Tinh sạch Protein bằng phương pháp tủa

Tinh sạch Protein bằng phương pháp tủa

Tinh sạch protein

bằng phương pháp tủa

Phương pháp tủa được sử dụng tương đối rộng rãi để thu nhận các phân tử sinh học mà nhất là protein Để tủa, người ta có thể dùng nhiều cách khác nhau: tủa bằng muối, tủa bằng các

dung môi hữu cơ hoặc thay đổi pH

của dung dịch có chứa protein

1 Tủa bằng muối

Đây là cách phổ biến để tủa protein Khả năng hòa tan của protein tùy

thuộc vào nhiều yếu tố: đặc tính lý

hóa tự nhiên của protein, pH, nhiệt độ, nồng độ của muối…

Ở nồng độ muối thấp, tính tan của

protein tăng nhẹ (salting in) Tuy

nhiên, ở nồng độ muối cao, tính tan

của protein giảm mạnh (salting out) Đầu tiên, giả thuyết salting in ở nồng

độ muối thấp được giải thích bởi

Debye - Huckel Trong dung dịch,

protein được bao bọc xung quanh bởi các ion muối mang điện tích trái dấu Chính đặc tính này gia tăng hoạt tính của các dung môi, làm giảm các phân

tử protein không mang điện tích, do

đó làm tăng tính tan của protein trong dung môi Giả thuyết của Debye –

Huckel cho rằng: tính tan của protein được biểu diễn bằng một hàm logarit, giá trị của hàm tỉ lệ với căn bậc hai

của cường độ ion trong dung dịch

Thuật ngữ salting out trong môi

trường có nồng độ muối cao được giải thích bởi Kirkwood Sự gia tăng

lượng ion muối trong dung dịch làm giảm quá trình Solvate hóa, giảm tính hòa tan của protein dẫn đến sự tủa

Ở nồng độ muối cao, độ hòa tan tuân theo công thức sau của Cohn:

log S = B - KI

Trong đó

S: độ hòa tan của protein

B: hằng số (tùy thuộc vào chức năng của protein, pH và nhiệt độ)

K: hằng số salting out (tuỳ thuộc vào

pH, hỗn hợp và lượng muối có trong dung dịch)

I: cường độ ion của muối

Đồ thị hàm log biểu diễn độ hòa tan của protein biến thiên theo nồng độ

muối:

Hình 1 Độ tan theo nồng độ muối

Những đường biểu diễn khác nhau tùy theo từng protein khác nhau Vì thế, khi muốn tách 1 protein từ một hỗn hợp gồm nhiều protein khác nhau, ta

có thể lựa chọn nồng độ muối thích hợp sao cho phù hợp nhất với protein mục tiêu

Độ dốc của đường salting out mô tả ở trên phụ thuộc vào chức năng của

protein và nồng độ muối, không phụ thuộc vào nhiệt độ và độ pH Ngoài

ra, nếu trọng lượng phân tử của

protein tăng thì lượng muối cần cho phương pháp tủa giảm xuống

Hiệu quả tủa protein của các anion

muối khác nhau thì khác nhau, có thể xếp theo thứ tự giảm dần như sau:

citrate > phosphate > sulphate >

acetate/chloride > nitrate >

thiocyanate

2 Tủa protein bằng các dung môi hữu cơ

Khi thêm dung môi hữu cơ vào môi trường, hằng số điện môi của môi

trường giảm xuống Công thức biểu diễn mối quan hệ giữa độ hòa tan và

hằng số điện môi:

ln (S/Sw) = (A/RT) (1/Dw - 1/D)

Trong đó

S: độ hòa tan của protein trong dung môi hữu cơ

Sw: độ hòa tan của protein trong nước D: hằng số điện môi của môi trường sau khi đã bổ sung dung môi hữu cơ vào

Dw: hằng số điện môi của nước

R: hằng số khí

T: nhiệt độ tuyệt đối

A: hằng số khí

Công thức trên cho thấy: khi thêm

dung môi hữu cơ vào môi trường,

hằng số điện môi tăng lên, khả năng hòa tan của protein giảm, vì thế tạo sự kết tủa Tuy nhiên, các dung môi hữu

cơ lại có ái lực với các bề mặt kỵ

nước của phân tử protein Kết quả là

chúng làm biến tính protein trong suốt quá trình tủa Do đó, khi tủa, chỉ nên

sử dụng các dung môi hữu cơ ở nồng

độ thấp (mặc dù một số dung môi

như: 2 – methyl – 2,4 – pentanediol (MPD), dimethyl Sulfoxide (DMSO)

và Ethanol có thể được sử dụng ở

nồng độ cao