Tiểu luận độc tố aflatocxin

. Lịch sử phát hiện Aflatoxin Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở nước Anh bị tổn thất rất nặng nề, lúc đầu hơn 10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là “bệnh gà tây X” (Turkey X disease). Sau đó, các loại gia cầm khác như vịt, gà lôi cũng bị nhiễm bệnh và tử vong rất nhiều. Qua điều tra, người ta xác định được bệnh có liên quan đến một loại độc tố do nấm có trong thức ăn sinh ra. Đến năm 1961 người ta đã tìm ra bản chất hoá học của độc chất này là Aflatoxin do vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus. Aflatoxin có 4 dẫn xuất quan trọng là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2. Giữa 4 loại trên thì thì Aflatoxin B1 chiếm nhiều nhất trong nông sản và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh nhất và phổ biến nhất.

Mục lục

1) Mở đầu

1.1 Lịch sử phát hiện Aflatoxin

Vào năm 1960, nghề nuôi gia cầm ở nước Anh bị tổn thất rất nặng nề, lúc đầu hơn 10.000 gà tây chết vì một bệnh mới gọi là “bệnh gà tây X” (Turkey X disease) Sau đó, các loại gia cầm khác như vịt, gà lôi cũng bị nhiễm bệnh và tử vong rất nhiều Qua điều tra, người ta xác định được bệnh có liên quan đến một loại độc tố do nấm có trong thức

ăn sinh ra Đến năm 1961 người ta đã tìm ra bản chất hoá học của độc chất này là

Aflatoxin do vi nấm Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus Aflatoxin có 4 dẫn xuất quan trọng là AFB1, AFB2, AFG1, AFG2 Giữa 4 loại trên thì thì Aflatoxin B1 chiếm nhiều nhất trong nông sản và gây tác hại nhiều nhất, gây ngộ độc nhanh nhất và phổ biến nhất

Năm 1961, các công trình nghiên cứu công nhận rằng Aflatoxin được tạo ra bởi nấm Aspergillus flavus và có thể là nguyên nhân gây ra khối u ở gan của động vật Trên động vật thủy sản, những nghiên cứu đầu tiên về độc tố Aflatoxin trên cá hồi được thực hiện bởi Ashley và các cộng sự

Từ đó trở đi có nhiều công trình nghiên cứu về độc tố Aflatoxin Các nhà khoa học cũng

đã xác định được công thức phân tử và công thức cấu tạo của Aflatoxin

1.2 Nguồn gốc của Aflatoxin

Aflatoxin thường được tạo bởi hai loài nấm quen thuộc là Aspergillus flavus và

Aspergillus parasiticus với các lượng khác nhau tùy thuộc vào chủng nấm, cơ chất, điều

kiện khí hậu và môi trường [1]

Một số loài nấm mốc khác cũng có khả năng sinh Aflatoxin với lượng rất ít như

loài: Penicillium puberulum Bai, các chủng thuộc Aspergillus như Aspergillus

tamariikita, Aspergillus niger tiegh, Aspergillus ostiamis wehmen, Aspergillus ruper…

Tuy nhiên cũng còn nhiều tranh cãi vì trong quá trình phát triển, Aspergillus flavus thường lẫn với nhiều loài nấm khác, đặc biệt là với Penicillium rubrum stoll và khi đó có

thể nhầm Aflatoxin là do Penicillium sản sinh ra

Trong một số trường hợp, cũng có thể nhầm lẫn với độc tố Sterigmatoxistin và Avecsin vì

có cấu tạo hóa học gần giống với Aflatoxin

Hình 1: Hai chủng nấm sinh Aflatoxin chủ yếu

− Không phải tất cả các chủng Aspergillus flavus được khảo sát đều sản sinh ra Aflatoxin,

chỉ 73% có khả năng sản sinh Aflatoxin, trong đó có 23% sản sinh Aflatoxin ở mức cao nhất Người ta đã ghi nhận được nhiều biến đổi quan trọng tùy theo cơ chất từ đó đã phân

lập các chủng A.flavus và tùy theo theo nguồn gốc địa lý Chẳng hạn, người ta đã thấy

trong số 284 mẫu phân lập từ gạo ở Hoa Kỳ có 94% số chủng có sinh độc tố, 86% đối với các mẫu phân lập từ lạc cũng tại nước này và chỉ 71% đối với các mẫu được phân lập cũng từ lạc nhưng ở Ixraen

− Ngoài ra, lượng Aflatoxin cũng thay đổi rất nhiều tùy theo các chủng

− Ngoài việc định lượng tổng số các Aflatoxin, người ta còn quan tâm xác định tỷ lệ riêng

nhất cả trong thiên nhiên lẫn nuôi cấy, rồi đến Aflatoxin G1, sau đó rất xa là Aflatoxin B2, còn Aflatoxin G2 và các Aflatoxin khác thì tỷ lệ khá thấp

− Phân biệt các chủng sinh độc tố và không sinh độc tố qua những đặc điểm hình thái: chủng sinh độc tố có đầu bào tử đính màu xanh lục, ngay cả ở các giống nuôi cấy lâu ngày (thể bình hai lớp, cuống bào tử đính với vách có gai)

− Một chủng sinh độc tố có thể mất khả năng đó qua nhiều lần cấy truyền liên tiếp trên các môi trường tổng hợp Thế nhưng tính độc của một chủng tăng lên khi cấy truyền liên tiếp trên những môi trường tự nhiên thích hợp

2) Cấu trúc và các tính chất của Aflatoxin

2.1 Cấu trúc của Aflatoxin

Các Aflatoxin thường nhiễm trên các sản phẩm thực vật Hiện nay người ta đã tìm thấy khoảng 18 loại aflatoxin khác nhau, tuy nhiên có 4 loại chính thường gặp nhất gồm

4 hợp chất của nhóm bis-furanocoumarin, là sản phẩm trao đổi chất tạo bởi nấm

Aspergillus flavus và Aspergillus parasiticus, được đặt tên là B1, B2, G1, G2

Bốn chất được phân biệt trên cơ sở màu phát quang của chúng B là chữ viết tắt của Blue (màu xanh nước biển) và chữ G là chữ viết tắt của Green (màu xanh lá cây) Các sắc kí đồ lớp mỏng alumin, thu được từ nước chiết bằng clorofrom : metanol (98.5 : 1.5) được tách bằng hệ thống clorofrom : cacbon tetraclorua : nước : metanol (2 : 2.5 : 1 : 3) đã phát hiện hai vết huỳnh quang dưới ánh sáng tử ngoại: một vết huỳnh quang xanh tím, đó là aflatoxin B1, một vết khác có Rf thấp hơn và huỳnh quang màu lục, đó là aflatoxin G1 Aflatoxin G1 có cấu trúc rất gần với cấu trúc aflatoxin B1: nó có hai chức lacton, còn aflatoxin B1 chỉ có một Bằng cách khử nối đôi cách trong nhân hidrofuran tận cùng của dihidroaflatoxin B1 và G1 ta thu được hai sản phẩm độc khác là aflatoxin B2

và G2 So với aflatoxin B1, độc tính của chúng đối với vịt con kém hơn từ 60 đến 100 lần; như vậy chúng sẽ không độc, nếu không có các khả năng mất hidrat chuyển thành aflatoxin B1 rất độc

Aflatoxin B1, B2 trong sữa bò được chuyển hoá và gọi là Aflatoxin M1 và Aflatoxin M2 (M là một chữ viết tắt của Milk) Aflatoxin M1 có huỳnh quang xanh tím, aflatoxin M2 có Rf thấp hơn và huỳnh quang tím Aflatoxin M1 là hidroxi – 4 aflatoxin B1,

và aflatoxin M2 là hidroxi – 4 aflatoxin B2

Trong bốn loại Aflatoxin thì Aflatoxin B1 thường được tìm thấy ở nồng độ cao nhất, tiếp theo là G1, trong khi đó B2 và G2 tồn tại ở nồng độ thấp hơn

Hình 2: Cấu trúc hóa học của Aflatoxin Ngoài 6 loại aflatoxin chủ yếu trên, người ta còn phát hiện một số loại aflatoxin khác, người ta đã đề nghị gọi các hợp chất đó là flavatoxin hoặc flavacuramin:

− Aflatoxin P1: là một sản phẩm trao đổi chất, là dẫn xuất fenolic của aflatoxin B1 Người ta đã phân lập được chúng trên cột ambeclit XAD – 2 (Rohm và Haas)

Trọng lượng phân tử của nó, xác định bằng khối phổ là 2.8 Sản phẩm này là kết quả sự khử metyl của aflatoxin B1

− Aflatoxin 3B hay toxin B3: một chất có Rf thấp, phân lập từ bình nuôi cấy A flavus, dạng tinh thể, màu vàng kim, độ độc kém aflatoxin B1 từ 40 đến 50 lần

− Aflatoxin B3 ( được Siubblefield và đồng sự phân lập) còn gọi là porositicol: nhân xiclopenten tận cùng của aflatoxin B1 được thay thế bằng một chuỗi bên etanol, do

đó chất này là 6 – metoxi -7 - (2’ – hidroxictyl) difurocumarin

2.2 Tính chất vật lí

Các Aflatoxin phát quang mạnh dưới ánh sáng cực tím sóng dài Điều này cho phép phát hiện các hợp chất này ở nồng độ cực kì thấp (0,5 ng hay thấp hơn trên một vết

ở sắc kí bản mỏng) Nó cung cấp điểm cơ bản về mặt thực hành cho tất cả các phương pháp hoá lý về việc phát hiện và định lượng Nồng độ Aflatoxin M1 0,02mg/l có thể được phát hiện trong sữa lỏng

Aflatoxin tinh khiết rất bền vững ở nhiệt độ cao lên đến điểm nóng chảy, khi được làm nóng trong không khí Tuy nhiên nó tương đối không bền khi để dưới không khí và dưới tia cực tím ở phiến sắc kí bản mỏng, và đặc biệt khi hoà tan ở các dung môi có độ phân cực cao Các Aflatoxin trong các dung môi clorofom và benzen bền vững trong nhiều năm nếu được giữ trong chỗ tối và lạnh Các Aflatoxin ít hoặc không bị phá huỷ dưới điều kiện nấu bình thường và làm nóng khi thanh trùng Tuy nhiên, khi có độ ẩm và

ở nhiệt độ cao vẫn có thể tiêu hủy aflatoxin trong một khoảng thời gian nhất định

Hình 3: Đường cong hấp phụ UV của Àflatoxin Các Aflatoxin được hoà tan trong các dung môi phân cực nhẹ như clorofom, metanol

và đặc biệt ở dimethylsulfoit (dung môi thường được sử dụng như phương tiện trong việc

áp dụng các Aflatoxin vào các động vật thực nghiệm) Tính tan của Aflatoxin trong nước dao động từ 10-20mg/l

2.3 Tính chất hóa học

Sự có mặt của vòng lacton ở phân tử Aflatoxin làm chúng nhạy cảm với việc thuỷ phân trong môi trường kiềm, đặc tính này là quan trọng trong bất kì quá trình chế biến thực phẩm vì quá trình xử lý kiềm làm giảm hàm lượng Aflatoxin của các sản phẩm, mặc

dù sự có mặt của protein, pH và thời gian xử lý có thể thay đổi các kết quả Tuy nhiên nếu xử lý kiềm là nhẹ thì việc axit hoá sẽ làm phản ứng ngược trở lại để tạo Aflatoxin ban đầu

Bảng 1: Tính chất lý – hóa chủ yếu của các aflatoxin

(* Kết quả của Townsend, ** Kết quả của Stubblefield và đồng tác giả, *** kết quả của Beljiaars)

Ở nhiệt độ cao (khoảng 100oC) sự mở vòng decarboxylation xảy ra và phản ứng có thể tiến xa hơn, dẫn đến sự mất mát các nhóm methoxy từ vòng thơm

Khi có các acid vô cơ và bổ sung nước, Aflatoxin B1 và G1 chuyển hóa thành Aflatoxin B2A và G2A Các sản phẩm cộng hợp tương tự của Aflatoxin B1 và G1 cũng được hình thành với clorua axit formic thionyl, clorua axit axetic và axit thionyl trifluoroacetic

Nhiều tác nhân oxy hóa, chẳng hạn như hypochlorite natri, thuốc tím, chlorine, hydrogen peroxide, ozone và peborat natri phản ứng với Aflatoxin và thay đổi các phân

tử Aflatoxin, một số phản ứng làm mất huỳnh quang

Sự hydro hóa Aflatoxin B1 và B2 sinh ra Aflatoxin G1, G2 tương ứng Sự khử Aflatoxin B1 bằng 3 mol hydro sinh ra tetrahydroxyaflatoxin khử Aflatoxin B1 và B2 bằng natriborohydride tạo ra RB1 và RB2 tương ứng Hiện tượng đó là kết quả của việc

mở vòng lacton bởi sự khử nhóm acid và nhóm xeton ở vòng cyclopentene.The mechanisms of these reactions are uncertain and the reaction products remain unidentified in most cases

3) Độc tính của Aflatoxin với cơ thể người

Ngoài việc gây ngộ độc cấp tính (liều gây chết người khoảng 10 mg), độc tố Aflatoxin còn được xem là nguyên nhân gây xơ gan và ung thư Aflatoxin là một trong những chất gây ung thư gan mạnh nhất, nếu hấp thu một lượng là 2,5 mg Aflatoxin trong thời gian ngắn (khoảng 3 tháng) có thể dẫn đến ung thư gan sau một năm

Aflatoxin gây ra các tác hại chính sau đây:

− Phá hủy tế bào gan, thận và các bộ phận khác

− Ức chế lên hệ miễn dịch

− Ăn mòn thành ruột và dạ dày

− Suy dinh dưỡng, chậm lớn, chết

− Gây ra ung thư gan ở người

Như vậy, Aflatoxin có khả năng gây độc cấp tính và mãn tính ở người Nghiêm trọng nhất và nguy hiểm nhất là khả năng gây xơ gan và ung thư gan [2]

3.1 Cơ chế tác động của Aflatoxin

Aflatoxin B1 là phân tử ái lực mạnh với thành ruột, có trọng lượng phân tử thấp nên dễ dàng được hấp thu hoàn toàn sau khi ăn

Khi đến ruột non, Aflatoxin B1 sẽ nhanh chóng được hấp thu vào tĩnh mạch và ruột non, tá tràng

Từ ống tiêu hóa, theo tĩnh mạch cửa, Aflatoxin tập trung vào gan nhiều nhất (chiếm khoảng 17% lượng Aflatoxin của cơ thể) tiếp theo là ở thận, cơ, mô mỡ, tụy, lách và 80%

bị bài tiết ra ngoài trong khoảng một tuần và đáng chú ý là nó còn bài tiết qua tuyến sữa gây bệnh cho thai nhi đang bú sữa mẹ Chu kì bán rã trong huyết tương là 36,5 phút, lượng phân phối là 14% trọng lượng cơ thể, giải phóng khỏi cơ thể là 1,25 L / kg / h Aflatoxin M1 chủ yếu bài tiết trong vòng 48 giờ [3]

Cho đến nay, các luận chứng khoa học đã công nhận khả năng tác động lên tế bào gan của Aflatoxin trải qua 5 giai đoạn sau:

− Ức chế các men polymerase mà chúng có vai trò tổng hợp DNA và RNA

− Làm chậm hoặc ngừng hẳn sự tổng hợp DNA

− Ngăn cản cơ chế sinh tổng hợp RNA truyền tin

− Biến đổi hình dạng nhân tế bào

− Hạn chế quá trình sinh tổng hợp protein

→ Hậu quả là gây ung thư biểu mô tế bào gan

Do cấu trúc hóa học có vòng dihydro-furan nên Aflatoxin B1 liên kết với một số enzym làm cản trở trao đổi chất dẫn đến tử vong

Tại gan, Aflatoxin B1 (AFB1) được chuyển hóa bởi nhóm enzym cytochrome p450 (ở người là P450 III A4 đối với người lớn và P450 III A6 đối với thai nhi) tạo thành nhiều sản phẩm chuyển hóa như Aflatoxicol, Aflatoxin Q1, Aflatoxin P1, và Aflatoxin M1, tùy thuộc vào khuynh hướng di truyền của loài Đối với con người, phần lớn Aflatoxin B1 chuyển hóa thành AFQ1, ngoài ra còn có AFM1, aflatoxicol (AFL), AFLH1, AFP1, AFB2a và AFB1-2, 2-dihydrodiol

Enzym Cytochrome P450 IIIA4 vừa kích hoạt vừa giải độc AFB1, qua quá trình trao đổi chất, các sản phẩm tạo thành bao gồm chất chuyển hóa độc hại (epoxit) từ

epoxidation và chất chuyển hóa ít độc hại từ hydroxy và demethylation Chỉ có 8, 9-exo epoxide gây đột biến còn những sản phẩm khác đều là những sản phẩm giải độc

Dưới sự xúc tác của enzim glutathione-S-transferase, liên hợp của epoxit và glutathione (GSH, một tripeptide nội sinh được tổng hợp từ tế bào bằng 3 amin: cysteine, glutamic và glycine, gắn kết với các độc chất trong gan, chuyển hóa chúng và đào thải ra ngoài) được tạo thành, làm giảm sự biến đổi DNA do epoxit gây ra Con người có ít glutathione-S-transferase hoạt động đối với liên kết 8,9-epoxit hơn so với chuột , vì thế con người ít có khả năng giải độc chất chuyển hóa quan trọng này

Các epoxit AFB1 có thể phản ứng với nitơ hạt nhân, các nguyên tử khác có thành phần oxy và lưu huỳnh trong tế bào (Guengerich và các cộng sự 1996) Chất hoạt động mạnh này có thể kết hợp với các thành phần của DNA cụ thể là guanine để tạo ra sự biến đổi trong DNA (Hendrickse 1991) Đây có thể là sản phẩm quan trọng nhất gây ung thư

Các đồng phân exo của aflatoxin B 1 (AFB 1) 8,9-epoxit gây đột biến bằng cách xen vào giữa DNA vì hình thành một sản phẩm cộng hợp với guanine do phản ứng với các nguyên tử 7N của guanine Mặc dù các epoxit thủy phân nhanh trong H2O (0,6 s -1 ở

25 ° C), nhưng các sản phẩm cộng hợp DNA vẫn rất cao

Trong cơ thể con người, AFB1 chuyển hóa chủ yếu thành sản phẩm cộng hợp aflatoxin B1-N7 guanin Sự đan xen các epoxit gây ra sự chuyển G thành T ở codon 249 của gen p53 trong gan (AGG →AGT: Arg → Ser), có thể dẫn đến tổn thương gan và ung thư gan

Hình 4: Sự chuyển hóa của Aflatoxin Ngoài ra trong quá trình tuần hoàn, Aflatoxin B1 còn được gắn với protein huyết tương đặc biệt là albumin để tạo thành aflatoxinalbumin (Autrup và cộng sự năm 1991)

Các AFB1 8,9- exo epoxit sau khi thủy phân tạo thành AFB1- dihydrodiol sẽ oxy hóa liên

tiếp dialdehyde và ngưng tụ với nhóm S-amin của lysine Sản phẩm cộng hợp này là một cấu trúc protein- aflatoxin hoàn toàn thay đổi chỉ giữ lại các coumarin và vòng cyclopen-tenone của hợp chất ban đầu Các chu kỳ bán rã trung bình của albumin ở người là khoảng 20 ngày Do đó, aflatoxin sẽ tích lũy lâu dài khi có albumin

Đối với các cơ quan khác trong cơ thể, Aflatoxin ảnh hưởng các chuỗi vận chuyển điện tử can thiệp vào hệ thống cytochrome – làm giảm ATP, ức chế ATPase, và gây sưng

ty thể, ngăn cản sản xuất năng lượng tế bào

Ngoài ra, việc tăng AFB1 – 8, 9 epoxit làm tăng đáng kể lượng lipid peroxide (Toskulkao và các cộng sự 1982) Peoroxy hóa lipid màng tế bào làm mất tính toàn vẹn của màng tế bào, giới hạn hoạt động của enzym và ly giải màng tế bào (Younes và Siegers 1984; Toskulkao và cộng sự năm 1982; Toskulkao và Glinsukon 1988)

AFM1 và AFG1 hình thành glucoronide hoặc liên hợp sulphate được bài tiết trong nước tiểu Sản phẩm cộng hợp với DNA và AFB1-N7-guanine cũng được bài tiết trong nước tiểu, Aflatoxin M1và M2 được bài tiết trong sữa Liên hợp AFB1-glutathione được bài tiết chủ yếu qua mật

Aflatoxin B1 có độc tính gần tương đương aflatoxin M1 Aflatoxin M2 ít độc hơn aflatoxin M1 Các aflatoxin B2 và G2 có độc tính kém hơn nhiều so với aflatoxin B1 Người ta còn nhận thấy rằng khi không có nối đôi dihydrofuran ở đầu cùng thì độc tính giảm đi khoảng 4.5 lần; độc tính cũng giảm khi có dạng lacton kép