hình 2.4 Cấu trúc nhiễm sắc thể của tế bào sinh vật eukaryote 10

Hình 2.5 Bộ máy sao chép DNA của vi khuẩn E coli 12

Hình 2.6 Enzyme replicase của vi khuẩn E coli là một protein dimer bất đối xứng 12

Hình 2.7 Tính bất đối xứng monomer cục bộ của phân tử DNA nhiễm sắc thể của một số vi khuẩn 18

Hình 2.8 DNA-walk trên các đoạn ở hai đầu của 16 phân tử DNA nhiễm sắc thể tế bào nấm men 19

Hình 2.9 Tần suất xuất hiện của các oligomer trên hai sợi bổ sung của phân tử DNA nhiễm sắc thể người số 22 20

Hình 2.10 Các ví dụ minh họa sự phân bố không cân đối của một số oligomer ở hai phía của điểm khởi đầu sao chép của bốn bộ gene vi khuẩn 22

Hình 2.11 Xác định vị trí điểm khởi đầu sao chép nhờ tần suất xuất hiện của các oligomer trong bộ gene của hai vi khuẩn cổ 24

Hình 2.12 Minh họa một cây phát sinh loài 31

Hình 4.1 Minh họa hai sợi DNA bổ sung của một phân tử DNA nhiễm sắc thể 40

Hình 4.2 Cách xác định tần suất xuất hiện của các trimer dọc theo chiều dài một trình tự nucleotide sợi đơn 41

Hình 4.3 Minh họa vị trí của các trimer trong các trình tự mang thông tin mã hóa protein của phân tử DNA nhiễm sắc thể theo vị trí của các nucleotide của codon 43

Hình 5.1 Tần suất xuất hiện của các monomer và oligomer trên hai sợi bổ sung của phân tử DNA nhiễm sắc thể 51

Hình 5.2 Minh họa sự hiện diện của một trimer và trimer BSĐN của nó trong một trình tự nucleotide sợi đơn 52

Hình 5.3 GC skew trong phân tử DNA nhiễm sắc thể B cereus ATCC 10987 53

Hình 5.4 AT skew trong phân tử DNA nhiễm sắc thể B cereus ATCC 10987 53

Hình 5.5 GC skew trong phân tử DNA nhiễm sắc thể số 4 của S cerevisiae 54

Hình 5.6 AT skew trong phân tử DNA nhiễm sắc thể số 4 của S cerevisiae 54

Hình 5.7 Các đồ thị biểu diễn sự phân bố của 6 cặp dimer/dimer BSĐN dọc theo chiều dài sợi Watson của phân tử DNA nhiễm sắc thể B cereus ATCC 10987 56

iv

Hình 5.8 Các đồ thị biểu diễn sự phân bố của các cặp AAA/TTT, AAC/GTT,AAT/ATT và ACA/TGT dọc theo chiều dài sợi Watson của phân tử DNA nhiễm sắc

thể B cereus ATCC 10987 57

Hình 5.9 Các đồ thị biểu diễn sự phân bố của các cặp AAAA/TTTT, AAAC/GTTT,AAAG/CTTT và AAAT/ATTT dọc theo chiều dài sợi Watson của phân tử DNA

nhiễm sắc thể B cereus ATCC 10987 58

Hình 5.10 Các đồ thị biểu diễn sự phân bố của 6 cặp dimer/dimer BSĐN dọc theo

chiều dài sợi Watson của phân tử DNA nhiễm sắc thể số 4 của S cerevisiae 59

Hình 5.11 Các đồ thị biểu diễn sự phân bố của các cặp AAA/TTT, AAC/GTT,AAT/ATT và ACA/TGT dọc theo chiều dài sợi Watson của phân tử DNA nhiễm sắc

thể số 4 của S cerevisiae 60

Hình 5.12 Các đồ thị biểu diễn sự phân bố của các cặp AAAA/TTTT, AAAC/GTTT,AAAG/CTTT và AAAT/ATTT dọc theo chiều dài sợi Watson của phân tử DNA

nhiễm sắc thể số 4 của S cerevisiae 61

Hình 5.13 Tần suất xuất hiện của các dimer trong tất cả các trình tự mang thông tin mãhóa protein của phân tử DNA nhiễm sắc thể 63Hình 5.14 Tần suất xuất hiện của các dimer trong tất cả các trình tự không mã hóaprotein của phân tử DNA nhiễm sắc thể 63Hình 5.15 Tần suất xuất hiện của các trimer trong tất cả các trình tự mang thông tin mãhóa protein của phân tử DNA nhiễm sắc thể 64Hình 5.16 Tần suất xuất hiện của các trimer trong tất cả các trình tự không mã hóaprotein của phân tử DNA nhiễm sắc thể 64Hình 5.17 Tần suất xuất hiện của các tetramer trong tất cả các trình tự mang thông tin

mã hóa protein của phân tử DNA nhiễm sắc thể 65Hình 5.18 Tần suất xuất hiện của các tetramer trong tất cả các trình tự không mã hóaprotein của phân tử DNA nhiễm sắc thể 66Hình 5.19 Tần suất xuất hiện của các cặp trimer mã hóa codon trong tất cả các trình tựmang thông tin mã hóa protein của phân tử DNA nhiễm sắc thể 69Hình 5.20 Tần suất xuất hiện của các trimer theo vị trí của các nucleotide của codontrong tất cả các trình tự mang thông tin mã hóa protein của phân tử DNA nhiễm sắcthể 70Hình 5.21 Tần suất xuất hiện của các trimer theo vị trí của các nucleotide của codontrong tất cả các trình tự sense và trong tất cả các trình tự antisense của phân tử DNAnhiễm sắc thể 72Hình 5.22 So sánh mức độ bất đối xứng của 5601 trình tự sense và antisense trong

phân tử DNA nhiễm sắc thể vi khuẩn B cereus ATCC 10987 78

Hình 5.23 So sánh mức độ bất đối xứng của 726 trình tự sense và antisense trong phân

tử DNA nhiễm sắc thể số 4 của S cerevisiae 79

Hình 5.24 So sánh các dãy giá trị bi(T/T BSĐN) trung bình của các nhóm I và II của cácphân tử DNA nhiễm sắc thể của các vi khuẩn khác nhau 85

v

Hình 5.25 So sánh các dãy giá trị bi(T/T BSĐN) trung bình của các nhóm I và II của 16

phân tử DNA nhiễm sắc thể của S cerevisiae 86

Hình 5.26 Sự phân bố của các trimer mã hóa codon trong các nhóm trình tự I và IItrong Hình 5.22 87Hình 5.27 Sự phân bố của các trimer mã hóa codon trong các nhóm trình tự I và IItrong Hình 5.23 88Hình 5.28 Đường cong tích lũy các giá trị gán bi(T/T BSĐN) trung bình trên các trình tự

sense và antisense của phân tử DNA nhiễm sắc thể B cereus ATCC 10987 90

Hình 5.29 Đường cong tích lũy các giá trị gán bi(T/T BSĐN) trung bình trên các trình tự

sense và antisense của phân tử DNA nhiễm sắc thể số 4 của S cerevisiae 91

Hình 5.30 Hai replichore của phân tử DNA nhiễm sắc thể vi khuẩn 93Hình 5.31 Mật độ phân bố của các trimer mã hóa codon trong các trình tự sense và

antisense trên hai replichore của phân tử DNA nhiễm sắc thể B cereus ATCC 10987.

95Hình 5.32 Hệ số tương quan Pearson của các dãy giá trị bi(T/T BSĐN) của các trình tựmang thông tin mã hóa protein và không mã hóa protein với dãy giá trị bi(T/T BSĐN) của

tất cả các trình tự mRNA của B cereus ATCC 10987 100

Hình 5.33 Hệ số tương quan Pearson của các dãy giá trị bi(T/T BSĐN) của các trình tựmang thông tin mã hóa protein và không mã hóa protein với dãy giá trị bi(T/T BSĐN) của

tất cả các trình tự mRNA của nhiễm sắc thể số 4 của S cerevisiae 101

Hình 5.34 So sánh các dãy giá trị bi(T/T BSĐN) giữa các trình tự mang thông tin mã hóa

protein và giữa các trình tự không mã hóa protein của phân tử DNA nhiễm sắc thể B.

cereus ATCC 10987 102

Hình 5.35 So sánh các dãy giá trị bi(T/T BSĐN) giữa các trình tự mang thông tin mã hóaprotein và giữa các trình tự không mã hóa protein của phân tử DNA nhiễm sắc thể số 4

của S cerevisiae 103

Hình 5.36 Đồ thị biểu diễn sự phân bố của các trimer dọc theo các trình tự không mã

hóa protein của phân tử DNA nhiễm sắc thể B cereus ATCC 10987 104

Hình 5.37 Đồ thị biểu diễn sự phân bố của các trimer BSĐN dọc theo các trình tự

không mã hóa protein của phân tử DNA nhiễm sắc thể B cereus ATCC 10987 105

Hình 5.38 Đồ thị biểu diễn sự phân bố của các trimer dọc theo các trình tự không mã

hóa protein của phân tử DNA nhiễm sắc thể số 4 của S cerevisiae 106

Hình 5.39 Đồ thị biểu diễn sự phân bố của các trimer BSĐN dọc theo các trình tự

không mã hóa protein của phân tử DNA nhiễm sắc thể số 4 của S cerevisiae 107

Hình 5.40 Mật độ phân bố của các trimer trong các trình tự mang thông tin mã hóaprotein và không mã hóa protein của phân tử DNA nhiễm sắc thể 108Hình 5.41 Tần suất xuất hiện của các trimer trong phân tử DNA nhiễm sắc thể của các

vi khuẩn khác nhau 110Hình 5.42 Mật độ phân bố của các trimer trong các phân tử DNA nhiễm sắc thể củacác vi khuẩn 111

vi

Hình 5.43 Phân loại Enterobacteria trên cơ sở các trình tự 16S rDNA 114 Hình 5.44 Phân loại Enterobacteria trên cơ sở mật độ phân bố của các trimer trong bộ

DANH MỤC BẢNG

Y

Bảng 2.1 Sự sử dụng codon ở vi khuẩn và người 28

Bảng 4.1 Minh họa cách sắp các giá trị b(T/T BSĐN) của các cặp T/TBSĐN trong các trình tự sense hoặc antisense Sj của phân tử DNA nhiễm sắc thể 47

Bảng 5.1 Sự sử dụng codon ở B cereus ATCC 10987 74

Bảng 5.2 Sự sử dụng codon ở S cerevisiae 75

Bảng 5.3 Các giá trị bi(T/T BSĐN) trung bình của mỗi nhóm trình tự trong Hình 5.22 82

Bảng 5.4 Các giá trị bi(T/T BSĐN) trung bình của mỗi nhóm trình tự trong Hình 5.23 83

viii

DANH MỤC HÌNH

YHình phụ 1 Tính bất đối xứng monomer cục bộ của các phân tử DNA nhiễm sắc thể

S cerevisiae 144

Hình phụ 2 Các đồ thị biểu diễn sự phân bố của các cặp ACC/GGT, ACG/CGT, ACT/

AGT và AGA/TCT dọc theo chiều dài sợi Watson của phân tử DNA nhiễm sắc thể B.

cereus ATCC 10987 146

Hình phụ 3 Các đồ thị biểu diễn sự phân bố của các cặp AGC/GCT, AGG/CCT, ATA/

TAT và ATC/GAT dọc theo chiều dài sợi Watson của phân tử DNA nhiễm sắc thể B.

cereus ATCC 10987 146

Hình phụ 4 Các đồ thị biểu diễn sự phân bố của các cặp ATG/CAT, CAA/TTG, CAC/

GTG và CAG/CTG dọc theo chiều dài sợi Watson của phân tử DNA nhiễm sắc thể B.

cereus ATCC 10987 147

Hình phụ 5 Các đồ thị biểu diễn sự phân bố của các cặp CCA/TGG, CCC/GGG, CCG/

CGG và CGA/TCG dọc theo chiều dài sợi Watson của phân tử DNA nhiễm sắc thể B.

cereus ATCC 10987 147

Hình phụ 6 Các đồ thị biểu diễn sự phân bố của các cặp CGC/GCG, CTA/TAG, CTC/

GAG và CTT/AAG dọc theo chiều dài sợi Watson của phân tử DNA nhiễm sắc thể B.

cereus ATCC 10987 148

Hình phụ 7 Các đồ thị biểu diễn sự phân bố của các cặp GAA/TTC, GAC/GTC, GCA/

TGC và GCC/GGC dọc theo chiều dài sợi Watson của phân tử DNA nhiễm sắc thể B.

cereus ATCC 10987 148

Hình phụ 8 Các đồ thị biểu diễn sự phân bố của các cặp GGA/TCC, GTA/TAC, TAA/

TTA và TCA/TGA dọc theo chiều dài sợi Watson của phân tử DNA nhiễm sắc thể B.

cereus ATCC 10987 149

Hình phụ 9 Các đồ thị biểu diễn sự phân bố của các cặp AAA/TTT, AAC/GTT, AAT/ATT và ACA/TGT dọc theo chiều dài sợi Watson của đoạn có vị trí từ 1000 đến

521000 của phân tử DNA nhiễm sắc thể B cereus ATCC 10987 149

Hình phụ 10 Các đồ thị biểu diễn sự phân bố của các cặp AAA/TTT, AAC/GTT,AAT/ATT và ACA/TGT dọc theo chiều dài sợi Watson của đoạn có vị trí từ 1000 đến

53000 của phân tử DNA nhiễm sắc thể B cereus ATCC 10987 150

Hình phụ 11 Các đồ thị biểu diễn sự phân bố của các cặp ACC/GGT, ACG/CGT,ACT/AGT và AGA/TCT dọc theo chiều dài sợi Watson của phân tử DNA nhiễm sắc

Hình phụ 13 Các đồ thị biểu diễn sự phân bố của các cặp ATG/CAT, CAA/TTG,CAC/GTG và CAG/CTG dọc theo chiều dài sợi Watson của phân tử DNA nhiễm sắc

Hình phụ 19 Các đồ thị biểu diễn sự phân bố của cặp AAA/TTT dọc theo chiều dài sợi

Watson của các phân tử DNA nhiễm sắc thể số 5, 6, 7 và 8 của S cerevisiae 156

Hình phụ 20 Các đồ thị biểu diễn sự phân bố của cặp AAA/TTT dọc theo chiều dài sợi

Watson của các phân tử DNA nhiễm sắc thể số 9, 10, 11 và 12 của S cerevisiae 157

Hình phụ 21 Các đồ thị biểu diễn sự phân bố của cặp AAA/TTT dọc theo chiều dài sợi

Watson của các phân tử DNA nhiễm sắc thể số 13, 14, 15 và 16 của S cerevisiae 157

Hình phụ 22 Các đồ thị biểu diễn sự phân bố của các cặp AAA/TTT, AAC/GTT,AAT/ATT và ACA/TGT dọc theo chiều dài sợi Watson của đoạn có vị trí từ 1 đến

150000 của phân tử DNA nhiễm sắc thể số 4 của S cerevisiae 158

Hình phụ 23 Các đồ thị biểu diễn sự phân bố của các cặp AAA/TTT, AAC/GTT,AAT/ATT và ACA/TGT dọc theo chiều dài sợi Watson của đoạn có vị trí từ 1 đến

15000 của phân tử DNA nhiễm sắc thể số 4 của S cerevisiae 159

Hình phụ 24 Tần suất xuất hiện của các trimer theo vị trí của các nucleotide của codon

trong tất cả các trình tự sense và antisense của các phân tử DNA nhiễm sắc thể B lata

383 160Hình phụ 25 Đường cong tích lũy các giá trị gán bi(T/T BSĐN) trung bình trên các trình tựmang thông tin mã hóa protein của phân tử DNA nhiễm sắc thể các vi khuẩn 202Hình phụ 26 Đường cong tích lũy các giá trị gán bi(T/T BSĐN) trung bình trên các trình tự

mang thông tin mã hóa protein của các phân tử DNA nhiễm sắc thể S cerevisiae 204

Hình phụ 27 Mật độ phân bố của các trimer mã hóa codon trong các trình tự sense và

antisense trên hai replichore của các phân tử DNA nhiễm sắc thể B lata 383 206

Hình phụ 28 Sự chồng khít lên nhau của các kết quả trong Hình 5.38 và Hình 5.39 208

x

DANH MỤC BẢNG PHỤ

Bảng phụ 1 Số lượng các nucleotide trong phân tử DNA nhiễm sắc thể B cereus

ATCC 10987 137

Bảng phụ 2 16 dimer và dimer BSĐN tương ứng 138

Bảng phụ 3 64 trimer và trimer BSĐN tương ứng 138

Bảng phụ 4 256 tetramer và tetramer BSĐN tương ứng 138

Bảng phụ 5 1024 pentamer và pentamer BSĐN tương ứng 139

Bảng phụ 6 Các điểm khởi đầu sao chép đã được xác minh trong nhiễm sắc thể số 4 của S cerevisiae 155

Bảng phụ 7 4096 hexamer được sắp theo trật tự alphabet 161

Bảng phụ 8 Vị trí của 2790 trình tự sense và antisense (nhóm I) trong phân tử DNA nhiễm sắc thể B cereus ATCC 10987 168

Bảng phụ 9 Vị trí của 2811 trình tự sense và antisense (nhóm II) trong phân tử DNA nhiễm sắc thể B cereus ATCC 10987 178

Bảng phụ 10 Vị trí của 363 trình tự sense và antisense (nhóm I) trong phân tử DNA nhiễm sắc thể số 4 của S cerevisiae 187

Bảng phụ 11 Vị trí của 363 trình tự sense và antisense (nhóm II) trong phân tử DNA nhiễm sắc thể số 4 của S cerevisiae 189

Bảng phụ 12 Kết quả phân nhóm khi so sánh các dãy giá trị bi(T/T BSĐN) của các trình tự sense và antisense trong các nhiễm sắc thể vi khuẩn 190

Bảng phụ 13 Kết quả phân nhóm khi so sánh các dãy giá trị bi(T/T BSĐN) của các trình tự sense và antisense trong các nhiễm sắc thể của S cerevisiae 191

Bảng phụ 14 Thành phần trimer mã hóa codon trong các nhóm a và b của 16 phân tử DNA nhiễm sắc thể của S cerevisiae trong nghiên cứu ở Mục 5.1.3.1 và Mục 5.1.3.2.2 193

Bảng phụ 15 Các giá trị bi(T/T BSĐN) trung bình của các nhóm I ở Hình 5.24 194

Bảng phụ 16 Các giá trị bi(T/T BSĐN) trung bình của các nhóm II ở Hình 5.24 196

Bảng phụ 17 Các giá trị bi(T/T BSĐN) trung bình của các nhóm I ở Hình 5.25 198

Bảng phụ 18 Các giá trị bi(T/T BSĐN) trung bình của các nhóm II ở Hình 5.25 200

Bảng phụ 19 bi(T/T BSĐN) trung bình của các nhóm (I) và (II) trong Hình 5.35 207

xi

Sợi T Sợi đơn DNA làm khuôn cho quá trình phiên mã

Sợi NT Sợi đơn DNA bổ sung với sợi làm khuôn cho quá trình phiên mã

NCBI National Center for Biotechnology Information

xii

CHƯƠNG 1 MỞ ĐẦU

1.1 LÝ DO CHỌN ĐỀ TÀI

Cùng với sự tiến bộ của tin học trong sinh học cũng như của các kỹ thuật thao táctrong sinh học phân tử, các trình tự hoàn chỉnh của bộ gene (genome) đã và đang trởthành nguồn thông tin quí giá hỗ trợ cho việc tìm hiểu cấu trúc bộ gene và các quátrình sinh học xảy ra trong tế bào sinh vật Các mối liên hệ giữa cấu trúc bộ gene vàcác quá trình sinh học xảy ra trong tế bào có thể được xác định thông qua việc thay đổihoặc xóa bỏ các trình tự nucleotide trong bộ gene Tuy nhiên, các kỹ thuật cao trongsinh học phân tử chưa đủ để việc thay đổi hoặc xóa bỏ các trình tự nucleotide trong bộgene luôn được thành công Các nghiên cứu gần đây của một số nhà khoa học trên thếgiới trong việc tìm hiểu, thay đổi và tạo mới các trình tự bộ gene đã tiết lộ sự liên quancủa sự sắp xếp của các nucleotide trong bộ gene đến một số các quá trình sinh học xảy

ra trong tế bào [ CITATION Ell01 \l 1033 ]1, [ CITATION LiX03 \l 1033 ]2, [ CITATION Ita05 \l 1033 ]3, [ CITATION Wan07 \l 1033 ]4, [ CITATION Esn07 \l

1033 ]5, [ CITATION Hol07 \l 1033 ]6, [ CITATION Gib08 \l 1033 ]7 Các kết quả

nghiên cứu này cho thấy những quá trình sinh học đó tác động lên sự thành công củacác thí nghiệm tìm hiểu, thay đổi và tạo mới các trình tự bộ gene Mặc dù các sinh vậtkhác nhau có các bộ gene với các trình tự nucleotide khác nhau, các nghiên cứu vào

những năm 2001 [ CITATION QiD011 \l 1033 ]8 và 2002 [ CITATION Bai02 \l

1033 ]9 cho thấy các phân tử DNA nhiễm sắc thể của các bộ gene đều có chung một

đặc điểm, đó là tính đối xứng Không như tính đối xứng trên cơ sở khoảng cách củahai vật thể nào đó thường được đề cập trong hình học, tính đối xứng của phân tử DNAnhiễm sắc thể sinh vật là đặc điểm dựa trên sự phân bố của các nucleotide trong phân

tử DNA nhiễm sắc thể Rõ ràng, các phân tử DNA nhiễm sắc thể tuy không giốngnhau về trình tự nucleotide nhưng lại giống nhau về đặc tính đối xứng, có nghĩa là cácnucleotide phải được sắp xếp theo một qui tắc nào đó để phân tử DNA nhiễm sắc thểtrở nên đối xứng Tuy nhiên, vẫn chưa có một qui tắc nào về sự sắp xếp của cácnucleotide trong phân tử DNA nhiễm sắc thể được công bố cho đến nay

xiii

Mặt khác, nhờ sự phát triển vượt trội của kỹ thuật xác định trình tự DNA, số lượng các

vi sinh vật với trình tự bộ gene được xác định hoàn chỉnh tăng lên đáng kể

[ CITATION ftp \l 1033 ]10 Sự góp mặt của các trình tự bộ gene hoàn chỉnh của các

vi sinh vật đã mở ra một hướng mới cho việc nhận biết các loài, mặc dù hiện nay việcphân loại các vi sinh vật một cách nhanh chóng về cơ bản dựa trên mức độ đồng dạngcủa các trình tự 16S rDNA – là các trình tự mang thông tin mã hóa cho thành phần 16SrRNA của bộ máy tổng hợp protein ribosome Tuy nhiên, các trình tự 16S rDNA gầnđây được phát hiện là không đủ đặc trưng để luôn được sử dụng với vai trò này, đặcbiệt là trong phân loại các vi sinh vật ở cấp độ dưới giống (genus), khi mà các loàitrong cùng một giống hoặc các chủng (strain) trong cùng một loài (species) khônggiống nhau về khả năng gây bệnh cho người, thực vật và động vật và do đó cần được

phân biệt [ CITATION Bre72 \l 1033 ]11, [ CITATION Bre73 \l 1033 ]12, [ CITATION Cil96 \l 1033 ]13, [ CITATION Wan97 \l 1033 ]14, [ CITATION Anz00 \l 1033 ]15, [ CITATION Mah05 \l 1033 ]16 Các trình tự nucleotide của tổng

thể bộ gene có tính đặc trưng loài, nhưng việc so sánh các trình tự này để xây dựngmối quan hệ tiến hóa của các loài là một vấn đề không đơn giản Việc đi tìm một công

cụ để phân loại các sinh vật nhờ các trình tự nucleotide hoàn chỉnh của các bộ gene đãcho ra đời các phương pháp phân loại mới dựa trên các dấu hiệu bộ gene (genomicsignature) – là những dấu hiệu được phát hiện trên cơ sở tần suất xuất hiện của cácoligomer trong các trình tự nucleotide nhiễm sắc thể Tuy nhiên, các phương phápphân loại sinh vật dựa trên các dấu hiệu bộ gene cho đến nay nói chung phức tạp trongphương thức và trong thuật toán sử dụng Chúng chưa được sử dụng một cách chínhthống do không thể phân biệt được một số các vi sinh vật và không đủ đặc trưng để

phân biệt một số vi khuẩn ở cấp độ dưới giống [ CITATION Kar95 \l 1033 ]17, [ CITATION Coe04 \l 1033 ]18, [ CITATION Coe05 \l 1033 ]19, [ CITATION van06 \l 1033 ]20, [ CITATION Boh09 \l 1033 ]21, [ CITATION Tak09 \l 1033 ]22, [ CITATION Sim09 \l 1033 ]23.

1.2 MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU

Đề tài nghiên cứu sự sắp xếp của các oligomer trong các phân tử DNA nhiễm sắc thểcủa các vi sinh vật nhằm hai mục đích sau:

xiv

i) Tìm hiểu sâu hơn kiến thức hiện tại về sự phân bố của các nucleotide trong

các phân tử DNA nhiễm sắc thể của vi khuẩn và nấm men

ii) Đưa ra được một phương pháp phân loại các vi khuẩn có mối quan hệ tiến

hóa gần ở cấp độ dưới giống

1.3 ĐỐI TƯỢNG VÀ PHẠM VI NGHIÊN CỨU

Đối tượng nghiên cứu của đề tài là các trình tự bộ gene đã được xác định hoàn chỉnh

và được lưu ở ngân hàng National Center for Biotechnology Information (NCBI)

[ CITATION ftp \l 1033 ]10 Do qui tắc sắp xếp của các nucleotide trong phân tử

DNA nhiễm sắc thể lần đầu tiên được khởi xướng và nghiên cứu bởi luận án này,phạm vi nghiên cứu của đề tài chỉ được giới hạn cho các trình tự bộ gene hoàn chỉnh

của vi khuẩn và nấm men Saccharomyces cerevisiae.

1.4 TÍNH CẤP THIẾT CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU

Trong công nghiệp công nghệ sinh học, việc tạo ra được những chủng, loài vi sinh vậtvới bộ gene cho những sản phẩm mong muốn là thực sự cần thiết Tuy nhiên, sự thànhcông trong việc tạo ra được những vi sinh vật này hiện tại phụ thuộc quá nhiều vàonhững hiểu biết của con người về các trình tự bộ gene và những quá trình sinh học liênquan đến trật tự sắp xếp của các nucleotide trong phân tử DNA nhiễm sắc thể

[ CITATION Ell01 \l 1033 ]1, [ CITATION LiX03 \l 1033 ]2, [ CITATION Ita05 \l

1033 ]3, [ CITATION Wan07 \l 1033 ]4, [ CITATION Esn07 \l 1033 ]5, [ CITATION Hol07 \l 1033 ]6, [ CITATION Gib08 \l 1033 ]7 Như đã đề cập trong

Mục 1.1, các trình tự nucleotide hoàn chỉnh của các phân tử DNA nhiễm sắc thể củacác cá thể vi sinh vật khác nhau thì không giống nhau nhưng đều có tính đối xứng Tuyvậy, các nucleotide được sắp xếp như thế nào để các phân tử DNA nhiễm sắc thể trởnên đối xứng thì chưa được biết đến Cho nên, việc xác định được qui tắc sắp xếp củacác nucleotide trong phân tử DNA nhiễm sắc thể sẽ là cơ sở để định hướng và thựchiện hiệu quả công việc tạo ra những vi sinh vật mong muốn Vì thế, nghiên cứu sựsắp xếp của các oligomer trong các phân tử DNA nhiễm sắc thể vi khuẩn và nấm men

là một đề tài quan trọng và có ý nghĩa cấp thiết trong công nghệ gene

xv

Mặt khác, như đã được đề cập ở Mục 1.1, các trình tự 16S rDNA hiện nay đang được

sử dụng một cách rộng rãi để nhận biết nhanh các vi khuẩn, nhưng do tính đặc trưngloài không cao của các trình tự này, một số vi khuẩn, nhất là các loài trong cùng mộtgiống hoặc các chủng trong cùng một loài có các khả năng gây bệnh khác nhau cho

người, động vật và thực vật không thể được phân biệt [ CITATION Cil96 \l 1033 ]13, [ CITATION Wan97 \l 1033 ]14, [ CITATION Anz00 \l 1033 ]15, [ CITATION Mah05 \l 1033 ]16 Khó khăn này cho đến nay vẫn chưa được giải quyết mặc dù các

giải pháp phân biệt các vi khuẩn này đã được nỗ lực nghiên cứu bởi nhiều nhà khoa

học trên thế giới [ CITATION Coe04 \l 1033 ]18, [ CITATION Coe05 \l 1033 ]19, [ CITATION van06 \l 1033 ]20, [ CITATION Boh09 \l 1033 ]21, [ CITATION Tak09 \l 1033 ]22 Vì vậy, việc xây dựng được một phương pháp phân loại có khả

năng phân biệt các vi khuẩn như thế thực sự mang tính cấp thiết

1.5 Ý NGHĨA KHOA HỌC CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU

Đề tài này tìm hiểu qui tắc sắp xếp của các nucleotide trong phân tử DNA nhiễm sắcthể vi khuẩn và nấm men, nhằm cung cấp sâu hơn kiến thức hiện tại về sự phân bố củacác nucleotide trong phân tử DNA nhiễm sắc thể tế bào vi sinh vật Đồng thời, đề tàinày xây dựng phương pháp phân loại các vi khuẩn có mối quan hệ tiến hóa gần ở cấp

độ dưới giống mà trong đó có một số vi khuẩn không thể được phân loại bởi cácphương pháp đã biết

1.6 Ý NGHĨA THỰC TIỄN CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU

Việc khám phá ra qui tắc sắp xếp của các nucleotide trong phân tử DNA nhiễm sắc thể

có thể giúp con người can thiệp có định hướng vào việc thay đổi có hiệu quả các trình

tự nucleotide trên nhiễm sắc thể bằng các kỹ thuật biến đổi DNA để phục vụ lợi íchcủa con người

Việc xây dựng được một phương pháp phân loại các vi khuẩn ở cấp độ dưới giống giảiquyết được khó khăn hiện tại trong việc phân biệt các vi khuẩn có mối quan hệ tiếnhóa gần, đặc biệt là các loài trong cùng một giống hoặc các chủng trong cùng một loàinhưng khác nhau về khả năng gây bệnh cho người, động vật và thực vật

xvi

1.7 TÍNH MỚI CỦA ĐỀ TÀI NGHIÊN CỨU

Nội dung nghiên cứu của đề tài luận án có những tính mới sau đây:

i) Đây là công trình đầu tiên nghiên cứu và xác định được qui tắc sắp xếp củacác trimer và trimer bổ sung đảo ngược (BSĐN) trong các trình tự mangthông tin mã hóa protein của phân tử DNA nhiễm sắc thể

ii) Luận án sử dụng khái niệm mới về bất đối xứng trimer để nghiên cứu sự phân

bố của các trimer trong các trình tự DNA của nhiễm sắc thể

iii) Luận án đưa ra khái niệm mật độ phân bố của các trimer trong một trình tựDNA, cũng là một khái niệm mới Với khái niệm này, luận án chứng minhcác nucleotide được sắp xếp có qui tắc trong phân tử DNA nhiễm sắc thể vikhuẩn để góp phần tạo nên tính đối xứng của phân tử DNA nhiễm sắc thểcũng như trình bày khả năng ứng dụng các trình tự bộ gene trong phân loạicác vi khuẩn có mối quan hệ tiến hóa gần ở cấp độ dưới giống

xvii

CHƯƠNG 2 TỔNG QUAN TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU

2.1 DNA

Vào năm 1919, Levene khám phá ra rằng phân tử DNA (deoxyribonucleic acid) là mộtphân tử chứa các nucleotide Mỗi nucleotide gồm có một nitrogen base và một đường

deoxyribose nối với nhau thông qua nhóm phosphate [ CITATION PLe19 \l 1033 ]24.

Các nucleotide này có thể là adenine (A), thymine (T), cytosine (C) hoặc guanine (G).Chúng khác nhau ở cấu trúc nitrogen base (Hình 2 .1) [ CITATION Ree08 \l

1033 ]25 Năm 1951, Erwin Chargaff phát hiện được rằng trong DNA, số lượng A

xấp xỉ bằng số lượng T cũng như số lượng C xấp xỉ bằng số lượng G [ CITATION

ECh51 \l 1033 ]26 Phát hiện này của Erwin Chargaff đã trở thành tiền đề cho Watson

và Crick xây dựng nên mô hình xoắn kép nucleotide của phân tử DNA vào năm 1953 [

CITATION JDW53 \l 1033 ]27 Theo Watson và Crick, phân tử DNA gồm có hai sợi

đơn polynucleotide, mỗi sợi được cấu tạo từ các nucleotide A, C, G và T Cácnucleotide này được nối với nhau thông qua các liên kết phosphodiester, trong đó mộtnhóm phosphate được nối với hai nhóm đường (deoxyribose) của hai nucleotide Nhưthế ở một đầu của sợi đơn polynucleotide có nhóm phosphate gắn vào nguyên tửcarbon số 5 và đầu kia có nhóm hydroxyl gắn vào nguyên tử carbon số 3 của đườngdeoxyribose Các đầu này lần lượt được gọi là đầu 5’ và đầu 3’ Hai sợi đơnpolynucleotide này kết hợp đối song (tức là các sợi với chiều 5’ → 3’ theo hướng đốinhau) nhờ các liên kết hydrogen giữa các nucleotide bổ sung, tức là giữa A và T, C và

G, G và C và T và A, tạo nên phân tử sợi đôi DNA (Hình 2 2) [ CITATION wik \l

xviii

1033 ]28 Vì vậy, một trong hai sợi này vẫn thường được gọi là sợi bổ sung của sợi

còn lại Trong một số trường hợp, hai sợi này còn được gọi là sợi Watson và sợi Crick

[ CITATION Bai02 \l 1033 ]9, [ CITATION RAC11 \l 1033 ]29.

Hình 2.1 Thành phần hóa học của DNA Cấu trúc hóa học của chuỗipolynucleotide (a), nucleotide (b) và các nitrogen base (c) được trình bày theo thứ

tự từ trái qua phải Đường pentose không có nhóm hydroxyl ở nguyên tử carbon

số 2 nên được gọi là đường deoxyribose [ CITATION Ree08 \l 1033 ]25

Hình 2.2 Các liên kết hydrogen giữa các nucleotide bổ sung trong phân tử DNA

xix

2.2 DNA OLIGOMER

Trong các phân tử DNA nhiễm sắc thể với trình tự nucleotide đã được xác định hoànchỉnh, các nucleotide A, C, G và T được sắp xếp theo qui tắc nào cho đến nay vẫnchưa được biết đến Nếu cho rằng A, C, G và T là những chữ cái thì các từ được tạothành từ những chữ cái này được gọi là các oligonucleotide, hay còn gọi là cácoligomer Monomer là từ được tạo thành từ A, C, G hoặc T Dimer, trimer, tetramer,pentamer, hexamer… là những từ được tạo ra từ 2, 3, 4, 5, 6… chữ cái trong bảng chữcái chỉ gồm bốn chữ cái A, C, G và T Cũng như các monomer, các oligomer trongphân tử DNA nhiễm sắc thể kết hợp với nhau như thế nào vẫn đang còn là một bí ẩn

2.3 CẤU TRÚC DNA NHIỄM SẮC THỂ

Trong các tế bào sinh vật prokaryote và eukaryote, kích thước của phân tử DNA nhiễmsắc thể có thể từ khoảng vài trăm ngàn cho đến hàng triệu cặp nucleotide bổ sung (basepair, viết tắt là bp) Các nucleotide của phân tử DNA nhiễm sắc thể kết hợp với cácprotein khác nhau để tạo nên một nhiễm sắc thể hoàn chỉnh Phân tử DNA nhiễm sắcthể có thể có dạng vòng hoặc dạng thẳng Ở dạng thẳng, hai chuỗi polynucleotide đốisong của phân tử DNA nhiễm sắc thể có nucleotide ở vị trí đầu tiên và nucleotide ở vịtrí cuối cùng tách rời nhau chứ không nối với nhau như ở phân tử DNA nhiễm sắc thểdạng vòng

2.3.1 Nhiễm sắc thể tế bào sinh vật prokaryote

Các tế bào sinh vật prokaryote, gồm vi khuẩn và archaea (vi khuẩn cổ), không cónhân, thường mang các nhiễm sắc thể dạng vòng, trong đó hai sợi đơn polynucleotide

có dạng vòng và kết hợp với nhau thông qua các liên kết hydrogen Trong tế bào chấtcủa tế bào vi khuẩn, DNA nhiễm sắc thể liên kết với các protein giống protein histonecủa tế bào sinh vật eukaryote (Mục 2.3.2), tạo thành những cấu trúc hạt cơ bản Cáchạt này lại tiếp tục liên kết với nhau làm hình thành cấu trúc xoắn ở các cấp độ khácnhau của cấu trúc nucleoid tùy thuộc vào điều kiện dinh dưỡng bên trong tế bào

[ CITATION Kim04 \l 1033 ]30 Hình 2 3 cho thấy hình ảnh của một nhiễm sắc thể

vi khuẩn hoàn chỉnh được phân lập khỏi tế bào và quan sát dưới kính hiển vi

[ CITATION Pos04 \l 1033 ]31

xx

Hình 2.3 Ảnh chụp nhiễm sắc thể của tế bào vi khuẩn E coli Nhiễm sắc thể được

tách khỏi tế bào và được chụp dưới kính hiển vi điện tử với độ phóng đại 12000

lần Thanh đo: 500 nm [ CITATION Pos04 \l 1033 ]31.

Hầu hết các bộ gene của các tế bào sinh vật prokaryote đều chỉ gồm một phân tử DNAnhiễm sắc thể dạng vòng Rất ít loài chứa các phân tử DNA nhiễm sắc thể dạng thẳng,

chẳng hạn như loài Agrobacterium tumefaciens có một phân tử DNA nhiễm sắc thể

dạng vòng và một dạng thẳng Một số loài có nhiều hơn một phân tử DNA nhiễm sắc

thể dạng vòng, chẳng hạn như các loài của giống Burkholderia, giống Vibrio Kích

thước của các phân tử DNA nhiễm sắc thể của cùng một bộ gene không giống nhau.Cũng như vậy, kích thước của các phân tử DNA nhiễm sắc thể của các loài khác nhau

cũng khác nhau [ CITATION ftp \l 1033 ]10

2.3.2 Nhiễm sắc thể tế bào sinh vật eukaryote

Khác với của các tế bào sinh vật prokaryote, các phân tử DNA nhiễm sắc thể của các

tế bào sinh vật eukaryote có dạng thẳng (Hình 2 4)

Một nghiên cứu về cấu trúc tinh thể của nucleosome trong nhân của tế bào người chothấy các nucleosome được tạo thành do các đoạn DNA nhiễm sắc thể với chiều dài

146 bp quấn quanh các protein histone H2A, H2B, H3 và H4 [ CITATION Lug \l 1033

]32 Các nucleosome này được nối với nhau nhờ các đoạn DNA nhiễm sắc thể liên kết

xxi

với protein histone H1 Các cấu trúc nucleosome lại kết hợp với nhau làm hình thànhcác sợi xoắn vào nhau và tạo thành các cấp độ cấu trúc khác nhau của chromatin.Trong quá trình sinh trưởng, các tế bào của sinh vật phát triển theo chu kỳ Trong mỗichu kỳ, mỗi tế bào trải qua các giai đoạn chuẩn bị cho quá trình phân chia tế bào nhằmtạo ra tế bào mới, trong đó có giai đoạn sao chép DNA nhiễm sắc thể để tạo thành hainhiễm sắc thể “chị-em” giống nhau từ một nhiễm sắc thể ban đầu Vào thời kỳ sau quátrình sao chép DNA nhiễm sắc thể và trước giai đoạn phân chia tế bào, chromatin củahai nhiễm sắc thể “chị-em” ở dạng nén chặt, nối với nhau qua tâm động (centromere)tạo nên hình chữ X (Hình 2 4) Hai nhiễm sắc thể này được phân bố vào hai tế bàomới sau quá trình phân chia tế bào chất, các thành phần chứa trong tế bào chất vàmàng sinh chất.

Tùy theo loài, bộ gene của các sinh vật eukaryote có số lượng phân tử DNA nhiễm sắcthể khác nhau Kích thước của các nhiễm sắc thể trong mỗi bộ gene cũng không giống

nhau [ CITATION ftp \l 1033 ]10

xxii

Hình 2.4 Cấu trúc nhiễm sắc thể của tế bào sinh vật eukaryote Hai chromatid làhai nhiễm sắc thể “chị-em” gắn với nhau ở tâm động Nucleosome là cấu trúcđược tạo thành do sự tương tác giữa các protein histone và DNA sợi đôi Cáchình màu đen-trắng là hình ảnh của DNA nhiễm sắc thể dưới kính hiển điện tử vi

truyền suốt [ CITATION Ree08 \l 1033 ]25

2.4 SỰ SAO CHÉP DNA NHIỄM SẮC THỂ

2.4.1 Sự sao chép DNA nhiễm sắc thể trong tế bào vi khuẩn

Ở hầu hết các tế bào vi khuẩn, các phân tử DNA nhiễm sắc thể ở dạng vòng, thường cómột điểm khởi đầu sao chép và một điểm kết thúc sao chép, phân chia phân tử DNAnhiễm sắc thể vi khuẩn thành hai nửa để sao chép gọi là hai replichore [ CITATION

Les08 \l 1033 ]33 Do đó bộ máy sao chép DNA (DNA replicase) chuyển động theo

một hướng nhất định trên phân tử DNA nhiễm sắc thể và sao chép cùng lúc cả hai sợipolynucleotide của DNA nhưng đảm bảo được sự tổng hợp của DNA xảy ra theohướng từ 5’ đến 3’ (5’  3’) (Hình 2 5) Để đạt được điều này, trên mỗi replichore,

bộ máy sao chép DNA đã tổng hợp một mạch DNA một cách liên tục (mạch trước,hay còn gọi là leading strand), còn sự tổng hợp mạch DNA kia thì không liên tục

xxiii

(mạch sau, hay còn gọi là lagging strand) [ CITATION Pom07 \l 1033 ]34 Replicase

của vi khuẩn Escherichia coli là enzyme DNA polymerase III (Pol III), một dimer –

được tạo thành từ 10 tiểu đơn vị protein (Hình 2 6) [ CITATION Mak88 \l 1033 ]35, [ CITATION Bra01 \l 1033 ]36, [ CITATION McH03 \l 1033 ]37, [ CITATION ISM \

l 1033 ]38 – gắn vào hai sợi polynucleotide được tách ra và bắt đầu lắp các nucleotide

bổ sung với các nucleotide trên các sợi đơn DNA này theo hướng từ 5’  3’, bằngcách gắn các nucleotide vào đầu 3’OH của mỗi sợi polynucleotide DNA đang đượctổng hợp

Trong Hình 2 6, các tiểu đơn vị α, ε, θ tạo nên phần chính (core) của Pol III, có chứcnăng xúc tác phản ứng tổng hợp DNA (α có hoạt tính polymerase; ε có hoạt tínhexonuclease theo chiều 3’  5’; chức năng của θ đến nay chưa được rõ) Tiểu đơn vị βđược gọi là “sliding clamp”, làm nhiệm vụ buộc core polymerase vào khuôn DNA.Các tiểu đơn vị γ, δ, δ’, χ, ψ tạo thành phức hợp γ (γ complex, hay còn gọi là clamploader) làm nhiệm vụ chuyển “sliding clamp” lên sợi khuôn DNA Sự kết hợp của β-clamp làm tăng tốc độ sao chép và khả năng sao chép (processivity, tức là số lượngnucleotide được đưa vào mạch đang sao chép trong mỗi lần bám vào khuôn của

polymerase) của Pol III [ CITATION Stu91 \l 1033 ]39.

Các sợi DNA mới luôn được tổng hợp theo hướng 5’  3’ nên một nửa của Pol IIIchịu trách nhiệm tổng hợp mạch trước theo chiều hướng vào chẻ ba sao chép, còn nửakia chịu trách nhiệm tổng hợp mạch sau theo chiều hướng ra xa chẻ ba sao chép (Hình

2 5)

xxiv

Hình 2.5 Bộ máy sao chép DNA của vi khuẩn E coli [ CITATION Pom07 \l

1033 ]34.

Hình 2.6 Enzyme replicase của vi khuẩn E coli là một protein dimer bất đối

xứng Các con số trong ngoặc đơn dưới các ký hiệu τ, β, α, ε, θ, γ, δ, δ’, χ, ψ là

khối lượng (kDa) của các tiểu đơn vị protein tương ứng Các tiểu đơn vị là dimer

có số 2 đứng phía sau các ký hiệu tương ứng “Core” nghĩa là thành phần chính

[ CITATION Mak88 \l 1033 ]35, [ CITATION Bra01 \l 1033 ]36, [ CITATION McH03 \l 1033 ]37, [ CITATION ISM \l 1033 ]38.

xxv

2.4.2 Sự sao chép DNA nhiễm sắc thể trong tế bào eukaryote

Các phân tử DNA nhiễm sắc thể dạng thẳng của các tế bào eukaryote có rất nhiều trình

tự khởi đầu sao chép Sự sao chép DNA của các nhiễm sắc thể này cũng được tiếnhành theo hai hướng xuất phát từ mỗi trình tự khởi đầu sao chép Phần lớn các trình tựkhởi đầu sao chép ở tế bào nấm men đã được nhận biết Người ta đã báo cáo rằng cókhoảng 500 vị trí khởi đầu sao chép trên bộ gene với kích thước khoảng 1,4 x 107 bpcủa các nấm men sinh sản kiểu nảy chồi hoặc phân đôi [ CITATION Rag01 \l

1033 ]40, [ CITATION Wyr01 \l 1033 ]41, [ CITATION Hei06 \l 1033 ]42, [ CITATION Nie07 \l 1033 ]43, [ CITATION Sio12 \l 1033 ]44, [ CITATION Ori \l

1033 ]45.

So với ở tế bào vi khuẩn, sự sao chép DNA ở tế bào nấm men phức tạp hơn nhiều, mặc

dù có nhiều điểm giống nhau Các enzyme replicase ở tế bào nấm men gồm có

polymerase α, polymerase δ và polymerase ε [ CITATION Hüb00 \l 1033 ]46.

Polymerase α mang hoạt tính primase, có nhiệm vụ tham gia tổng hợp RNA primercho cả mạch trước và mạch sau, đồng thời kéo dài các RNA primer bằng cách tổng

hợp các đoạn ngắn DNA khởi đầu Theo [ CITATION Hüb00 \l 1033 ]46, khi có

khoảng 20 nucleotide, polymerase α bị thay thế bởi polymerase ε trên mạch trước và δtrên mạch sau Các polymerase δ và ε có hoạt tính 3’ → 5’ exonuclease nhưng không

có hoạt tính primase Cho đến nay, tương tác giữa DNA và các yếu tố sao chép ở tếbào eukaryote được tìm hiểu khá nhiều và chi tiết bởi nhiều nghiên cứu khác nhau

[ CITATION 15D \l 1033 ]47, [ CITATION Bor08 \l 1033 ]48, [ CITATION Ria02 \l

1033 ]49, [ CITATION Dun09 \l 1033 ]50, [ CITATION Bam97 \l 1033 ]51, [ CITATION Kon92 \l 1033 ]52, [ CITATION Kri94 \l 1033 ]53, [ CITATION 22G96 \l 1033 ]54 Mặc dù vậy, vẫn còn nhiều tranh cãi về vai trò cụ thể của các

polymerase δ và ε Một số nghiên cứu cho thấy polymerase ε tham gia trực tiếp vàoviệc sao chép DNA tại vị trí khởi đầu trong giai đoạn thiết lập chẻ ba sao chép, có liên

hệ mật thiết với chẻ ba sao chép trong suốt quá trình chẻ ba sao chép di chuyển, và có

vai trò độc lập so với enzyme polymerase δ [ CITATION Apa97 \l 1033 ]55, [ CITATION Mas00 \l 1033 ]56, [ CITATION Wag01 \l 1033 ]57, [ CITATION Fen03 \l 1033 ]58, [ CITATION Fuk04 \l 1033 ]59, [ CITATION Pur07 \l 1033 ]60.

xxvi

Mặt khác, đã có bằng chứng xác thực cho thấy polymerase ε làm nhiệm vụ tổng hợp

mạch trước [ CITATION Hir05 \l 1033 ]61, nhưng một nghiên cứu khác lại cho rằng

polymerase δ có thể làm nhiệm vụ sao chép mạch trước trong trường hợp polymerase ε

vì một lý do nào đó mà bị mất chức năng [ CITATION Kes99 \l 1033 ]62 Polymerase

ε được chứng minh là cần thiết cho việc sao chép hiệu quả và chính xác DNA

[ CITATION Shi06 \l 1033 ]63, [ CITATION Jas08 \l 1033 ]64, tuy rằng khả năng sao chép của hai enzyme này là tương đương [ CITATION Chi07 \l 1033 ]65 Ở nấm

men S cerevisiae, khả năng sao chép của polymerase δ tăng lên nhờ PCNA

[ CITATION Lan08 \l 1033 ]66.

2.5 TÍNH BẤT ĐỐI XỨNG VÀ ĐỐI XỨNG CỦA DNA NHIỄM SẮC THỂ

2.5.1 Các định luật của Erwin Chargaff

2.5.1.1 Định luật Erwin Chargaff thứ nhất

Từ các thí nghiệm phân tích định lượng thành phần của DNA bằng sắc ký giấy, ErwinChargaff kết luận rằng trong một sợi đôi DNA, số lượng A luôn luôn xấp xỉ với sốlượng T, còn số lượng C luôn luôn xấp xỉ với số lượng G [ CITATION ECh51 \l

1033 ]26 Đây là định luật Chargaff thứ nhất Mô hình DNA xoắn kép của

Wason-Crick và thực tế cũng đã chứng minh rằng trong một sợi đôi DNA, số lượng A luônluôn bằng với số lượng T, còn số lượng C luôn luôn bằng với số lượng G [ CITATION

JDW53 \l 1033 ]27.

2.5.1.2 Định luật Erwin Chargaff thứ hai

Sự áp dụng của định luật Chargaff thứ nhất vào sợi đơn DNA được gọi là định luật

Chargaff thứ hai [ CITATION Rud68 \l 1033 ]67, [ CITATION Bel99 \l 1033 ]68, [ CITATION For00 \l 1033 ]69 Định luật Chargaff thứ hai đúng nếu trong một sợi

đơn DNA, số lượng A xấp xỉ bằng số lượng T và số lượng C xấp xỉ bằng số lượng G,khi đó sợi DNA được cho là đối xứng Nếu định luật Chargaff thứ hai không đúng, sợiDNA đang xét được cho là bất đối xứng

Đối với oligomer, định luật Chargaff thứ hai đúng nếu số lượng các oligomer trongmột sợi đơn DNA xấp xỉ bằng số lượng các oligomer bổ sung đảo ngược (BSĐN)tương ứng của chúng trong sợi đó, tức là sợi DNA đối xứng Trái lại, nếu trong sợi này

xxvii

mà số lượng các oligomer khác so với số lượng các oligomer BSĐN tương ứng của

chúng thì sợi DNA bất đối xứng [ CITATION Bai02 \l 1033 ]9.

2.5.2 Các phương pháp xác định tính bất đối xứng và đối xứng của DNA

2.5.2.1 Phương pháp tính nucleotide skew

Phương pháp này được sử dụng để xác định mức độ bất đối xứng DNA dựa vào sự

khác nhau về tần suất xuất hiện của các nucleotide [ CITATION Lob96 \l 1033 ]70, [ CITATION Gri98 \l 1033 ]71, [ CITATION McL98 \l 1033 ]72, [ CITATION Mra98 \l 1033 ]73, [ CITATION Lob02 \l 1033 ]74 Công thức tính như sau:

AT-skew = (nA-nT)/(nA+nT)

GC-skew = (nG-nC)/(nG+nC)

Trong đó, nA, nC, nG và nT tương ứng là tần suất xuất hiện của các nucleotide A, C, G

và T trong một trình tự nucleotide sợi đơn Với một trình tự nucleotide mã hóa choprotein, có thể tính mức độ bất đối xứng của nó dựa vào tần suất xuất hiện của cácnucleotide này ở các vị trí 1, 2 hay 3 của codon (xem khái niệm về codon ở Mục

trí thứ ba của codon sẽ được tính như sau:

[ CITATION Lob96 \l 1033 ]70, [ CITATION Gri98 \l 1033 ]71, [ CITATION McL98 \l 1033 ]72, [ CITATION Mra98 \l 1033 ]73, [ CITATION Lob02 \l 1033 ]74,

nhưng không giúp được nhiều trong việc tìm hiểu trật tự sắp xếp của các nucleotidetrong phân tử DNA nhiễm sắc thể

xxviii

2.5.2.2 Phương pháp tính oligomer skew

Tương tự như với nucleotide skew, oligomer skew được định nghĩa là độ lệch giữa tầnsuất xuất hiện của oligomer và của oligomer BSĐN của nó Lopez và cộng sự

[ CITATION Lop99 \l 1033 ]75 đã tính oligomer skew như sau:

Oligomer skew = (mN – nNt)/(mN + nNt)

trong đó, m và n tương ứng là tần suất xuất hiện của oligomer (N) và oligomer BSĐNcủa nó (Nt) Lopez và cộng sự tìm thấy rằng việc sử dụng tetramer skew để nhận diệnđiểm khởi đầu sao chép chính xác hơn là sử dụng GC skew

2.5.2.3 Phương pháp DNA-walk

Cũng tương tự như phương pháp tính nucleotide skew, có thể sử dụng phương phápAT-walk hoặc GC-walk để xác định mức độ bất đối xứng của một đoạn DNA Đồngthời, có thể quan sát sự thay đổi về mức độ bất đối xứng trong đoạn DNA bằng cáchlập đường cong tích lũy của AT- hoặc GC-walk Với AT-walk, giá trị của nucleotide

A mỗi lần xuất hiện là 1 và T là -1, còn giá trị của các nucleotide C và G là 0; với walk, giá trị của nucleotide G mỗi lần xuất hiện là 1 và nucleotide C là -1, còn giá trị

GC-của các nucleotide A và T là 0 [ CITATION Gie00 \l 1033 ]76 Giống như phương

pháp tính nucleotide skew, việc sử dụng phương pháp này cũng không cho biết nhiềuhơn về trật tự sắp xếp của các nucleotide trong phân tử DNA nhiễm sắc thể

2.5.2.4 Phương pháp Baisnée

Áp dụng định luật Chargaff thứ hai cho các oligomer, Baisnée và cộng sự

[ CITATION Bai02 \l 1033 ]9 đã xác định tần suất xuất hiện của các oligomer trong

một trình tự nucleotide sợi đơn và đã tính mức độ bất đối xứng oligomer của sợi DNAnày bằng công thức sau:

Trong đó, S1 có giá trị từ 0 (tức là hoàn toàn bất đối xứng) đến 1 (hoàn toàn đối xứng)

và được tính cho các oligomer i có kích thước như nhau, với i = 1, …, 4N, trong đó N

là kích thước của oligomer, tức số lượng nucleotide trong mỗi oligomer f i và f i ’ lần

xxix

lượt là tần suất xuất hiện của oligomer i và oligomer BSĐN của oligomer i trong trình

tự nucleotide sợi đơn Theo Baisnée và cộng sự, cũng có thể xác định mức độ đối xứngcủa trình tự nucleotide sợi đơn bằng hệ số tương quan Pearson (Pearson correlation

coefficient) S C giữa các tần suất xuất hiện của các oligomer i (dãy giá trị X) và các tần suất xuất hiện của các oligomer BSĐN tương ứng của các oligomer i (dãy giá trị Y) trong trình tự, với i = 1, …, 4N và N là kích thước của oligomer:

Trong đó, f i và f i ’ là các giá trị tần suất xuất hiện của các oligomer i trong hai dãy giá trị X và Y tương ứng; và là các giá trị trung bình của các f i và f i ’tương ứng trong các

dãy giá trị X và Y.

Hàm số CORREL() có thể được tìm thấy trong Microsoft Excel S C biểu thị mức độtương đồng giữa hai dãy giá trị biểu diễn tần suất xuất hiện của các oligomer và

oligomer BSĐN tương ứng của chúng trong trình tự DNA sợi đơn Tương tự S1, sợi

DNA được coi là đối xứng khi S C có giá trị xấp xỉ bằng 1

So với phương pháp tính nucleotide skew, phương pháp này ưu việt hơn hẳn vì chothấy được cả mức độ khác nhau về số lượng giữa các oligomer và các oligomer BSĐNtương ứng của chúng trong một sợi đơn DNA

2.5.3 Sự tuân thủ của DNA nhiễm sắc thể theo các định luật của Erwin Chargaff

2.5.3.1 Tính bất đối xứng

Thành phần nucleotide trong các bộ gene của các sinh vật khác nhau được nghiên cứumạnh kể từ khi xuất hiện các trình tự bộ gene hoàn chỉnh Tính bất đối xứng monomerđược tìm thấy trong các đoạn cục bộ của phân tử DNA nhiễm sắc thể các tế bào vi

khuẩn [ CITATION Lob96 \l 1033 ]70, [ CITATION Gri98 \l 1033 ]71, [ CITATION McL98 \l 1033 ]72, [ CITATION Mra98 \l 1033 ]73, [ CITATION Lob02 \l 1033 ]74, [ CITATION Fre98 \l 1033 ]77 Trong Hình 2 7, có thể thấy rằng các đoạn DNA

xxx

ngắn có mức độ bất đối xứng monomer cao hơn các đoạn DNA dài hơn [ CITATION

Mra98 \l 1033 ]73

Ở tế bào nấm men, bằng cách cắt các trình tự ngắn hơn 6 kbp ở hai đầu mút của tất cả

16 phân tử DNA nhiễm sắc thể rồi nối lại với nhau, các trình tự cách xa hai đầu mútcủa phân tử 12 kbp cũng được cắt ra và nối tương tự, sau đó thực hiện phương pháp

DNA-walk trên các trình tự này, Gierlik và cộng sự [ CITATION Gie00 \l 1033 ]76

cho rằng chỉ có các trình tự ở hai đầu mút phân tử DNA nhiễm sắc thể mới bất đốixứng, còn các trình tự cách xa hai đầu mút 12 kbp thì không (Hình 2 8)

Tính bất đối xứng monomer cũng được nghiên cứu rộng rãi trên các đối tượng

eukaryote khác [ CITATION Niu03 \l 1033 ]78, [ CITATION Gre03 \l 1033 ]79, [ CITATION Tou03 \l 1033 ]80, [ CITATION Tou04 \l 1033 ]81, [ CITATION Tou05

\l 1033 ]82 Các nghiên cứu này cho thấy tính bất đối xứng monomer cục bộ có liên

quan đến các quá trình sao chép và phiên mã

xxxi

Hình 2.7 Tính bất đối xứng monomer cục bộ của phân tử DNA nhiễm sắc thể củamột số vi khuẩn Đường liền nét biểu diễn CG-skew của các đoạn 50 kbp, trongkhi đường đứt nét biểu diễn CG-skew của các đoạn 10 kbp [ CITATION Mra98 \l

1033 ]73 Trục nằm ngang biểu diễn chiều dài phân tử DNA nhiễm sắc thể (Mb,

megabase) Mũi tên chỉ vị trí khởi đầu sao chép

xxxii

Hình 2.8 DNA-walk trên các đoạn ở hai đầu của 16 phân tử DNA nhiễm sắc thể tếbào nấm men (a) Các trình tự ngắn hơn 6 kbp của các đầu mút của phân tử DNAnhiễm sắc thể sau khi đã cắt đi phần telomere (b) Các trình tự ngắn hơn 6 kbpcách các đầu mút của phân tử DNA nhiễm sắc thể 12 kbp Đường màu đen: AT-

walk, đường màu xám: GC-walk [ CITATION Gie00 \l 1033 ]76.

2.5.3.2 Tính đối xứng

Định luật Chargaff thứ nhất luôn luôn đúng cho mọi sợi đôi DNA, bao gồm cả cácphân tử DNA nhiễm sắc thể Định luật Chargaff thứ hai cũng đúng cho cả các sợi đơncủa phân tử DNA nhiễm sắc thể của các tế bào sinh vật prokaryote và eukaryote, nghĩa

là các nhiễm sắc thể đối xứng [ CITATION QiD011 \l 1033 ]8, [ CITATION Bai02 \l

1033 ]9 Hình 2 9 cho thấy tính đối xứng của phân tử DNA nhiễm sắc thể số 22 của

tế bào người [ CITATION Bai02 \l 1033 ]9 Các tác giả của Hình 2 9 lưu ý rằng tần

suất xuất hiện của một oligomer trên sợi Watson theo chiều 5’  3’ gần như tươngđương với tần suất xuất hiện của nó trên sợi Crick theo chiều 5’  3’

xxxiii

Hình 2.9 Tần suất xuất hiện của các oligomer trên hai sợi bổ sung của phân tửDNA nhiễm sắc thể người số 22 Số lượng oligomer với kích thước N là 4N Tầnsuất xuất hiện của các oligomer được xác định theo cách chồng các oligomer lênnhau với sai khác một nucleotide theo hướng 5’  3’ [ CITATION Bai02 \l

1033 ]9.

Mặc dù vậy, vì sao các phân tử DNA nhiễm sắc thể đối xứng cho đến nay vẫn chưađược rõ Về mặt cơ chế, có một số nghiên cứu giả thiết rằng đảo đoạn và chuyển vịđảo ngược bên trong nhiễm sắc thể đã tạo ra tính đối xứng này [ CITATION Alb06 \l

1033 ]83, [ CITATION Alb07 \l 1033 ]84, [ CITATION Oka07 \l 1033 ]85 Trên thực

tế, đảo đoạn in vivo bên trong mỗi replichore của vi khuẩn có thể làm phá vỡ sự phân

bố của nucleoid trong tế bào, ảnh hưởng nghiêm trọng đến các quá trình tiến đến sự

phân bào [ CITATION Esn07 \l 1033 ]5, [ CITATION Nik99 \l 1033 ]86 Tuy nhiên,

đảo đoạn xảy ra quanh vùng tiếp giáp của hai replichore của vi khuẩn với các điểmcuối của đoạn DNA bị đảo có khoảng cách như nhau đối với điểm khởi đầu sao chép

lại là một hiện tượng phổ biến trong tự nhiên [ CITATION Liu06 \l 1033 ]87,

[ CITATION Dar08 \l 1033 ]88 Trong khi đó, các nghiên cứu in vivo khác lại tiết lộ

rằng tính đối xứng của các phân tử DNA nhiễm sắc thể vi khuẩn, hay nói một cáchtương đương, như đã đề cập ở Mục 1.1, là sự sắp xếp vốn có của các nucleotide trongcác phân tử DNA nhiễm sắc thể vi khuẩn, có liên quan đến tốc độ sao chép và sự ổn

định của phân tử DNA nhiễm sắc thể [ CITATION Ita05 \l 1033 ]3, [ CITATION

xxxiv

Wan07 \l 1033 ]4, [ CITATION Gib08 \l 1033 ]7 Như vậy, đảo đoạn có thể là cơ chế

nhằm duy trì đặc tính đối xứng vốn có của các phân tử DNA nhiễm sắc thể chứ khôngphải để tạo ra đặc tính này

2.6 TRÌNH TỰ NUCLEOTIDE TRONG PHÂN TỬ DNA NHIỄM SẮC THỂ

VÀ CÁC MỐI LIÊN QUAN

2.6.1 Sự phân bố của các nucleotide trong phân tử DNA nhiễm sắc thể và vị trí

điểm khởi đầu sao chép

Các nghiên cứu trước đây cho thấy rằng sự phân bố của các nucleotide trong phân tửDNA nhiễm sắc thể tế bào sinh vật prokaryote không phải là ngẫu nhiên, mặc dù trật

tự sắp xếp của chúng trong phân tử DNA nhiễm sắc thể như thế nào vẫn chưa được rõ.Nucleotide skew có thể được sử dụng để nhận biết vị trí điểm khởi đầu sao chép ở một

số nhiễm sắc thể vi khuẩn [ CITATION Mra98 \l 1033 ]73 Sự phân bố của các

oligomer trong phân tử DNA nhiễm sắc thể không được công bố nhiều Nếu N là kíchthước của oligomer, trong đó N có thể là 1, 2, 3, 4… tương ứng với tên gọi monomer,dimer, trimer, tetramer … thì số lượng của các oligomer này là 4N, do đó khi kíchthước oligomer càng lớn, nghiên cứu sẽ càng trở nên phức tạp vì số lượng oligomertăng lên Có lẽ vì thế mà chỉ có sự phân bố của vài oligomer trong phân tử DNA nhiễmsắc thể đã được nghiên cứu mà thôi Salzberg và cộng sự [ CITATION Sal98 \l

1033 ]89 tìm thấy rằng các oligomer phân bố không cân đối ở hai phía của điểm khởi

đầu sao chép của một số vi khuẩn (Hình 2 10) Lopez và cộng sự [ CITATION Lop99

\l 1033 ]75 đã sử dụng oligomer skew để xác định vị trí khởi đầu sao chép ở vi khuẩn

cổ Nhóm tác giả của nghiên cứu này tìm thấy rằng sử dụng tetramer skew để nhậndiện vị trí khởi đầu sao chép chính xác hơn là sử dụng GC skew (Hình 2 11) Nhómnghiên cứu của Lopez cho rằng kết quả này là do khi xảy ra sự sắp xếp lại DNA trong

bộ gene, oligomer skew có khuynh hướng được phục hồi nhanh hơn GC skew, bởi vì

GC skew được hình thành có lẽ là do đột biến xảy ra chậm và không đều một cách tựnhiên trên mạch trước và mạch sau Lý giải này có vẻ mang tính cảm tính hơn là tínhxác thực của GC skew, bởi vì nguyên nhân vì sao có GC skew và oligomer skew chođến nay vẫn chưa được biết đến.Worning và cộng sự [ CITATION Wor06 \l 1033 ]90

cũng sử dụng tần suất xuất hiện của các oligomer có kích thước đến 8 nucleotide đểxác định vị trí khởi đầu sao chép trong các phân tử DNA nhiễm sắc thể dạng vòng

xxxv

Đối chiếu với phần trình bày ở Mục 2.4.1, trong quá trình sao chép DNA nhiễm sắcthể vi khuẩn, hai bộ máy sao chép chuyển động theo hai hướng rời xa điểm khởi đầusao chép Ở mỗi hướng, bộ máy sao chép tổng hợp cả mạch trước và mạch sau Nhưvậy, sự phân bố khác nhau của các nucleotide ở hai phía của vị trí khởi đầu sao chéptrong phân tử DNA nhiễm sắc thể tế bào vi khuẩn cũng chính là sự khác nhau về sựphân bố của chúng trên hai sợi làm khuôn sao chép ở mạch trước và mạch sau Lobry

và Sueoka [ CITATION Lob02 \l 1033 ]74 cũng cho thấy các vị trí thứ ba của codon

trên mạch trước tương đối giàu G hơn C và giàu T hơn A so với trên mạch sau

xxxvi

Hình 2.10 Các ví dụ minh họa sự phân bố không cân đối của một số oligomer ởhai phía của điểm khởi đầu sao chép của bốn bộ gene vi khuẩn Các vị trí của

TTTGTTTT trong bộ gene của Borellia burgdorferi, của TGTGTGTG trong bộ gene của Treponema pallidum, của GAGCAGGG trong bộ gene của E coli và của TGAAGAGG trong bộ gene của Bacillus subtilis Các đoạn thẳng đứng phía trên

đường trung tâm nằm ngang chỉ vị trí của oligomer trong một sợi DNA, phía dướichỉ vị trí của oligomer trong sợi bổ sung ‘Ori’ chỉ vị trí điểm khởi đầu sao chép

[ CITATION Sal98 \l 1033 ]89.

Rocha [ CITATION Roc04 \l 1033 ]91 nhận định rằng tần suất xuất hiện của các

oligomer trong mạch trước và mạch sau khác nhau là do nhiều yếu tố khác nhau tạothành, chẳng hạn như sự khác nhau về sự phân bố của các nucleotide ở trong phân tửDNA nhiễm sắc thể, các tín hiệu sao chép, hoặc sự phân bố không cân xứng của cácgene và các tín hiệu điều hòa tương ứng trên hai mạch sao chép; sự khác nhau về tần

xxxvii

suất xuất hiện của các oligomer này là kết quả của các sự khác nhau có quan hệ vớicác tín hiệu liên quan đến các quá trình sinh học khác nhau trong tế bào, chẳng hạnnhư các chuỗi trình tự T thường xuất hiện khi có mặt của các yếu tố kết thúc khôngphụ thuộc vào yếu tố Rho, một protein ở tế bào prokaryote có liên quan đến sự kếtthúc phiên mã, thường xuất hiện trên mạch trước; một ví dụ khác là các trình tự Chi,các trình tự này tăng cường quá trình tái tổ hợp DNA theo con đường RecBCD ở vi

khuẩn E coli, cũng xuất hiện trên mạch trước nhiều hơn trên mạch sau, nhưng các

trình tự Chi lại giàu GT và chứa các trimer tương ứng với các codon được sử dụngthường xuyên

Vì thế vẫn đang tồn tại nhiều nghi vấn xung quanh vấn đề ý nghĩa sinh học của sựkhác nhau về tần suất xuất hiện của các trình tự oligomer ở hai phía của điểm khởi đầusao chép

xxxviii

Hình 2.11 Xác định vị trí điểm khởi đầu sao chép nhờ tần suất xuất hiện của cácoligomer trong bộ gene của hai vi khuẩn cổ Trục tung biểu diễn giá trị skew tíchlũy Trục hoành biểu diễn chiều dài phân tử DNA nhiễm sắc thể Dấu mũi tên biểudiễn vị trí của đoạn DNA mã hóa cho protein gắn đặc hiệu vào trình tự khởi đầu

sao chép, Cdc6 hoặc ORC [ CITATION Lop99 \l 1033 ]75.

2.6.2 Hai mạch sao chép DNA và các bộ máy sao chép

DNA polymerase của vi khuẩn về mặt cấu trúc, như trình bày ở Mục 2.4.1, là một

protein dimer bất đối xứng [ CITATION Mak88 \l 1033 ]35, [ CITATION Bra01 \l

1033 ]36, [ CITATION McH03 \l 1033 ]37, [ CITATION Mak_88 \l 1033 ]92 Đơn

vị thứ nhất của dimer gồm có các tiểu đơn vị α, β, θ, ε và τ Đơn vị thứ hai gồm α, β, θ,

ε, γ, δ, δ’, χ và ψ Các tiểu đơn vị α, ε và θ trong mỗi đơn vị kết hợp với nhau tạo nênthành phần chính “core” có khả năng xúc tác phản ứng tổng hợp DNA Trong quátrình sao chép, “core” của đơn vị thứ nhất chịu trách nhiệm tổng hợp mạch trước còn

xxxix

“core” của đơn vị thứ hai chịu trách nhiệm tổng hợp mạch sau Tiểu đơn vị β chịutrách nhiệm xúc tiến và giúp đỡ thành phần chính “core” bám vào sợi khuôn DNA,trong khi các tiểu đơn vị δ và δ’ tương ứng được cho là có tương tác đặc hiệu với τ và

γ τ hoạt động như một sợi dây buộc vào “core” xúc tác tổng hợp mạch sau và giúpphản ứng tổng hợp DNA bởi “core” này được tiếp tục khi quá trình tổng hợp bị một sốDNA oligomer cản trở χ và ψ là các thành phần đặc trưng tham gia quá trình tổng hợpmạch sau

Ở tế bào eukaryote, như trình bày ở Mục 2.4.2, mạch trước và mạch sau cũng đượctổng hợp nhờ sự tham gia của các DNA polymerase khác nhau

Rõ ràng, bộ máy tổng hợp mạch trước không giống với bộ máy tổng hợp mạch sau.Các nucleotide trong phân tử DNA nhiễm sắc thể hẳn phải được sắp xếp sao cho tươngthích với cấu trúc của các bộ máy sao chép

2.6.3 Sự thay đổi trình tự nucleotide nhiễm sắc thể bằng phương pháp tái tổ hợp

sử dụng trình tự oligonucleotide sợi đơn và hiệu suất tái tổ hợp

Bằng cách sử dụng phương pháp tái tổ hợp các trình tự oligonucleotide sợi đơn vàotrình tự DNA nhiễm sắc thể, một số nghiên cứu đã thành công trong việc thay đổi các

trình tự nucleotide nhiễm sắc thể [ CITATION Ell01 \l 1033 ]1, [ CITATION LiX03 \l

1033 ]2 Phương pháp này cho hiệu suất tái tổ hợp cao hơn nhiều so với phương pháp tái tổ hợp DNA đồng dạng [ CITATION Mur98 \l 1033 ]93 vì chỉ cần sử dụng trình tự

oligonucleotide sợi đơn cỡ vài chục bp thay vì hàng nghìn bp nucleotide đồng dạng,đồng thời có thể sử dụng được cho cả tế bào prokaryote và eukaryote [ CITATION

Ell01 \l 1033 ]1, [ CITATION LiX03 \l 1033 ]2, [ CITATION Igo01 \l 1033 ]94, [ CITATION Liu021 \l 1033 ]95, [ CITATION Dek03 \l 1033 ]96, [ CITATION Rio12 \l 1033 ]97 Để thay đổi trình tự nucleotide nhiễm sắc thể, trình tự

oligonucleotide sợi đơn phải được thiết kế để có thể tái tổ hợp được vào một trong haitrình tự sợi đơn của nhiễm sắc thể, hoặc là sợi làm khuôn cho quá trình phiên mã (sợiT) hoặc là sợi bổ sung với sợi làm khuôn cho quá trình phiên mã (sợi NT), nhờ -RedBeta protein trong quá trình sao chép DNA Tuy nhiên, các nghiên cứu này cho thấyrằng hiệu suất tái tổ hợp của trình tự oligonucleotide sợi đơn vào sợi T và sợi NTkhông giống nhau, thậm chí sản phẩm của quá trình tái tổ hợp có thể không được tạo

xl