Sinh hoa mien dich DH da nang phuhmtu

NGUYỄN THỊ LAN Khoa hoá SINH HOÁ MIỄN DỊCH ðà Nẵng - 2007 CHƯƠNG I MỘT SỐ KHÁI NIỆM CƠ BẢN 1.1 Khái niệm miễn dịch ñáp ứng miễn dịch hệ miễn dịch 1.1.1 Miễn dịch Hàng ngày người phải ñối mặt với vi sinh vật gây bệnh Trong ñó có loại sinh trưởng phát triển thể, cản trở ngừng chức hoạt ñộng quan, dẫn ñến bệnh tật Nhưng thể không bị bệnh, không nhiễm trùng Bởi thể biết bảo vệ hàng loạt chế thích ứng phức tạp hoàn hảo Tập hợp hệ thống bảo vệ gọi miễn dịch Miễn dịch (immunity) trạng thái bảo vệ ñặc hiệu thể chống lại yếu tố gây bệnh chúng xâm nhập vào thể Ngày miễn dịch học ñã trở thành ngành khoa học ñang phát triển chiếm vị trí quan trọng ñặc biệt sinh học y học 1.1.2 Hệ miễn dịch Hệ thống miễn dịch bao gồm quan nhiều loại tế bào nằm rải rác khắp thể, hợp tác với ñể nhận diện phản ứng với kháng nguyên theo nhiều kiểu dẫn ñến ñáp ứng miễn dịch cuối Các quan lympho trung ương bao gồn tuỷ xương tuyến ức nơi phát sinh huyến luyện ñào tạo tế bào lympho Các quan lympho ngoại vi nơi chứa ñựng tế bào lympho hoạt ñộng ñáp ứng miễn dịch gồm lách, hạch kênh bạch huyết Các tế bào hệ miễn dịch người: Gồm tất tế bào bạch cầu thể, khoảng 8000 tế bào /mm3 máu bao gồm - Tế bào hạt chiếm 50÷80% - Tế bào lympho 20÷45% - Mono bào ñại thực bào3÷8 % 1.1.3 ðáp ứng miễn dịch Là bảo vệ thể nhiều phần tử tế bào nằm rải rác khắp thể tham gia theo chế bảo vệ không ñặc hiệu ñặc hiệu gọi ñáp ứng miễn dịch Là tượng phức tạp thực nhiều loại tế bào gồm nhiều công ñoạn với chế ñiều hòa tế nhị Nếu ví hệ thống miễn dịch dàn nhạc tế bào nhạc công tuyến ức nhạc trưởng 1.2 Miễn dịch học cổ ñiển, miễn dịch học ñại Miễn dịch học cổ ñiển Miễn dịch học cổ ñiển hay gọi miễn dịch học truyền nhiễm, học thuyết tính ñề kháng thể biện pháp tiêm chủng phòng bệnh truyền nhiễm như: bệnh lao, bệnh sởi, ho gà, uốn ván, bạch hầu Miễn dịch học ñại Miễn dịch học ñại gọi miễn dịch không nhiễm trùng Miễn dịch học ñại không ñối lập với miễn dịch học cổ ñiển mà phát triển xa sang lĩnh vực khác :Ghép mô, Ghép quan, miễn dịch khối u, xác ñịnh kháng nguyên nhóm máu, phát khiếm khuyết miễn dịch bẩm sinh, bệnh tự miễn Các nguyên tắc miễn dịch học ñại ñược phát nhờ phân tích di truyền chế ngăn cản gép mô, gép quan từ người sang người khác, yếu tố chấn áp phát triển tế bào ưng thư Qua nhiều phân tích cho thấy nguyên nhân thải loại mảnh gép phát sinh tế bào ung thư mang tính di truyền, chế ñào thải chống lại phát triển tế bào ung thư mang tính chất miễn dịch Tuy nhiên miễn dịch học cổ ñiển hay miễn dịch học ñại ñều phận miễn dịch học nói chung miễn dịch học nhiễm trùng ñứng ngang hàng với miễn dịch học gép mô, ñều ñược xây dựng tảng miễn dịch di truyền học 1.3 Phân hạng tính miễn dịch Tính miễn dịch tự nhiên tính miễn dịch thu ñược Miễn dịch tự nhiên Miễn dịch tự nhiên, hay gọi miễn dịch bẩm sinh, tính ñặc hiệu Bắt ñầu xuất tiến hoá từ loài cá, chim, thú ñến loài người Miễn dịch tự nhiên gồm thành viên hàng rào vật lý da, màng nhầy, ñại thực bào, mono bào, tế bào bạch cầu ña nhân, bạch cầu ưa axit chất tiết (cytokin) tế bào Miễn dịch thu ñược Miễn dịch thu ñược hay gọi miễn dịch thích ứng có tính ñặc hiệu cao, có tham gia thụ thể tế bào lympho ñại thực bào Có hai loại tính miễn dịch thu ñược ñó là: - Miễn dịch dịch thể ñược biểu khả phản ứng kháng thể hoà tan, thành phần tiết tế bào lympho B - Miễn dịch qua trung gian tế bào khả ñáp ứng tất tế bào lympho 1.4 Khái niệm kháng nguyên Kháng nguyên (antigen) vật chất sống chết từ môi trường bên lọt vào thể ñộng vật theo nhiều ñường khác Phần lớn chúng có chất protein xa lạ với thể ñộng vật “ Cái tôi” Kháng nguyên từ bên lọt vào thể phần lớn vi sinh vật gây bệnh virus, vi khuẩn, kí sinh trùng Con ñường khác xuất kháng nguyên thể tế bào hay vi cấu trúc thể bị biến ñổi thành xa lạ với thể như: tế bào ung thư, mô lạ thể Kháng nguyên ñặc hiệu (chất sinh miễn dịch) chất có khả kích thích sinh kháng thể ñể chống lại nó, liên kết với kháng thể, thụ thể ñặc hiệu tế bào lympho ðặc ñiểm chung kháng nguyên ñặc hiệu phân tử chúng có kích thước lớn Kích thước lớn mang hết tín hiệu của hệ thống di truyền ngoại lai ðặc ñiểm chung thứ hai phân tử kháng nguyên mang nhóm ñặc hiệu kháng nguyên Chính ñể chống nhóm mà thể ñã sinh trung tâm hoạt ñộng kháng thể Ngoài kháng nguyên phải có cấu trúc phức tạp Như tất chất sinh miễn dịch ñều kháng nguyên, song số chất kháng nguyên lại không gây ñáp ứng miễn dịch Ví dụ hapten chất có trọng lượng phân tử thấp gắn với kháng thể ñặc hiệu không kích thích tạo kháng thể nên kháng nguyên thực thụ 1.5 Khái niệm kháng thể Kháng thể hay gọi Antibody globulin có huyết ñộng vật có khả liên kết ñặc hiệu với kháng nguyên ñã kích thích sinh Kháng thể theo ñịnh nghĩa gọi kháng thể miễn dịch hay kháng thể ñặc hiệu (immunoglobulin) Kháng thể tự nhiên hay gọi kháng thể không ñặc hiệu, có sẵn dịch thể trước tiếp xúc với kháng nguyên sữa, nước tiểu 1.6 Cơ chế bảo vệ không ñặc hiệu 1.6.1 Hàng rào vật lý Bao gồm da niêm mạc ngăn cách nội môi môi trường xung quanh Da: Bao gồm lớp biểu bì lớp mô liên kết tạo hàng rào vật lý ngăn cản xâm nhập vi sinh vật Thông thường vi sinh vật không xâm nhập vào thể mà chủ yếu chúng vào thể qua vết thương, sau ñó vào mạch máu tới quan Niêm mạc: màng bao phủ phận ñường ruột, hô hấp, sinh dục Cũng da niêm mạc bao gồm lớp biểu mô mô liên kết Phía dýới tuyến tiết dịch ñể bắt giữ vi sinh vật Do niêm mạc có ñộ ẩm cao nên số virus, vi khuẩn sống sót ví dụ vi khuẩn gây bệnh giang mai Dịch thể: Nước mắt, nước tiểu dịch thể có khả trôi vi sinh vật 1.6.2 Hàng rào vi sinh vật Phần lớn vi sinh vật ñường tiêu hóa phân bố xoang miệng, vi sinh vật ñường hô hấp, phận sinh dục Bình thường chúng không gây bệnh không xâm nhập vào thể Chúng chiếm vị trí ngăn không cho VSV gây bệnh vào thể 6.3.Hàng rào hóa học ðộ pH: pH thấp ngăn phát triển vi sinh vật Dịch vi: Dịch vị dày với enzym có pH thấp ức chế phát triển vi sinh vật Interferon: (IFN) Là nhóm glucoprotein cảm ứng chứa khoảng 146166 amino acid, chúng xuất tế bào thể người bị nhiễm virus ñể chống lại virus Hiện người ta biết có tới 22 gen nhiều loại tế bào khác người ñại thực bào, tế bào lympho, tế bào thuộc quan lympho trung tâm ngoại vi có khả sản xuất IFN chúng bị nhiễm virus ðến năm 1980 người ta ñã phân lập ñược gen mã hoá tổng hợp ba loại IFN xây dựng công nghệ sản xuất INF phương pháp tái tổ hợp IFN loại protein tương ñối ñơn giản, sản phẩm tế bào sống, nên thân không ñộc Có loại IFN: α, β, γ khác số amino axit hoạt tính sinh học chúng α-IFN bạch cầu sản xuất có virut xâm nhập, β-IFN nguyên bào sợi sản xuất, γ-IFN bạch cầu sản xuất qua phản ứng hệ miễn dịch IFN tác dụng chống virus theo chế sau: - IFN không tác ñộng trực tiếp lên virus, mà tác ñộng lên tế bào ñể tế bào tổng hợp loại protein ñặc biệt, có khả kìm hãm phát triển virus xâm nhập thể cách ngăn cản khởi ñầu dịch mã phá huỷ ARN thông tin virus - IFN có tác dụng ức chế tăng sinh nhanh chóng tế bào ác tính, tác ñộng ngăn cản trình dịch mã tổng hợp protein tế bào - IFN có tác dụng tăng cường biểu glucoprotein MHC lớp I II bề mặt tế bào, tạo ñiều kiện cho tế bào hệ thống miễn dịch nhận diện kháng nguyên virus - IFN với tư cách lymphokin tham gia trình ñiều hoà miễn dịch, thúc ñẩy trình biệt hoá tế bào lympho T, NK, ðTB Interleukin: Interleukin lymphokin bao gồm có Interleukin-1 (IL-1) Interleukin-2 (IL-2) Nó có khả giúp thể ñiều hoà miễn dịch, tăng khả miễn dịch chống ung thư IL-2 cytokin quan trọng ñối với phát triển ñáp ứng miễn dịch thích ứng IL-2 có vai trò hoạt hoá tế bào lympho T Bố thể:là nhón protein huyết thuộc hệ thống miễn dịch bẩm sinh không ñặc hiệu Nó nhóm glucoprotein có tác dụng ức chế phát triển tế bào vi sinh vật Hoạt ñộng bố thể làm tổn thương thành tế bào vi sinh vật gây bệnh sau ñó làm tan tế bào 1.6.4.Hiện tượng thực bào Nhiều loại bạch cầu tham gia vào trình bảo vệ không ñặc hiệu theo ñường thực bào Các tế bào ñều có nguồn gốc từ tế bào nguồn tuỷ xương (hình 1.1) * Bạch cầu hạt: bao gồm bạch cầu trung tính ña nhân, bạch cầu kiềm bạch cầu ưa axit; tế bào bạch cầu hạt thường chứa nhiều hạt sinh chất nhỏ chất khác Bạch cầu trung tính (PMN-polymorphonuclear neutrophile): chứa hạt không bắt màu thuốc nhuộm, ñược tạo thành khối lượng lớn tuỷ xương thường xuyên có máu PMN ñóng vai trò bảo vệ không ñặc hiệu chống nhiễm trùng, chúng có khả thực bào chất lạ kể vi sinh vật phế thải tế bào theo chế hoá ứng ñộng hấp dẫn Bạch cầu ưa kiềm: chứa hạt bắt màu thuốc nhuộm kiềm xanh metylen Bạch cầu ưa axit: phản ứng với thuốc nhuộm axit bắt màu ñỏ với thuốc nhuộm eosin Bạch cầu axit có vai trò cân hoạt ñộng sống bạch cầu kiềm gây ñộc ñối với ấu trùng số ký sinh trùng giun * Bạch cầu không hạt: bao gồm tế bào mono lympho bào Tế bào lympho: bao gồm hai loại tế bào lympho B tế bào lympho T tế bào ñóng vai trò quan trọng ñáp ứng miễn dịch ñặc hiệu Tế bào mono: tế bào ñơn nhân, tiền thân ñại thực bào Khi chui qua mao mạch tới mô bị nhiễm trùng chúng trở thành ñại thực bào ðại thực bào: ðại thực bào tế bào có kích thước lớn, có khả bắt giữ xử lý kháng nguyên với tế bào lympho sản xuất kháng thể ñể dáp ứng miễn dịch ðTB ñóng vai trò quan trọng chống nhiễm virus Nó tiết enzym xytokin gặp virus ðây tín hiệu ñầu tiên ñáp ứng miễn dịch Hoặc vi sinh vật ñược dịch lympho ñưa hạch lympho ñây VSV bị thực bào tiêu diệt * Hệ thống thực bào ñơn nhân (mononuclear phagocyte system): Là mạng lưới bạch cầu ñơn nhân có khả thực bào Dịch chứa hệ thống có nhiệm vụ bắt giữ tiêu diệt vi sinh vật mô tập trung VSV vào hạch lympho ñể tiêu diệt Một số ñại thực bào hệ thống có khả chui khỏi hệ thống ñịnh cư mô, ngược lại số ñại thực bào trạng thái tự chúng di chuyển vào mô bị vi sinh vật xâm nhập Hình 1.1: Các tế bào tham gia ñáp ứng miễn dịch không ñặc hiệu Cơ chế thực bào Cơ chế thực bào gồm bước sau: - Các vi sinh vật gặp thực bào dính vào thành tế bào, thông thường thông qua thụ thể tế bào - Thông qua thụ thể ñại thực bào thâu vi sinh vật vào bên tế bào sau ñó ñóng kín lại tạo không bào tiêu hóa gọi phagosom - Các lysosome tiến ñến dung hợp với phagosome ñể tạo thành phagolysosome Vi sinh vật phagolysosome bị tiêu hoá enzyme có nhiều lysosome - Vật chất sinh sau tiêu hoá vi sinh vật ñược tống nội tiêu bên tế bào Cơ chế chuyển hoá tiêu diệt vi sinh vật tế bào: Các enzyme có lysosome chuyển hoá tiêu diệt tế bào thông qua chế khác nhau: - Tạo thành H2O2, -OH, tác nhân ñộc ñối với vi sinh vật từ oxy phân tử enzyme phụ thuộc oxy lysosome - Sản sinh tác nhân ñộc gốc nitrat, nitrit, halogen, có tác dụng ñộc ñến tế bào ñể tiêu diệt tế bào - Phân giải tế bào nhờ enzyme thuỷ phân phospholipase, lysozyme, ribonuclease, deribonuclease, - Tế bào bạch cầu trung tính tổng hợp nên defensin tiêu diệt tế bào cách tăng khả thấm màng sinh chất tế bào vi khuẩn, nấm ngăn cản nhân lên virus 1.6.5 Sốt Thông thường thân nhiệt ổn ñịnh nhiệt ñộ 370C ðể trùy nhiệt ñộ não có vùng ñồi (hypothalamus) làm nhiệm vụ ñiều hòa nhiệt ñộ thể Sốt tăng nhiệt thể, chế bảo vệ tự nhiên thể thể bị nhiễm khuẩn Sự gia tăng nhiệt ñộ thể làm tăng hoạt ñộng interferon, tăng hoạt tính enzyme làm giảm nồng ñộ sắt tự máu nguồn cung cấp sắt cho sinh trưởng phát triển vi sinh vật Cơ chế sốt: ðại thực bào sau tiêu hoá vi sinh vật giải phóng chất gây sốt kích thích tế bào sinh IL-1, chất có nhiệm vụ kích thích vùng ñồi tiết prostaglandin ñiều chỉnh cho nhiệt ñộ thể tăng lên Khi nồng ñộ IL-1 máu giảm thể ñáp ứng cách giãn mạch máu tiết mồ hôi ñể hạ nhiệt ñến nhiệt ñộ bình thường thể Một số chất gây sốt như: Polysaccarit, Peptidoglycan nội ñộc tố ngoại ñộc tố gây sốt ñặc hiệu ví dụ ñộc tố phá huỷ hồng cầu Streptococcus pyogenes 1.6.6.Viêm cấp không ñặc hiệu Viêm gì? Viêm ñược tạo thành ñể khu trú vi sinh vật vào nơi không cho chúng lan rộng thêm Bốn triệu chứng viêm ðỏ: bạch cầu kiềm tế bào mast tiết chất hoạt mạch chẳng hạn histamin làm dãn mạch làm cho máu dồn nơi vết thương nhiều Nóng: hậu dãn mạch, dòng máu tăng lên vị trí nhiễm trùng làm nhiệt ñộ tăng lên Sưng: tính thấm thành mạch tăng, tiết dịch tập trung quanh tế bào mô Tính thấm tăng dẫn ñến xuyên mạch tế bào trung tính ñại thực bào tới ổ dịch làm nhiệm vụ thực bào ðau: trường hợp bị viêm, tế bào máu bị tan, khởi ñộng số tế bào tiết prostaglandin kích thích thần kinh gây ñau Hình 6.8 Kỹ thuật huỳnh quang miễn dịch trực tiếp Mô phương pháp huỳnh quang gián tiếp Bước 1:Cố ñịnh tiêu phiến kính Bước 2: Tráng kính vơí kháng thể ñặc hiệu ñể tạo phức hợp KN-KT Bước 3:Tráng kháng thể ñặc hiệu với kháng thể có gắn với thuốc nhuộm huỳnh quang Bước 4:Soi ñọc kết ñèn hyùnh quang (ñèn UV) 7.3 Thí nghiệm miễn dịch phóng xạ Nguyên tắc: Về nguyên tắc tương tự huỳnh quang miễn dịch, khác kháng nguyên kháng thể ñựơc ñánh dấu chất phóng xạ (126I ) Thí nghiệm Rosalyn Yalow ñề nghị năm 1960 ñể xác ñịnh nồng ñộ insulin huyết tương Nhờ phát minh mà bà ñã nhận giải thưởng Noben năm 1977 Ngày phương pháp ñược sử dung ñể xác ñịnh hoocmon, globulin miễn dịch, kháng nguyên virus Các bước tiến hành - Lấy lượng xác kháng nguyên có ñánh dấu chất phóng xạ (ví dụ 126I ) - Cho lượng kháng nguyên ñánh dấu nói tác dụng ñặc hiệu với lượng kháng thể vừa ñủ - Rửa kháng ngyuyên ñánh dấu không bắt cặp với kháng thể - ðo ñộ phóng xạ phức chất kháng nguyên ñánh dấu - kháng thể (A) - Cũng thí nghiệm ñây ta thêm lượng kháng nguyên huyết có ñặc tính tương tự kháng nguyên ñánh dấu Do cạnh tranh mà kháng nguyên kết hợp ñặc hiệu với kháng thể, sau ñó lượng kháng thể dư kết hợp với kháng nguyên ñánh dấu - Rửa kháng nguyên ñánh dấu không bắt cặp với kháng thể - ðo ñộ phóng xạ phức kháng nguyên ñánh dấu với kháng thể lại (B) - Từ giá trị A&B ta tính ñược nồng ñộ kháng nguyên huyết cần nghiên cứu 7.4 Kỹ thuật chất hấp phụ miễn dịch gắn enzym (ELISA - Enzyme Linker Immunosorbent Assay) Những xét nghiệm hấp phụ miễn dịch gắn enzyme kỹ thuật nhạy ñơn giản, cho phép xác ñịnh kháng nguyên kháng thểầm có nồng ñộ thấp (khoảng 0,1 mg/ml) So với phương pháp miễn dịch phóng xạ phương pháp ñơn giản rẻ tiền an toàn mà ñảm bảo ñộ xác Các xét nghiệm ñược tiến hành nhựa polystyren có 96 giếng ñáy bằng, thể tích giếng khoảng 200 µl Nguyên tắc chung kỹ thuật ELISA: Nguyên tắc chung kỹ thuật ELISA tạo liên kết ñặc hiệu kháng nguyên kháng thể Sự liên kết ñó cho phép xác ñịnh có mặt kháng thể kháng nguyên Người ta sử dụng kháng thể gắn cộng hợp enzym sau ñó bổ sung chất, enzym thủy phân chất tạo thành chất làm thay ñổi màu dung dịch Tùy thuộc vào cường ñộ màu dung dịch ta suy nồng ñộ kháng nguyên kháng thể cần nghiêm cứu Các enzyme thường dùng là: (galactosidase; glucoxydase; akanline phosphotasen, ) Ngoài ñể tăng ñộ nhạy phương pháp người ta sử dụng hệ thống công hợp biotin -avidin, biotin -sprept Hệ thống cộng hợp miễn dịch biotin - avadin Biotin ( vitaminH) ñược tổng hợp từ sinh vật thực vật có trọng lượng phân tử khoảng 244Da Biotin có lực với avidin (là chất có nhiều lòng trắng trứng) Avidin có vị trí phân tử liên kết với biotin, biotin dễ dàng kết hợp với protein: kháng thể, enzyme loại kháng nguyên khác Phương pháp nâng cao ñộ nhạy xét nghiệm ñặc biệt xét nghiệm miễn dịch mà kháng nguyên pha rắn Hệ thống cộng hợp miễn dịch biotin - strept Người ta tìm thấy chất hoạt tính tương tự avidin từ xạ khuẩn ta có hệ thống cộng hợp miễn dịch biotin - strept xét nghiệm miễn dịch Hệ thống cộng hợp miễn dịch biotin - strept (avidin) dùng xét nghiệm miễn dịch ñặc biệt vai trò avidin strept avidin thay ñổi cho Ngày kít ñã ñược chế tạo từ hãng tiếng giới Các kháng nguyên kháng thể cần xác ñịnh ñược hấp phụ trực tiếp gián tiếp lên bề mặt giếng nhựa Sau ñó mặt phẳng giếng ñược bao phủ loại ñệm chứa protein, thường gelatin BSA ñể ngăn ngừa liên kết không ñặc hiệu ñối với nhựa Có nhiều kỹ thuật ELISA , dưói ñây trình bày kỹ thuật ELI AE tóm bắt kháng ngyuên ELISE cạnh tranh (hình 7.9) Hình 7.9: Kỹ thuật ELI SA 7.5.1 Phương pháp ELI SA tóm bắt khánh nguyên (bánh kẹp) Phương pháp dùng ñể xác ñịnh chất có phân tử lượng lớn nguyên tác kháng thể gắn lên chất mang (thành giếng) Người ta bổ sung KN, kháng thể thứ ñể KT2 kết hợp với KN (cần phân tích) dạng bánh kẹp Sau ñó rửa trôi phần không bắt cặp bổ sung kháng thể cộng hợp enzyme, chất Enzyme chuyển chất thành hợp chất màu ñược xác ñịnh phổ kế Từ nồng ñộ chất màu ta tính ñược nồng ñộ chất cần phân tích Bước 1: Nhỏ KT1 vào giếng ñể cho KT1 bám vào thành giếng (antitoxin) KT1 Bước 2: Che protein Protein Bước 3: Nhỏ kháng nguyên ñặc hiệu (toxin) ñể KN bắt cặp với KT1 Kháng nguyên Bước 4: Bổ sung KT2 ñể tạo phức hợp KT1-KN-KT2 KT2 Bước 5: sung kháng thể cộng hợp enzym ñể enzym ( KT.E) ñể lạo phúc hợp KT1-KN-KT2- KT E KH-E Bước 6: Bổ sung chât ñể enzym thủy phân chất tạo thành chất màu - Cơ chất Bước 7: Enzym chuyển chất thành hợp chất màu xanh Cơ chất Màu dung dịch phát mắt phổ kế, từ mật ñộ quang ta tính ñược nồng ñộ kháng nguyên ( nồng ñộ ñộc tố) 7.4.2 Phương pháp ELISA cạnh tranh Nguyên tắc: Cộng hợp kháng nguyên protein (hepten) ñược cố ñịnh bề mặt chất rắn Cho lượng kháng nguyên tự kháng thể cộng hợp enzyme vào Kháng nguyên cố ñịnh kháng nguyên tự cạnh tranh bám vào kháng thể Lượng kháng nguyên tự nhiều kháng thể bị kháng nguyên cố ñịnh giữ lại Sau rửa trôi chất dư, bổ sung chất ñể enzyme phân huỷ thành hợp chất màu Màu dung dịch phát phổ kế, từ mật ñộ quang A1, A2 mẫu chứng mẫu nghiên cứu ta tính ñược nồng ñộ kháng nguyên (nồng ñộ ñộc tố) theo công thức C= A1 − A2 100;% A1 Trong ñó: A1 mật ñộ quang mẫu chứng A2 Mật ñộ quang mẫu nghiên cứu Nếu C ≥ 50% ñược coi dương tính Những test thường sử dụng: Các enzyme ñược dùng ñặc biệt nhiều test nhanh spot test , dip test Ưu ñiểm test ñễ sử dụng, rẻ tiền nhanh ñộ nhạy cao Tuy nhiên sử dụng test người nghiên cứu cần phải hiểu rõ nghiên cứu cử ñể sử dụng test cho thích hợp Ứng dụng: Kỹ thuật dùng ñể ñịnh tính ñịnh lượng chất có phân tử lượng nhỏ, ñộc tố nấm mốc, dư lượng thuốc trừ sâu, dư lượng chất kháng sinh Các bước thực hiện: Bước 1: Gắn cộng hợp SBA-afatoxi B1(AFB1) (A FB cố ñịnh protein hapten - SBA) AFB BS A AFB1 AFB1 BSA AFB1 BSA BSA Cộng hợp protein (BSA) kháng nguyên (AFB) Bước 2: Tráng giếng protein AFB BS A AFB BS A Protein tráng giếng Bước 3: Cho tiếp cộng hợp kháng thể gắn enzyme vào mẫu xét nghiệm mẫu chứng ñể tạo phức hợp KN-.KT.E,KN cố ñịnh - KT AFB BS A AFB BS A Kháng thể cộng hợp enzyme Mẫu chứng A FB Trong mẫu xét nghiệm, kháng nguyên tự nhiều kháng thể gắn với kháng nguyên cố ñịnh AFB BS A B1 Kháng thể cộng hợp enzyme, kháng nguyên A FB BS A Mẫu nghiên cứu có có A FB tự Bước 4: Rửa trôi kháng thể không bắt cặp với kháng nguyên cố ñịnh mẫu chứng mẫu nghiên cứu Như mẫu chứng kháng nguyên tự nên kháng thể cộng hợp bị kháng nguyên cố ñịnh giữ lại nhiều AF BS AF BS AF BS Mẫu ñối chứng mẫu nghiên cứu sau rủa trôi AF BS Bước 5: Bổ sung chất AF BS AF BS AF BS AF Cơ chất BS Bước 6:Cơ chất bị enzyme phân huỷ thành hợp chất có màu xanh AF BS AF BS AF BS AF BS Mẫu chứng có màu ñậm mẫu nghiên cứu 7.5 Kỹ thuật thấm miễn dịch Ứng dụng: Kỹ thuật dùng nhiều chuẩn ñoán nhiễm HIV, nhiễm khuẩn xác ñịnh kháng thể ñơn dòng Kỹ thuật gồm nhiều bước ñược tổng hợp phương pháp (ñiện di SDS- Page, wethern bot, ELISE) - ðiện di protein gel acrylamit ñể tách protein - Chuyển protein từ bảng gel lên màng lai (nitroxenlulose) - Phủ huyết chứa kháng thể lên màng lai tiến hành lai - Rửa kháng thể không bắt cặp kháng nguyên màng lai ( proten) - Thêm kháng kháng thể cộng hợp enzym ñể kháng thể phản ứng với phức hợp (kháng nguyên - kháng thể) - Bổ sung chất ñể enzyme thủy phân chất thành dung dịch màu - Xác ñịnh nồng ñộ kháng thể huyết thông qua việc ño màu dung dịch phổ kế 7.6 Phương pháp sắc ký lực miễn dịch Thông thường ñộc tố nấm mốc (AFB1) nông sản thực phẩm thấp (ở dạng lượng vết) ðể ñịnh lượng với ñộ xác AFB1 ta cần phải làm giàu mẫu phương pháp sắc ký lực miễn dịch Sắc ký lực miễn dịch ñược dựa phản ứng ñặc hiệu kháng thể kháng nguyên (AFB1) Phương pháp ñặc hiệu mà ñơn giản, dễ thực không ñộc hại cho người sử dụng Nguyên lý sắc ký lực miễn dịch Cột sắc ký lực miễn dịch ñược minh hoạ hình 7.10 Trên hạt gel kháng thể ñặc hiệu với chất cần phân tích ñược gắn cách bền vững không hoạt tính Các hạt gel ñược nhồi cột nhỏ (cột sắc ký) Khi cho dịch chiết mẫu qua cột chất cần phân tích (kháng nguyên) bị kháng thể giữ lại Sau toàn mẫu ñã qua cột, ta rửa cột ñể loại bỏ phần không bắt cặp ñặc hiệu với kháng thể Sau ñó sử dụng dung môi ñể kéo kháng nguyên khỏi kháng thể Dung dịch thu ñược, xác ñịnh phương pháp ELISA số phương pháp phân tích khác Hình 7.10: Cột sắc ký lực miễn dịch 7.7 Phương pháp ñiện di miễn dịch 1- ðiện di khuyếch tán miễn dịch Nguyên tắc Kỹ thuật dựa tượng khuyếch tán kháng nguyên kháng thể khuyếch tán tự nhiên mà người ta sử dụng dòng ñiện ñể hướng dẫn cho kháng nguyên kháng thể gặp nhanh Kháng nguyên chuyển ñộng từ cực âm sang cực dương, kháng thể chuyểng ñộng ngược lại cho ñến kháng nguyên gặp kháng thể tạo thành vòng cung kết tủa nhìn ñược mắt thông qua thuốc nhuộm ñặc hiệu Cách thực - Chuẩn bi gel agar gel agarose (1% ñệm barbitone pH = 8,2) - Trải gel phiến kính dày khoảng 3mm - ðục hai giếng cách khoảng 1cm theo chiều dài phiến kính - Chuyển phiến kính vào buồng ñiện di có chứa dung dịch ñệm barbitone pH = 8,2 - Cho mẫu phân tích chứa kháng nguyên phía cực âm ( khoảng 5÷10µl) - Cho lượng tương ứng kháng thể phía cực dương - Tiến hành ñiện di ñiện 8v/1cm vòng 30 phút - Nếu có phản ứng kháng nguyên kháng thể xuất vòng cung kết tủa nhìn ñược mắt thông qua thuốc nhuộm CBB, 0,025% (Coomassie briliant blue) 2- ðiện di hội tụ ñẳng ñiện Kỹ thuật cho phép tách biệt ñược protein theo ñiểm ñẳng ñiện chúng vị trí pH khác gel Gradient pH ñược tạo gel ñược hình thành cực âm cực dương trình ñiện di Kết protein di chuyển sức hút nhóm ñiện tích ñối với cực dương cực âm cho ñến protein khác biệt ñiện tích ñạt tới ñiểm ñẳng ñiện chúng dừng lại Dãy pH gel ñược trì ổn ñịnh ta sử dụng hợp chất ñiện di lưỡng tính ñược gọi ampholit mang Những ion lưỡng tính có ñiểm ñẳng ñiện xác ñịnh ñược lựa chọn phân bổ ñều thành dãy pH mong muốn Hỗn hợp ampholit ñược bán sẵn từ hãng tiếng gới Người ta sử dụng gel polyacrylamit ñể ñiện di, ñối với phân tử kồng kềnh ta sử dụng gel agarose Sau chuẩn bị xong: mẫu phân tích, khuôn gel, ta ñặt vào buồng ñiện di, nối ñiện cực vào nguồn tiến hành ñiện di Thời gian ñiện di phụ thuộc vào thang pH, thường người ta ñiện di qua ñêm nhiệt ñộ 40C 3- ðiện di hai chiều (2D-Page) ðiện di hai chiều gel polyacrylamit ñược dùng ñể mô tả phương pháp tách tách phân tử protein theo hai chiều ðiện di chiều có ñộ phân giải cao, bao gồm có ñiện di hội tụ ñiện di protein SDS - Page ðiện di hai chiều công cụ hữu íc nghiên cứu nghiên cứu lâm sàng Nhờ ñiện di hai chiều (2D-Page) kháng thể tinh chế ñược chuyể thấm miễn dịch ñể phát kháng nguyên epitop tương ứng ðiện di hai chiều kết hợp với nhuộm bạc cho phép ñánh giá xác mức ñộ tinh loại protein ñịnh.(xem phần mô phỏng) + Yêu câu pyê [...]... Các phân tử có khối lượng nhỏ hơn 5 00 0Da không hoạt ñộng như một kháng nguyên (penixilin, aspirin không có tính sinh miễn dịch) Từ 6000-1000 0Da có thể có hoặc không có khả năng sinh miễm dịch ví dụ như insulin thì không có khả năng ñáp ứng miễn dịch Từ 10000- 14000 là kháng nguyên yếu trừ khi chúng ñược gắn với các trợ chất Giới hạn phân tử lượng 40000- 5000 0Da là kháng nguyên mạnh Kích thước phân... nhiên kháng nguyên có thể vào cơ thể bằng nhiều con ñường khác nhau: như qua niêm mạc ñường hô hấp, sinh dục, qua da Tuy nhiên, người ta có thể chủ ñộng tiêm kháng nguyên vào da dưới da hoặc trong bắp thịt hay qua ñường tĩnh mạch ñể giúp kháng nguyên nhanh chóng tiếp cận với hệ thống miễn dịch - Nếu tiêm qua da, cơ bắp có ñáp ứng miễn dịch tế bào - Tiêm qua tĩnh mạch có ñáp miễn dịch dịch thể Nguyên tắc...CHƯƠNG 2 CHẤT SINH MIỄN DỊCH VÀ KHÁNG NGUYÊN 2.1 Chất sinh miễn dịch và kháng nguyên Cần phải phân biệt các phân tử có tính kháng nguyên và các phân tử có tính sinh miễn dịch (immunogen) Chất sinh miễn dịch là chất khi ñi vào cơ thể ñộng vật ở ñiều kiện thích hợp có khả năng gây ñáp ứng miễn dịch Tuy nhiên... protein có cấu trúc phức thì sẽ trở thành chất sinh miễn dịch Ngoài 3 ñiều kiện trên khả năng sinh miễn dịch ñộ mạnh yếu của kháng nguyên cũng phụ thuộc vào cả dạng thể hiện và cách thức xâm nhập vào cơ thể của kháng nguyên ðường vào của kháng nguyên theo ñường tĩnh mạch hoặc qua khoang bụng thì tốt hơn ñường dưới da hoặc cơ Trợ chất có tác dụng kéo dài sự tiếp xúc của kháng nguyên có hiệu quả vì vậy việc... bề mặt tế bào của nhiều loại ñộng vật hoặc chủng vi sinh vật khác nhau Kháng thể ñược tạo thành chống lại kháng nguyên của loài này cũng có thể phản ứng chéo với kháng nguyên của loài khác Tự Kháng nguyên: Là thành phần vốn có của cõ thể, nhưng trong ñiều kiện nhất ñịnh cơ thể coi là vật lạ và sinh ra kháng thể chống lại chúng 2.4.3 Kháng nguyên vi sinh vật Kháng nguyên vi khuẩn: Thành phần của kháng... tiết ra bên ngoài từ tế bào vi sinh vật Kháng nguyên không hòa tan: Là thành phần của tế bào vi sinh vật, các ñộc tố khi mất tính ñộc vẫn dữ nguyên tính kháng nguyên nhưng không gây bệnh Ví dụ giải ñộc tố bạch hầu uốn ván ñựơc dùng ñể chế vaccine Kháng nguyên virus: Có hai nhóm chính Kháng nguyên V: Là một phần hoặc toàn bộ hạt virut nguyên vẹn có khả năng kích thích sinh kháng thể trung hòa virus... phức tạp: Một chất sinh miễn dịch phải có cấu trúc phân tử phức tạp, kháng nguyên càng phức tạp thì tính miễn dịch càng cao Ví dụ như là polylizin là một polyme có khối lượng phân tử là 3000 0Da nhưng không gây ñáp ứng miễn dịch vì cấu trúc ñơn giản Ngược lại hapten có khối lượng phân tử nhỏ và không có tính miễn dịch nhưng khi gắn với protein có cấu trúc phức thì sẽ trở thành chất sinh miễn dịch Ngoài... lại những chất chiết từ tuyến ức, thì sự thiếu hụt miễn dịch sẽ ñược hồi phục Vào năm 1961 hai nhà khoa học Burnet và Mile ñã xác minh vai trò của tuyến ức bằng thực nghiệm là cắt bỏ tuyến ức ở chuột mới sinh Sau khi bị cắt, chuột nhắt không ñược hoàn hảo về mặt miễn dịch cho ñến lúc chết Chúng chậm lớn, da bị viêm, tăng nhạy cảm với bệnh nhiễm khuẩn, kháng thể hình thành kém, tế bào lympho trong máu... thích sẽ tăng sinh Khi có KN kích thích tăng sinh tế bào plasma và tế bào nhỏ Sản ra lymphokin Thể hiện quá mẫn muộn Hỗ trợ tế B sản xuất KT(TH) Kiểm tra ñáp ứng miễn dịch (TC) Thời gian sống: nhiều tháng ñến nhiều năm Thời gian sống lâu: nhiều tháng ñến nhiều năm Thời gian sống ngắn: nhiều ngày ñến nhiều tuần 1- Quá trình biệt hóa tế bào T Tế bào lympho T bắt nguồn từ tế bào gốc của tuỷ xương sinh ra tế... nucleid hoặc là kháng nguyên ñược tách từ tế bào chủ ñã bị nhiễm virus 2.5 Vacxin và tá chất Vacxin ? Vacxin là chất liệu chế từ các vi sinh vật hoặc các kháng nguyên ñặc hiệu của chúng ñể ñưa vào cơ thể người hay ñộng vật ñể gây miễn dịch chủ ñộng cho cộng ñồng do chính các vi sinh vật tương ứng gây ra Tiêu chuẩn chấp nhận cho một vacxin là: - Tuyệt ñối an toàn và vô trùng khi sử dụng với khối lượng lớn