Buoi 2 1HH aa và protein

HÓA HỌC ACID AMIN VÀ PROTEIN MỤC TIÊU: Phân loại viết công thức 20 acid amin thường gặp phân tử protein Trình bày nguyên tắc phân tích hỗn hợp acid amin phương pháp sắc ký giấy, sắc ký trao đổi ion, điện di giấy Mô tả dạng liên kết cấu trúc peptid protein, bậc cấu trúc tính đặc hiệu protein 4.Liệt kê số peptid có hoạt tính sinh học Trình bày bước xác định thứ tự acid amin chuỗi peptid Trình bày phân loại chức protein DÀN BÀI 1.ĐẠI CƯƠNG 2.ACID AMIN 3.PEPTID 4.PROTEIN ĐẠI CƯƠNG Protein: - hợp chất hữu có trọng lượng phân tử cao - tạo thành từ nhiều đơn vị acid amin kết hợp với liên kết peptid Vai trò: - cấu tạo: Protein thành phần tế bào, nguyên liệu cần thiết để tổ hợp thành phần cấu trúc thể - hóa sinh: enzyme, xúc tác trình chuyển hóa thể sinh vật • Acid amin (aa): đơn vị cấu tạo nhỏ protein • Peptid: phân tử gồm từ – vài chục aa (< 50) • Protein: phân tử gồm từ > 50 aa tới ngàn aa ( có vài chục ngàn) Cấu trúc phức tạp ACID AMIN • Acid amin (aa) sản phẩm thủy phân cuối peptid protein • Các dạng protein khác loài sinh vật (virus, vi khuẩn, thực vật, động vật) xây dựng 20 aa gọi 20 aa chuẩn hay aa thường gặp phân tử protein • Trong 20 aa này, - thể không sản xuất số aa, aa lại cần cho tăng trưởng, nên phải cung cấp từ thức ăn gọi aa cần thiết - Những aa mà thể tổng hợp gọi aa không cần thiết • Ngoài có - số aa gặp phân tử protein (chỉ gặp số protein định) -và nhiều aa không gặp phân tử protein (chúng dạng tự kết hợp không thấy thành phần phân tử protein) 2.1 Cấu tạo hóa học Công thức acid - amin Một số aa có nhóm amin không gắn vào carbon , mà gắn vào carbon , … Hầu hết aa thường gặp tự nhiên thuộc loại acid - amin 2.2 Phân loại  Dựa vào tính phân cực aa không phân cực Alanin Isoleucin Leucin Methionin Phenylalanin Prolin Tryptophan Valin aa phân cực Arginin Asparagin Acid aspartic Acid glutamic Cystein Glutamin Glycin Histidin Lysin Serin Threonin Tyrosin 10 Insulin 48 PROTEIN Gồm hàng trăm đến hàng nghìn aa 4.1 Các bậc cấu trúc protein I II III IV 49 4.2 Phân loại - Theo nguồn gốc: protein động vật, protein thực vật - Theo hình dạng:  Protein cầu: albumin, globulin, insulin, enzym…  Protein sợi: collagen, keratin, myosin…  Protein trung gian: fibrinogen - Theo thành phần hóa học: - Protein thuần: phân tử toàn aa - Protein tạp: aa có chất khác protein gọi nhóm ngoại 50 Protein có Albumin sữa, trứng, huyết Globulin huyết thanh, mô dịch sinh vật Protamin (pro kiềm) tế bào trứng Histon (pro kiềm) nhân tế bào động vật Keratin long, tóc, móng, sừng (cys nhiều) Collagen mô liên kết Prolamin glutelin (pro thực vật) hạt Protein tạp nhóm ngoại Ví dụ Nucleoprotein acid nucleic nucleohiston Glucoprotein glucid hay dẫn xuất glucid mucoprotein Cromoprotein chất màu hemoglobin Lipoprotein lipid Phosphoprotein acid phosphoric casein sữa Metaloprotein kim loại (Fe, Cu, Zn, Mg…) ferritin 51 4.3 Tính chất lý hóa protein 4.3.1 Trọng lượng phân tử • Protein phân tử keo có kích thước lớn (> 0,001 µm), khuếch tán chậm dung dịch không qua màng thẩm tích • TLPT > 6.000 • Phương pháp siêu ly tâm phân tích: xác định trọng lượng phân tử protein 52 4.3.2 Sự hòa tan kết tủa protein Trong dung dịch: - lớp áo nước: protein hydrat hóa (các phân tử nước bám vào nhóm ưa nước –NH2, -COOH… phân tử protein) - tích điện dấu: phân tử protein đẩy yếu tố Protein khó kết tủa dung dịch protein vững bền Nếu hai yếu tố protein kết tủa 53 Làm lớp áo nước: -dùng chất hút nước (alcol, aceton, sulfat amon…) -hoặc làm biến tính protein: + acid (acid nitric, acid sulfuric, acid trichloracetic…) + muối kim loại nặng Làm điện tích protein: - điều chỉnh pH dung dịch pHi - thêm muối vào dung dịch (ví dụ NaCl) 54 4.3.3 Sự biến tính protein Tia X, acid, base, kim loại nặng, nhiệt độ… Protein dễ bị biến tính Mất tính chất ban đầu (độ tan giảm, tính chất sinh học) Đứt liên kết hydro, liên kết muối… Cấu trúc protein bị đảo lộn (các nhóm kỵ nước quay ngoài, nhóm ưa nước quay vào trong) Sự hydrat hóa giảm, độ tan giảm Protein dễ kết tủa 55 Không thuận nghịch thuận nghịch - Biến tính thuận nghịch (sự hoàn nguyên): Ví dụ: trypsin 90oC/ pH = bị biến tính khả thủy phân liên kết peptid; làm lạnh trở lại cấu trúc ban đầu có hoạt tính enzyme Biến tính không thuận nghịch: Ví dụ lòng trắng trứng đun sôi 56 Ứng dụng:  Để đề phòng biến tính chiết xuất tinh chế protein, phải thực điều kiện thích hợp  Bảo quản protein nhiệt độ thấp (0 – 40oC), nhiệt độ dung dịch protein bị biến tính Tốt bảo quản dạng đông khô  Trong kỹ thuật xét nghiệm sinh hóa người ta khử tạp loại bỏ protein cách kết tủa protein acid tricloacetic, sulfosalycilic hay muối 57 kim loại nặng 4.3.4 Tính chất lưỡng tính Mỗi protein có pHi riêng biệt Ở pH môi trường định, protein tùy thuộc vào pHi chúng mà tích điện dương hay âm di chuyển phía cực trái dấu điện trường Ứng dụng: kỹ thuật điện di để tách protein hỗn hợp nhiều protein Ví dụ: điện di protein huyết 58 4.3.5 Tính chất hóa học - Protein bị thủy phân dở dang thành peptid thủy phân hoàn toàn thành aa nhờ enzym hay acid, base nhiệt độ cao - Protein tạo màu phản ứng biuret Do dùng phản ứng để định lượng protein phương pháp so màu - Các gốc aa phân tử protein cho phản ứng đặc trưng aa tự tương ứng 59 4.4 Chiết xuất tinh chế protein Tránh làm biến tính protein Thông thường gồm giai đoạn sau: - Nghiền nát nguyên liệu - Chiết nước, dung dịch muối NaCl đẳng trương (NH4)SO4 - Dùng phương pháp sắc ký, điện di, siêu ly tâm phân tách để tách phân đoạn protein mong muốn - Tinh chế phân đoạn thu phương pháp thích hợp - Kiểm tra lại độ tinh khiết protein sau tinh chế 60 4.5 Chức protein - Chức xúc tác: enzym, xúc tác phản ứng hóa học xảy tế bào - Chức vận chuyển: ví dụ, hemoglobin vận chuyển oxy, lipoprotein vận chuyển lipid - Chức vận động: actin myosin tạo co - Chống đỡ học: mô liên kết mô xương - Chức bảo vệ: +globulin miễn dịch protein kháng thể bảo vệ thể chống lại protein lạ, virus, vi khuẩn +Interferon protein tế bào động vật có xương sống tiết chống lại nhiễm virus 61 - Tạo dẫn truyền xung động thần kinh: rhodopsin protein nhận ánh sáng có tế bào hình que màng lưới mắt người động vật có vú - Chức điều hòa: số protein có chức điều hòa trình chuyển hóa (các hormon), trình truyền thông tin di truyền (các protein kìm hãm) - Chức dự trữ, dinh dưỡng: feritin dự trữ sắt gan, lách; ovalbumin lòng trắng trứng, gliadin hạt lúa mì; casein sữa./ 62 [...]... (pHi) 25 Ứng dụng: điện di ví dụ: pH 3,9 aa 1 ,2 có pHi > 3,9; aa 3,4 có pHi < 3,9 26 2. 6 Tính chất hóa học của aa 2. 6.1 Hóa tính do chức α-amin 2. 6.1.1 Phản ứng với acid nitơ (HNO2) R - CH – COOH + HNO2 NH2 (trừ prolin và hydroxyprolin là 2 acid imin) R - CH – COOH + N2 + H2O OH 2. 6.1 .2 Phản ứng với aldehyd (phản ứng tạo base Schiff) R - CH – COOH + HCHO R - CH – COOH + H2O aldehyd NH2 N = CH2 Base... polypeptid 29 26 .2 Hóa tính của nhóm carboxyl 2. 6 .2. 1 Phản ứng khử nhóm carboxyl (Sodium borohydride NaBH4) R - CH – COOH R - CH – CH2 - OH NH2 NH2 Alcol α-amin 2. 6 .2. 2 Phản ứng khử carboxyl -CO2 R - CH – COOH R – CH2 – NH2 Decarboxylase NH2 amin 30 2. 6.3 Hóa tính do 2 chức - NH2 và –COOH (phản ứng với ninhydrin) Phức hợp xanh tím Phản ứng này được áp dụng rộng rãi để định tính và định lượng aa, đặc biệt... được dùng làm gia vị 2. 4.3 Tính quang hoạt Trừ glycin ra, các aa khác đều có tính quang hoạt do có C* 2. 4.4 Phổ hấp thụ -Tyr, Trp và Phe hấp thụ mạnh ở vùng cực tím (24 0 – 28 0 nm) - Cys hấp thụ yếu ở λ = 24 0 nm - Các aa khác hấp thụ ở λ = 22 0 nm - Phần lớn các protein đều chứa tyr nên người ta thường dựa vào tính chất này để định lượng protein ở λ = 28 0 nm 23 2. 5 Tính lưỡng tính của aa Nhóm -COOH: thể... (Gln, Q) 13 2. 2.1.3 Acid amin kiềm • R có 1 nhóm amin Lysin (Lys, K) Arginin (Arg, R) 14 2. 2 .2 Acid amin mạch vòng 2. 2 .2. 1 Acid amin có nhân thơm Phenylalanin (Phe, F) Tyrosin (Tyr,Y) 2. 2 .2. 2 Acid amin chứa dị vòng R có nhân imidazol Tryptophan (Trp, W) R có nhân indol Prolin (Pro, P) Histidin (His, H) Lưu ý: Cystin 16 Ngoài 20 aa trên, còn có một số aa hiếm gặp trong phân tử protein ( aa không chuẩn),... CH2 – CH2 – COOH CH2 – CH2 – CH2 - COOH NH2 acid β-alanin NH2 acid γ-aminobutyric Thyroxin 18 2. 3 Hóa học lập thể của aa R- HC* – COOH NH2 Trừ glycin ra, các aa khác đều có ít nhất 1 C bất đối, do đó đều có tính quang hoạt: quay phải: (+), quay trái: (-) Các dạng đồng phân lập thể (cấu hình L hoặc D): COOH H2N - C* - H COOH H - C* - NH2 CH2OH CH2OH L-serin D-serin 19 Các aa thường gặp trong phân tử protein. .. là L -aa D -aa chỉ gặp ở thành tế bào một số vi sinh vật (ví dụ: D-glutamin ở vỏ vi khuẩn B subtilis) Các aa tổng hợp bằng phương pháp hóa học (dạng tiêm truyền) thường ở dưới dạng đồng phân tử của 2 đồng phân D và L và được ký hiệu là D,L -aa 20 Số đồng phân lập thể (ĐPLT): 2n (n là số C*) Đa số các aa thường gặp chỉ có 1 C*, do đó có 2 ĐPLT Riêng threonin và isoleucin có 2 C* nên có 4 ĐPLT H NH2 H3C...Dựa vào gốc R: aa mạch thẳng và aa mạch vòng 2. 2.1 Acid amin mạch thẳng 3 nhóm tùy theo số nhóm –COOH và -NH2 có trong phân tử 2. 2.1.1 Acid amin trung tính (monoamin monocarboxylic acid) •R là chuỗi hydrocarbon no: (Gly or G) 11 • R có nhóm OH: Serin (Ser, S) Threonin (Thr, T) • R có chứa S: (Cys, C) Methionin (Met, M) 12 2 .2. 1 .2 Acid amin acid • R có 1 nhóm carboxyl:... Schiff 27 2. 6.1.3 Phản ứng với 2, 4 dinitrofluorobenzen (DNFB) (Phản ứng Sanger) Môi trường kiềm yếu 2, 4 dinitrophenyl aa (DNP -aa) (màu vàng) Phản ứng dùng để xác định aa N-tận của chuỗi peptid 28 2. 6.1.4 Phản ứng với phenylisothiocyanat (PITC) (Phản ứng Edman) phenylthiocarbamyl aa (PTC -aa) môi trường H+, trong dung môi nitrometan phenylthiohydantoin tương ứng, không màu Phản ứng Edman dùng xác định aa. ..  R mà có nhóm –OH, –COOH và –NH2 thì dễ tan hơn - không tan hoặc ít tan trong alcol - không tan trong ête (riêng prolin và hydroxyprolin thì tan được trong alcol và ête) -Các aa tan trong acid và kiềm loãng thì tạo thành các muối của aa Riêng tyrosin chỉ tan ít trong acid và kiềm loãng 22 2. 4 .2 Vị - Các aa thường có vị ngọt kiểu đường - Leucin không vị - isoleucin và arginin có vị đắng - Muối natri... phương pháp sắc ký và điện di 31 2. 6.4 Hóa tính của gốc R Nhóm chức hóa học Phản ứng aa - NH2 và –COOH Lys, Asp, Glu tạo muối – SH Cys oxy hóa khử Nhân thơm Phe và Tyr nitro hóa và halogen hóa –OH alcol Ser và Thr este hóa –OH phenol Tyr phản ứng đặc hiệu với thuốc thử Millon (HgNO/ HNO3 đđ) cho màu đỏ cam Tóm lại, nhóm R quyết định các phản ứng đặc hiệu của aa 32 2.7 Phân tích một hỗn hợp aa - Phương pháp