Tinh sạch PROTEIN (Phần 1) pdf

Tinh sạch PROTEIN (Phần 1) I- Giới thiệu chung S ự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta có thể xác định được trình tự acid amin, mối liên hệ về tiến hóa gi ữa các protein trong những cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng sinh hóa của các protein đó. Hơn thế nữa, việc tinh thể hóa protein chỉ có thể thực hiện với những protein tinh sạch và từ những tinh thể đó chúng ta sẽ biết được cấu trúc bậc 4 cũng như các đơn v ị chức năng của protein thông qua dữ liệu chiếu xạ tia X. Vì vậy, quá trình tinh sạch protein không ngừng được cải tiến để đạt được độ tinh sạch cao nhất nhưng nhìn chung một quá trình tinh sạch protein cũng cần đi qua các bước căn bản sau: 1. Nhận biết protein mục tiêu 2. Ly trích protein từ tế bào 3. Thu nhận protein mục ti êu dựa trên độ hoà tan, kích thư ớc, điện tích, và liên kết ái lực 4. Phân tách protein b ằng điện di trên gel 5. Xác định trọng lượng và kh ối lượng của protein II. Nhận biết protein mục tiêu Kết quả của sự tinh sạch là một m ẫu protein chỉ chứa đúng một loại phân tử, ở đây là một loại protein mà nhà sinh hóa quan tâm. Mẫu protein này chỉ là một phân đoạn chiếm 1% vật liệu ban đầu, vốn có thể là dịch nuôi cấy tế bào hay một cơ quan riêng biệt lấy của thực vật hay động vật. Để xác định được protein mục tiêu từ hỗn hợp protein, nhà sinh hóa cần thực hiện một thử nghiệm dựa vào đặc tính của protein đó. Nếu protein mục tiêu là một enzyme thì thử nghiệm sẽ được thực hiện dựa trên hoạt tính của enzyme đó. Cụ thể như v ới enzyme lactate dehydrogenase, m ột enzyme có vai trò trong việc sản xuất năng lượng từ glucose cũng như tổng hợp glucose từ lactate, để xác định enzyme này thì dựa trên phản ứng của nó trong tế bào. Sau đó, dựa vào khả năng hấp thụ ánh sáng mạnh ở bước sóng 340nm của Nicotinamide adenine dinucleotide (NADH), ta có thể đo được lượng ánh sáng được hấp thụ ở bước sóng 340nm trong một đơn vị thời gian để xác định hoạt tính của enzyme lactate dehydrogenase. Trên thực tế việc tìm ra một thử nghiệm hiệu quả thường rất khó, nhưng nếu có được một cách thử nghiệm càng đặc hiệu thì quá trình tinh sạch càng hiệu quả. Tuy nhi ên, để chắc chắn quá trình tinh sạch hoạt động tốt, chúng ta còn c ần một thông số là lượng protein có trong hỗn hợp được thử nghiệm. Hiện nay có rất nhiều phương pháp phát hiện nhanh và chính xác nồng độ protein. Dựa vào 2 thông số thực nghiệm là hoạt tính enzyme và nồng độ protein, ta có thể xác định hoạt tính riêng của enzyme tức là tỉ lệ hoạt tính enzyme với hàm lượng protein có trong mẫu thử nghiệm. Hoạt tính riêng càng cao thì quá trình tinh sạch càng hiệu quả hay nói cách khác, mục tiêu của việc tinh sạch là làm tăng tối đa hoạt tính riêng. III. Ly trích protein từ tế bào Khi đã tìm ra thử nghiệm ph ù hợp và chọn đư ợc nguồn protein, chúng ta cần phân đoạn dịch tế b ào thành nhiều phần và xác đ ịnh xem phần nào ch ứa nhiều protein mục tiêu. Quá trình tìm phân đo ạn mục tiêu được phát triển bằng sự m ày mò qua từng thí nghiệm. Bư ớc đầu tiên là phá vỡ màng tế bào, t ạo thành h ỗn hợp đồng chất. Sau đó phân đo ạn hỗn hợp bằng ly tâm, d ịch nổi chứa phân tử có trọng lư ợng thấp, những phân tử có trọng lượng cao hơn l ắng xuống đáy ống ly tâm. Dịch nổi lại đư ợc ly tâm lần nữa với lực mạnh hơn để tạo cặn v à dịch nổi mới. Tiến trình này, đư ợc gọi là ly tâm phân đo ạn, sẽ tạo đư ợc nhiều phân đoạn khác nhau v ới tỉ trọng giảm dần, mỗi phân đoạn này chứa hàng trăm phân t ử protein khác nhau, sẽ đư ợc tinh sạch sau khi đã qua th ử nghiệm hoạt tính. Thông thường, một phân đoạn có hoạt tính cao sẽ là ngu ồn v ật liệu cho các kỹ thuật tinh sạch hiệu quả. . Tinh sạch PROTEIN (Phần 1) I- Giới thiệu chung S ự tinh sạch của protein rất quan trọng vì từ protein tinh sạch chúng ta có thể xác định được trình. độ tinh sạch cao nhất nhưng nhìn chung một quá trình tinh sạch protein cũng cần đi qua các bước căn bản sau: 1. Nhận biết protein mục tiêu 2. Ly trích protein từ tế bào 3. Thu nhận protein. gi ữa các protein trong những cá thể khác nhau và khảo sát các chức năng sinh hóa của các protein đó. Hơn thế nữa, việc tinh thể hóa protein chỉ có thể thực hiện với những protein tinh sạch và