Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2016 THOÂNG BAÙO KHOA HOÏC ẢNH HƯỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN CHIẾT XUẤT BẰNG NƯỚC VỚI SỰ HỖ TRỢ SIÊU ÂM ĐẾN HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HÓA CỦA DỊCH CHIẾT TỪ HẢI MIÊN Ircinia mutans EFFECTS OF ULTRASOUND-ASSISTED AQUEOUS EXTRACTION CONDITIONS ON ANTIOXIDANT ACTIVITY OF EXTRACTS FROM MARINE SPONGE Ircinia mutans Huỳnh Nguyễn Duy Bảo1, Nguyễn Khắc Bát2 Ngày nhận bài: 22/01/2016; Ngày phản biện thông qua: 25/5/2016; Ngày duyệt đăng: 15/6/2016 TÓM TẮT Nghiên cứu đánh giá ảnh hưởng điều kiện chiết xuất nước cất với hỗ trợ siêu âm đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ hải miên Ircinia mutans dựa vào hoạt tính khử gốc tự DPPH tổng lực khử Kết nghiên cứu cho thấy tỷ lệ nguyên liệu/nước cất, thời gian, nhiệt độ số lần chiết có ảnh hưởng đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ hải miên Nghiên cứu xác định điều kiện chiết xuất thích hợp để thu dịch chiết từ hải miên có hoạt tính chống oxy hóa cao tỷ lệ nguyên liệu/nước cất: 1/6; thời gian chiết: 15 phút; nhiệt độ chiết: 30oC; số lần chiết: lần Từ khóa: Hải miên, hoạt tính khử gốc tự do, tổng lực khử, hoạt chất sinh học ABSTRACT This study evaluated the influence of aqueous extraction conditions assisted by ultrasound on antioxidant activity of extracts from marine sponge Ircinia mutans through DPPH free radical scavenging activity and total reducing power The results shown that marine sponge-to-distilled water ratio, extraction time, extraction temperature and extraction repetition affected the antioxidant activity of marine sponge extracts The appropriate condition for antioxidant extraction from the marine sponge was sponge-to-distilled water ratio: 1/6; extraction time: 15 min; extraction temperature: 30oC; extraction repetition: times Keywords: Marine sponge, radical scavenging activity, total reducing power, bioactive compounds I ĐẶT VẤN ĐỀ Hải miên nguồn tiềm cho việc nghiên cứu khai thác hoạt chất sinh học tự nhiên có khả ứng dụng y học đa dạng cấu trúc hóa học chất chuyển hóa có chúng Trong năm gần đây, số nghiên cứu phát hợp chất có hoạt tính sinh học từ hải miên chất chống oxy hóa, chất kháng viêm, kháng khuẩn, chống lao, chống ung thư, kháng nấm, chống sốt rét, kháng virus kháng HIV (Mehbub cộng sự, 2014) Hải miên xếp vào nhóm có chứa hoạt chất chống oxy hóa cao số nguồn hoạt chất chống oxy hóa tự nhiên Một số chất chuyển hóa hải miên có hoạt tính Khoa Công nghệ thực phẩm - Trường Đại học Nha Trang Viện Nghiên cứu hải sản Hải Phòng TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2016 chống oxy hóa cao polypeptide, saponin, sterol, flavonoid, glycoside hợp chất phenol (Halliwell, 1994; Chairman Singh, 2012) Ngoài ra, Sato cộng (2006) tìm thấy hợp chất carotenoid, polyphenol, glutathione số loài hải miên, hợp chất có hoạt tính chống oxy hóa cao Việt Nam có điều kiện thuận lợi cho loài hải miên với sinh vật ký sinh chúng phát triển Những nghiên cứu trước công bố có khoảng 201 loài hải miên tìm thấy vùng biển Việt Nam (Thai Minh Quang, 2000) Trong đó, loài hải miên Ircinia spp nhà khoa học quan tâm nghiên cứu khai thác hoạt chất sinh học dịch chiết Để chiết xuất hoạt chất chống oxy hóa từ hải miên đạt hiệu cao, nghiên cứu tiến hành xác định ảnh hưởng điều kiện chiết xuất nước cất với hỗ trợ siêu âm đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ hải miên I mutans nhằm tìm điều kiện chiết xuất thích hợp để thu dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa cao II ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Nguyên vật liệu hóa chất 1.1 Nguyên vật liệu Hải miên I mutans sử dụng nghiên cứu lấy mẫu vùng biển Phú Quốc, tỉnh Kiên Giang (Kumar Pal, 2012) Nghiên cứu Orhan cộng (2012) cho thấy dịch chiết từ loài hải miên Ircinia spinulosa, I fasciculata, and I variabilis có hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm, khử gốc tự 2,2 diphenyl1picrylhydrazine (DPPH) ức chế acetylcholinesterase Hoạt tính kháng khuẩn dịch chiết từ hải miên I mutans Nazemi cộng (2014) công bố protein có hoạt tính kháng khuẩn phân lập từ hải miên Salehi cộng (2014) Nhìn chung, công bố nghiên cứu hoạt tính chống oxy hóa hải miên I mutans hạn chế Để khai thác hiệu nguồn tài nguyên quý giá này, việc nghiên cứu tách chiết hoạt chất sinh học từ hải miên I mutans vùng biển Việt Nam cần thiết Huỳnh Nguyễn Duy Bảo Nguyễn Khắc Bát (2015) nghiên cứu ảnh hưởng loại dung môi chiết siêu âm đến hoạt tính chống oxy hóa hàm lượng protein dịch chiết hải miên I mutans, kết nghiên cứu cho thấy nước cất dung môi thích hợp để chiết xuất hoạt chất chống oxy hóa từ hải miên protein hoạt chất chống oxy hóa chủ yếu có • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Hình Hải miên I mutans lấy mẫu vùng biển Phú Quốc Ngay sau lấy mẫu, hải miên ướp lạnh vận chuyển phòng thí nghiệm Trường Đại học Nha Trang Tại phòng thí nghiệm, hải miên bảo quản đông nhiệt độ - 200C để sử dụng cho nghiên cứu 1.2 Hóa chất 2,2 diphenyl-1picrylhydrazine (DPPH), Bovine serum albumin (BSA), Folin-Ciocalteu reagent mua từ Công ty Sigma-Aldrich, Hoa Kỳ Các hóa chất lại loại đạt tiêu Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2016 chuẩn dùng cho phân tích hóa học, mua siêu âm tần số 20KHz 30oC khoảng từ Công ty Loba Chemie, Ấn Độ Công ty thời gian khác nhau: 5, 10, 15, 20 25 Wako, Nhật Bản phút Sau đưa ly tâm 4oC 20 Phương pháp nghiên cứu Thí nghiệm xác định ảnh hưởng điều kiện chiết xuất (tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, thời gian chiết, nhiệt độ chiết, số lần chiết) nước cất với hỗ trợ siêu âm đến hoạt tính sinh học chống oxy dịch chiết từ hải miên I mutans tiến hành sau: 2.1 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/nước cất Mỗi mẫu thí nghiệm lấy 100 g hải miên đông lạnh -20oC đưa cắt nhỏ đến kích thước - mm đồng hóa với nước cất tỷ lệ nguyên liệu/nước cất (g/ml) là: 1/2, 1/4, 1/6, 1/8 1/10 Hỗn hợp đồng hóa đưa chiết xuất với hỗ trợ sóng siêu âm tần số 20KHz thời gian 10 phút 30oC Sau đưa ly tâm 4oC 20 phút với vận tốc 3000 vòng/phút Sau ly tâm, tách lấy dịch lọc qua giấy lọc Whatman số Bã lọc tiến hành chiết lại lần với thông số cách chiết lần đầu Dịch lọc thu từ lần chiết nhập chung lại tiến hành ly tâm 4oC 10 phút với vận tốc 15000 vòng/phút Tách lấy dịch ly tâm lọc qua giấy lọc Whatman số 1, bổ sung thêm dung môi vào dịch lọc cho đủ 3000 ml dịch chiết Dịch chiết hải miên thu giữ C dùng để phân tích o phút với vận tốc 3000 vòng/phút Sau ly tâm, tách lấy dịch lọc qua giấy lọc Whatman số Bã lọc tiến hành chiết lại lần với thông số cách chiết lần đầu Dịch lọc thu từ lần chiết nhập chung lại tiến hành ly tâm 4oC 10 phút với vận tốc 15000 vòng/phút Tách lấy dịch ly tâm lọc qua giấy lọc Whatman số 1, bổ sung thêm dung môi vào dịch lọc để đảm bảo thể tích dịch chiết thu mẫu Dịch chiết hải miên thu giữ 4oC dùng để phân tích hoạt tính chống oxy hóa ngày 2.3 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng nhiệt độ chiết Mỗi mẫu thí nghiệm lấy 100 g hải miên đông lạnh -20oC đưa cắt nhỏ đồng hóa đồng hóa với nước cất tỷ lệ nguyên liệu/ nước cất thích hợp xác định thí nghiệm mục 2.1 Hỗn hợp đồng hóa đưa chiết xuất siêu âm nhiệt độ khác nhau: 10, 20, 30, 40 50oC thời gian thích hợp xác định thí nghiệm mục 2.2 Sau đưa ly tâm 4oC 20 phút với vận tốc 3000 vòng/phút Sau ly tâm, tách lấy dịch lọc qua giấy lọc Whatman số Bã lọc tiến hành chiết lại lần với thông số cách chiết hoạt tính chống oxy hóa ngày lần đầu Dịch lọc thu từ lần chiết 2.2 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng thời nhập chung lại tiến hành ly tâm 4oC gian chiết 10 phút với vận tốc 15000 vòng/phút Tách lấy Mỗi mẫu thí nghiệm lấy 100g hải miên đông dịch ly tâm lọc qua giấy lọc Whatman số 1, lạnh -20 C đưa cắt nhỏ đến kích thước - bổ sung thêm dung môi vào dịch lọc để đảm mm đồng hóa với nước cất tỷ lệ nguyên bảo thể tích dịch chiết thu mẫu liệu/nước cất thích hợp xác định Dịch chiết hải miên thu giữ thí nghiệm mục 2.1 Hỗn hợp đồng hóa 4oC dùng để phân tích hoạt tính chống oxy hóa đưa chiết xuất với hỗ trợ sóng ngày o TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản 2.4 Thí nghiệm xác định ảnh hưởng số lần chiết Mỗi mẫu thí nghiệm lấy 100 g hải miên đông lạnh -20oC đưa cắt nhỏ đồng hóa đồng hóa với nước cất tỷ lệ nguyên liệu/ nước cất thích hợp xác định thí nghiệm mục 2.1 Hỗn hợp đồng hóa đưa chiết xuất siêu âm với thời gian nhiệt độ thích hợp xác định thí nghiệm mục 2.2 2.3 Sau đưa ly tâm 4oC 20 phút với vận tốc 3000 vòng/phút Sau ly tâm, tách lấy dịch lọc qua giấy lọc Whatman số Đối với mẫu chiết từ - lần, bã lọc từ lần chiết tiến hành chiết lại tương ứng từ - lần với với thông số cách chiết lần đầu Mẫu chiết lần không lặp lại trình chiết Dịch lọc thu từ lần chiết nhập chung lại tiến hành ly tâm 4oC 10 phút với vận tốc 15000 vòng/phút Tách lấy dịch ly tâm lọc qua giấy lọc Whatman số 1, bổ sung thêm dung môi vào dịch lọc để đảm bảo thể tích dịch chiết thu mẫu Dịch chiết hải miên thu giữ 4oC dùng để phân tích hoạt tính chống oxy hóa ngày Số 2/2016 Phương pháp phân tích Hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ hải miên đánh giá dựa vào khả khử gốc tự DPPH phân tích theo phương pháp Fu cộng (2002) dựa vào tổng lực khử phân tích theo phương pháp Oyaizu (1986) Phương pháp xử lý số liệu Số liệu trình bày báo giá trị trung bình lần thí nghiệm Tính giá trị trung bình vẽ đồ thị sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2003 Sự khác biệt có ý nghĩa mặt thống kê (p < 0,05) giá trị trung bình phân tích phần mềm thống kê R phiên 2.13.1 III KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Ảnh hưởng tỷ lệ nguyên liệu/nước cất đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ hải miên Hoạt tính khử gốc tự DPPH tổng lực khử dịch chiết hải miên chiết xuất nước cất với tỷ lệ nguyên liệu/nước cất khác có hỗ trợ sóng siêu âm tần số 20KHz thời gian 10 phút 30oC thể hình Hình Hoạt tính khử gốc tự DPPH (a) tổng lực khử (b) dịch chiết hải miên chiết xuất nước cất với tỷ lệ nguyên liệu/nước cất khác có hỗ trợ sóng siêu âm tần số 20KHz thời gian 10 phút 30oC • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Kết phân tích phương sai cho thấy tỷ lệ nguyên liệu/nước cất có ảnh hưởng đến hoạt tính khử gốc tự DPPH tổng lực khử dịch chiết hải miên (P < 0,001) Hình cho thấy, hoạt tính khử gốc tự DPPH dịch chiết hải miên tăng (P < 0,05) thay đổi tỷ lệ nguyên liệu/nước cất từ 1/2 đến 1/4, hoạt tính khử gốc tự DPPH dịch chiết hải miên không tăng thêm (P > 0,05) tỷ lệ nguyên liệu/nước cất thay đổi từ 1/4 đến 1/10 Trong đó, tổng lực khử dịch chiết hải miên tăng (P < 0,05) thay đổi tỷ lệ nguyên liệu/nước cất từ 1/2 đến 1/6, tổng lực khử mẫu dịch chiết hải miên Số 2/2016 tỷ lệ nguyên liệu/nước cất 1/6, 1/8 1/10 khác biệt (P > 0,05) Từ kết chọn tỷ lệ nguyên liệu/nước cất thích hợp cho chiết xuất chất chống oxy hóa từ hải miên 1/6 Ảnh hưởng thời gian chiết đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ hải miên Hoạt tính khử gốc tự DPPH tổng lực khử dịch chiết hải miên chiết xuất nước cất với tỷ lệ nguyên liệu/ nước cất 1/6, có hỗ trợ sóng siêu âm tần số 20KHz khoảng thời gian khác 30oC thể hình Hình Hoạt tính khử gốc tự DPPH (a) tổng lực khử (b) dịch chiết hải miên chiết xuất nước cất với tỷ lệ nguyên liệu/nước cất: 1/6 có hỗ trợ sóng siêu âm tần số 20KHz khoảng thời gian khác 30oC Kết phân tích phương sai cho thấy thời giảm tăng thời gian chiết từ 15 phút lên 25 gian chiết có ảnh hưởng đến hoạt tính khử gốc phút (P > 0,05) Từ kết chọn thời tự DPPH tổng lực khử dịch gian chiết thích hợp cho chiết xuất chất chống chiết hải miên (P < 0,001) Hình cho thấy, oxy hóa từ hải miên 15 phút hoạt tính khử gốc tự DPPH dịch chiết Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hoạt hải miên tăng (P < 0,05) tăng thời gian chiết từ phút lên 10 phút, hoạt tính khử gốc tự DPPH dịch chiết hải miên không tính chống oxy hóa dịch chiết từ hải miên Hoạt tính khử gốc tự DPPH tổng tăng thêm (P > 0,05) tăng thời gian chiết từ lực khử dịch chiết hải miên 10 phút đến 25 phút Trong đó, tăng thời chiết xuất nước cất với tỷ lệ nguyên liệu/ gian chiết từ phút đến 15 phút làm tăng tổng nước cất 1/6, có hỗ trợ sóng siêu lực khử dịch chiết hải miên (P < 0,05) âm tần số 20KHz 15 phút nhiệt độ tổng lực khử dịch chiết hải miên chiết khác thể hình TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2016 Hình Hoạt tính khử gốc tự DPPH (a) tổng lực khử (b) dịch chiết hải miên chiết xuất nước cất với tỷ lệ nguyên liệu/nước cất: 1/6 có hỗ trợ sóng siêu âm tần số 20KHz 15 phút nhiệt độ khác Kết phân tích phương sai cho thấy nhiệt độ chiết có ảnh hưởng đến hoạt tính khử gốc tự DPPH (P < 0,05) tổng lực khử (P < 0,001) dịch chiết hải miên Hình cho thấy, hoạt tính khử gốc tự DPPH mẫu dịch chiết hải miên khác biệt (P > 0,05) ngoại trừ mẫu chiết xuất nhiệt độ 30oC có hoạt tính khử gốc tự DPPH cao mẫu chiết xuất nhiệt độ 10oC (P < 0,01) Tổng lực khử mẫu chiết xuất 10, 20, 40 50oC khác biệt đáng kể (P > 0,05) thấp tổng lực khử mẫu chiết xuất nhiệt độ 30oC Từ kết chọn nhiệt độ chiết thích hợp cho chiết xuất chất chống oxy hóa từ hải miên 30oC Ảnh hưởng số lần chiết đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ hải miên Hoạt tính khử gốc tự DPPH tổng lực khử dịch chiết hải miên chiết xuất nước cất với tỷ lệ nguyên liệu/ nước cất 1/6, có hỗ trợ sóng siêu âm tần số 20KHz 15 phút 30oC với số lần chiết khác thể hình Hình Hoạt tính khử gốc tự DPPH (a) tổng lực khử (b) dịch chiết hải miên chiết xuất nước cất với tỷ lệ nguyên liệu/nước cất: 1/6 có hỗ trợ sóng siêu âm tần số 20KHz 15 phút 30oC với số lần chiết khác • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Kết phân tích phương sai cho thấy số lần chiết có ảnh hưởng đến hoạt tính khử gốc tự DPPH tổng lực khử dịch chiết hải miên (P < 0,001) Hình cho thấy, hoạt tính khử gốc tự DPPH tổng lực khử dịch chiết hải miên tăng tăng số lần chiết từ đến lần (P < 0,01) Hoạt tính khử gốc tự DPPH tổng lực khử mẫu chiết 3, lần khác biệt đáng kể (P > 0,05) Từ kết chọn số lần chiết thích hợp cho chiết xuất chất chống oxy hóa từ hải miên lần Số 2/2016 IV KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Trong điều kiện chiết xuất nước cất với hỗ trợ siêu âm, tỷ lệ nguyên liệu/ nước cất, thời gian chiết, nhiệt độ chiết số lần chiết có ảnh hưởng đáng kể đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ hải miên Các thông số thích hợp cho chiết xuất chất chống oxy hóa từ hải miên I mutans nước cất với hỗ trợ sóng siêu âm tần số 20KHz sau: - Tỷ lệ nguyên liệu/nước cất: 1/6 - Thời gian chiết: 15 phút; - Nhiệt độ chiết: 30oC; - Số lần chiết: lần TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt: Huỳnh Nguyễn Duy Bảo, Nguyễn Khắc Bát (2015) Ảnh hưởng loại dung môi chiết siêu âm đến hoạt tính chống oxy hóa hàm lượng protein dịch chiết từ hải miên (Ircinia mutans) Tạp chí Khoa học – Công nghệ Thủy sản, số 4/2015: 11–17 Tiếng Anh: Chairman, K., Singh, A J A R., Alagumuthu, G (2012) Cytotoxic and antioxidant activity of selected marine sponges Asian Pacific Journal of Tropical Disease, 2(3): 234–238 Fu H., Shieh D., Ho C (2002) Antioxidant and free radieal scavenging activities of edible mushrooms Food lipids, 9: 35-46 Halliwell, B (1994) Free radicals, antioxidants, and human disease: curiosity, cause or consequence? The Lancet, 344: 721-724 Kumar, M S., Pal, A K (2012) Investigation of bioactivity of extracts of Marine Sponge, Spongosorites halichondrioides (Dendy, 1905) from western coastal areas of India Asian Pacific Journal of Tropical Biomedicine, S1784-S1789 Mehbub, M F., Lei, J., Franco, C., Zhang, W (2014) Marine sponge derived natural products between 2001 and 2010: Trends and opportunities for discovery of bioactives Marine Drugs, 12(8): 4539-4577 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG • Tạp chí Khoa học - Công nghệ Thủy sản Số 2/2016 Nazemi, M., Motallebi, M A A., Jamili, S., Mashinchian, A., Ghavam, M P (2014) Comparison of antibacterial activities of Ircinia mutans extracts in two different seasons from Kish Island, Persian Gulf, Iran Iranian Journal of Fisheries Sciences, 13(4): 823-833 Orhan, I E., Ozcelik, B., Konuklugil, B., Putz, A., Kaban, U G., Proksch, P (2012) Bioactivity screening of the selected turkish marine sponges and three compounds from Agelas oroides Record of Natural Products, 6(4): 356 -367 Oyaizu, M (1986) Studis on products of browning reations: autioxidative activities of products of browning reaction prepared from glucosamine Japanese Journal of Nutrition, 44: 307-315 10 Salehi, A., Patong, R., Ahmad, A (2014) Isolation And Characterization Of Some Kind Bioactive Proteins Sponge As Antibacterial Agent International Journal of Scientific & Technology Research, 3(2): 233-236 11 Sato, S., Kuramoto, M., Ono, N., Ircinamine, B (2006) Bioactive alkaloid from marine sponge Dactylia sp Tetrahedron Letters, 47: 7871–7873 12 Taheri, A., Jalalinezhad, S (2015).Antioxidative and Cytotoxic Effect of Marine Sponge (Geodia perarmata) Extracts against Breast and Colorectal Cancer Cells 2nd International Conference on Advances in Environment, Agriculture & Medical Sciences (ICAEAM-15), June 11-12, 2015, Antalya (Turkey) 13 Thai Minh Quang (2013) A review of the diversity of sponges (porifera) in Vietnam The 2nd international workshop on marine bioresources of Vietnam, Hanoi 5-6/6/2013, 109-115 10 • TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG