Tinh sạch protein - Phần 4

Giới thiệu chung Sự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta có thể xác định được trình tự acid amin, mối liên hệ về tiến hóa giữa các protein trong những cá thể...

Tinh protein (tt) V Phân tách protein điện di gel Để đánh giá trình tinh protein có hiệu hay khơng, ngồi cách xác định hoạt tính đặc trưng protein có tăng lên sau bước tinh sạch, cách làm hình protein diện mẫu sau bước; điều thực nhờ kỹ thuật điện di V.1Điện di chiều Một phân tử có mang điện tích di chuyển điện trường Hiện tượng này, đặt tên điện di, giúp hướng tới kỹ thuật mạnh để phân tách protein đại phân tử khác DNA RNA Vận tốc di chuyển (v) protein (hay phân tử nào) điện trường phụ thuộc vào lực điện trường (E), điện tích thực protein (z) hệ số ma sát (f) Lực điện Ez kéo phân tử mang điện tích tới điện cực trái dấu bị cản trở lực kéo độ nhớt fv tăng lên ma sát phân tử chuyển động với môi trường Lực ma sát phụ thuộc vào khối lượng, hình dạng phân tử di chuyển lẫn độ nhớt (η) môi trường Với khối cầu có bán kính r, ta có Điện di thực gel (hay vật thể rắn giấy) gel giống ray phân tử làm tăng phân tách Những phân tử nhỏ kích thước lỗ gel di chuyển xuyên qua gel, phân tử lớn lỗ gel gần khơng di chuyển Những phân tử có kích thước trung bình di chuyển gel với nhiều vận tốc khác điện di thực bảng polyacrylamide mỏng, thẳng đứng Hướng dòng điện từ xuống Gel polyacrylamide, tạo thành từ polymer hóa acrylamide liên kết chéo methylenebisacrylamide, chọn làm môi trường cho điện di có tính trơ mặt hóa học tạo hình nhanh chóng Điện di cách lọc qua gel mà theo tất phân tử, khơng xét kích thước, bị tác động lực để di chuyển chất Gel xem tương đương với hạt cột lọc gel Các protein phân tách dựa khối lượng điện di acrylamide điều kiện bị biến tính Hỗn hợp protein hịa tan dung dịch sodium dodecyl sulfate (SDS), chất tẩy mang điện tích âm phá tất nối khơng cộng hóa trị protein ban đầu Mercaptoethanol (2-thioethanol) hay dithiothreitol thêm vào để làm giảm số nối disulfide Phức hợp SDS với protein bị biến tính có điện tích thực âm tỉ lệ thuận với khối lượng protein Điện tích âm có gắn với SDS lớn nhiều điện tích thân protein ban đầu; thế, điện tích ban đầu protein không ảnh hưởng đáng kể đến điện tích phức hợp Phức hợp SDS-protein sau mẫu để chạy điện di Khi điện di kết thúc, protein gel nhìn thấy dãy băng cách nhuộm với bạc hay chất nhuộm màu Coomassie blue Những đánh dấu phóng xạ phát cách đặt phim chụp x quang lên miếng gel, q trình gọi phóng xạ tự ghi Những protein nhỏ di chuyển nhanh gel, protein lớn phía đầu, gần vị trí nạp mẫu Tính di động phần lớn chuỗi polypeptide điều kiện tỉ lệ với khối lượng chúng Tuy nhiên, có vài protein giàu carbohydrate protein màng không tuân theo mối tương quan SDSPAGE có độ phân tách cao, cho kết nhanh độ nhạy cao Chỉ với lượng nhỏ khoảng 0.1ug (~2pmol) protein cho vạch rõ nhuộm với Coomassie blue chí (~0.02ug) phát nhuộm bạc Những protein chênh lệch khối lượng khoảng 2% (ví dụ: 40 kD 41 kD hay khác khoảng 10 acid amin) phân biệt SDS-PAGE Vì vậy, SDS-PAGE giúp đánh giá kết trình tinh Với phân đoạn đầu tiên, kết dãy gồm nhiều protein Nhưng qua bước tinh sạch, số lượng protein giảm có băng ngày đậm Vạch tương ứng với protein mục tiêu V.2 Điện di dựa vào điểm đẳng điện Các protein cịn phân tách điện dựa vào tỉ lệ số acid amin có tính acid số acid amin có tính base chúng Điểm đẳng điện protein (pI) điểm pH mà điện tích thực Tại điểm pH này, tính di động protein điện trường z cơng thức (1) Mỗi protein có pI riêng; ví dụ pI cytochrome C, protein vận chuyển ion có tính base cao, 10.6, pI albumin huyết thanh, protein có tính acid máu, 4.8 Giả định cho hỗn hợp protein chạy điện trường miếng gel với khuynh độ pH, khơng có diện SDS Mỗi protein di chuyển đến vị trí mà pH pI Dựa vào tượng này, ta có phương pháp phân tách protein dựa vào điểm đẳng điện protein để tạo Khuynh độ pH, trước hết cho vào gel hỗn hợp polyampholyte (những polymer nhỏ đa điện tích) có nhiều giá trị pI, sau điện di hỗn hợp Điện di dựa vào điểm đẳng điện phân tách protein nhanh với khả phân biệt chênh lệch pI khoảng 0.01 hay protein khác đơn vị điện tích phân tách phương pháp V.3 Điện di hai chiều Đây phương pháp có khả phân tách cao sư kết hợp SDSPAGE với điện di dựa vào điểm đẳng điện Mẫu protein chạy điện di dựa vào điểm đẳng điện sau đó, đặt khoảng gel có chứa protein vừa điện di lên gel SDSpolyacrylamide theo phương nằm ngang Protein chịu điện trường theo chiều dọc Kết mơ hình điểm phân tách hai chiều, chiều ngang theo điểm đẳng điện, chiều dọc theo khối lượng Khả phân tách phương pháp chứng minh ngàn protein vi khuẩn E coli phân tách lần chạy điện di Những protein phân tách từ tế bào điều kiện sinh lý khác phân tách phương pháp này, sau cường độ tính hiệu xác định Với cách này, protein cụ thể thấy dạng mạnh hay yếu tùy vào tình trạng sinh lý Tuy nhiên, phương pháp có hạn chế có nhiều protein phân tách lại phân biệt rõ Để khắc phục hạn chế này, người ta kết hợp điện di hai chiều với kỹ thuật khối phổi V.4 Đánh giá kết tinh protein - - - Sau bước tinh sạch, thông số sau cần ghi nhận để đánh giá q trình tinh protein: Protein tổng số: lượng protein có phân đoạn Thơng số tính cách nhân nồng độ phần phân đoạn với tổng thể tích phân đoạn Hoạt tính tổng: hoạt tính enzyme phân đoạn Thơng số tính cách nhân hoạt tính enzyme có lượng mẫu xét nghiệm với tổng thể tích phân đoạn Hoạt tính riêng: hoạt tính tổng chia cho protein tổng số Yield: hoạt tính cịn lại sau bước tinh thể phần trăm hoạt tính dịch chiết thơ với hoạt tính dịch chiết khởi đầu 100% Mức tinh sạch: mức độ tinh sạch, tính cách chia hoạt tính riêng, tính sau bước tinh sạch, với hoạt tính riêng dịch chiết ban đầu Qua theo nghiên cứu khảo nghiệm, người ta thấy sau bước tinh sạch, mức độ tinh tăng lên yield lại giảm Thật vậy, với kỹ thuật SDS-PAGE, ta nạp lượng mẫu định vào giếng gel ứng với bước tinh sạch, ta thấy số băng giảm tỉ lệ với mức độ tinh tỉ lệ lượng protein mục tiêu với tổng số protein diện tăng Vì vậy, đánh giá trình tinh phải dựa vào thông số mức độ tinh yield Một q trình tinh tốt có mức độ tinh cao số yield thấp Nếu số yield cao cịn mức độ tinh thấp có nghĩa nhiều tạp nhiễm mẫu (nhiều protein protein mục tiêu) làm phức tạp việc giải thích thí nghiệm VI Xác định khối lượng protein Phép ghi phổ khối lượng kỹ thuật dùng để phân tích hóa học hữu nhiều năm Tuy nhiên, gần đây, khả bay thấp protein làm tác dụng phép ghi phổ khối lượng việc nghiên cứu phân tử Khó khăn khắc phục có kỹ thuật chuyển protein đại phân tử khác thành dạng khí đưa vào ứng dụng matrixassisted laser desorption-ionization (MALDI) electrospray spectrometry Ở tập trung vào kỹ thuật MALDI Trong kỹ thuật này, ion protein phóng sau tăng tốc qua điện trường Những ion di chuyển qua đường ống dài hút chân không (flight tube), ion nhỏ di chuyển nhanh đến đầu đọc trước Vì vậy, dựa vào thời gian bay (time of flight - TOF) điện trường ta biết khối lượng protein (hay xác tỉ lệ khối lượng với điện tích) Với lượng nhỏ phân tử sinh học, dù nhỏ đến khoảng vài picomole đến vài femtomole, phân tích với cách Một máy phổ ghi khối lượng dạng MALDI-TOF dược dùng phân tích hỗn hợp insulin βlactoglobulin kết khối lượng protein 5733.9 18,364, so với kết tính tốn la 5733.5 18,388 Thí nghiệm cho thấy MALDI-TOF thật kỹ thuật xác để xác định khối lượng protein Kỹ thuật ứng dụng việc xác định dựa vào khối lượng peptide (peptide mass fingerprinting) kỹ thuật mở rộng khả ứng dụng điện di hai chiều Mẫu cần nghiên cứu chiết phân cách riêng biệt phương pháp hóa học hay enzyme học Khối lượng phân đoạn protein xác định phương pháp khối phổ Cuối cùng, khối lượng peptide so với số liệu có tính máy vi tính Kỹ thuật cho kết tốt Ví dụ, số 150 protein nấm men phân tách điện di chiều, kỹ thuật giúp xác định 80% protein VII Siêu ly tâm Siêu ly tâm không phương pháp phân tách hỗn hợp thơ thành phần tế bào mà hiệu việc phân tách phân tích phân tử sinh học Với phương pháp này, không xác định khối lượng tỉ trọng mà cịn biết hình dạng phân tử phân tích tương tác phân tử Để có điểm này, cần diễn tả cách toán học phân tử bị tác động lực ly tâm Dưới tác động lực ly tâm, phân tử di chuyển qua môi trường lỏng Để biết tốc độ di chuyển phân tử ta cần phải tính hệ số lắng (s) theo cơng thức với m khối lượng phân tử, v thể tích phần (nghịch đảo tỉ trọng phân tử), p tỉ trọng môi trường f số lắng thường biểu đơn vị Svedberg (S) 10-3 s Giá trị S nhỏ, phân tử di chuyển chậm Vận tốc lắng phân tử phụ thuộc vào khối lượng Một phân tử có hình dạng tỉ trọng với phân tử khác nặng lắng nhanh Hình dạng ảnh hưởng đến vận tốc lắng tác động đến độ nhớt Hệ số ma sát phân tử cuộn lại nhỏ phân tử cồng kềnh dù chúng có khối lượng Vì vậy, phần tử dạng thẳng lắng chậm phân tử hình cầu dù chúng có khối lượng Một phân tử đặc di chuyển mau phân tử đặc nghịch đảo lực đẩy phân tử đặc nhỏ Vận tốc lắng phụ thuộc vào tỉ trọng dung dịch (p) phân tử lằng p < 1, p > không di chuyển p = Một kỹ thuật tách protein dựa vào hệ số lắng khác protein kỹ thuật ly tâm phân đoạn tạo khuynh độ tỉ trọng ống ly tâm cách trộn dung dịch có tỉ trọng khác nhau, có tỉ trọng cao, có tỉ trọng thấp Ví dụ, hỗn hợp sucrose 20% sucrose 5% có khuynh độ tỉ trọng từ 5% phía đến 20% đáy tube lượng nhỏ dung dịch hổn hợp protein nạp vào phía khuynh độ tỉ trọng máy quay, protein di chuyển theo khuynh độ tách dựa hệ số lắng chúng thời gian tốc độ ly tâm có qua thực nghiệm Ta tạo lỗ đáy ống ly tâm để thu nhận phân đoạn protein Khối lượng protein xác định trực tiếp trạng thái lắng cân có nghĩa mẫu ly tâm vận tốc thấp đủ để lắng cân với khuếch tán kỹ thuật xác định khối lượng protein xác sử dụng cho protein khơng qua biến tính cấu trúc bậc bốn protein bảo tồn Đây điểm lợi phương pháp so với SDS-PAGE, định khối lượng protein bị biến tính Với hai phương pháp này, SDS-PAGE cho ta biết khối lượng đơn phân, siêu ly tâm phân đoạn cho ta biết khối lượng dạng đa phân, ta kết hợp để biết có đơn phân protein đa phân  ... chế có nhiều protein phân tách lại phân biệt rõ Để khắc phục hạn chế này, người ta kết hợp điện di hai chiều với kỹ thuật khối phổi V .4 Đánh giá kết tinh protein - - - Sau bước tinh sạch, thông... Vì vậy, SDS-PAGE giúp đánh giá kết trình tinh Với phân đoạn đầu tiên, kết dãy gồm nhiều protein Nhưng qua bước tinh sạch, số lượng protein giảm có băng ngày đậm Vạch tương ứng với protein mục... tính tổng chia cho protein tổng số Yield: hoạt tính cịn lại sau bước tinh thể phần trăm hoạt tính dịch chiết thơ với hoạt tính dịch chiết khởi đầu 100% Mức tinh sạch: mức độ tinh sạch, tính cách