nghiên cứu thành phần hóa học cây xuân tiết tiền (justicia monetaria r ben , ancanthaceae)

DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.2 Các lignan được phân lập từ các loài Justicia 7 Bảng 1.3 Các flavonoit, tecpenoit, ancaloit, cumarin được phân lập Bảng 4.1 Khối lượng, hiệu suất thu các phần

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC BÁCH KHOA HÀ NỘI

-

NGUYỄN THỊ HUYỀN

NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC

CÂY XUÂN TIẾT TIỀN

(JUSTICIA MONETARIA R BEN., ANCANTHACEAE)

Chuyên ngành : HÓA HỮU CƠ

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC:

1 PGS.TS Trần Thu Hương

2 TS Lê Huyền Trâm

Hà Nội – 2011

LỜI CẢM ƠN

Bản luận văn này được thực hiện tại Bộ môn Hóa Hữu cơ, Viện Kỹ thuật Hóa học, trường Đại học Bách Khoa Hà Nội

Trước hết xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Trần Thu Hương

và TS Lê Huyền Trâm, Bộ môn Hóa Hữu cơ, Viện Kỹ thuật Hóa học, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội, đã giao đề tài, tận tình hướng dẫn, chỉ bảo và giúp đỡ để em hoàn thành luận văn này

Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầy giáo, cô giáo, các cán bộ tại Bộ môn Hóa Hữu cơ, Viện Kỹ thuật Hoá học, Trường Đại học Bách Khoa Hà Nội cùng gia đình, bạn bè đã động viên, khích lệ và giúp đỡ em trong suốt quá trình học tập

và hoàn thành bản luận văn này

Cảm ơn đồng nghiệp, gia đình, bạn bè và những người thân đã động viên, giúp đỡ tôi hoàn thành nhiệm vụ học tập và nghiên cứu

Hà nội, ngày tháng năm 2011

Học viên

Nguyễn Thị Huyền

MỞ ĐẦU 1

1.2 Tổng quan về chi Justicia, họ Acanthaceae 4

1.2.1 Thực vật học của chi Justicia 4

1.2.2 Nghiên cứu hóa học chi Justicia 7

1.2.3 Nghiên cứu hoạt tính sinh học chi Justicia 17

1.3 Cây Xuân tiết tiền (Justicia monetaria R Ben.) 21

Chương II PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23

2.1 Mẫu thực vật 23

2.2 Các phương pháp phân lập các hợp chất 23

2.3 Các phương pháp xác định cấu trúc các hợp chất 28

Chương III THỰC NGHIỆM 30

3.2 Chiết tách và phân lập các hợp chất từ lá cây Xuân tiết tiền 31

3.3 Các hằng số và dữ kiện phổ của các hợp chất đã phân lập được 34

Chương IV KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37

4.1 Mẫu thực vật 37

4.2 Xác định cấu trúc hóa học của các hợp chất phân lập được 39

KẾT LUẬN 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 53

PHỤ LỤC 60

DÙNG TRONG LUẬN VĂN

NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance)

13C-NMR Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C (Carbon-13 Nuclear Magnetic

Resonance Spectroscopy)

1H-NMR Phổ cộng hưởng từ proton (Proton Magnetic Resonance

Spectroscopy)

HMQC Heteronuclear Multiple Quantum Coherence

HMBC Heteronuclear Multiple Bond Coherence

DEPT Distortionless Enhancement by Polarisation Transfer

ESI-MS Phổ khối lượng phun mù điện tử (Electron Spray Ionization

DANH MỤC CÁC BẢNG

Bảng 1.2 Các lignan được phân lập từ các loài Justicia 7 Bảng 1.3 Các flavonoit, tecpenoit, ancaloit, cumarin được phân lập

Bảng 4.1 Khối lượng, hiệu suất thu các phần chiết và hợp chất từ

bột lá cây Xuân tiết tiền (Justicia monetaria R Ben) 36

Danh mục hình

Hình 1.2 Cây Xuân tiết tiền (Justicia monetaria R Ben., Acanthaceae) 22

Hình 2.1 Bản mỏng silica gel tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck) 25

Hình 2.2 Quá trình phân tách trên sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel 28

Hình 3.1 Lá cây Xuân tiết tiền (Justicia monetaria R Ben.) 30

Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết các lớp chất từ lá cây Xuân tiết tiền 31

Sơ đồ 3.3 Quá trình phân tách các hợp chất từ phần chiết n-hexan 33

Sơ đồ 3.3 Quá trình phân tách các hợp chất từ phần chiết nước 34

MỞ ĐẦU

Từ nhiều thế kỷ nay các sản phẩm thiên nhiên luôn là nguồn chủ yếu cung cấp các thuốc chữa bệnh cho con người, và khoảng một nửa các dược phẩm được sử dụng ngày nay có nguồn gốc từ các sản phẩm thiên nhiên Nhiều hoạt chất thiên nhiên chiết xuất từ các họ thực vật khác nhau đã được nghiên cứu và ứng dụng rất hiệu quả để chữa bệnh trong thực tế Rutin chiết

xuất từ cây Hoa hòe (Sophora japonica L., Fabaceae) có tác dụng làm giảm tính thấm của mao mạch, là một chất chống oxi hóa (antioxydant), có tác

dụng bảo vệ adrenalin trong tuần hoàn, đồng thời tăng cường sức chịu đựng

của mao mạch Artemisinin từ cây Thanh hao hoa vàng (Artemisia annua L.,

Asteraceae) có hiệu quả rất tốt để điều trị bệnh sốt rét ác tính do có tác dụng

cả đối với các dòng ký sinh trùng sốt rét kháng được sự điều trị bằng

chloroquin Curcumin từ cây Nghệ vàng (Curcuma longa L., Zingiberaceae)

dùng để chữa một số bệnh viêm loét dạ dày và đường tiêu hóa Berberin, một

hoạt chất được chiết xuất từ cây Vàng đắng (Coscinium fenestratum (Gaertn.)

Colebr., Menispermaceae) là một loại thuốc dân tộc đã được nghiên cứu và

sử dụng ở Việt Nam làm thuốc trị bệnh đường ruột Từ củ Bình vôi

(Stephania rotunda Lour., Menispermaceae) đã chiết xuất được hoạt chất

rotundin và từ hoạt chất này sản xuất thuốc an thần gây ngủ khá tốt Từ cây

Thông đỏ Thái Bình Dương (Taxus brevifolia Nutt., Taxaceae) các nhà khoa

học đã phân lập được taxol và phát hiện hoạt chất này có hoạt tính gây độc tế bào đối với nhiều dòng tế bào ung thư, đặc biệt là ung thư vú và ung thư buồng trứng Hoạt chất taxol cùng với các dẫn xuất bán tổng hợp như taxotere

đã chính thức được sử dụng để điều trị cho bệnh nhân ung thư

Hiện nay, các sản phẩm thiên nhiên vẫn tiếp tục đóng một vai trò trung tâm trong việc phát hiện và phát triển các dược phẩm mới, không những được

sử dụng trực tiếp để làm các tác nhân điều trị, mà còn là những hợp chất dẫn đường cho việc phát triển các thuốc mới hoặc là các chất dò sinh hóa để làm sáng tỏ các nguyên lý của dược lý học con người

Việt Nam nằm trong vùng nhiệt đới ẩm, có gió mùa nên có hệ thực vật rất phong phú và đa dạng Hiện nay, đã có trên 12.000 loài thực vật bậc cao được thống kê, trong số đó cây làm thuốc chiếm khoảng 26-30% Từ lâu, nhân dân ta đã biết dùng nhiều loài cây cỏ trong tự nhiên để phòng bệnh và chữa bệnh Nhiều loài trong họ Ô rô (Acanthaceae) đã được sử dụng trong y học dân

gian làm thuốc chữa bệnh Ví dụ như loài Pseuderanthemum palatiferum

(Nees) Radlk (Xuân hoa) dùng chữa rối loạn tiêu hóa, điều trị chấn thương,

chảy máu; loài Andrographis paniculata (Xuyên tâm liên) được dùng trị một số

bệnh đường ruột và đường tiêu hoá như lỵ cấp tính, viêm ruột, viêm dạ dày, ngộ độc thức ăn, một số bệnh kèm theo sốt do cả vi khuẩn và virus

Theo hướng nghiên cứu thành phần hoá học và hoạt tính sinh học của các cây thuốc có công dụng chữa bệnh, chúng tôi đã lựa chọn cây Xuân tiết

tiền (Justicia monetaria R Ben.) thuộc họ Ô rô (Acanthaceae) làm đối tượng

nghiên cứu của luận văn này Theo một số bài thuốc dân gian của dân tộc Dao, cây Xuân tiết tiền được dùng để chữa một số bệnh về gan, tiêu viêm, giải độc gan, thận Đây là một cây thuốc có giá trị của Việt Nam, nhưng cho đến nay ở trong nước cũng như trên thế giới chưa có một công trình nào công

bố về thành phần hóa học và hoạt tính sinh học của loài cây này để có cơ sở khoa học vững chắc cho việc sử dụng một cách hợp lý, có hiệu quả nhất

Nội dung chính của luận văn bao gồm:

1 Nghiên cứu phân lập các hợp chất tinh khiết từ lá cây Xuân tiết tiền

(Justicia monetaria R Ben., Acanthaceae)

2 Xác định cấu trúc hóa học của các chất phân lập được từ cây Xuân

tiết tiền

Chương 1 TỔNG QUAN

1.1 VÀI NÉT VỀ HỌ ACANTHACEAE [1, 2, 57]

Họ Acanthaceae (họ Ô rô) thuộc bộ Scrophulariales (Hoa mõm sói), liên bộ Lamlanae (Hoa môi) là một họ thực vật lớn có khoảng 250 chi và 2.400 loài, phân bố chủ yếu ở phía Nam và Đông Nam châu Á, châu Phi và

Mỹ La tinh Ở Việt Nam, theo các tài liệu tra cứu thì hiện có khoảng 47 chi với khoảng 217 loài khác nhau

Theo tác giả Võ Văn Chi [3] họ Acanthaceae ở Việt Nam gồm các chi sau:

Andrographis Hygrophila Pseuderanthemum Asystasia Justicia Rhinacanthus

Dicliptera Pararuellia

Graptophyllum Peristrophe

Đặc điểm thực vật của các loài thuộc họ Acanthaceae là cây thảo đứng hay thân leo, thân thường chia đốt Một số loài có dạng cây bụi hoặc cây gỗ nhỏ Lá đơn mọc đối, không có lá kèm Hoa lưỡng tính, không đều, có khi có

lá bắc và lá bắc con rõ Đài gồm năm lá có khi dính lại với nhau, đôi khi bắt gặp có bốn lá ở một số loài do bị tiêu biến Tràng có ống hình trụ phình to ở gốc, chia năm nhưng không đều, hầu như chia hai môi, môi trên chẻ đôi, môi dưới chia hai thuỳ Nhị hai hoặc nhị bốn, trong đó có hai nhị trội hơn hẳn về kích thước Bầu trên hai ô, vòi nhuỵ có dạng sợi đơn, đầu nhuỵ chẻ đôi Quả

nang có hai ô, gồm nhiều noãn có chân Khi già quả tự mở bằng cách co giãn

từ đỉnh xuống chân, các mảnh vỏ cong và rời khỏi trục giữa Hạt có cuống

ngắn, phôi lớn và thường không có nội nhũ

Nhiều loài thuộc họ Ancanthaceae là những cây thuốc được sử dụng

trong y học dân gian của Việt Nam như Pseuderanthemum palatiferum (Nees) Radlk (Xuân hoa), Thunbergia grandiflora (Rottl.) (Roxb.) (Dây bông xanh),

Ancanthus iliciofolius L (Ô rô to), Andrographis paniculata (Burm.f.) Nees

(Xuyên tâm liên), v.v… Một số chi thuộc họ này do có hoa đẹp nên còn được

trồng làm cây cảnh như Acanthus, Justicia, v.v

1.2 TỔNG QUAN VỀ CHI JUSTICIA, HỌ ACANTHACEAE

1.2.1 Thực vật học của chi Justicia [4, 5]

Chi Justicia là một trong những chi lớn nhất trong họ Acanthaceae,

theo ước tính có khoảng 600 loài Theo Phạm Hoàng Hộ [4] ở Việt Nam có

một số loài Justicia (Bảng 1.1) sau:

Bảng 1.1 Một số loài Justicia của Việt Nam

1 Xuân tiết Justicia adhatoda L

Syn Adhartoda vasica Ness

Quảng Trị

2 Xuân tiết bằng Justicia aequalis R Ben Tuyên Quang

3 Xuân tiết Balance Justicia balancae Lind Đà Nẵng

4 Xuân tiết kiểng Justicia brandegeana Wassh

& L B Sm

Sài Gòn (gốc Mehico)

5 Xuân tiết trắng Justicia candida R Ben Bắc Thái

6 Đắng thiệt Clemen Justicia clemensorum (R

Ben.) B Hans syn Isoglossa

9 Xuân tiết Eberhardt Justicia eberhadtii R Ben Bắc Thái

10 Xuân tiết Evrard Justicia evrardii R Ben Cà Ná

11 Đẳng thiệt khó Justicia fastidiosa (R Ben.) B

Hans syn Isoglossa

clemensorum R Ben

Phú Khánh

12 Xuân tiết hoa dòn Justicia fragilis Wall Hà Nội, Hải

Phòng, Tây Ninh

13 Thanh táo, tần cửu,

thuốc trặc

Justicia gendarussa Burm F

Syn Gendarussa vulgaris

Ness

(-)

14 Xuân tiết chụm Justicia glomerulata R Ben Đà Nẵng,

Kontum

15 Xuân tiết mập Justicia grossa C B Clarke Lạng Sơn

16 Đẳng thiệt không gai Justicia inermis (R Ben.) B

Hans

Syn Isoglossa clemensorum

R Ben

Bình Trị Thiên

17 Xuân tiết lép Justicia ingrata R Br Nha Trang

18 Xuân tiết dài Justicia longula R Ben Hòa Bình

19 Xuân tiết tiền Justicia monetaria R Ben Sơn Tây

20 Xuân tiết đuôi chuột Justicia myuros R Ben Quảng Ninh

21 Xuân tiết Nees Justicia neesiana (Nees) T

Ander

Đăk Nông, Kontum

24 Xuân tiết hao ẩm Justicia oreophila C B

Clarke

Bà rá

25 Xuân tiết hình đờn Justicia pandurifomis R Ben Bắc Thái

26 Đùi gà Justicia polanei R Ben Lào Cai

27 Xuân tiết lồi Justicia prominens R Ben Châu Đốc

28 Xuân tiết bò, Tước sàng Justicia procumbens L Đà Lạt

29 Xuân tiết chẻ bốn Justicia quadrifaria (Nees) T

Ander

Đồng Nai

30 Xuân tiết ngao du Justicia vagabunda R Ben

syn Raphidospora vagabunda

R Ben

Bắc Thái, Hà Sơn Bình

31 Xuân tiết bụng Justicia ventricosa Wall Lạng Sơn,

Quảng Trị, Đồng Xoài

Ghi chú: (-): Không thấy đề cập trong tài liệu

Dưới đây là hình ảnh của một số loài thuộc chi Justicia

a) Justicia brandegeana Wassh

& L B Sm.(Xuân tiết kiểng )

b) Justicia gendarussa Burm F

(Tần cửu, Thanh táo)

c) Justicia gendarussa Burm F

(Xuân tiết bò, Tước sàng)

d) Justicia betonica L

(White shrimp plant)

Hình 1.1 Hình ảnh một số loài Justicia, họ Acanthaceae

1.2.2 Nghiên cứu hóa học chi Justicia

Chi Justicia đã được chú ý nghiên cứu về hóa học từ những năm 1960 Thành phần hóa học của các loài Justicia khá đa dạng Theo các công trình

nghiên cứu đã công bố trên thế giới, từ các bộ phận khác nhau của các loài

Justicia đã phân lập được nhiều hợp chất thuộc các nhóm polyphenol (lignan,

flavonoit, cumarin) tecpenoit, ancaloit,

a) Các lignan

Lignan là lớp hợp chất chủ yếu được phân lập từ các loài Justicia Đây là

lớp hợp chất tự nhiên có sự đa dạng sinh học (chống ung thư, chống viêm, kháng khuẩn, kháng nấm, kháng tiểu cầu, kháng virus ) góp phần phát triển thành các chế phẩm điều trị bệnh mới

Nhiều lignan có khung arylnaphtalid được tìm thấy trong chi Justica với

tỷ lệ tương đối cao Ví dụ, jusmicaranthin 22 được phân lập từ phần chiết CHCl3 của Justicia neessi cho hiệu suất 0,025% [45] Phần chiết etanol của lá

Justicia extensa chứa khoảng 1% justicidin P 47 [55] Một số arylnaphtalid

lignan ở dạng dẫn xuất glycosid và các lignan hỗn tạp khác cũng được tìm

thấy trong các loài Justicia

Các hợp chất lignan được phân lập từ các loài thuộc chi Justicia được

Toàn bộ cây

1-aryl-2,3-naphtalid lignan:

cilinaphthalid A (1), cilinaphthalid B (2);

Các lignan khác: heliobuphthalmin

(3), chinensinaphthol methyl ether (4), justicidin A (5), taiwanin E methyl ether (6), chinensinaphthol (7),

[19]

diphyllin (8), 4′-dimethyl chinensinaphthol methyl ether (9)

Justicia

hyssopifolia

Tây Ban Nha

Lá

3-hydroxymethyl-1-methoxy-5,6-methylenedioxyphenyl)-2-naphthoic

methylene-dioxy-4-(3,4-acid lacton (l2), genin (13), helioxanthin (14), justicidin E (15), gadain (16), cubebin (17)

[52]

Đảo Canary

Lá và rễ justiflorinol (24), justicinol (25),

patentiflorin A (26), patentiflorin B (27), 4′′-O-axetylpatentiflorin B (28),

Toàn bộ cây

arylnaphtalid lignan:

chinensinaphthol methyl ether (4), taiwanin E methyl ether (6), chinensinaphthol (7), diphyllin (8), neojusticin A (30), neojusticin B (31), justicidin A (32), justicidin B (33), taiwanin E (34)

[16]

Trung Quốc

Toàn bộ cây

diphyllin (8), justicidin A (32),

procumbenoside A

[4-O-α-L-

arabinopyranosyl-(1′′′t2′′)-β-D-[20]

apiofuranosyldiphyllin] (35), tuberculatin (36), ciliatoside A (37)

Toàn bộ cây

rostellulin A (38), justin B (39), justicidin C (40), cilinaphthalid A (1), justicidin A (32)

Phần trên mặt đất

justicidin A (32), justicidin B (33), justicidin C (40), justicidin D (41), diphyllin (8), diphyllin apiosid (42), diphyllin apiosid-axetat (43),

secolignan glycosid: juspurpurin (47),

arylnaphtalen glycosid: justalakonin

Dưới đây là cấu trúc hóa học của một số hợp chất lignan được phân lập

từ các loài thuộc chi Justicia

R 1 = R 2 = R 3 = R 4 = −OMe, R 5 = −OH

R 1 = R 2 = R 3 = R 4 = R 5 = −OMe

R 1 = R 4 = R 5 = −OMe, R 2 = R 3 = −OCH2O−

R 1 = R 2 = R 3 = −OMe, R 4 = R 5 = −OCH2O−

R 1 = −OMe, R 2 = R 3 = R 4 = R 5 = −OCH2O−

R 1 = −OH, R 2 = R 3 = −OCH2O−, R 4 = R 5 = −OMe

O O

COOCH3COOCH3

3

O O

OH

O O

O O OMe OMe

15

13 14 16 17

HO

O

O

O O GlcO

18

19

O O

Ar O

O

1 2 2a

3a 3 4 4a

O O OH

O O

O

O

O

O OH

23

O O O

O

O

O OH

24

O

O O

OCH3

O OH

H3CO

H3CO

25

O O

H3C HO

OH HO

H3C HO

R 2

R 1

O O

H3CO

31

R 1 − R 2 = −OCH2O−

33

34 R1−R 2 = R 4 −R 5 = −OCH2O−, R 3 = −OH

R 1 = R 2 = −OCH3, R 3 = −OH, R 4 −R 5 = −OCH2O−

32 R1 = R 2 = R 3 −OCH3, R 4 −R 5 = −OCH2O−

35 R = β-D-apiofuranosyl

O

O O

OMe

OMe O

1'' 4''

O

36 R = R' = H

37 R = β-D-xylopyranosyl, R' = H

38 39 40

O O

O O

O

O

O O

OH

OMe MeO

O

O

O O MeO

OMe MeO

O O

O O

O

O OH

OH

HO HO

45 R = OCH3

46 R = H

O O OGlc

O O

O O

47

48

O O

O

O

O O O

O

50

HO O

O O

O

O O

O O

O OMe

Glc O

O

51

b) Các hợp chất khác

Ngoài lignan là lớp hợp chất chính như đã nói ở trên, các nghiên cứu về hóa học cho thấy sự có mặt của nhiều lớp chất có hoạt tính sinh học khác

trong chi Justicia như flavonoit, tecpenoit (với các khung fridelan, ursan,

oleanan tritecpen), ancaloit và các hợp chất chứa nitơ Umbeliferon và

scopoletin là hai cumarin được phân lập từ Justicia pectoralis Jacq., Justicia

procumbens [37, 58] Các hợp chất steroit như stigmasterol, sitosterol,

daucosterol cũng được phân lập từ lá và rễ của các loài Justicia gendarussa,

Justicia flava [11, 21]

Bảng 1.3 tổng kết các hợp chất thuộc các lớp chất flavonoit, tecpenoit,

ancaloit, cumarin đã được phân lập từ các loài thuộc chi Justicia

Bảng 1.3 Các flavonoit, tecpenoit, ancaloit, cumarin

được phân lập từ các loài Justicia

[60]

Toàn bộ cây

[33]

Thái Lan Phần trên

mặt đất

justiciosid E (69), justiciosid F (70), justiciosid G (71)

[32]

Justicia

procumbens

Trung Quốc

Lá friedelin (72), epi-friedelinol

(73), axit asiatic (74)

[60]

Trung Quốc

Toàn bộ cây

axit ursolic (75), axit euscaphic (76), axit 2α- hydroxyursolic (77), axit tormentic (78)

OH HO

53 52

OH HO

Glc

54

R2O

O OH

60 R1 = R 2 = H, R 3 = OH

61 R1 = H, R 2 = R 3 = OH

OH O

O OH

OH HO

55

64 63

OH Glc

12 13 17

1''

9

HO

24 23

OH HO

O HO

O OH HO

HO

OR 2 O

O

1'

H H

H

H

10 1 5 8

OH HO

O HO

O OH HO

HO

OR 2 O

27

12 13 17

6

8

1''

1' 23

HO

9 12

O

O

80

N N OH

O

N N OH

81

HO

N N OH

82

83 R = OGlc

84 R = H

R

N H

N

N

H N

O

N

H

NH2O H

H

N H

OH

HO H MeO

MeO

O

O

88

1.2.3 Nghiên cứu hoạt tính sinh học chi Justicia

Nhiều loài thuộc chi Justicia, họ Ô rô (Acanthaceae) đã được sử dụng

rộng rãi trong y học cổ truyền của một số nước để chữa các loại bệnh khác nhau Toàn bộ cây hoặc phần trên mặt đất thường được sử dụng để làm thuốc

và hay dùng nhất là dịch chiết nước của lá cây, của bột rễ cây, hoặc sử dụng kết hợp với các loài cây khác Việc khảo sát, nghiên cứu về hoạt tính sinh học

nhằm làm sáng tỏ tác dụng chữa bệnh của các loài Justicia

Một số loài thuộc chi Justicia có hoạt tính chống ung thư đối với các

dòng tế bào ung thư khác nhau Dịch chiết etanol của phần trên mặt đất của

Justicia neesii Ramamoorthy có hoạt tính chống ung thư kháng lympho bào

bạch cầu P-388 ở chuột Dịch chiết metanol của Justicia procumbens L. ức

chế đáng kể sự tăng trưởng của lympho bào bạch cầu P-388 in vivo và có hoạt tính gây độc tế bào in vitro đối với dòng ung thư biểu mô người [16]

Một số loài Justicia có hoạt tính kháng virus, chẳng hạn như Justicia

betonica L và Justicia flava có khả năng kháng virus gây viêm miệng Dịch

chiết nước của phần trên mặt đất của Justicia gendarussa có khả năng chống

sự sao chép ngược của virus HIV type 1 [48] Dựa trên những kết quả nghiên

cứu thu được, một số loài Justicia có thể được dùng làm thuốc điều trị bệnh

do virus gây ra

Justicia pectoralis có hoạt tính kháng khuẩn cao khi kháng được các vi

khuẩn E coli, E faecalis và S epidermidis Hơn nữa, loài này thể hiện hoạt

tính kháng sốt rét khi cho các test dương tính khi theo dõi sự tăng trưởng và

phát triển của ấu trùng của muỗi Aedes aegypti giai đoạn IV Các dịch chiết

thực vật với nồng độ 0,05 đến 0,50 mg/ml là đạt yêu cầu cho việc thử hoạt tính diệt ấu trùng Trong số các dịch chiết được thử nghiệm thì dịch chiết của

Justicia pectoralis được nhận thấy là độc đối với ấu trùng muỗi [15]

Nhiều hợp chất được chiết xuất từ các loài Justicia có hoạt tính sinh học

thú vị Lignan là lớp hợp chất chính có mặt trong các phần chiết có hoạt tính

của các loài Justicia Chúng thể hiện một số tác dụng dược lý rất quan trọng

như chống ung thư, kháng vi rút, kháng viêm và kháng tiểu cầu Elenosid

(18), một arylnaphtalen lignan phân lập từ loài Justicia hyssopifolia L., đã

được nghiên cứu sâu về hoạt tính sinh học Khảo sát về hoạt tính sinh học cho thấy hợp chất này có nhiều hoạt tính như gây độc tế bào, kháng virus, kháng côn trùng, giãn cơ, kích thích hoạt động của hệ thống thần kinh trung ương ở chuột nên được sử dụng làm thuốc an thần và thư giãn cơ bắp tương tự như một số loại thuốc an thần, giảm đau khác [30, 41, 42] Elenosid đã được thử hoạt tính gây độc tế bào trên các dòng tế bào ung thư người trong khoảng nồng độ từ 10-5 đến 10-4 M, với LD50 là 305 mg/kg ở chuột, suy yếu dần ở các liều 25, 50 và 100 mg/kg Kết quả là sau 5 ngày tiêm hợp chất này đã không quan sát thấy liều gây chết [7] Ngoài ra, hợp chất này cũng thể hiện hoạt tính gây độc tế bào đối với dòng tế bào ung thư bạch cầu [41]

Nhiều lignan được phân lập từ các loài Justicia có một số hoạt tính sinh

học khác đáng chú ý Hoạt tính kháng tiểu cầu tụ tập của các lignan

cilinaphtalid B (2), chinensinaphtol metyl ete (4), taiwanin E metyl ete (7), dimetyl chinensinaphtol metyl ete (10), neojusticin A (30), justicidin B (31), taiwanin E (34) [24] Đặc biệt, phần chiết methanol của Justicia procumbens cũng có hoạt tính này khi ức chế 50% axit arachidonic trong tiểu cầu thỏ [16]

4’-Hoạt tính kháng tiểu cầu tụ tập lý giải được việc sử dụng các dịch chiết thu

được từ các loài Justicia trong điều trị bệnh tim

Diphylin (8), justicidin A (32), justicidin B (33), diphylin apiosid (42) và

diphylin apiosid-5-axetat (43) được phân lập từ các loài Justicia procumbens,

Justicia extensa, Justicia ciliata có hoạt tính kháng virus mạnh, kháng được

virus gây viêm miệng và có hoạt tính gây độc tế bào thấp, kháng các tế bào ung thư phổi của thỏ (RL-33) [9, 18]

Neojusticin A (30) và justicidin B (33) là hai lignan có khả năng ức chế

các tập hợp thứ cấp gây ra bởi adrenalin Hơn nữa, những hợp chất này cũng

có hoạt tính đối với enzym cyclooxygenase-1 (COX-1) với tác dụng kháng một phần tiểu cầu tụ tập do hoạt tính của COX-1 và làm giảm sự tạo thành thromboxan [59]

Helioxanthin (11) có hoạt tính ức chế sự tăng trưởng của virus viêm gan

B ở người Hợp chất này được phân lập từ Justicia flava và được sử dụng phổ

biến trong việc điều trị HIV/AIDS ở Uganda [36, 53]

Hoạt tính kháng u của phần lớn các lignan như cilinaphtalid A (1), diphyllin (8), justicidin E (15), patentiflorin A (26), patentiflorin B (27), justicidin A (32), justicidin B (33), taiwanin E (34), tubeculatin (35), diphyllin apiosid (42), và diphyllin apiosid-5-axetat (43) có liên quan đến việc

sử dụng phổ biến của các loài Justicia procumbens, Justicia ciliata, Justicia

rhodoptera, và Justicia patentiflora trong liệu pháp chống ung thư Diphyllin

(8), justicidin A (32) và tubeculatin (35) được phân lập từ Justicia ciliata,

có tác dụng chống ung thư đáng kể đối với một số dòng tế bào ung thư người như ung thư biểu mô, ung thư cổ tử cung, ung thư đại trực tràng và ung thư vú… [20] Justicidin A (32) còn thể hiện hoạt tính gây độc tế bào khi kháng

các dòng tế bào ung thư T-24, CaSki, SiHa, HT-3, PLC/PRF/5 in vitro [18]

Justiciresinol được phân lập từ Justicia glauca có hoạt tính gây độc tế bào

thấp khi ức chế ba dòng tế bào ung thư người là A-549 (ung thư phổi),

MCF-7 (ung thư vú), và HT-29 (ung thư tuyến ruột kết) [49] Podophyllotoxin được ứng dụng rộng rãi trong hóa trị liệu ung thư và đã được sử dụng như là một tiền chất để bán tổng hợp thành dược phẩm trong điều trị bệnh ung thư [13]

Một số lignan khác như tawanin E metyl ete (7), diphyllin (8), helioxanthin (11), elenosid (18), justicidin A (32), justicidin B (33), tuberculatin (37), cilinaphtalid A (1) cũng thể hiện hoạt tính chống ung thư mặc dù chúng được

phân lập từ các loài Justicia khác nhau không thể hiện hoạt tính này

Một số ít các polyphenol được phân lập từ các loài Justicia đã được khảo

sát về hoạt tính sinh học Hợp chất 3’,4’-dihydroxyflavon (52) thuộc nhóm

flavonoit có khả năng làm giãn mạch và loài Justicia cataractae Leonard có

hoạt tính hạ huyết áp (anti-hypertensive activity), được dùng làm thuốc trị các bệnh cao huyết áp [31], tiểu đường [58] Apigenin (3) có tác dụng chống oxi

hóa, kháng viêm và giúp ngăn chặn một số yếu tố gây viêm [47] Vitexin (54),

một flavonoit được phân lập từ lá của Justicia gendarussa, có tác dụng như

một loại thuốc chống viêm có hiệu lực cao, có hoạt tính kháng enzym lipoxygenase và cyclooxynase-2 (COX-2) [48] Các hợp chất apigenin (53) và

5-vitexin (54) được phân lập từ phần chiết ethanol của Justicia gendarussa,

được sử dụng trong y học dân gian điều trị các chứng viêm, thấp khớp, viêm khớp [6, 46] Các hoạt tính kháng vi sinh vật và kháng viêm của kaempferitrin

(62) [21, 23] và tác dụng làm giảm nồng độ glucozơ trong máu có liên quan

đến việc loài Justicia spicigera được sử dụng phổ biến làm thuốc để điều trị

các bệnh tiểu đường, ung thư và tiêu chảy, đau bụng, đầy hơi, chống viêm… trong y học cổ truyền của một số nước Hợp chất có khung coumarin là

umbeliferon (63) được phân lập từ phần chiết ancol của lá Justicia pectoralis

có các hoạt tính kháng viêm, giãn phế quản, do đó, loài Justicia pectoralis

thường được dùng phổ biến trong điều trị viêm bệnh phế quản và các bệnh về đường hô hấp [37]

Allantoin (87), một hợp chất thuộc nhóm ancaloit được phân lập từ loài

Justicia spicigera, có hoạt tính kháng viêm và chống ung thư rất hiệu quả [21;

43] Ba ancaloit là vasicin (80), vascinon (81) và vascinol (82) được phân lập

từ lá của Justicia adhatoda có hoạt tính giãn phế quản và được sử dụng phổ

biến trong điều trị bệnh viêm phế quản [8] Các hợp chất jusbetonin (83) và

10H-quindolin (84) được phân lập từ lá của Justicia betonica có hoạt tính

kháng u mạnh [50], mặc dù loài này được sử dụng loài phổ biến trong y học

cổ truyền của Ấn Độ, Thái Lan để điều trị tiêu chảy các bệnh viêm nhiễm và HIV/AIDS [33, 36]

Ngoài ra, tác dụng chống thụ tinh (antifertility) của justicisaponin (79),

một hợp chất triterpenoidal glycosid [12, 27] có liên quan đến việc sử dụng

loài Justicia simplex rất phổ biến như loại thuốc phá thai và kiểm soát khả

năng sinh sản [12]

Như vậy, các kết quả nghiên cứu về hóa học và hoạt tính sinh học của

các loài thuộc chi Justicia ở trên cho chúng ta những luận cứ khoa học để lý

giải tác dụng dược lý cũng như hiểu rõ hơn về giá trị dược liệu của những cây thuốc này

1.3 CÂY XUÂN TIẾT TIỀN (JUSTICIA MONETARIA R BEN.)

• Đặc điểm thực vật:

Cây Xuân tiết tiền là cây cỏ không lông Lá có phiến bầu dục thon, to vào

12 x 6 cm, gân phụ 9-10 cặp, lúc khô màu dợt; cuống dài 2 cm Phát hoa có lá hoa kết lợp, hình muỗng tròn đặc sắc, cao vào 1 cm, tiểu nhụy 2; noãn sào 2 buồng, 2 noãn [4]

Cây phân bố ở độ cao 600 m, thuộc các tỉnh phía Bắc Việt Nam, và là một loài cây đặc hữu ở nước ta

• Công dụng: Theo một số bài thuốc dân gian của dân tộc Dao, cây

Xuân tiết tiền được dùng để chữa một số bệnh về gan, tiêu viêm, giải độc gan,

thận Theo tra cứu, chúng tôi không thấy một tài liệu nào đề cập đến công

dụng của loài cây này

Hình 1.2 Cây Xuân tiết tiền (Justicia monetaria R Ben., Acanthaceae)

a) Hình ảnh cây theo tài liệu [4]

b) Mẫu lá cây thu hái tại Phúc Thuận, Phổ Yên, Thái Nguyên

• Nghiên cứu hóa học:

Cho đến nay, hoàn toàn chưa có một công trình khoa học nào nghiên cứu

về thành phần hoá học cũng như hoạt tính sinh học của cây Xuân tiết tiền

(Justicia monetaria R Ben., Acanthaceae) Vì vậy, trong luận văn này chúng tôi

mong muốn nghiên cứu hoá học của cây Xuân tiết tiền nhằm làm sáng tỏ công dụng chữa bệnh, để có cơ sở khoa học vững chắc cho việc sử dụng loài cây này một cách hợp lý và hiệu quả nhất

Chương 2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.1 MẪU THỰC VẬT

Mẫu thực vật là lá cây Xuân tiết tiền được thu hái thời điểm như nêu trong mục 3.1 Mẫu tươi sau khi lấy về được rửa sạch, thái nhỏ, phơi khô nơi thoáng mát, sau đó sấy khô ở 40oC Mẫu đã khô được xay nhỏ thành dạng bột rồi được xử lý tiếp theo như ở mục 3.2

Mẫu thực vật đã được xác định tên khoa học bởi TS Trần Huy Thái, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt

Nam (VAST), khẳng định đây là loài Justicia monetaria R Ben (Xuân tiết

tiền) thuộc họ Acanthaceae (Ô rô)

2.2 CÁC PHƯƠNG PHÁP PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT

2.2.1 Phương pháp chiết

Chiết là quá trình tách và phân ly các chất dựa vào quá trình chuyển một chất hoà tan trong một pha lỏng vào một pha lỏng khác không hoà tan với nó

+ Mục đích: Sử dụng phương pháp chiết để chuyển một lượng nhỏ chất

nghiên cứu trong một thể tích lớn dung môi này vào một thể tích nhỏ dung môi khác nhằm nâng cao nồng độ của chất cần nghiên cứu và được gọi là chiết làm giàu Ngoài ra còn dùng phương pháp chiết pha rắn để tách hay phân ly các chất trong một hỗn hợp phức tạp với điều kiện thích hợp Phương pháp này thường được dùng để phân tách các hợp chất tự nhiên có trong thực vật

+ Cơ sở của quá trình chiết: Là dựa vào sự phân bố khác nhau của các

chất trong hai chất lỏng không tan lẫn với nhau Sự phân bố khác nhau là do tính tan khác nhau của các chất trong pha lỏng

Quá trình chiết dựa trên định luật phân bố Nerst:

A A

CA, CB: nồng độ chất hoà tan trong hai pha lỏng A, B không tan lẫn

+ Phân loại quá trình chiết:

Có thể thực hiện một trong hai phương pháp sau:

9 Quá trình chiết sử dụng bình chiết Soxhlet: Đây là phương pháp chiết

nóng bằng cách đun hồi lưu dung môi với chất rắn một thời gian rồi rút ra,

dùng thiết bị này để chiết nhiều lần liên tục và để tiết kiệm dung môi

9 Chiết ngâm: Ngâm chất rắn vào dung môi trong một thời gian rồi chiết

dung môi ra (chiết nguội) Đây là phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật vì nó không đòi hỏi nhiều công sức Thông thường bình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục

vì mẫu được ngâm trong dung môi khoảng 24h sau đó lấy chất chiết ra Việc

kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một số cách như:

- Với các ancaloid: có thể kiểm tra sự xuất hiện của các hợp chất này bằng sự tạo kết tủa với các thuốc thử đặc trưng như Dragendorff, Mayer…

- Với các flavonoid: do chúng thường là các chất màu nên khi dịch chảy

ra không còn màu cho biết đã rửa hết chất này trong quá trình chiết

- Trong trường hợp các lacton của secquiterpen và các glycozit trợ tim

có thể sử dụng phản ứng Kedde để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với anilin axetat cho biết sự xuất hiện của các hydratcacbon và

từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc

Như vậy, phụ thuộc vào mục đích cần lấy chất gì để lựa chọn dung môi thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lý để đạt hiệu quả cao nhất trong việc chiết tách các sản phẩm có nguồn gốc thiên nhiên

2.2.2 Sắc ký lớp mỏng (TLC) [14]

Phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) là một phương pháp hiện đang được sử dụng rất rộng rãi trong các ngành khoa học hoá học-sinh học-hoá dược với các mục đích khác nhau như để tách hỗn hợp nhiều cấu tử vô cơ hoặc hữu cơ với độ nhạy cao (có thể phát hiện các chất vi lượng với độ tin cậy cao), lượng mẫu phân tích nhỏ (chỉ cần dùng ống capilla chấm vài giọt dung dịch vào bản mỏng), tốc độ phân tích nhanh, cần thời gian ngắn, thậm chí có thể phân tích nhiều mẫu cùng lúc, kĩ thuật tiến hành đơn giản, rẻ tiền Phương pháp TLC được dùng để phân tích định tính hay định lượng, hoặc để kiểm tra

độ tinh khiết của các hợp chất cũng như hỗ trợ cho các phương pháp sắc ký khác (sắc ký cột) để tìm hệ dung môi phù hợp cho việc phân tách bằng sắc ký

Để phân tích định tính các phần chiết và khảo sát các phân đoạn sau khi tiến hành phân tách sắc ký cột có thể sử dụng bản mỏng tự tráng hoặc bản mỏng tráng sẵn có bán trên thị trường Trong luận văn này chúng tôi thực hiện phương pháp sắc ký lớp mỏng (TLC) trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien

60 F254 (Merck 1,05715)

Hình 2.1 Bản mỏng silica gel tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck)

• Cách đưa chất lên bản mỏng: lấy một lượng nhỏ cặn chiết hòa tan bằng

2 - 3 giọt dung môi thích hợp, sau đó dùng ống mao quản chấm chất lên bản

• Chuẩn bị dung môi cho sắc ký:

Các dung môi (n-hexan, axeton, etyl axetat, clorofoc, metanol…) đều

được làm khan và chưng cất lại

Sau đó pha các hệ dung môi theo tỷ lệ phù hợp Lắc kỹ cho các dung môi trộn đều nhau trong hệ rồi cho vào bình khai triển đáy bằng có nắp nhám kín

Để yên dung môi đến khi bão hòa mới sử dụng để chạy sắc ký lớp mỏng

+ chiều dài 100cm, đường kính 2,5 cm;

+ chiều dài 45cm, đường kính 1,0 cm

Các chất hấp phụ và dung môi sử dụng cho sắc ký cột:

• Sắc ký cột pha thường:

- Dùng chất hấp phụ silica gel của hãng Merck với các cỡ hạt khác nhau (0,040-0,063 mm; 0,063-0,1mm và 0,063-0,2mm) tùy theo yêu cầu tách chất

Chất hấp phụ pha thường dùng để tách các phần chiết từ ít phân cực (n-hexan,

diclometan) đến phân cực trung bình (clorofoc, etylaxetat)

- Dung môi sử dụng trong sắc ký cột pha thường là n-hexan, etylaxetat

(EtOAc), toluen, axeton, clorofoc, metanol (MeOH) Các dung môi đều được làm khan, chưng cất lại và bảo quản trong chai kín

• Sắc ký cột pha đảo:

- Dùng các chất hấp phụ sau:

+ YMC RP-18 (30-50 µm, Fujisilisa Chemical Ltd.);

+ Sephadex LH -20 (Sigma-Aldrich);

+ Nhựa trao đổi ion Diaion HP-20 (Misubishi Chem Ind Co Ltd Tokyo)

Chất hấp phụ pha đảo dùng để tách các phần chiết từ phân cực (phần

chiết n-butanol) đến phân cực cao (phần nước còn lại sau khi chiết)

- Dung môi sử dụng trong sắc ký cột pha đảo là metanol và nước, rửa giải gradien dung môi

• Phân tách các hỗn hợp bằng phương pháp sắc ký cột trên silica gel:

* Chuẩn bị mẫu (tẩm mẫu):

Các phần chiết từ cây được hoà tan bằng axeton, metanol (hoặc dung môi thích hợp khác) vừa đủ cho đến khi tan hết Trộn dung dịch nhận được với lượng silica gel (cỡ hạt 40 – 63 µm) theo tỷ lệ 1g chất/1,2 đến 1,5g silica gel sao cho sau đó khi làm bay hơi dung môi đến khô thu được một hỗn hợp bột tơi có màu từ vàng s¸ng đến nâu đen tuỳ theo màu sắc của các phần chiết Hỗn hợp này được đưa lên cột sắc ký để phân tách

* Nhồi cột: Cân silica gel (cỡ hạt tương ứng theo yêu cầu tách) theo định lượng tương ứng với lượng mẫu đã tẩm, cho vào cét rồi đổ dung môi n-

hexan lªn, khuấy đều cho bọt khí ra hết rồi nhồi vào cột Dùng bơm nén cột nhiều lÇn đến khi trong cột không còn bọt khí và cho dung môi chảy qua nhiều lần để cột được nén đều… Để ổn định cột một thời gian rồi tiến hành chạy sắc ký cột

* Triển khai sắc ký cột: Mở khoá dưới để cho dung môi chảy ra khỏi

cột, cho đến khi bề mặt dung môi cách bề mặt silica gel khoảng 2 mm Cho toàn bộ chất đã tẩm silica gel từ từ lên cột Đảm bảo cho bề mặt của lớp chất

ở phía trên và phía dưới cột tạo thành mặt phẳng ngang, như vậy trong quá trình rửa giải, chất sẽ xuống đều Rắc một lớp mỏng silica gel lên trên, rồi phủ

một lớp bông thuỷ tinh để tránh hiện tượng các chất bị khuyếch tán ngược

Tiến hành rửa giải (tốc độ rửa giải 20 giọt/phút) với (các) hệ dung môi được xác định nhờ vào các khảo sát th¨m dò bằng TLC, cuối cùng rửa giải bằng MeOH

Hình 2.2 Quá trình phân tách trên sắc ký cột với chất hấp phụ silica gel

* Khảo sát các phân đoạn: Tiến hành khảo sát các phân đoạn nhận

được bằng TLC, gom các phân đoạn giống nhau lại Sau đó, cất loại các dung môi để thu các nhóm phân đoạn

Tiến hành sắc ký cột nhiều lần để thu được các hợp chất tinh khiết

2.3 CÁC PHƯƠNG PHÁP XÁC ĐỊNH CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT

Để xác định cấu trúc của các hợp chất phân lập được cần sử dụng kết hợp các phương pháp vật lý hiện đại Đó là các phương pháp phổ, bao gồm phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng (MS) và phổ cộng hưởng từ hạt nhân một chiều và hai chiều (NMR)

Phổ cộng hưởng từ cacbon 13 (13C-NMR) được ghi trên máy Bruker Avance 500 MHz Spectrometer, ở tần số 125 MHz

Độ dịch chuyển hoá học δ (ppm) so sánh với độ dịch chuyển hoá học của TMS (tetrametylsilan) như chất nội chuẩn

Các phổ IR, MS, NMR được ghi trên các thiết bị của Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST)

2.3.4 Điểm nóng chảy

Điểm nóng chảy (tnc) của các hợp chất tinh khiết được đo trên thiết bị Boetius (Đức)

Chương 3 THỰC NGHIỆM

3.1 THU HÁI VÀ XỬ LÝ MẪU

Lá cây Xuân tiết tiền (Justicia monetaria R Ben., Acanthaceae) được

thu hái ở vùng núi Tam Đảo, xã Phúc Thuận, huyện Phổ Yên, tỉnh Thái Nguyên, Việt Nam vào tháng 3 năm 2010

Mẫu được giám định tên khoa học bởi TS Trần Huy Thái, Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST)

 

Hình 3.1 Lá cây Xuân tiết tiền (Justicia monetaria R Ben.)

Lá Xuân tiết tiền tươi sau khi thu hái được rửa sạch, phơi khô trong bóng râm, rồi đem sấy ở nhiệt độ 40oC

Mẫu đã khô được xay nhỏ thành dạng bột Từ 15 kg lá Xuân tiết tiền tươi thu được 3,2 kg bột lá khô

3.2 CHIẾT TÁCH VÀ PHÂN LẬP CÁC HỢP CHẤT TỪ LÁ CÂY XUÂN TIẾT TIỀN

3.2.1 Tạo các phần chiết từ bột lá cây

Bột lá cây Xuân tiết tiền (3200 g) được ngâm chiết ba lần (72 giờ/1lần) với metanol ở nhiệt độ phòng Sau khi cất loại dung môi thu được dịch MeOH sệt

Dịch chiết MeOH này được hoà với nước cất và chiết với 3 lit n-hexan thu được dịch chiết n-hexan Dịch chiết metanol được chiết tiếp với 2 lit etyl axetat thu

được dịch chiết etyl axetat Các dịch chiết được cất loại dung môi dưới áp suất

giảm thu được các phần chiết tương ứng là phần chiết n-hexan (ký hiệu JH, 69,6

g), etyl axetat (JE, 6,3 g) và dịch cô từ lớp nước (JN, 300 g) Quy trình chiết tạo

các phần chiết từ bột lá cây Xuân tiết tiền được trình bày ở Sơ đồ 3.1

- Cất quay chân không loại dung môi

- Pha loãng bằng nước cất

Chiết với n-hexan

Cất loại dung môi

Dịch chiết

n-hexan

Dịch chiết etyl axetat

Dịch chiết metanol-nước

dung môi Cất loại dung môi

Sơ đồ 3.1 Quy trình chiết các lớp chất từ lá cây Xuân tiết tiền

3.2.2 Phân lập các hợp chất từ phần chiết n-hexan

Khảo sát TLC trên lớp mỏng silica gel với một số hệ dung môi khác

nhau, chúng tôi nhận thấy để phân tách phần chiết n-hexan trên chất hấp phụ này thì hệ dung môi n-hexan/etyl axetat cho kết quả tốt nhất Vì vậy, chúng

tôi đã chọn hệ dung môi này làm dung môi rửa giảicho sắc ký cột

50g phần chiết n-hexan (JH) được hòa tan trong một lượng tối thiểu

dung môi CH2Cl2 cho tan hết Dung dịch nhận được trộn với 75g silica gel (cỡ hạt 0,063-0,020 mm), rồi đuổi hết dung môi thành một hỗn hợp bột tơi mịn Sau khi đã chuẩn bị cột nhồi silica gel bằng bằng phương pháp nhồi ướt, hỗn hợp chất đã tẩm silica gel được phân tách bằng sắc ký cột với chất hấp

phụ là silica gel (cỡ hạt 0,063-0,020 mm), rửa giải bằng hệ dung môi

n-hexan/etyl axetat với tỷ lệ etylaxetat tăng dần từ 0% đến 100% (v/v) thu được

100 phân đoạn, mỗi phân đoạn 25 ml

Sau đó khảo sát sắc ký lớp mỏng các phân đoạn thu được và gom các phân đoạn có sắc ký đồ tương đối giống nhau, thu được 10 nhóm phân đoạn, ký hiệu

từ JH1 đến JH10 Các nhóm phân đoạn JH1, JH2, JH3 và JH4 ở dạng dầu màu đỏ, có mùi thơm đặc trưng Nhóm phân đoạn JH4 được phân tách tiếp

bằng CC với chất hấp phụ silica gel (Merck, cỡ hạt 0,063-0,100 mm) và hệ

dung môi n-hexan/EtOAc gradien theo các tỷ lệ 30/1 đến 5/1 (v/v), thu được

hợp chất dạng tinh thể hình kim màu trắng, ký hiệu là J1 (20,0 mg)

Nhóm phân đoạn JH7 được kết tinh lại trong hệ n-hexan/EtOAc thu

được hợp chất dạng tinh thể hình kim, màu trắng ký hiệu là J2 (37,0 mg) Nhóm phân đoạn JH9 được phân tách tiếp bằng CC với chất hấp phụ silica

gel (Merck, cỡ hạt 0,063-0,100 mm) và hệ dung môi CH2Cl2/EtOAc gradien theo các tỷ lệ 7/1 đến 1/1 (v/v), thu được 21,0 mg chất bột vô định hình màu

trắng, ký hiệu là J3

Quá trình phân tách phần chiết n-hexan từ lá cây Xuân tiết tiền được trình

bày ở Sơ đồ 3.2