Tinh sạch protein bằng phương pháp tủa (tt) docx

Tủa protein bằng phương pháp điểm đẳng điện Khi thay đổi pH của môi trường, mức độ tủa của protein cũng thay đổi.. Ở giá trị pH cao, protein tích điện âm vì các nhóm carbocyl trong phân

Tinh sạch protein bằng phương pháp tủa (tt)

3 Tủa protein bằng phương pháp điểm đẳng điện

Khi thay đổi pH của môi trường, mức

độ tủa của protein cũng thay đổi Ở

pH thấp, protein tích điện dương vì nhóm amide bị proton hóa (thu nhận proton) Ở giá trị pH cao, protein tích điện âm vì các nhóm carbocyl trong phân tử protein bị mất đi proton (mất

H+) Tại giá trị pI (Isoelectrics point - điểm đẳng điện), protein không tích

điện Điều này làm giảm tính tan của protein vì protein không còn khả năng tương tác với môi trường, khi đó, các phân tử protein sẽ tách ra khỏi môi

trường Hiện tượng này được giải

thích bằng phương trình Cohn

Đồ thị biểu diễn độ hòa tan của 2

protein khác nhau thay đổi theo pH

Hình 2 Tỷ lệ protein tủa theo pH

)

Phương pháp này thường dùng cho các protein đậu nành (có điểm đặng điện khoảng 4.6)

4 Tủa protein bằng các non – ionic polymer

Phương pháp này được thực hiện

bằng cách cho thêm non – ionic vào trong dung dịch protein Khi thêm

vào, số lượng các phân tử nước có thể tương tác được với protein giảm

xuống Người ta thường sử dụng

dextrans và polyethylen glycols

µi = µi0 + RT (ln mi + fii mi + fij + mj) Trong đó

µi0: điện thế hóa học chuẩn của phần

tử i

µi: điện thế hóa học của phần tử i

R: hằng số khí

T: nhiệt độ tuyệt đối

mi, mj: nồng độ molar của phần tử i và

j

fii: hệ số tương tác của phần tử i

fij: hệ số tương tác giữa phần tử i và j Khi protein tồn tại ở nồng độ cao, hay

pH môi trường vượt ra ngoài điểm

đẳng điện mới xảy ra quá trình tương tác giữa các cấu tử trong protein

Muốm thêm loại non – ionic polymer nào vào trong dung dịch protein tùy thuộc vào trọng lượng phân tử của

protein đó Cũng tương tự như tủa

protein bằng phương pháp điểm đẳng điện Tại 1 giá trị pH nào đó (sau khi thêm non – ionic polymer) thì khả

năng hòa tan của protein cũng giảm xuống Các ion non – ionic polymer thường sử dụng là các dung môi hữu

cơ như Ethanol hay Acetone Các

dung môi khác ít sử dụng vì khó thao tác và có thể gây biến tính protein

Chú ý:

- Nhiệt độ thấp làm tăng hiệu quả tủa

và giảm sự biến tính protein

- Nồng độ ion: 0.05 – 0.2

- Đối với chất tan có trọng lượng phân

tử càng cao thì lượng dung môi cần cho quá trình tủa càng ít Theo Scopes (1982), khi bắt đầu tủa protein bằng Acetone, nên tuân theo công thức sau:

[(v/v)%] = 1.8 - 0.12 ln [MW]

Trong đó

(v/v)% là thể tích dung môi cần cho quá trình tủa – tính theo %

MW: trọng lượng phân tử của chất tan Nếu trong hỗn hợp có sự hện diện của

2 protein, tính tan của protein này sẽ giảm vì sự hiện diện của protein kia

Thuận lợi của phương pháp tủa bằng cách sử dụng non – ionic polymers là protein sản phẩm bền, và có thể sử

dụng ở nhiệt độ phòng

5 Tủa bằng ion kim loại

Trong phương pháp tủa này, ion kim loại sẽ gắn với một phần của phân tử protein Thuận lợi của phương pháp này là có thể tủa được protein trong một dung dịch rất loãng Các ion kim loại có thể chia làm ba nhóm Các ion như Mn2+, Fe2+, Co2+, Ni2+, Zn2+ và

Cd2+ sẽ gắn chặt vào các acid

carboxylic và các hợp chất có chứa nitrogen Các ion như Ca2+, Ba2+,

Mg2+ và Pb2+ sẽ gắn với nhóm chức acid carboxylic Các ion như Ag2+,

Hg2+, và Pb2+ sẽ gắn chặt với các

nhóm có chứa lưu huỳnh

MỘT SỐ PROTOCOL THAM

KHẢO

Tủa protein bằng acetone

1 Làm lạnh acetone xuống – 200C

2 Chuyển mẫu protein vào trong các tube eppendorff thích hợp

3 Thêm 4 lần thể tích acetone lạnh

vào tube

4 Vortex, ủ ở - 200C trong 60 phút

5 Ly tâm ở 13.000 – 15.000 x g trong vòng 10 phút

6 Cẩn thận loại bỏ dịch nổi Tránh

chạm tới phần cặn protein

(Nếu muốn loại bỏ hoàn toàn các chất tạp nhiễm, có thể lặp lại các bước từ 2 – 6) trước khi tiến hành bước 7)

7 Để cho acetone bay hơi tự do ở

nhiệt độ phòng trong vòng khoảng 30 phút

Tủa bằng Acetone/TCA

(Trichloroacetic acid)

1 Chuẩn bị dung dịch TCA 10%

trong aceton Bảo quản ở - 200C cho đến khi sử dụng

2 Thêm 10 thể tích TCA 10% trong acetone vào mẫu Vortex Ủ ở - 200C

ít nhất 3h (tốt nhất nên ủ qua đêm)

3 Ly tâm ở 15 000 x g trong 10 phút Loại bỏ dịch nổi

4 Thêm 1 thể tích acetone lạnh ( -

200C) Vortex Để ở - 200C ít nhất 10 phút

5 Ly tâm 15000 x g trong 5 phút

Loại bỏ dịch nổi

6 Để cặn khô tự nhiên trong không khí

Tủa bằng TCA/DOC

(Deoxycholate)

1 Chuẩn bị dung dịch DOC 2%

2 Trộn mẫu với DOC 2% theo tỉ lệ 1/1000 Ủ trên đá 30 phút

3 Thêm TCA 100% vào mẫu sao cho nồng độ cuối cùng của TCA là 15% Vortex ngay (để tránh các khối tủa

lớn hình thành có thể manh theo các phần tử tạp nhiễm)

4 Để yên ít nhất 1h Tốt nhất là ủ qua đêm

5 Ly tâm 15 000 x g trong 10 phút Loại bỏ dịch nổi có chứa TCA và các chất tạp nhiễm

6 Thêm Ethanol lạnh hay Acetone

lạnh vào cặn để rửa

7 Vortex kỹ cho cặn tan hoàn toàn

Để ở nhiệt độ phòng trong 5 phút

8 Ly tâm 15 000 x g trong 10 phút Cẩn thận loại bỏ dịch nổi

9 Lặp lại bước rửa, ly tâm, loại dịch nổi

10 Làm khô cặn

Tủa bằng Chloroform/Methanol

1 Thêm 4 thể tích Methanol vào mẫu Vortex kỹ

2 Thêm 1 thể tích Chloroform

Vortex

3 Thêm 3 thể tích nước Vortex

4 Ly tâm 15 000 x g trong 2 phút

(Lúc này, protein có thể còn trên phần dịch nổi) Loại đi phần nước ở lớp

trên

5 Thêm 4 thể tích Methanol Vortex

6 Ly tâm 15 000 x g trong 2 phút

Cẩn thận loại bỏ hoàn toàn dịch nổi Tránh chạm đến phần cặn

7 Làm khô mẫu bằng buồng hút chân không hay bằng không khí