Kỹ thuật bào chế thuốc nang và phương pháp kiểm nghiệm - Chương 2

Năm 1843, quy trình sản xuất viên nén được mô tả chính thức bởi Thomas Brockedon.1874 máy dập viên nén ra đời. Tuy vậy, việc sản xuất viên nén vẫn phát triển rất chậm. Cho đến 1932 trong Dược điển An

Chuyên đề KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP SINH HỌC I MỞ ĐẦU Trong ngành Dược có nhiều phương pháp khác để kiểm tra chất lượng thuốc phương pháp hoá học, phương pháp vật lý, phương pháp sinh học Phương pháp hoá, vật lý tiến hành nhanh, xác áp dụng với chất thành phần hoá học biết Một số dược phẩm có yêu cầu hiệu lực tác dụng, tính chất riêng biệt độ an tồn vaccine, độc tính bất thường hay yếu tố gây sốt số loại thuốc…Những tiêu chuẩn xác định phương pháp lý, hoá mà phải dùng phương pháp sinh học       1.1 Nguyên tắc •Phương pháp sinh học dựa nguyên tắc: So sánh hiệu lực tác dụng đặc tính riêng chất thử với chất chuẩn tương ứng điều kiện thời gian thí nghiệm Trong lĩnh vực kiểm nghiệm thuốc, hai loại thử nghiệm áp dụng nhiều là: - Kiểm nghiệm thuốc phương pháp thử động vật - Kiểm nghiệm thuốc thử nghiệm vi sinh vật        1.2 Chất chuẩn Chất chuẩn yếu tố quan trọng để đánh giá chất lượng chất thử Chất chuẩn chia làm hai loại: - Chất chuẩn gốc - Chất chuẩn thứ cấp Chất chuẩn phải bảo quản ống thuỷ tinh nhiệt độ thích hợp tuỳ theo mẫu (thường nhiệt độ < 50C) điều kiện khô, tránh ánh sáng 1.3 Đánh giá kết Thử nghiệm sinh học thường có thời gian thí nghiệm kéo dài phụ thuộc vào nhiều yếu tố tính chất đáp ứng sinh vật thí nghiệm, người làm thí nghiệm, điều kiện thử nghiệm Các yếu tố thường khơng ổn định Vì kết thử nghiệm sinh học phải đánh giá toán thống kê Độ xác phép thử thể giới hạn tin cậy  II KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỬ TRÊN ĐỘNG VẬT  2.1 Nguyên tắc Kiểm nghiệm thuốc phép thử động vật dựa đáp ứng động vật thí nghiệm chế phẩm đưa vào thể liều lượng theo qui định thí nghiệm đẻ đánh giá chất lượng chế phẩm cần thử       2.2 Động vật thí nghiệm Yêu cầu: Động vật thí nghiệm phải đồng đều, khiết nịi giống, khoẻ mạnh khơng nhiễm bệnh, khơng có thai ni dưỡng đầy đủ Chất lượng động vật định xác phép thử 2.3 Thử Invivo Invitro Thử nghiệm tiến hành thể động vật sống gọi Invivo Phép thử tiến hành quan cô lập động vật: tim, tử cung, ruột, máu… gọi thử Invitro        2.4 Liều (Dose) Liều lượng chế phẩm thử đưa vào thể động vật lần cho mục đích thí nghiệm Ví dụ: Liều LD0, LD50, LD100, MLD, liều thử chất hạ áp, liều thử chất gây sốt 2.5 Một số thử nghiệm động vật áp dụng kiểm nghiệm thuốc 2.5.1 Thử độc tính bất thường • Ngun tắc: Độc tính bất thường mẫu thử đánh giá số chuột nhắt sống chết thời gian 48 sau chuột nhận lượng thuốc thử thích hợp đường tiêm đường uống Thí nghiệm thường áp dụng cho thuốc đơng dược có dược liệu độc ô đầu, phụ tử hay chế phẩm đơng dược • Động vật thí nghiệm :  Dùng chuột nhắt trắng khoẻ mạnh, chuột khơng có thai, cân nặng từ 18g đến 22g • Nguyên tắc tiến hành:  Chất thử hoà tan NaCl 0,9% nước cất pha tiêm để tạo dung dịch có nồng độ quy định cho chuyên luận  Thí nghiệm thử chuột, cho chuột 0,5 ml dung dịch chất thử đường dùng sau:  + Tiêm tĩnh mạch  + Tiêm màng bụng  + Tiêm da  + Uống     • Đánh giá kết quả: Sau 48h dùng thuốc lần thứ nhất, khơng có chuột chết, mẫu thử đạt yêu cầu Nếu có hay nhiều chuột chết thời gian phải làm lại thí nghiệm lần thứ hai Thí nghiệm lần thứ hai tiến hành với 10 chuột cân nặng từ 20g Sau 48h khơng có chuột chết mẫu thử đạt u cầu Nếu có hay nhiều chuột chết, mẫu thử không đạt yêu cầu     2.2.2 Thử chất gây sốt • Nguyên tắc: Là phương pháp sinh học để kiểm tra chất lượng mẫu thử, dựa tăng thân nhiệt thỏ sau tiêm thuốc thử cần thử vào tĩnh mạch tai Các dịch tiêm truyền yêu cầu bắt buộc phải thử chất gây sốt Các thuốc tiêm ghi nhãn “khơng có chất gây sốt” tích từ 15ml trở lên phải thử chất gây sốt  • Động vật thí nghiệm:  Thực thỏ trưởng thành, khoẻ mạnh, đực (khơng có thai) nặng từ 1,5kg trở lên Thỏ nuôi đầy đủ với chất kháng sinh Nhiệt độ nhà chăn ni phịng thí nghiệm khơng chênh lệch q 30C Trong ngày trước ngày thí nghiệm , thỏ lấy nhiệt độ lần/ngày vào buổi sáng, lần cách 1h Chỉ dùng thỏ có nhiệt độ từ 38 - 39,80C Trong thời gian lấy nhiệt độ khơng cho thỏ ăn, cho uống nước Những thỏ có chênh lệch nhiệt độ lần đo ngày ≥0,60C không dùng để thí nghiệm   • Khử trùng nhiệt khơ:  Dùng để khử trùng dụng cụ bền với nhiệt bông, băng, vải, gạc, dụng cụ thuỷ tinh…  Điều kiện tiệt trùng là: 1800C/ 30 phút 1700C/ giờ, 1600C/ • Khử trùng nước:  Dùng để khử trùng môi trường nuôi cấy dụng cụ phẫu thuật  Môi trường thường khử trùng nồi hấp 1200C/ 20 phút  Các môi trường dễ bị hỏng nhiệt mơi trường có đường, sữa, bia, máu, albumin… cần khử trùng nhiệt độ thấp phương pháp sau:  + Khử trùng gián đoạn (phương pháp Tyndall)  + Khử trùng nhiệt độ thấp (phương pháp Pasteur)        • Phương pháp lọc: Dùng để khử trùng chất dễ bị phá huỷ nhiệt Cho chất lỏng chảy qua màng lọc có kích thước lỗ lọc ≤ 0,22μm Phần chảy qua phễu đựng dụng cụ vô trùng • Khử trùng tia xạ: Tia tử ngoại (UV) dùng nhiều để khử trùng buồng pha chế, tủ cấy vi sinh vật 3.3 Thử vơ trùng 3.3.1 Mục đích: Phát có mặt vi khuẩn, vi khuẩn nấm chế phẩm dịch tiêm truyền, số loại thuốc tiêm, thuốc tra mắt dụng cụ y tế mà theo tiêu chuẩn riêng cần phải vô trùng     3.3.2 Nguyên tắc: Vi sinh vật có chế phẩm thử phát triển môi trường dinh dưỡng thích hợp, chúng làm đục mơi trường lỏng, tạo váng bề mặt lắng cặn đáy ống nghiệm Trên môi trường đặc vi khuẩn, vi khuẩn nấm mọc thành khuẩn lạc đặc trưng 3.3.3 Môi trường Các loại môi trường  Môi trường Thioglycolat (phát vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí)  Mơi trường canh thang (phát vi khuẩn hiếu khí)  Mơi trường Wilson – Blair (phát vi khuẩn kỵ khí)  Mơi trường Sabuoraud lỏng (phát vi nấm) • Kiểm tra chất lượng môi trường: - Độ vô trùng:  Lấy 1- ống (hoặc bình) mơi trường làm ủ 30- 350C ngày môi trường phát vi khuẩn, 25- 280C ngày với mơi trường phát vi nấm Sau thời gian nuôi cấy, ống mơi trường khơng có vi sinh vật mọc - Khả dinh dưỡng:  Cấy vào ống môi trường thích hợp khoảng 100 tế bào vi sinh vật sau:  + Vi khuẩn hiếu khí: Staphylococcus aureus  Baccillus subtilis  Pseudomonas aeruginosa  + Vi khuẩn kỵ khí: Clostridium sporogenes  + Vi khuẩn nấm: Candida albicans  Aspergillus niger Các ống thử vi khuẩn nuôi cấy 30- 350C/ ngày, ống thử vi nấm ủ 25- 280C/ ngày Sau thời gian nuôi cấy vi sinh vật phải phát triển tốt môi trường    3.3.4 Lấy mẫu thử: Thông thường, lơ có 100 đơn vị, lấy đơn vị để kiểm nghiệm Nếu nhiều 50 đơn vị lấy thêm đơn vị không 10 Tuy nhiên, lấy mẫu cần dựa vào tiêu chuẩn nghành tiêu chuẩn sở sản phẩm để lấy mẫu cho thích hợp        3.3.5 Kiểm tra tác dụng ức chế vi sinh vật chế phẩm thử Một số thuốc trình sản xuất dược thêm chất bảo quản chất ảnh hưởng đến phát vi sinh vật có chế phẩm Một chế phẩm chưa biết có tác dụng ức chế vi sinh vật hay khơng cần phải kiểm tra : Lấy ống loại môi trường phát vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí, vi nấm cấy vào ống chế phẩm cần thử Cấy khoảng 100 tế bào vào ống môi trường tương ứng Nuôi cấy 30 - 350C/ ngày vi khuẩn, 25 - 28 0C/ ngày vi nấm Trong thời gian nuôi cấy, vi sinh vật phát triển giống (mọc nhanh phong phú) ống chứng ống kiểm tra, chế phẩm thử coi khơng có tác dụng ức chế Nếu ống có chất thử, vsv phát triển yếu không phát triển so với ống chất thử, chế phẩm có chất ức chế Tác dụng ức chế chất thử phải loại bỏ cách pha lỗng, trung hồ, dùng phương pháp màng lọc        3.3.6 Phương pháp thử Thử vơ trùng thực theo hai phương pháp: • Phương pháp dùng màng lọc: Thiết bị lọc thường thuỷ tinh, thép khơng gỉ, nhựa gồm phận tháo rời, có lưới đỡ màng lọc Màng lọc nitrat cellulose thường dùng lọc nước, dầu dung dịch alcol yếu Màng acetat cellulose để lọc dung dịch alcol mạnh Lỗ màng có nhiều kích thước khác nhau, thường dùng màng có Φ ≈ 50mm Φlỗ màng lọc ≤ 0,45μm Thiết bị lọc màng lọc phải khử trùng trước thí nghiệm Dung dịch chất thử chảy qua màng lọc, vi sinh vật giữ lại màng, cấy màng lọc vào môi trường thích hợp để phát vi khuẩn, vi nấm Phương pháp màng lọc kiểm nghiệm thuốc có tác dụng ức chế vi sinh vật, đặc biệt thuốc kháng sinh, đòi hỏi thiết bị tốt điều kiện vơ trùng cao  • Phương pháp ni cấy trực tiếp:  Phương pháp có kỹ thuật đơn giản, khả phát vi sinh vật giảm số lượng vi sinh vật phân phối thể tích chất thử lớn khơng thực với chế phẩm có tác dụng ức chế chất kháng sinh • Lượng mẫu thử dùng thí nghiệm: Lượng mẫu thử cần cấy vào môi trường tuỳ thuộc vào loại mẫu (bảng 2) Chất lỏng dầu hay dung dịch dầu phải thêm vào môi trường nuôi cấy 1% tween 80 chất nhũ hoá khác với nồng độ thích hợp Mẫu thử dạng mỡ hay kem hồ lỗng vào dung dịch pepton 0,1% vơ trùng theo tỷ lệ 1/10 trước cấy vào môi trường (dung dịch pepton cần tween 80 theo tỷ lệ 1ml/1lit     Lượng chế phẩm đơn vị đóng gói Lượng tối thiểu cho mơi trường ni cấy Thể tích mơi trường Chất lỏng: Thể tích V < 1ml Toàn ống ml ≤ V < ml 1/ ống ml ≤ V < 20 ml ml 20 ml ≤ V < 50 ml ml 50 ml ≤ V < 100 ml 10 ml V > 100 ml Thường 10% - Chất rắn: Khối lượng P < 50 mg Toàn đơn vị đóng gói 50 mg < P < 200 mg 1/ khối lượng đơn vị đong gói P ≥ 200 mg 100mg Bảng 2: Lượng mẫu thử cần cấy vào môi trường 10 ml 15 ml 20ml 40 ml 80 ml 100 ml 20 ml 40 ml 80 ml      • Kỹ thuật thử: Mẫu thử dược phẩm: Dùng dụng cụ vô trùng cấy trực tiếp chế phẩm thử vào môi trường phát vi khuẩn, vi nấm Chất rắn dạng bột cho trực tiếp vào môi trường làm thành dung dich hay nhũ dịch 1% sau cấy vào mơi trường Mẫu thử băng gạc, khâu phẫu thuật kích thước hình dạng cho phép, nhúng tồn mẫu thử vào 100 ml môi trường Mẫu thử dây truyền dịch: cho dung dịch pepton 0,1% vô trùng chảy qua để thu 15 ml cấy vào 100ml môi trường Môi trường phát vi khuẩn ni cấy 30- 350C ngày, 25- 280C ngày vi nấm (Mỗi loại môi trường làm 2- ống thử song song)         • Nhận định kết quả: - Mẫu thử coi vô trùng sau thời gian nuôi cấy khơng có vi khuẩn, vi nấm phát triển - Nếu có nhiều ống có vi sinh vật mọc cần làm lại lần thứ 2: + Nếu vi sinh vật mẫu vơ trùng + Nếu có vi sinh vật giống với lần mẫu thử không vơ trùng - Nếu có vi sinh vật khác với lần thí nghiệm làm lại lần với số lượng mẫu gấp đơi: + Khơng có vi sinh vật phát triển mẫu vơ trùng + Có vi sinh vật mọc mẫu không vô trùng     3.4 Thử giới hạn vi sinh vật Các dược phẩm trình sản xuất thường bị nhiễm vi khuẩn, vi nấm Vì vậy, thử giới hạn vi sinh vật thử nghiệm bắt buộc cho dược phẩm từ nguyên liệu đế thành phẩm không tiệt trùng trinh sản xuất 3.3.4.1 Mục đích Thử độ nhiễm vi sinh vật nhằm mục đích xác định giới hạn tối đa số lượng vi khuẩn hiếu khí, vi nấm có 1g (hoặc 1ml) chế phẩm thử Đồng thời phát vi khuẩn điểm vệ sinh quy định khơng có thuốc là: Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Escherichia coli, loài Salmonella, vi khuẩn kỵ khí Clostridia          3.3.4.2 Nguyên tắc • Phép thử dựa nguyên tắc Đếm số vi khuẩn hiếu khí, nấm mốc, nấm men có dược phẩm thể khuẩn lạc đặc trưng đĩa thạch dinh dưỡng thích hợp Căn vào đặc tính hình thái, sinh lý, sinh hố loại vi khuẩn để xác định vi khuẩn gây bệnh Trên sở kết thí nghiệm đánh giá chất lượng thuốc theo tiêu chuẩn dược điển tiêu chuẩn sở 3.3.4.3 Phương pháp thử • Mơi trường: - Môi trường thạch casein - đậu tương (thử vi khuẩn hiếu khí) - Mơi trường thạch thường (thử vi khuẩn hiếu khí) - Mơi trường Sabouraud - kháng sinh (thử vi nấm) Thêm 100mg benzylpenicillin 1000mg tetracylin vào lít mơi trường tiệt trùng, 50 mg cloramphenicol cho lít mơi trường trước tiệt trùng     • Chuẩn bị mẫu thử: Mẫu thử theo quy định lấy 10g (hoặc 10ml) để thí nghiệm Mẫu thử chất rắn hay chất lỏng làm thành dung dịch hay nhũ dịch nước, pha loãng vào dung dịch đệm phosphat pH = 7,2 d2 NaCl 0,9% để nồng độ 10-1 sau pha nồng độ 10-2, 10-3,… tuỳ theo yêu cầu thí nghiệm Mẫu thử chất lỏng khơng hồ lẫn vào nước dạng dầu, kem thuốc mỡ cần thêm lượng chất nhũ hố vơ trùng thích hợp tween 20, tween 80 làm nóng nhẹ để tạo hỗn dịch đồng              • Kiểm tra chất ức chế Kết thí nghiệm khơng có giá trị mẫu thử có chất bảo quản thành phần có ảnh hưởng đến phát triển vi sinh vật Vì vậy, cần kiểm tra chất ức chế trước đếm số lượng vi sinh vật Vi sinh vật thị: Staphylococcus aureus (đại diện vi khuẩn Gram +) Escherichia coli (đại diện vi khuẩn Gram -) Candida albicans (đại diện vi nấm) Các chủng nuôi cấy mơi trường dinh dưỡng thích hợp sau 18 – 24 (đối với vi khuẩn) 24 đến 48 vi nấm, làm thành nhũ dịch có khoảng 100 tế bào/ml - Cách tiến hành: Đĩa thử 1: Cho 1ml chất thử nồng độ thích hợp Đĩa thử 2: ml chất thử + ml nhũ dịch vi sinh vật Đĩa đối chứng: 1ml nước cất vô trùng + 1ml nhũ dịch vi sinh vật Cho vào đĩa 15 - 20 ml môi trường để nguội 450C Ủ 30 - 350C/ 24 - 48 (đối với vi khuẩn) 25 - 280C/ 48 - 72 (đối với C.albicans) ... II KIỂM NGHIỆM THUỐC BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỬ TRÊN ĐỘNG VẬT  2. 1 Nguyên tắc Kiểm nghiệm thuốc phép thử động vật dựa đáp ứng động vật thí nghiệm chế phẩm đưa vào thể liều lượng theo qui định thí nghiệm. .. thuốc, hai loại thử nghiệm áp dụng nhiều là: - Kiểm nghiệm thuốc phương pháp thử động vật - Kiểm nghiệm thuốc thử nghiệm vi sinh vật        1 .2 Chất chuẩn Chất chuẩn yếu tố quan trọng để... chuột chết, mẫu thử không đạt yêu cầu     2. 2 .2 Thử chất gây sốt • Nguyên tắc: Là phương pháp sinh học để kiểm tra chất lượng mẫu thử, dựa tăng thân nhiệt thỏ sau tiêm thuốc thử cần thử vào