Nghiên cứu thành phần hóa học cây nữ lang hardwicke (valeriana hardwickii wall valerianaceae)

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HUỲNH LỜI NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY NỮ LANG HARDWICKE (VALERIANA HARDWICKII WALL VALERIANACEAE) LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC TP HỒ CHÍ MINH, năm 2019 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH HUỲNH LỜI KHƯU NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY NỮ LANG HARDWICKE (VALERIANA HARDWICKII WALL VALERIANACEAE) CHUYÊN NGÀNH: DƯỢC HỌC CỔ TRUYỀN MÃ SỐ: 62720406 LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS TS TRẦN HÙNG TP HỒ CHÍ MINH, năm 2019 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu riêng tơi, kết nghiên cứu trình bày luận án trung thực, khách quan chưa công bố nơi Tác giả luận án Huỳnh Lời LỜI CÁM ƠN Luận án hình thành với mong muốn tìm dược liệu có thành phần thuốc an dịu thần kinh Euphytose Pháp Valeriana officinalis Luận án bắt đầu báo cáo đề cương vào tháng 03-2010 công nhận NCS tháng 17-06-2010 Luận án tiến hành BM Dược Liệu, Khoa duợc, ĐHYD TpHCM Vetmeduni – Vienna (từ 14-01-2012 đến 23-12-2012), báo cáo để góp ý 26-06-2017, trình cấp mơn 29-11-2017, trình cấp trường 25-03-2019 Q trình thực luận án có giúp đỡ, chia sẻ, động viên từ người thân, thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp, quan liên quan em sinh viên Trước hết xin trân trọng gởi lời cám ơn sâu sắc tới Cha Huỳnh Thống (87 tuổi), Mẹ Huỳnh Thị Ngọc (85 tuổi), Cha Mẹ suốt đời hy sinh cho con, chịu nhiều khổ cực, nhiều lúc phải vay mượn, mượn gạo, mượn tiền, dù gia đình nghèo khó, Cha Mẹ tâm cho ăn học thành người Cù lao chín chữ khơng qn Em xin chân thành cám ơn Thầy PGS TS Trần Hùng hướng dẫn, giúp đỡ trình thực luận án, dù bận, Thầy dành nhiều thời gian sửa thật cẩn thận Em xin gởi lời cám ơn sâu sắc đến Chị Huỳnh Thị Nguyên (Chị Ba), Anh Huỳnh Khẩn (Anh Tư), Anh Huỳnh Bán (Anh Năm), Em út Huỳnh Lợi, Anh Chị Em giúp đỡ, dành hết cơng việc khó nhọc để em (anh) học hành Trong dòng họ, cháu xin cám ơn Chú Châu Tín gia đình (các em Nghĩa, Hiền, Phú, Quý, Khoa, Tài, Minh), gia đình Chú SáuChâu Bối (em Thịnh (đã mất), Tưởng, Phúc), gia đình Năm Châu Do (em Lan, Huệ, Thành, Hoa, Thu, Xuân, Đông, Quang), gia đính Bác Hai Châu Cảnh (Anh Phẩm, chị Cương, chị Cường, chị Hạnh, anh Út) Em xin tỏ lòng tri ân sâu sắc đến quý Thầy Cô Anh Chị Em Bộ Môn Dược Liệu – Khoa Dược, ĐHYD TpHCM Em tỏ lòng tri ân sâu sắc đến Thầy GS Ngô Vân Thu (Nguyên Chủ Nhiệm BM Dược Liệu, Thầy ngày 30-05-2018), Thầy quan tâm hỏi han xem luận án, gởi cho em tài liệu tham khảo Em tỏ lòng biết ơn đến Thầy ThS Vương Văn Ảnh, thầy hướng dẫn đề tài tốt nghiệp DSĐH năm 1997, Thầy động viên, chia sẻ với em nhiều kiến thức Em xin cám ơn Cô PGS TS Nguyễn Khắc Quỳnh Cứ, Thầy TS Võ Văn Lẹo (Thầy thường chia sẻ kiến thức, chia sẻ vui buồn sống, giúp đỡ lúc khó khăn tài chính), Cơ PGS TS Huỳnh Ngọc Thụy, Thầy GS TS Nguyễn Minh Đức, Thầy TS Phạm Đông Phương, Cô PGS TS Bùi Mỹ Linh, Thầy TS Nguyễn Viết Kình (góp ý nhiều NMR), Cơ ThS Ngơ Thị Xuân Mai, Chị DS Đặng Thị Lệ Thủy (giúp đỡ nhiều tài chính), Chị Nguyễn Thị Liên, Chị Lê Thị Kim Châu, Chị Nguyễn Thị Kim Xuyến (mất 2018), Em TS Trần Thị Vân Anh (giúp đỡ NMR), Em TS Mã Chí Thành (giúp tra cứu tài liệu, scifinder.com lúc học Hàn quốc), Em TS Lê Thị Hồng Vân (chia sẻ nhiều trình làm luận án, bào vệ xong 13-7-2018), Em ThS Nguyễn Thị Ánh Nguyệt (đã giúp tìm nhiều tài liệu lúc học Mỹ năm 20102011), Em ThS Nguyễn Thị Xuân Diệu, Em ThS Võ Ngọc Linh Giang, Em Ds Lưu Thị Hiền (nghỉ làm BM từ 2013), Em DS Nguyễn Mạnh Tín Tín (giúp nhiều NMR, du học Hàn Quốc), Em DS Nguyễn Thị Xuân Lan, Em DSTH Nguyễn Thi Hồng Giang Em xin gởi lời cám ơn đến quý Thầy, Cô, Anh Chị Em thuộc SAPHARCEN, Thầy PGS TS Trần Cát Đông, Cô PGS TS Trần Anh Vũ, Thầy PGS TS Phan Thanh Dũng, em ThS Cao Thị Thanh Thảo, Em CN Nguyễn Thị Thùy Linh, Em ThS Bùi Quang Thành Em CN Trịnh Túy An, Em ThS Nguyễn Thị Xuân Diệu, Em Ds Hà Vi, Em ThS Lê Văn Huấn (giúp đỡ nhiều lúc báo cáo luận án thủ tục, chia sẻ giúp đỡ, người em thân thiết, quý mến), Em ThS Nguyễn Quang Nam, Em CN Nguyễn Thị Linh Giang Em xin gởi lời cám ơn chân thành đến quý lãnh đạo Khoa Dược: Thầy GS TS Lê Quan Nghiệm (đã nghỉ hưu), PGS TS Lê Minh Trí, PGS TS Trần Thành Đạo, PGS TS Nguyễn Thiện Hải Em gởi lời cám ơn chân thành đến quý Thầy Cô Khoa Dược – GS Nguyễn Văn Thanh, PGS TS Trần Thanh Nhãn, PGS TS Nguyễn Tuấn Dũng, PGS TS Vĩnh Định, PGS TS Phan Thanh Dũng, PGS TS Nguyễn Đức Tuấn, PGS TS Trương Ngọc Tuyền, TS LÊ Nguyễn Bảo Khánh, PGS TS Trương Thị Đẹp, TS Nguyễn Đức Hạnh, CÔ PGS TS Huỳnh Thị Ngọc Lan, PGS TS Nguyễn Đinh Nga, TS Trần Thị An Tường, TS Nguyễn Hữu Lạc Thủy, TS Ngô Thanh Diệp, TS Phan Văn Hồ Nam Em xin gởi lời cám ơn chân thành đến quý Thầy, Cô thuộc Khoa Dược, ĐH QT Hồng Bàng: Thầy PGS TS Hồ Thanh Phong, Cô ThS Trần Thị Thu Hằng, Cô ThS Trần Thị Thu Hồng, Em ThS Lý Tú Loan, Em ThS Lý Hồng Hương Hạ Em xin gởi lời cám ơn đến quý Thầy Cô trường ĐHYK Phạm Ngọc Thạch - Anh PGS TS Bùi Tùng Hiệp, Anh TS Nguyễn Đăng Thoại, em TS Khưu Mỹ Lệ Em xin gởi lời cám ơn chị TS Vũ Thị Huỳnh Hân (CĐ YT Cần Thơ) Em không quên ơn quý Thầy, Cô ĐHYD Cần Thơ: Anh PGS TS Phạm Thành Suôl, , em ThS Nguyễn Ngọc Quỳnh, em TS Đỗ Châu Minh Vĩnh Thọ, em TS Nguyễn Ngọc Vân Em xin gởi lời cám ơn PGS TS Nguyễn Thị Hồi, em ThS Hồng Xuân Huyền Trang (ĐHYD Huế), Anh xin gởi lời cám ơn em ThS Đỗ Văn Mãi (ĐH Tây Đô), em ThS Thái Thị Cẩm (CĐ Bến Tre), em ThS Lê Vinh Bảo Châu (ĐH Võ Trường Toản), em ThS Bùi Hoàng Minh (ĐH Nguyễn Tất Thành) Em xin gởi lời cám ơn sâu sắc đến quý Thầy Cô thuộc Trung Tâm Sâm Dược liệu: Thầy PGS TS Trần Công Luận, PGS TS Nguyễn Thị Thu Hương, Thầy DS Phan Văn Đệ (đã mất) (giúp định danh loài), Em CN Trương Quang Lực (đã giúp tìm mẫu định danh loài) Em xin gởi lời cám ơn đến Thầy Cô Trường Vetmeduni – Vienna: GS Chowig Franz, GS Johanes Novak, bạn TS Thomas Pacher, anh TS Rudolf Moldzio Xin chân thành cám ơn vợ chồng em Nguyễn Hữu Chí – Hoàng Thị Ánh Dương, Em Thành, vợ chồng em Hiếu - Triều, vợ chồng em Khuê - Phương, vợ chồng em Long - Hoa (vợ Long) giúp đỡ ngày nghiên cứu Vienna Em xin chân thành cám ơn Anh BS Hà (TT Y Tế Nam Trà My), Anh Trần Kích (UBND Huyện Nam Trà My), Anh Hồ Văn Du, Em Lượng (Nóc Măng Lùng), Sơn (Tam Thành) chuyến tìm mẫu Trà Linh, Quảng Nam Em xin gởi lời cám ơn chân thành đến q Thầy Cơ thuộc Phịng Sai Đại Học – ĐHYD TpHCM: Thầy TS Trần Văn Phơi, Thầy TS Hoàng Tiến Mỹ, Thầy TS Hà Mạnh Tuấn, Chị Thủy, Anh Thọ, Anh Quý, em Chương, em Mai, em Khải, em Hiếu, em Thịnh Anh xin gởi lời cám đến em TS Nguyễn Thụy Việt Phương, em ThS Dương Hồng Tố Quyên (BV YH CT TpHCM), em ThS Trần Thị Huyên (chia sẻ, giúp đỡ nhiều vật chất, tinh thần) Thầy xin gởi lời cám ơn chân thành đến em sinh viên đồng cam cộng khổ trình làm luận án: Các em Trần Thị Bảo Châu (D2005), Nguyễn Thị Thanh Bình, Bùi Ngọc Thảo Trang (D2006), Nguyễn Thị Như Phượng, Nguyễn Thị Huyền Trâm (D2007), Nguyễn Thị Phú, Bùi Khương Duy, Nguyễn Thị Thanh Tú, Phan Thị Như Ngọc (D2008), Lê Thị Thu Hồng (D2010), Nguyễn Thùy Vi (D2011) Cuối cùng, anh xin cám ơn Em Phạm Thị Ái với hy sinh thầm lặng, cao cả, bao dung i MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT ii  DANH MỤC CÁC BẢNG iv  DANH MỤC CÁC HÌNH vi  DANH MỤC CÁC BIỂU ĐỒ viii  DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ix  MỞ ĐẦU 1  CHƯƠNG 1.  TỔNG QUAN 3  1.1.  Tổng quan chi Valeriana 3  1.2.  Tổng quan Nữ lang Hardwicke 39  CHƯƠNG 2.  NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 43  2.1.  Nguyên vật liệu 43  2.2.  Phương pháp nghiên cứu 47  CHƯƠNG 3.  KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 63  3.1.  Kết nghiên cứu thực vật học V hardwickii 63  3.2.  Kết nghiên cứu hóa học 74  3.3.  Kết định lượng 106  3.4.  Kết thử nghiệm tác dụng sinh học 114  CHƯƠNG 4.  BÀN LUẬN 132  4.1.  Về mặt thực vật học V hardwickii 132  4.2.  Về mặt hóa học V hardwickii 133  4.3.  Về định lượng thành phần 139  4.4.  Về thử nghiệm sinh học 140  KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 144  DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN  TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC ii DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ nguyên Nghĩa ACN Acetonitril ADN Acid Desoxynucleic BZD Benzodiazepin COSY Correlation Spectroscopy CTAB Cetyltrimethylammonium Bromid d doublet DCM Dichloromethane DEPT Distortionless Enhancement by Polarization Transfer DMSO Dimethyl Sulfoxid dNTP Deoxynucleotid Triphosphat DPPH 2,2-Diphenyl Picryl Hydrazyl EtOAc Ethyl Acetat FBS Fetal Bovine Serum FID Flame Ionization Detector Đầu dị ion hóa lửa FRAP Ferric Reducing Antioxidant Power Khả chống oxy hóa khử ion sắt FST Force Swimming Test Thử nghiệm bơi gắng sức GABA Gamma Amino Butyric Acid GC Gas Chromatography hc Hợp chất HMBC Heteronuclear Multiple Bond Correlation HPLC High Performance Liquid Chromatography HSQC Heteronuclear Single Quantum Correlation IC Inhibitory Concentration ITS Internal Transcribed Spacer J J-constant Hằng số ghép LD Lethal Dose Liều gây chết Đỉnh Đôi Sắc ký khí Sắc ký lỏng hiệu cao Nồng độ ức chế iii Từ viết tắt Từ nguyên Nghĩa LDB Light Dark Box Thử nghiệm ngăn sáng tối LOD Limit of Detection Giới hạn phát LOQ Limit of Quantification Giới hạn định lượng m multiplet Đỉnh đa MS Mass Spectrometry Khối phổ MSD Mass Selective Detector Đầu dò chọn lọc số khối n-BuOH n-Butanol NMR Nuclear Magnetic Resonance Cộng hưởng từ hạt nhân OFT Open Field Test Thử nghiệm môi trường mở PCR Polymerase Chain Reaction PDA Photodiode Array PI Propidium Iodid ppm Parts Per Million Phần triệu q quartet Đỉnh bốn s singlet Đỉnh đơn SKĐ Sắc ký đồ SKK Sắc Ký Khí SKLM Sắc Ký Lớp Mỏng t triplet THDN 6,10.11-trihydroxy dihydronepetalacton TLTK Tài Liệu Tham Khảo TT Thuốc Thử TT AH Thuốc thử Acid acetic băng-acid Hydrocloric (8:2) TT VS Thuốc thử Vanillin – acid Sulfuric UPLC Ultra-Performance Liquid Chromatography - Sắc ký lỏng siêu hiệu UV Ultraviolet tử ngoại  Chemical shift Độ dời hóa học Dãy diode quang Đỉnh ba iv DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 1.1 Các monoterpen có chi Valeriana 4  Bảng 1.2 Các sesquiterpen có chi Valeriana 6  Bảng 1.3 Hàm lượng tinh dầu có lồi thuộc chi Valeriana 15  Bảng 1.4 Các iridoid có Valeriana 16  Bảng 1.5 Các flavonoid có chi Valeriana 26  Bảng 1.6 Các lignan phân lập từ Valeriana 28  Bảng 1.7 Các chế phẩm có Valerian 38  Bảng 1.8 Các chế phẩm phối hợp có Valerian 38  Bảng 2.1 Trình tự cặp mồi ITS sử dụng phản ứng PCR 48  Bảng 2.2 Hóa chất dùng cho phản ứng PCR 48  Bảng 3.1 Kết phân tích sơ thành phần hố thực vật V hardwickii 74  Bảng 3.2 Giá trị Rf vết phân tích SKLM với hệ dung môi 75  Bảng 3.3 Giá trị Rf vết phân tích SKLM với hệ dung môi 75  Bảng 3.4 Giá trị Rf vết SKLM iridoid có V hardwickii V officinalis 76  Bảng 3.5 Thành phần bay V officinalis V hardwickii 80  Bảng 3.6 Nhóm hợp chất bay V hardwickii V officinalis 83  Bảng 3.7 Dữ liệu khối phổ chất chưa xác định V officinalis V hardwickii 83  Bảng 3.8 Dữ liệu phổ 13C -NMR 1H- NMR () hợp chất 90  Bảng 3.9 Dữ liệu phổ 13C -NMR 1H- NMR () hợp chất 92  Bảng 3.10 Dữ liệu phổ 1H –NMR 13C-NMR () 3-6 97  Bảng 3.11 Dữ liệu phổ 13C -NMR 1H- NMR () hợp chất 99  Bảng 3.12 Dữ liệu phổ 1H –NMR 13C-NMR () hợp chất 10 101  Bảng 3.13 Dữ liệu phổ 1H –NMR 13C-NMR () hợp chất 11 103  Bảng 3.14 Dữ liệu phổ 1H –NMR 13C-NMR hợp chất 11 so sánh với hợp chất tương tự 105  Bảng 3.15 Tương quan nồng độ acid caffeic độ hấp thu 106  Bảng 3.16 Hàm lượng hợp chất phenol tồn phần tính theo a caffeic 106  Bảng 3.17 Pha động dùng cho chương trình rửa giải UPLC-PDA 108  Bảng 3.18 Phuơng trình tuyến tính polyphenol định lượng UPLC-PDA 110  40 Phổ HSQC hợp chất 11 41 Phổ COSY hợp chất 11 42 Phổ NOESY hợp chất 11 43 Phổ HMBC 11 44 Phụ lục Sắc ký đồ phân tích cao chiết thử nghiệm in vivo Ghi chú: A: cao nước, B: cao EtOH 45%, C: cao DCM 45 Phụ lục 10 Khảo sát bước sóng phát định lượng polyphenol Sắc ký đồ phổ UV chất đối chiếu clorogenic Sắc ký đồ phổ UV chất đối chiếu rhoifolin Sắc ký đồ phổ UV chất đối chiếu neobudofficid Sắc ký đồ phổ UV chất đối chiếu linarin 46 Phụ lục 11 Sắc ký đồ thăm dị hệ dung mơi MeOH Ghi chú: Aquity UPLC BEH C18 (1,7 àm; 2,1 ì 50 mm), pha động acid formic 0,1% (A)- acid formic MeOH (B): 0-5 phút 90% A, 5-10 phút: 90%A-85%A, 10-15 phút: 85% A, 15-20 phút: 85-50% A bước sóng phát 325 nm Tốc độ dòng 0,4 mL/phút Phụ lục 12 Diện tích đỉnh polyphenol dung mơi chiết MeOH 10% Acid clorogenic MeOH 20% MeOH 40% MeOH 60% MeOH 80% MeOH 100% 3061530 2721360 3401700 3571785 3061530 3231615 Rhoifoolin 210245 194555 209199 173635 215475 171899 Neobudofficid 16917 18646 18590 15244 16359 18962 Linarin 454553 341823 363642 338187 316369 356369 Phụ lục 13 Biểu đồ biểu thị diện tích đỉnh polyphenol dung môi chiết 47 Phụ lục 14 Diện tích đỉnh polyphenol số lần chiết Lần Acid clorogenic Rhoifoolin Neobudofficid Linarin Lần Lần Tỷ lệ % chiết lần Tỷ lệ % chiết lần 3402031 187110 34020 5,16 0,94 2092002 18605 364110 125520 1302 14564 29288 205 10923 5,59 6,48 3,74 1,30 1,02 2,80 Phụ lục 15 Biểu đồ biểu thị diện tích đỉnh polyphenol số lần chiết Phụ lục 16 Diện tích đỉnh polyphenol thời gian chiết 15 phút 30 phút 45 phút Acid clorogenic 3401120 3571176 3407922 Rhoifoolin 2092110 2133952 2194202 Neobudofficid 18701 18906 18988 Linarin 365210 373244 376166 Phụ lục 17 Diện tích đỉnh polyphenol nhiệt độ chiết 30 oC 40 oC 50 oC Acid clorogenic 3401800 3571890 3575292 Rhoifoolin 2092528 2094621 2098806 18705 19078.84 19452.93 365283 381355.5 383181.9 Neobudofficid Linarin Phụ lục 18 Sắc ký đồ thăm dị hệ dung mơi acetonitril với tỷ lệ khác 48 Hệ dung môi Tốc độ dòng tất 0,2 mL/phút, UV 335 nm Tỷ lệ dung môi Hệ Tỷ lệ dung môi A: Acid formic 0,1% dung A: Acid formic 0,1% ACN ACN môi B: Nước acid formic 0,1% B: Nước acid formic 0,1% 0-5’: 97% A; 5-10’: 97-84% A 0-10’: 97-95% A 10-16’: 84-78% A 10-15’: 95-78% A 16-20’: 78-5% A 15-20’: 78-5% A 20-25’: 5% A 20-25’: 5% A 0-10’: 97-84% A 0-3’: 97-90% A; 2-7’: 90% A 10-15’: 84-78% A 7-12’: 90-78 A 15-20’: 78-5% A; 20-25’: 5% A 12-15’: 78-5% A; 15-25: 5% 0-2’: 97%-93% A; 2-5’: 93% A 0-10’: 97-78% A 5-10’: 93-84% A 10-15’: 78% A 12-12,5’: 84-78% A 15-20’: 78-5% A 12-16’: 78% A; 16-20’: 78-5% A 20-25’: 5% A 20-25’: 5% A 49 Phụ lục 19 Sắc ký đồ khảo sát tốc độ dòng phương pháp UPLC Điều kiện hệ dung môi Bảng 3.27, UV 335 nm 50 Phụ lục 20 Kết khảo sát tính tương thích hệ thống TB SD RSD% TB Rhoifolin SD RSD% TB Neobudofficid SD RSD% TB Linarin SD RSD% Acid clorogenic tR (phút) 3,31 0,02 0,60 12,55 0,06 0,50 14,75 0,02 0,20 15,39 0,04 0,20 STB N k (àV ì s) 340680 8525 5910 275 19,7 1,7 209177 112482 390 3497 77,4 0,2 18562 385594 768 17417 91,2 4,1 363542 220570 1102 6456 95,2 0,3 α Rs As 1,18 3,69 1,77 1,06 4,69 1,29 1,09 5,96 1,26 1,07 5,78 1,23 Ghi chú: N: số đĩa lý thuyết biểu kiến Phụ lục 21 Dữ liệu đường tuyến tính polyphenol phân tớch bng UPLC-PDA Acid clorogenic C (àg/mL STB (àVìs) ) Rhoifolin C (àg/mL STB (àVìs) ) Neobudofficid C (àg/mL STB (àVìs) ) Linarin C (àg/mL STB (àVìs) ) 120 735918 75 577210 7,5 73497,6 120 815295 60 377394 37,5 293000 3,75 37120 60 418100 30 188697 18,75 146551 1,875 18558 30 209054 15 97340 9,375 76064 0,938 9732 15 108481 7,5 49317 4,688 39291 0,469 5222 7,5 55588 51 Phụ lục 22 Đường tuyến tính polyphenol phân tích UPLC-PDA Phụ lục 23 Độ tinh khiết pic polyphenol trích từ sắc ký đồ UPLC-PDA Acid clorogenic Rhoifolin Neobudofficid Linarin 52 Phụ lục 24 Sắc ký đồ UPLC-PDA nồng độ LOD LOQ 3.20 AU 3.319 AU -0.0001 3.00 3.50 Minutes Sắc ký đổ acid chlorogenic chuẩn nồng độ LOQ -0.00035 AU 12.541 -0.00030 -0.0002 -0.0004 12.40 12.60 Minutes 12.80 Sắc ký đổ rhoifolin chuẩn nồng độ LOD 12.575 0.0000 -0.00025 12.40 12.60 12.80 Minutes Sắc ký đổ rhoifolin chuẩn nồng độ LOQ -0.0001 14.753 -0.0004 AU -0.0003 -0.0005 14.70 14.80 Minutes 14.770 AU 0.0000 3.40 Minutes Sắc ký đổ acid chlorogenic chuẩn nồng độ LOD AU 3.326 0.0002 0.0000 -0.0002 -0.0003 14.50 14.90 Sắc ký đổ neobudofficid chuẩn nồng độ LOD 15.00 Minutes Sắc ký đổ neobudofficid chuẩn nồng độ LOQ 15.394 AU -0.0002 -0.0003 -0.0004 15.30 Sắc ký đổ linarin chuẩn nồng độ LOD 15.40 Minutes 15.50 Sắc ký đổ linarin chuẩn nồng độ LOQ 53 Phụ lục 25 Đánh giá hệ số phương trình hồi quy phương pháp UPLC Acid clorogenic Regression Statistics  Multiple R  0.999937  R Square  0.999874  Adjusted R Square  0.999832  Standard Error  3622.054  Observations  5  ANOVA    Significance  SS  MS  F  F  1  3.12E+11  3.12E+11 23762.72 6.02E‐07  3  39357818  13119273 4  3.12E+11           Standard     Coefficients  Error  t Stat  P‐value  Lower 95%  Intercept  5945.813  2452.142  2.424742 0.09377 ‐1858  X Variable 1  6102.956  39.59061  154.1516 6.02E‐07 5976.961  xét hệ số b: P= 0,09 > 0,05. hệ số b khơng có ý nghĩa  xét hệ số a: P = 6E‐07