Đề tài “Nghiên c ứu thành ph ần hóa h ọc cây Nữ lang Hardwicke (Valeriana hardwickii Wall.- Valerianaceae)” được tiến hành nhằm tìm ra và chứng minh giá trị y học của cây thuốc này và so sánh với các loài đã dùng trên thế giới nhằm tăng cường nguồn thảo dược trong điều trị chứng mất ngủ cho người Việt Nam và nâng cao giá trị của dược liệu nước nhà.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH NGHIÊN CỨU THÀNH PHẦN HÓA HỌC CÂY NỮ LANG HARDWICKE (Valeriana hardwickii Wall Valerianaceae) Chuyên ngành: Dược học cổ truyền Mã số: 62720406 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Thành Phố Hồ Chí Minh Tp Hồ Chí Minh, năm 2018 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH LIÊN QUAN Cơng trình hoàn thành tại: ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Trần Hùng Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ Hội đồng đánh gía luận án cấp trường họp tại: ĐẠI HỌC Y DƯỢC THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH vào hồi …… giờ……….ngày…….tháng…… năm ……… Có thể tìm hiểu luận án tại: - Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Khoa học Tổng hợp Thành phố Hồ Chí Minh Thư viện Đại học Y Dược Thành phố Hồ Chí Minh Huỳnh Lời, Trần Thị Bảo Châu, Trần Hùng (2011), “Nghiên cứu Nữ lang Harwicke I: Khảo sát thực vật học Nữ lang Hardwicke (Valeriana hardwickii Wall Valerianaceae)”, Tạp chí Y Học Thành Phố Hồ Chí Minh, 15(1), tr 612-616 Loi Huynh, Hung Tran, Thomas Pacher, Johannes Novak (2013), “Comparative analysis of the essential oils of Valeriana hardwickii Wall from Vietnam and Valeriana officinalis from Austria” Journal of Essential Oil Research, 25(5), pp 409-414 Huỳnh Lời, Bùi Ngọc Thảo Trang, Trần Hùng (2014), “Nghiên cứu Nữ lang Hardwicke II: Phân lập terpenoid từ thân thân rễ Nữ lang Hardwicke Valeriana hardwickii”, Tạp chí Tạp chí Y Học Thành Phố Hồ Chí Minh, 18(2), tr 478-480 Huỳnh Lời, Nguyễn Hữu Chí, Rudolf Moldzio, Trần Hùng (2015), “Nghiên cứu Nữ lang Hardwicke III: Độc tính dòng tế bào thần kinh isovaleroxyvaltrat hydrin linarin phân lập từ Nữ lang Hardwicke (Valeriana hardwickii wall Valerianaceae) tác dụng chống oxy hóa Valeriana hardwickii Valeriana officinalis” Tạp chí Y Học Thành Phố Hồ Chí Minh, 19(3), tr 574-580 Huỳnh Lời, Bùi Khương Duy, Nguyễn Thị Phú, Võ Phùng Nguyên, Trần Hùng (2015) “Acute toxicity and anxiolytic, tranquilizing-like effect of Valeriana hardwickii extract in mice”, Journal of Medicinal Materials - Hanoi (Tạp chí Dượcc Liệu), 20 (3), tr 186-192 Huỳnh Lời, Trần Hùng (2015), “Chemical constituents of Valeriana hardwickii Wall” Proceeding of Asean PharmNET I, Bangkok, pp 274-279 Loi Huynh, Hung Tran, Markus Bacher and Thomas Pacher (2016), “Iridoids and flavonoids from Valeriana hardwickii Wall.”, Journal of Pharmacognosy and Phytochemistry”, 5(3), pp 245-248 1 24 GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Thử nghiệm tác dụng sinh học Tác dụng chống oxy hóa với DPPH rễ, thân, quy theo Trolox 9,11; 6,53 13,71 mg/g V hardwickii so với 15,76; 10,25 30,85 mg/g rễ, thân, loài V officinalis Tác dụng chống oxy hóa với FRAP rễ; thân, tính theo Trolox 1,12; 0,69; 1,87 mg/g V hardwickii; so với 1,84; 0,97; 3,43 mg/g rễ; thân, lồi V officinalis Linarin, isovaleroxy valtrat hydrin khơng gây độc dòng tế bào Neuroblastoma N18TG2 nồng độ 0,01; 0,1; 10 g/ml Hợp chất 6,10,11-trihydroxy dihydronepetalacton (THDN) khơng gây độc dòng tế bào MDA-MB 231, HCT 116 Leukemia nồng độ g/ml 50 g/ml Các cao chiết nước, cao chiết EtOH 45% cao DCM V hardwickii không gây độc tính cấp chuột với liều Cao DCM, cao EtOH 45% cao nước 5000; 11900 14640 mg/kg chuột Kết thử nghiệm cao mơ hình mơi trường mở, hai ngăn sáng tối bơi gắng sức cho thấy cao chiết có tác dụng an thần, giải lo âu chuột với liều 1/10 1/20 liều thử độc tính cấp KIẾN NGHỊ Các kết đạt nêu luận án sở khoa học để thực hướng nghiên cứu cho dược liệu Nữ lang V hardwickii: Phân lập thêm thành phần Nữ lang V hardwickii, đặc biệt iridoid, lignan Xác định thành phần chưa xác định sắc ký khí Nghiên cứu điều kiện trồng trọt để sản xuất chế phẩm từ duợc liệu này, thay cho V officinalis ngoại nhập Khảo sát tác dụng sinh học thử nghiệm in vitro in vivo cao chiết tác dụng khác dược liệu kháng viêm, tiểu đường Áp dụng phương pháp định lượng UPLC-PDA để định lượng mẫu thu thập nơi Đặt vấn đề Hiện nay, theo thống kê, tỷ lệ người ngủ cấp mãn tính giới thay đổi từ 3,9-22% Ở Việt Nam, tính theo tỷ lệ chung với 10% nước có gần 9,5 triệu người ngủ mãn tính Mất ngủ dẫn tới nhiều bệnh lo lắng, tăng huyết áp, bệnh tim mạch, tăng lipid máu Thuốc điều trị ngủ có nguồn gốc hóa dược BDZ có nhiều tác dụng phụ lệ thuốc, té ngã, buồn ngủ, sa sút trí tuệ, tử vong Vì vậy, việc tìm kiếm dược liệu cho điều trị bệnh ngủ cần thiết Ở Việt nam, Valeriana hardwckii (Nữ lang) dùng trị ngủ có tài liệu nghiên cứu Valeriana hardwickii Vì vậy, đề tài “Nghiên cứu thành phần hóa học Nữ lang Hardwicke (Valeriana hardwickii Wall.Valerianaceae)” tiến hành nhằm tìm chứng minh giá trị y học thuốc so sánh với loài dùng giới nhằm tăng cường nguồn thảo dược điều trị chứng ngủ cho người Việt Nam nâng cao giá trị dược liệu nước nhà Đề tài bao gồm mục tiêu sau: - Khảo sát hình thái, vi phẫu, bột dược liệu phân tích ADN - Phân tích sơ thành phần hóa học, phân tích thành phần hóa học sắc ký lớp mỏng, sắc ký lỏng, sắc ký khí Các phân tích có so sánh với V officinalis - Chiết xuất, phân lập xác định cấu trúc thành phần có Nữ lang Hardwicke - Định luợng thành phần có Nữ lang Hardwicke UPLC - Tiến hành thử hoạt tính sinh học cao chiết hợp chất phân lập từ Nữ lang Hardwicke Tính cấp thiết đề tài Việc tìm kiếm dược liệu cho điều trị bệnh ngủ cần thiết Nước ta có có nguồn tài nguyên thực vật phong phú với 12000 loài nguồn dược liệu quý dùng bệnh có bệnh ngủ Các lồi thuộc chi Valeriana dùng phổ biến để điều trị ngủ, lo âu, chữa chứng đau dày-ruột dùng từ lâu nước châu Âu châu Á.Valerian ngày đưa vào chuyên luận Dược điển nước tài liệu thống điều trị Việc dùng Valerian tác dụng phụ, tương đương với placebo Do lý trên, đề tài thực loài Valeriana hardwickii nhằm làm sáng tỏ thành phần tác dụng dược lý dược liệu Những đóng góp luận án 3.1 Thực vật học Việc phân tích ADN V hardwickii với mã số định danh KX356086.1 trang thư viện gen Mỹ (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore) lần thực với gen ITS Với đồ gen công bố, nhà nghiên cưú thực vật có sở liệu để so sánh, xác định phân loại loài chi Valeriana 3.2 Phân tích thành phần - - - Phân tích sắc ký lớp mỏng tiến hành lồi V hardwickii V officinalis Phân tích giúp làm sáng tỏ thành phần hóa học V hardwickii đồng thời phân tích so sánh với dược liệu nghiên cứu nhiều V officinalis nhằm giúp cho hiểu rõ tương đồng hóa học tương đồng tác dụng dược lý Phân tích sắc ký lỏng hiệu cao lần tiến hành để định tính thành phần hóa học V hardwickii có so sánh với V officinalis Phân tích HPLC góp phần làm sáng tỏ tương đồng hóa học hai dược liệu Phân tích sắc ký khí phân tích lồi V hardwickii Việt nam Ngoài loài này, phương pháp tiến hành V officinalis Kết cho thấy thành phần giống khác hai dược liệu Phân tích cơng bố tạp chí quốc tế chuyên ngành sắc ký khí giúp cho nhà hóa học có sở liệu kiểu hóa học (chemotype) hai loài 3.3 Phân lập thử tác dụng sinh học hợp chất phân lập - Trong nghiên cứu này, có chất flavonoid lần tìm thấy chi Valeriana, neobudofficid, rhoifolin, neodiosmin Ngồi 23 cưú thực vật có sở liệu để xác định loài so sánh với lồi khác thuộc chi Valeriana Nghiên cứu hóa học Kết phân tích sơ thành phần hóa học cho thấy V hardwickii có tinh dầu, terpenoid, polyphenol Kết phân tích sắc ký lớp mỏng cho thấy V hardwickii có thành phần terpenoid (tinh dầu, triterpen, iridoid…), polyphenol So sánh với V officinalis cho thấy lồi có thành phần tương tự thành phần khác biệt Phân tích HPLC cho thấy V hardwickii chủ yếu có polyphenol, thân rễ ngồi polyphenol có iridoid Trong rễ V officinalis chủ yếu chứa dẫn chất thuộc dẫn chất acid valerenic với hàm lượng lớn rễ V hardwickii với thành phần iridoid di-en thành phần Phân tích thành phần bay GC/MS cho kết rễ, thân, loài V hardwickii có số thành phần xác định tương ứng 62, 31, 31, trong rễ V officinalis có 55 thành phần Từ V hardwickii, phân lập 11 hợp chất, tất lần phân lập từ loài (-sitosterol, daucosterol, linarin, neobudofficid, rhoifolin, neodiosmin, acid oleanolic, acid ursolic, chlorvaltrat, isovaleroxy valtrat hydrin 6,10,11-trihydroxy dihydronepetalacton) Trong 6,10,11-trihydroxy dihydronepetalacton hợp chất lần đầu biết Định lượng thành phần Phenol toàn phần lá, thân rễ tính theo acid caffeic 24,3; 17,4; 18,4 mg/g V hardwickii; so với lá, thân rễ 43,1; 16,0; 23,4 mg/g V officinalis Phương pháp định lượng đồng thời linarin, rhoifolin, neobudofficid acid clorogenic UPLC-PDA đuợc xây dựng với khoảng tuyến tính (R2 > 0,999; 0,05-120 gml), độ lặp lại (RSD < 2%), độ đạt 90 – 107% Hàm lượng acid clorogenic, rhoifolin, neobudofficid linarin mẫu V hardwickii 1,24; 0,69; 0,05; 1,26% Hàm luợng acid clorogenic thân rễ V hardwickii 5,1% 0,45%; so với 0,44% 0,66% rễ V officinalis 3 22 thử nghiệm tác dụng độc tế bào Leukemia, HCT 116 MDA MB 231 Kết cho thấy THDN khơng độc dòng tế bào Theo báo cáo hợp chất có cấu trúc tương tự jatamin A, jatamin G, hexahydro-6hydroxy-7-(hydroxymethyl)-4-methylenecyclopenta[c]pyran-1(3H)-on, villosid aglycon phân lập từ V wallichii Ba chất đầu thử tác dụng dòng tế bào ung thư nguời K562 HepG2 cho thấy khơng có tác dụng ức chế dòng tế bào (IC50 > 50 M) - + Về thử nghiệm độc tính cấp, an thần giải lo âu cao chiết V hardwickii Trong nghiên cứu này, tất chuột sống sót sau dùng cao chiết với liều lượng khác sau 14 ngày quan sát Khơng có khác nhóm uống cao chiết nhóm chứng Khơng có bất thường quan chuột Điều cho thấy cao chiết khơng có độc tính cấp an tồn sử dụng Độc tính cấp liều 5000 mg/kg (DCM), 11900 mg/kg (cao 45% EtOH) cao nước với liều 14640 mg/kg V hardwickii xem khơng phân loại độc tính liều g/kg không gây chết hay triệu chứng độc chuột Theo tài liệu, loài khác thuộc chi Valeriana Valeriana pavonii với liều 2000 mg/kg với cao EtOH, V jatamansi với liều 10000 mg/kg, liều dùng V hardwickii nghiên cứu cao an toàn với loài thuộc chi Valeriana nêu Các nghiên cứu khác công bố độc tính V officinalis cho thấy cao EtOH có độc tính thấp với liều 3,3 g/kg (đường tiêm phúc mạc) KẾT LUẬN Sau trình năm thực đề tài (9/2010-9/2016) với phương pháp thực vật học, hóa học thử nghiệm sinh học, luận án hoàn thành nội dung nghiện cứu đạt tất mục tiêu đề ban đầu Thực vật học V hardwickii Hình thái thực vật mô tả chi tiết, đặc điểm vi phẫu, bột dược liệu mô tả Việc xác định ADN V hardwickii với mã số KX356086.1 đăng trang pubmed.com giúp cho nhà nghiên - ra, có chất lần đầu cơng bố lồi V hardwickii chlorvaltrat, isovaleroxyvaltrat hydrin, acid oleanolic, acid ursolic, linarin Chúng thuộc nhóm iridoid, triterpenoid flavonoid Kết đăng tạp chí quốc tế chun ngành hóa học dược liệu, giúp cho nhà nghiên cứu có liệu phổ học thành phần hóa học chi Valeriana Cơng trình nghiên cứu phân lập chất lần đầu công bố 6,10,11-trihydroxy dihydronepetalacton Hợp chất thử độc tính dòng tế bào Với chất này, cần thử nghiệm mơ hình tác dụng dược lý khác tiểu đường, chống viêm, kháng histamin nhằm tìm cơng dụng điều trị Linarin, isovaleroxy valtrat hydrin 6,10,11-trihydroxy dihydronepetalacton chất lần đầu thử nghiệm độc tính dòng tế bào kết chúng khơng có tác dụng độc tế bào Kết cho thấy an toàn sử dụng V hardwickii 3.4 Định lượng hàm lượng phenol tồn phần thử nghiệm chống oxy hóa Định lượng phenol toàn phần thử tác dụng chống oxy hóa mơ hình DPPH FRAP tiến hành lần hai dược liệu V hardwickii V officinalis Kết cho thấy hàm lượng hợp chất phenol tác dụng chống oxy hóa chúng 3.5 Định lượng flavonoid acid clorogenic V hardwickii V officinalis Lần phương pháp sắc ký lỏng siêu hiệu (UPLC-PDA) tiến hành xây dư5ng định lượng đồng thời flavonoid acid clorogenic Phương pháp đuợc dùng để định luợng thành phần V hardwickii ứng dụng chúng để định lượng acid clorogenic V officinalis 3.6 Thử nghiệm độc tính cấp, an thần giải lo âu cao chiết V hardwickii Tác dụng dược lý V hardwickii lần tiến hành dược liệu V hardwickii với cao chiết nước, EtOH 45% cao DCM Các cao khơng gây độc tính cấp chuột Kết cho thấy cao có tác dụng an thần, giải lo âu chuột Tác dụng an thần, giải lo âu đăng tạp chí chuyên ngành dược liệu nước Bố cục luận án Luận án gồm 136 trang: Mở đầu trang, tổng quan tài liệu 35 trang, nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu 20 trang, kết nghiên cứu 64 trang, bàn luận 12 trang, kết luận đề nghị trang Luận án có 39 bảng, 56 hình, 15 biểu đồ, sơ đồ, 151 tài liệu tham khảo gồm tài liệu tiếng Việt 143 tài liệu tiếng Anh, 24 phụ lục thể kết thực nghiệm Chương TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan chi Valeriana Chi Valeriana thuộc họ Valerianaceae Hiện xếp vào họ Caprifoliaceae Họ Valerianaceae có khoảng 350 lồi Ở nước ta có lồi: V hardwickii (Nữ lang) V jatamansi (Sì to) Thành phần hóa học lồi thuộc chi Valeriana chủ yếu chứa tinh dầu, iridoid (valepotriat), triterpenoid, flavonoid, acid phenol, lignan, alkaloid Ngồi có amino acid (arginin, GABA, glutamin, tyrosin), acid béo, cholin chất vô khác 1.2 Tổng quan loài V hardwickii Trên giới V hardwickii mọc Ấn Độ, Trung Quốc, Myanmar, Malaysia, Indonesia Ở nuớc ta, Nữ lang (V hardwickii) mọc Ô Quý Hồ, Tả Giàng Phình, núi Hàm Rồng, Xà Xén, Sapa, Hà Giang (Đồng Văn, Mèo Vạc), Quảng Nam (Trà My: Ngọc Linh), Kon Tum (Đắk Tô: Ngọc Linh), Lâm Đồng (Đà Lạt) Cho đến nay, nghiên cứu hoá học lồi V hardwickii khơng nhiều Năm 1989, Đỗ Ngọc Thanh cộng phân lập thành phần từ V hardwickii ký hiệu N1, N2 chưa xác định cấu trúc 21 Lần đầu tiên, phương pháp định luợng thiết lập dùng để định lượng thành phần bao gồm flavonoid V hardwickii acid clorogenic hai dược liệu V hardwickii V officinalis Hiện chưa có tài liệu công bố việc định lượng đồng thời thành phần Valeriana Trong nghiên cứu này, kết định lượng UPLC-PDA cho thấy acid clorogenic nhiều thân V hardwickii với hàm lượng 5,19% thấp V officinalis 0,44% Ngoài flavonoid định lượng với hàm lượng tương ứng acid clorogenic, rhoifolin, neobudofficid, linarin 1,24%, 0,69%, 0,05%,1,26% Trong báo cáo định lượng thành phần phương pháp HPLC-PDA kết cho thấy hàm lượng cao toàn loài V officinalis 1,16% Trong V hardwickii, hàm lượng linarin 1,26% cao hàm lượng V jatamansi với hàm lượng 0,24% Dựa vào kết định lượng, thân V hardwickii nguồn chiết xuất acid clorogenic nguồn để chiết linarin Kết xây dựng phương pháp dùng để định tính, định lượng thành V hardwickii góp phần xây dựng tiêu chuẩn cho dược điển cho dược liệu Về thử nghiệm sinh học + Về thử nghiệm chống oxy hóa Khả chống oxy hóa cao dịch chiết lá, thấp dịch chiết thân, điều hàm lượng hợp chất phenol phận lồi Đã có báo cáo trước khả chống oxy hóa V hardwickii DPPH với chất đối chiếu acid ascorbic, nhiên thử nghiệm khảo sát tòan chiết riêng rẽ dung môi khác nước, EtOH, aceton, cloroform, hexan Trong cao aceton hexan có tính chống oxy hóa cao Rễ V officinalis thử nghiệm khả chống oxy hóa với DPPH tính theo Trolox 7,88 mM/100 g dược liệu (19,7 mg/g) với FRAP tính theo Trolox 1,78 mM/100 g (4,45 mg/g), kết tương tự kết qủa nghiên cứu + Về thử nghiệm độc tính hợp chất phân lập V hardwickii Trong nghiên cứu này, hợp chất 6,10,11-trihydroxy dihydronepetalacton V hardwickii chất lần phân lập tự nhiên 20 neuroblastoma N18TG2 cho thấy linarin khơng có tác dụng độc dòng tế bào Hơn nữa, linarin chứng minh có tính giảm đau, hạ sốt, chống viêm Ngồi ra, linarin có tính an thần kéo dài giấc ngủ chuột với thí nghiệm bảng đục lỗ (hole board test) Neobudofficid có cấu trúc gồm đường rhamnose gắn vào đường glucose Neobudofficid không phổ biến tự nhiên tìm thấy Turpinia arguta Staphyleaceae Buddleja officinalis Scrophulariaceae, chưa thấy có tài liệu báo cáo tồn neobudofficid chi Valeriana tác dụng sinh học hợp chất Rhoifolin lần đuợc phân lập từ Rhus succedanea đặt tên dựa vào tên chi Rhus Hợp chất phân lập từ chi Valeriana có tác dụng chống co thắt mạch vành chống thiếu máu tim chuột Neodiosmin tìm thấy Citrus aurantium, Trollius ledebourii Ranunculaceae lần đầu phân lập Valeriana Neodiosmin tan nước, có tính khử đắng (debittering), chống oxy hóa mạnh, đuợc ứng dụng thực phẩm, dược phẩm dùng nghiên cứu trợ tan với cyclodextrin lysin Thành phần tinh dầu V hardwickii var arnottiana valeracetat, bornyl acetat, methyl linoleat, cuparen α-cedren hàm lượng tinh dầu 0,3% Tinh dầu V hardwickii mọc Hymalaya có thành phần methyl linoleat, valeracetat, bornyl acetat terpinyl acetat Các hợp chất epoxysesquithujen, volvalerenol (triterpen với vòng 12 carbon), 4α,5α-epoxy-8β-hydroxy-1α-hydro-α-guaien; 4α,5α-epoxy-1-hydroxy-α-guaien (sesquiterpen), syzalterin, 6methylapigenin, 5-hydroxy-7,4'-dimethoxyflavon, genkwanin, acacetin, apigenin, quercetin, tricin, farrerol, sosakuranetin; 5,3',4'-trihydroxy-7methoxyflavanon, bornyl ferulat, bornyl caffeat hợp chất phân lập từ V hardwickii 1.3 Tác dụng sinh học V hardwickii Cho đến nay, có cơng trình nghiên cứu tác dụng V hardwickii Cao chiết thân rễ V hardwickii thể tác dụng chống co thắt 1.4 Công dụng y học cổ truyền Theo y học cổ truyền, Nữ lang có vị ngọt, đắng, tính bình, tác động vào kinh: tâm, can Cây có tác dụng ninh tâm, an thần, hoạt huyết, thơng kinh Lồi tương đối Việt Nam Hoạt chất từ thân rễ dùng làm thuốc thần kinh tim, chống co thắt; dùng làm thuốc chữa phong thấp, đau dày, điều kinh, sốt trẻ em Nữ lang V hardwickii dùng với liều 10 g hãm với 100 ml nước sôi, để nguội uống ngày nghiền dược liệu thành bột uống với liều 1-4 g/ ngày, thái nhỏ dược liệu, ngâm ethanol 60% với tỷ lệ 1/5, ngày dùng 2-10 g pha lỗng, ngồi dùng dạng cao mềm, ngày dùng 1-4 g Cơng trình phân lập hợp chất nghiên cứu đăng tạp chí quốc tế, giúp cho V hardwickii biết đến rộng rãi Về định lượng thành phần + Về định lượng phenol toàn phần Kết định lượng phenol toàn phần cho thấy hàm lượng phenol toàn phần loài gần tương tự Xét hàm lượng phenol toàn phần phận cây, hàm luợng chúng dịch chiết cao dịch chiết thân rễ, điều xảy hai lồi Đã có vài nghiên cứu hàm lượng phenol tồn phần với chuẩn acid gallic cơng bố với V jatamansi (12,82 mg GAE/g dw), V officinalis (14,2 mg GAE/g dw) Trong cơng trình này, V hardwickii lần định luợng phenol toàn phần dựa acid caffeic Hàm lượng chúng V hardwickii nghiên cứu thấp so với loài V jatamansi (100,44 mg/100 g (trên mặt đất) 91,64 mg/100 g (rễ)) + Về định lượng flavonoid acid clorogenic V hardwickii UPLC-PDA Chương NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu - Nguyên liệu Nữ lang (V hardwickii) thu hái mọc hoang Cổng Trời (vùng Bidoup núi Bà), thành phố Đà Lạt Ngọc Linh, Quảng Nam Thời điểm thu hái 6/2010, 9/2011, 6/2013, 9/2015 - 19 Nguyên liệu V officinalis thu thập vườn dược liệu trường Vetmeduni – Vienna, Autria Thu hái vào 6/2012, 4/2015 Có ba iridoid phân lập V hardwickii chúng công bố lần này, clorovaltrat, isovaleroxyvaltrat hydrin (valtrat hydrin B4) 6,10,11-trihydroxy-dihydronepetalacton Trong đó, hợp chất sau hợp chất lần đầu phân lập tự nhiên Trong có hai hợp chất thử nghiệm hoạt tính sinh học tế bào isovaleroxyvaltrat hydrin 6,10,11-trihydroxy-dihydronepetalacton, hợp chất lại khơng thử tan nước Hợp chất isovaleroxyvaltrat hydrin cho thấy không độc tế bào NB N18TG2 Isovaleroxyvaltrat hydrin phân lập từ V alliriifolia, V capense có tác dụng an thần súc vật thử nghiệm 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1 Phương pháp thực vật học V hardwickii - Khảo sát hình thái, sinh thái vi phẫu kỹ thuật thường quy - Khảo sát ADN CTAB giải trình tự ADN gen ITS 5.8 S rADN, so sánh với lồi chi cơng bố 2.2.2 Phương pháp hóa học - Định tính thành phần phương pháp hóa học thường quy - Phân tích thành phần hóa học sắc ký lớp mỏng, HPLC, phân tích xác định thành phần bay vi chưng cất kết hợp với GCMS, GC-FID - Phân lập xác định cấu trúc hợp chất V hardwickii kỹ thuật sắc ký - Xác định cấu trúc hợp chất phân lập phương pháp phổ học (MS, NMR) 2.2.3 Phương pháp định lượng - Định lượng phenol toàn phần: dùng thuốc thử Folin-Ciocalteu - Xây dựng quy trình định lượng đồng thời acid clorogenic flavonoid V harwickii UPLC-PDA: Xây dựng quy trình chuẩn bị mẫu, pha động, đường tuyến tính, độ xác độ 2.2.4 Phuơng pháp thử nghiệm tác dụng sinh học - Đánh giá tác dụng chống oxy hóa phân đoạn chiết mơ hình DPPH FRAP - Thử nghiệm độc tế bào dòng tế bào Neuroblastoma N18TG2 phương pháp PI resazurin, dòng tế Leukemia, HCT 116 MDA MB 231 phương pháp XTT - Thử nghiệm độc tính cấp phương pháp mơ tả Đỗ Trung Đàm (1996) - Thử nghiệm tác dụng an thần giải lo âu chuột mơ hình: Mơ hình mở, mơ hình ngăn sáng tối bơi gắng sức theo Porsolt (2001) Clorovaltrat hợp chất tự nhiên có clor phân lập lần đầu từ V officinalis S Popov cộng vào năm 1974 Sau clorovaltrat với 20 hợp chất khác Sheng Lin cộng phân lập từ V jatamansi công bố năm 2013 Clorovaltrat đuợc báo cáo có tác dụng độc dòng tế bào ung thư phổi (lung adenocarcinoma (A 549)), ung thư tuyến tiền liệt (metastatic prostate cancer (PC-3M)), ung thư ruột kết (colon cancer (HCT-8)) ung thư gan (hepatoma (Bel 7402)) mức trung bình với IC50 khoảng 0,89–9,76 M Hợp chất 6,10,11-trihydroxy dihydronepetalacton (THDN) V hardwickii chất lần phân lập tự nhiên thử nghiệm tác dụng độc tế bào Leukemia, HCT 116 (Human colorectal carcinoma) 116 MDA MB 231 Kết cho thấy THDN không độc dòng tế bào Hợp chất có cấu trúc tương tự jatamin A, jatamin G, hexahydro-6-hydroxy-7-(hydroxymethyl)-4-methylenecyclopenta[c]pyran1(3H)-on, villosid aglycon Jatamin A, jatamin G, hexahydro-6-hydroxy-7(hydroxymethyl)-4-methylenecyclopenta[c]pyran-1(3H)-on có báo cáo tài liệu tác dụng dòng tế bào ung thư nguời K562 HepG2 cho thấy tác dụng ức chế dòng tế bào Trong cơng trình này, có bốn flavonoid phân lập linarin, neobudofficid, rhoifolin neodiosmin Tất chúng thuộc nhóm flavon glycosid với đường glucose gắn với hay đơn vị rhamnose Trong flavonoid này, linarin thử độc tính tế bào dòng tế bào 18 italica, V tuberosa, V edulis, V faurei Patchouli alcol, kessyl acetat, kessanyl acetat thành phần nhiều lồi thuộc chi Valeriana khơng diện lồi nghiên cứu Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Về phân lập hợp chất V hardwickii Quá trình phân lập kỹ thuật khác bao gồm sắc ký cột mở, sắc ký lỏng áp suất trung bình, sắc ký rây phân tử phân lập 11 hợp chất tinh khiết Các hợp chất phân lập bao gồm terpenoid sitosterol (483 mg) (1), daucosterol (463 mg) (2), acid oleanolic (11 mg) (7), acid ursolic (1,72 g) (8); irodoid clorovaltrat (73 mg) (9) isovaleroxyvaltrat hydrin (13 mg) (10), 6,10,11-trihydroxy-dihydronepetalacton (730 mg) (11); flavoinoid linarin (480 mg) (3), neobudofficid (52 mg) (4), rhoifolin (86 mg) (5) neodiosmin (8 mg) (6) Trong hợp chất phân lập, 6,10,11-trihydroxy-dihydronepetalacton hợp chất tự nhiên lần đầu công bố Cột silica gel áp dụng để phân lập hợp chất terpen sitosterol, daucosterol, acid oleanolic, acid ursolic, clorovaltrat, isovaleroxy valtrat hydrin, 6,10,11-trihydroxy-dihydronepetalacton flavonoid glycosid linarin Sắc ký lỏng áp suất trung bình MPLC với pha đảo RP-18 áp dụng để phân lập flavonoid glycosid linarin, rhoifolin neobudofficid Sephadex LH-20 dùng để tinh chế phân đoạn cao n-BuOH Iridoid nepetalacton bị phân hủy nhiệt, iridomyrmecin chịu 30 phút 120 oC Tuy nhiên, valepotriat dễ bị hư nhiệt, ánh sáng, acid hay kiềm Sản phẩm phân hủy homobaldrinal hay baldrinal, chúng có hóa tính tạo polymer Trong nghiên cứu này, iridoid valepotriat phân lập thành công, hợp chất bền, khó phân lập điều kiện nhiệt đới 3.1 Thực vật học V hardwickii Hình thái thực vật mô tả chi tiết, đặc điểm vi phẫu, bột dược liệu làm sáng tỏ Việc định danh ADN V hardwickii với mã số định danh KX356086.1 đăng trang pubmed.com giúp cho nhà nghiên cưú thực vật có sở liệu để so sánh loài thuộc chi Valeriana 3.2 Nghiên cứu hóa học 3.2.1 Phân tích thành phần hóa học Kết qủa phân tích sơ cho thấy V hardwickii có hợp chất terpenoid (tinh dầu, triterpen, iridoid…), polyphenol Sắc ký lớp mỏng dùng để so sánh với dược liệu V officinalis, kết cho thấy có thành phần tương tự có khác thành phần Phân tích HPLC V hardwickii chủ yếu có polyphenol, thân rễ ngồi polyphenol có iridoid Trong rễ V officinalis chủ yếu chứa dẫn chất thuộc acid valerenic sesquiterpen với hàm lượng lớn rễ V hardwickii với thành phần iridoid dien thành phần Phân tích GC cho thấy V hardwickii, rễ, thân, có 62, 31, 31 thành phần xác định chiếm 90%, 90% 92% tổng chất bay xác định, theo thứ tự Ở V officinalis, rễ có 55 thành phần xác định chiếm 81,6% tổng số thành phần bay Các terpenoid nhiều báo cáo thành phần chi Valeriana sitosterol V officinalis, sitosterol acid ursolic V officinalis Ngoài ra, acid ursolic, acid oleanolic chất thường gặp thực vật phân lập từ V laxiflora Acid oleanolic acid ursolic báo cáo tài liệu tính kháng lao M tuberculosis với MIC 29,7 g/ml (acid oleanolic) 41,9 g/ml (acid ursolic) Hình 3.43 Săc ký đồ GC so sánh V hardwickii V officinalis 17 Hình 3.43 Săc ký đồ GC so sánh thân V hardwickii V officinalis var arnottiana tồn kiểu hóa học tinh dầu Kiểu I với thành phần valeracetat, 8-epikessyl glycol diacetat, -kessyl acetat, kiểu II với thành phần maaliol, kessanyl acetat Thành phần tinh dầu V hardwickii nghiên cứu không giống với kiểu hóa học V wallichii V hardwickii var arnottiana nêu Tuy nhiên với maaliol chiếm tỷ lệ lớn, kiểu hóa học V hardwickii nghiên cứu gần giống với kiểu I V wallichii kiểu II V hardwickii var arnottiana Thành phần p-anethol có tỷ lệ lớn thân V hardwickii nghiên cứu tìm thấy thành phần tinh dầu rễ thân rễ V wallichii với hàm lượng thấp (0,1-0,4%) Các thành phần dễ bay V officinalis Hình 3.43 Săc ký đồ GC so sánh rễ V hardwickii V officinalis 3.2.2 Phân lập xác định cấu trúc Từ V hardwickii, 11 hợp chất, tất lần phân lập, bao gồm hợp chất -sitosterol, daucosterol, linarin, neobudofficid, rhoifolin, neodiosmin, acid oleanolic, acid ursolic, chlorvaltrat, isovaleroxy valtrat hydrin 6,10,11-trihydroxy dihydronepetalacton Trong đó, 6,10,11trihydroxy dihydronepetalacton hợp chất lần đầu cơng bố Đối với V officinalis, rễ có 55 thành phần xác định chiếm 81,6% tổng số thành phần bay Trong thân, chưa phát có thành phần bay lá, vài thành phần xác định, acid isovaleric, acid hexanoic neophytadien Nghiên cứu cho thấy thành phần bay có hàm lượng vuợt trội camphen, bornyl acetat với monoterpen, valerenal với sesquiterpen, điều tương tự tương tự công bố trước Theo tài liệu cơng bố, thành phần bay rễ V officinalis có kiểu hóa học A, B, C V officinalis nghiên cứu có thành phần tinh dầu khơng thuộc kiểu A, B, C nêu Tuy nhiên có valerenal với hàm lượng cao, tinh dầu V officinalis nghiên cứu gần giống với kiểu B Cơng trình nghiên cứu phân tích thành phần bay từ V hardwickii V officinalis đăng tạp chí quốc tế nhằm nâng cao giá trị dược liệu nước nhà So sánh thành phần dễ bay V hardwickii V officinalis Thành phần loài nghiên cứu acid isovaleric, αpinen, camphen, borneol, bornyl acetat, α-gurjunen, calaren, maaliol, spathulenol, caryophyllen oxid, valeranon, valerenal, neophytadion valerenyl acetat, thành phần nêu tìm thấy nhiều lồi thuộc chi Valeriana V hardwickii, V officinalis, V celtica, V wallichii, V pyrolaefolia, V himalayana, V pancicii, V sisymbriifolia, V 16 Về chương trình nhiệt, nghiên cứu đưa chương trình nhiệt tối ưu cho phân tách hợp chất cho hai loài V hardwickii V officinalis Với chương trình nhiệt này, thành phần phân tích lên tới 90% tổng lượng hợp chất có tinh dầu Các thành phần dễ bay V hardwickii Ở V hardwickii, rễ có 64 thành phần có 60 thành phần có hàm lượng lớn 0,05% thành phần dạng vết xác định chiếm 89,9% tổng lượng chất bay xác định Tương tự, thân có 32 thành phần có 31 thành phần chiếm tỷ lệ 89,8%, 91,9% tổng lượng hợp chất bay Trong tài liệu công bố, rễ V hardwickii Ấn độ có 31 thành phần tổng 89,6% 28 thành phần tổng 92,1% thành phần khảo sát So với tài liệu trên, rễ loài V hardwickii Việt nam có thành phần đa dạng Trong luận án này, lần công bố thành phần bay từ thân V hardwickii Những thành phần tương tự rễ V hardwickii nghiên cứu so với tài liệu bao gồm monoterpen -pinen, camphen, borneol, đặc biệt bornyl acetat thành phần trội Các thành phần sesquiterpen có tương đồng lồi V hardwickii Việt nam Ấn độ gurjunen, cadinen, caryophyllen, ar-curcumen, allo-aromadendren Trong nghiên cứu này, thành phần acid isovaleric phát có nhiều nhiều loài thuộc chi Valeriana, tạo mùi đặc trưng cho chi Tuy nhiên, thành phần dễ bay không phát vài nghiên cứu gần nhiệt độ buồng GC lúc khởi điểm 50 oC hay chí cao Ngoài acid isoaleric thành phần đáng kể, thành phần rễ V hardwickii nghiên cứu tương đối khác biệt với rễ loài chi cơng bố, V hardwickii var hardwickii với thành phần epoxysesquithujen V hardwickii var arnottiana với thành phần valeracetat methyl linoleat Trong nghiên cứu tinh dầu V wallichii vùng Tây Bắc Hymalaya cho thấy tồn kiểu hóa học (chemotype) tinh dầu Trong đó, kiểu I với thành phần oxysesquiterpen bao gồm maaliol viridiflorol kiểu II có thành phần patchouli alcohol, viridiflorol Tài liệu cho thấy V hardwickii Sơ đồ 2.1 Sơ đô chiết phân bố Sơ đồ 2.2 Sơ đô phân lập hợp chất 1, 2, 10 15 Kết giải trình tự gen ITS lần đầu công bố trang liệu Mỹ (www.pubmed.com) với mã nhận diện cấp KX356086.1 Việc công bố đồ gen ITS đóng góp cho cho sở liệu gen loài chi Valeriana Các nhà nghiên cứu dựa sở liệu để so sánh định danh V hardwickii Về phân tích HPLC Sơ đồ 2.3 Sơ phân lập hợp chất 3,4,5 Kết phân tích định tính so sánh dịch chiết V hardwickii V officinalis HPLC (Mục 3.2.1.2) cho thấy có chứa thành phần dẫn chất thuộc acid clorogenic, flavonoid iridoid di-en Từ kết qủa phân tích, việc phân lập hợp chất tiến hành Kết phân lập thu bốn flavonoid linarin, neobudofficid, rhoifolin neodiosmin, ba iridoid clorovaltrat, isovaleroxyvaltrat hydrin, 6,10,11trihydroxy dihydronepetalacton, bốn terpenoid -sitosterol, daucosterol, acid oleanolic, acid ursolic Bên cạnh đó, việc phân tích cho thấy có acid clorogenic giúp cho việc định lượng chúng hai loài V hardwickii V officinalis Việc phân tích định HPLC cho thấy thành phần rễ hai lồi có khác Thành phần rễ loài V hardwickii chủ yếu valepotriat di-en trong lồi V officinalis chủ yếu chứa dẫn chất khung valeran acid hydroxyvalerenic, acid acetoxyvalerenic acid valerenic Việc phân tích định, tính định lượng iridoid valepotriat báo cáo với việc dùng HPLC Về phân tích GC Sơ đồ 2.4 Sơ đô phân lập hợp chất 11 Có nhiều phương pháp chuẩn bị mẫu phân tích tinh dầu chưng cất lơi theo nước, phương pháp chiết dung môi, phương pháp ép, phương pháp ướp, lấy mẫu trực tiếp từ quan tiết, vi chưng cất hay headspace Trong nghiên cứu này, phương pháp vi chưng cất dùng để chiết tinh dầu từ hai loaì V hardwickii V officinalis Phương pháp có ưu điểm dùng lượng nhỏ nguyên liệu từ vài chục mg đến g bẫy với lượng dung mơi (0,3 ml hexan) 14 11 officinalis 1,84; 0,97; 3,43 mg Trolox/g mẫu Mơ hình FRAP trên rễ; thân, V hardwickii 1,12; 0,69; 1,87 mg Trolox/g mẫu 3.4.2 Tác dụng độc tế bào Linarin, isovaleroxy valtrat hydrin khơng độc dòng tế bào Neuroblastoma N18TG2 với nồng độ 0,01; 0,1; 10 g/ml Hợp chất 6,10,11-trihydroxy dihydronepetalacton (THDN) thử độc tính dòng tế bào MDA-MB 231, HCT 116 Leukemia, kết cho thấy THDN không độc dòng tế bào nêu với nồng độ g/ml 50 g/ml 3.4.3 Độc tính cấp, tác dụng an thần giải lo âu Các cao chiết nước, cao chiết EtOH 45% cao DCM V hardwickii không gây độc tính cấp chuột với liều Cao DCM, cao EtOH 45% cao nước 000; 11900 14640 mg/kg chuột Kết thử nghiệm cao mơ hình mơi trường mở, hai ngăn sáng tối bơi gắng sức cho thấy cao chiết có tác dụng an thần, giải lo âu chuột với liều 1/10 1/20 liều thử độc tính cấp Sơ đồ 2.5 Sơ phân lập hợp chất BÀN LUẬN Chi Valeriana có nhiều loài dùng làm thuốc phổ biến châu Âu V officinalis, Trung quốc, Ấn độ V jatamansi, hay Nhật V faurei nhiều nước khác Về thực vật học Đã có nhiều nghiên cứu thực vật học, hóa học tác dụng dược lý loài giới Ở Việt nam, lồi V hardwickii biết gần chưa có báo cáo thuốc Việc nghiên cứu thực vật học, hóa học tác dụng sinh học duợc liệu hợp chất phân lập điều cần thiết nhằm đóng góp thơng tin góp phần chứng minh tác dụng Nghiên cứu giúp nâng cao giá trị nguồn dược liệu kho tàng dược liệu nước nhà Những công bố nước quốc tế nghiên cứu nguồn tham khảo cho cơng trình nghiên cứu tổng quan nghiên cứu Nữ lang V hardwickii chi Valeriana Sơ đồ 2.6 Sơ đô phân lập hợp chất 10 12 13 3.2.2.1 Hợp chất 1: Sitosterol Hợp chất 2: Daucosterol 3.2.2.4 Hợp chất 9: Chlorvaltrat Hợp chất 10: Isovaleroxyvaltrat hydrin Hợp chất 11: 6,10,11-trihydroxy dihydronepetalacton O 1''' H O H O 1'' H 11 O H O H 10 R 3.2.2.2 Hợp chất 3: Linarin, hợp chất 4: Neobudofficid, hợp chất 5: Rhoifolin, hợp chất 6: Neodiosmin OH H H O 1' 3' R=Cl: Clorvaltrat O R=Isovaleryl: Isovaleroxy valtrat hydrin 6,10,11-trihydroxy dihydronepetalacton 3.3 Định lượng thành phần 3.2.2.3 Hợp chất 7: Acid oleanolic Hợp chất 8: Acid ursolic 29 30 20 19 12 18 13 11 25 22 COOH 14 16 10 3.4 Thử nghiệm tác dụng sinh học 17 26 21 3.4.1 Tác dụng chống oxy hóa Mơ hình DPPH rễ, thân, V officinalis 15,76; 10,25 30,85 mg Trolox/g mẫu Mơ hình DPPH rễ, thân, V hardwickii 28 15 27 HO 23 9,11; 6,53 13,71 mg Trolox/g mẫu Mơ hình FRAP rễ; thân, V 24 Acid oleanolic - Kết định lượng phenol toàn phần lá, thân rễ V hardwickii tương ứng 24,3; 17,4; 18,4 mg acid caffeic/g, lá, thân rễ V officinalis tương ứng 43,1; 16,0; 23,4 mg /g - Định lượng đồng thời linarin, rhoifolin, neobudofficid acid clorogenic UPLC-PDA với khoảng tuyến tính (R2 > 0,999; 0,05-120 gml), độ lặp lại (RSD < 2%), độ đạt 90 – 107% Hàm lượng acid clorogenic, rhoifolin, neobudofficid linarin mẫu V hardwickii 1,24; 0,69; 0,05; 1,26% Hàm luợng acid clorogenic thân rễ V hardwickii 5,1% 0,45%; rễ V officinalis 0,44% 0,66% Acid ursolic ... hardwckii (Nữ lang) dùng trị ngủ có tài liệu nghiên cứu Valeriana hardwickii Vì v y, đề tài Nghiên cứu thành phần hóa học Nữ lang Hardwicke (Valeriana hardwickii Wall .Valerianaceae) tiến hành... jatamin G, hexahydro-6-hydroxy-7-(hydroxymethyl)-4-methylenecyclopenta[c]pyran1(3H)-on, villosid aglycon Jatamin A, jatamin G, hexahydro-6-hydroxy-7(hydroxymethyl)-4-methylenecyclopenta[c]pyran-1(3H)-on... Nghiên cứu Nữ lang Hardwicke III: Độc tính dòng tế bào thần kinh isovaleroxyvaltrat hydrin linarin phân lập từ Nữ lang Hardwicke (Valeriana hardwickii wall Valerianaceae) tác dụng chống oxy hóa