Khảo sát thành phần hóa học cao Etyl Acetat và Metanol của cây Hedyotis Dichotoma Koen.ex Roth (Rubiaceae)

Chương TỔNG QUAN Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Tổng quan 1.1 ĐẶC TÍNH THỰC VẬT Chi Hedyotis gồm khoảng 180 loài, thân thảo, thuộc họ Cà phê (Rubiaceae) Chúng thường mọc vùng đất cát, dọc theo bờ sông vùng duyên hải [5] Có khoảng 70 loài thuộc chi Hedyotis Việt Nam, chủ yếu Hedyotis biflora (L.) Lam, Hedyotis diffusa Willd, Hedyotis corymbosa (L.) Lam, Hedyotis capitellata var.mollis Piere ex Pit, Hedyotis heynii R Br… [3] Cây An điền lưỡng phân thuộc chi Hedyotis có tên khoa học Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth, thuộc họ Cà phê (Rubiaceae) Hình 1.1: An điền lưỡng phân Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth (Rubiaceae) Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Tổng quan 1.1.1 Mô tả Cỏ niên, cao đến 30 cm, có nhánh dài Lá không lông, có phiến hẹp, dài 3-5 cm, rộng 3-5 mm, gân phụ không rõ; bẹ nhỏ có hai Tụ tán lưỡng phân đều, thưa nhánh Hoa nhỏ, màu lam hay tím tím, tứ phân Nang tròn tròn, to mm, hột nhỏ nhiều [3] 1.1.2 Phân bố Cây mọc nơi đất cát, vườn, dựa biển Phú Quốc [3] 1.2 THÀNH PHẦN HÓA HỌC 1.2.1 An điền lưỡng phân (Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth) Năm 1997, A S Hamzah cộng [6] cô lập từ rễ Hedyotis dichotoma isovitexin, acid ursolic, hai antraquinon là: 1,4-dihydroxy-2,3dimetoxyantraquinon 2,3-dimetoxy-9-hydroxy-1,4-antraquinon Năm 2001, R Ahmad cộng [15] cô lập hai coumarin scopoletin fraxin với cấu trúc sau O OH OH OMe OMe O MeO O Isovitexin Glc O OH OH O 1,4-Dihydroxy-2,3-dimetoxyantraquinon MeO OH O OMe HO O Scopoletin OMe H O O 2,3-Dimetoxy-9-hydroxi-1,4-antraquinon COOH MeO HO O O Glc O Fraxin HO Acid ursolic Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Tổng quan 1.2.2 Những chi Hedyotis • An điền bò (Hedyotis diffusa Willd) [7, 8, 9] Acid ursolic; hydroxyantraquinon; metylantraquinon; acid oleanolic; β-sitosterol; stigmasterol; 2-metyl-3-hydroxy-4-metoxyantraquinon; 2-metyl-3-metoxyantraquinon; 2-metyl-3- 2,3-dimetoxy-6- (Z)-6-O-p-metoxycinnamoyl scandosid metyl ester; (E)-6-O-p-metoxycinnamoyl scandosid metyl ester; (Z)-6-Oferuloyl scandosid metyl ester; (E)-6-O-feruloyl scandosid metyl ester; (Z)-6-O-pcoumaroyl scandosid metyl ester; (E)-6-O-p-coumaroyl scandosid metyl ester; kaempferol 3-O-[2-O-(6-O-E-feruloyl)-β-D-glucopyranosyl]-β-D-galactopyranosid; quercetin 3-O-[2-O-(6-O-E-feruloyl)-β-D-glucopyranosyl]-β-D-galactopyranosid; quercetin 3-O-[2-O-(6-O-E-feruloyl)-β-D-glucopyranosyl]-β-D-glucopyranosid; kaempferol 3-O-(2-O-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranosid quercetin 3-O(2-O-β-D-glucopyranosyl)-β-D-galactopyranosid • An điền cạnh nhọn (Hedyotis acutangula Champ.ex Born) Arborinon; isoarborinol; isoarborinyl acetat; germanicol; taraxerol; erythrodiol; acid ursolic; acid oleanolic olean-12-en-3β,28,29-triol • An điền cỏ (Hedyotis herbacea L.) [11, 12] Kaempferol-3-O-arabinopyranosid; kaempferol-3-O-rutinosid; 2,3-dimetoxy9-hydroxy-1,4-antraquinon; ursolic; 2-hydroxymetyl-10-hydroxy-1,4-antraquinon; 1,4-dyhydroxy-2,3-dymetoxyantraquinon acid 1,4-dyhydroxy-2- hydroxymetylantraquinon 1.3 NGHIÊN CỨU VỀ DƯỢC TÍNH Hiện chưa có tài liệu nói dược tính An điền lưỡng phân (Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth), nên trình bày dược tính số thuốc thuộc chi Hedyotis nhân dân sử dụng để điều trị bệnh • An điền bò (Hedyotis diffusa Willd) [1] An điền bò có tác dụng kháng sinh, trị đau hầu họng, viêm nhiễm đường tiểu, đường ruột, viêm loét dày, tá tràng, nóng sốt (kể sốt xuất huyết, sởi, thủy đậu), trị sỏi mật, sưng hạch bạch huyết, viêm gan, ung thư gan, ung thư cổ tử cung Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Tổng quan • An điền cạnh nhọn (Hedyotis acutangula Champ.ex Born) [2] Trị viêm gan, bệnh đường tiết niệu, viêm màng tiếp hợp cấp, viêm họng, ho Liều dùng 15 – 30 g, dạng thuốc sắc • An điền cỏ (Hedyotis herbacea L.) [2] Ở Ấn Độ, toàn sắc uống trị sốt rét dùng tắm cho người bị bệnh tê thấp Bột nghiền với mật ong dùng cho người bị bệnh sốt sưng đau thấp khớp Cây dùng với dầu dầu dùng để trị bệnh chân voi đau Lá dùng trị bệnh hen suyễn lao phổi • An điền đầu (Hedyotis capitellata var.mollis Piere ex Pit) [3] Trị bệnh lở miệng lưỡi, loét dày, viêm họng, lở loét da, chữa vết thương làm chóng lên da non, chữa đau mắt, chữa bong gân • An điền hai hoa (Hedyotis biflora L.) [2] Ở Ấn Độ, dùng chữa sốt cơn, dày bị kích thích, suy giảm thần kinh Ở Cà Mau, nhân dân dùng sắc nước để chữa bệnh viêm mủ sau mổ Cây dùng để chữa sốt, đau nhức xương cốt, thấp khớp Ở Vĩnh Phú nhân dân dùng chữa rắn cắn • An điền lớn (Hedyotis hedyotidea (DC.) Hand – Mazz.) [2] Trị trúng thử, cảm mạo, ho, viêm dày, trĩ, mụn nhọt, đau lưng: liều dùng 15 – 30 g, dạng thuốc sắc, trị lở ngứa da • An điền thông (Hedyotis pinifolia Wall.ex G Don) [2] Ở Trung Quốc, dùng trị cam tích trẻ em đòn ngã tổn thương Ở Malaysia, dùng làm thuốc đắp chỗ đau thể • An điền nhám (Hedyotis verticillata L.) [2] Chữa cảm mạo, phát sốt, đau họng, ho khan, ho có đờm, viêm ruột, tiêu chảy, kiết lị, viêm màng tiếp hợp cấp, rắn rết cắn: liều dùng 12 – 20 g, dạng thuốc sắc Dùng chữa mụn nhọt, ung thũng, sưng vú, viêm mủ da, rắn độc, rết cắn: lấy tươi giã nát, đắp nấu nước rửa • An điền hoa nhỏ (Hedyotis tenelliflora Bl.) [2] Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Tổng quan Thường dùng trị u ác tính, viêm ruột thừa, lỵ, ho, rắn độc cắn, viêm mủ da Liều dùng: 10 – 60 g, dạng thuốc sắc • An điền tai (Hedyotis auricularia L.) [2] Chữa cảm mạo phát sốt, đau họng, ho khan, ho có đờm, viêm ruột, tiêu chảy, kiết lị, viêm màng tiếp hợp cấp, rắn rết cắn: liều dùng 12 – 20 g, dạng thuốc sắc Dùng chữa mụn nhọt, ung thũng, sưng vú, viêm mủ da, rắn rết cắn: lấy tươi giã nát, đắp nấu nước rửa • Cóc mẵn (Hedyotis corymbosa (L.) Lamk) [3] Cóc mẵn có tác dụng hạ nhiệt, kiện vị, bổ thần kinh (trị xáo trộn thần kinh), trị nhức xương, trị lãi Rễ cho màu đỏ máu tươi, trị sót bao tử, đau lách, sưng gan, vàng da Lá trị sốt 1.4 KHẢO SÁT HOẠT TÍNH SINH HỌC ™ Thử nghiệm độc tính Brine Shrimp [4] Các kết nghiên cứu giới cho thấy có mối liên quan thuận chiều độc tính cao trích từ thuốc ấu trùng Brine Shrimp với tác dụng cao thuốc dòng tế bào ung thư như: KB (human nasopharyngeal carcinoma), L5178Y, L1210, P-388 (3PS) bệnh bạch cầu chuột Đa số hợp chất hữu có tác dụng tế bào ung thư có tác dụng với thử nghiệm Brine Shrimp Xác định liều chết thử nghiệm Brine Shrimp dự đoán cao trích có khả giết tế bào ung thư môi trường nuôi cấy tế bào số loài côn trùng khác có số ảnh hưởng liên quan đến dược lí nên tác giả đề xuất mô hình thử nghiệm thí nghiệm sàng lọc sơ định hướng việc trích ly, cô lập hợp chất có hoạt tính sinh học từ cao trích Phân đoạn hợp chất có kết thử nghiệm Brine Shrimp dương tính, với giá trị LC50 ≤ 200 μg/ml tiếp tục nghiên cứu với thử nghiệm chuyên ngành sâu Mô hình nhiều nước giới sử dụng không đòi hỏi trang thiết bị đắt tiền điều kiện vô trùng trường hợp nuôi cấy tế bào, sử dụng Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Tổng quan lượng mẫu cao (2 – 20 mg), thời gian thử nghiệm ngắn (24 sau cho ấu thể vào) thuận tiện cho nhà hóa học tự thực thử nghiệm sinh học phòng thí nghiệm Các hợp chất cho kết dương tính tiếp tục thử nghiệm sinh học với phương tiện kĩ thuật cao cấp Chương NGHIÊN CỨU VÀ KẾT QUẢ Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu kết 2.1 THU HÁI VÀ XỬ LÝ MẪU Cây An điền lưỡng phân thu hái tỉnh Bình Phước Cây nhận danh tên khoa học Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth PGS TS Trần Hợp, Khoa Sinh, Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh Cây lưu lưu giữ tiêu thực vật, ký hiệu mẫu số US-C020, giữ phòng thí nghiệm Hóa Hữu cơ, Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh 15 kg tươi An điền lưỡng phân rửa sạch, phơi khô, cắt nhuyễn, thu bột khô 1,64 kg 2.2 ĐIỀU CHẾ CÁC LOẠI CAO Bột khô trích kiệt etanol theo phương pháp ngâm dầm, lọc, cô quay, thu hồi dung môi, thu cao etanol thô 100,92 g Cao etanol thô trích pha rắn silica gel, giải ly đơn dung môi có độ phân cực tăng dần: eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat metanol Quy trình điều chế thu suất loại cao trình bày sơ đồ 2.1 bảng 2.1 Các cao theo dõi sắc kí lớp mỏng trình bày hình 2.1 Bảng 2.1: Khối lượng thu suất loại cao thu từ cao etanol ban đầu Các loại cao Ký hiệu cao Khối lượng (g) Thu suất (%) Eter dầu hỏa E 3,21 3,18 Cloroform A CA 3,91 3,87 Cloroform B CB 5,49 5,44 Etyl acetat A AA 5,98 5,93 Etyl acetat B AB 0,112 0,11 Etyl acetat C AC 8,96 8,88 Metanol M 50,83 50,37 Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu kết Sơ đồ 2.1: Quy trình điều chế loại cao từ An điền lưỡng phân phương pháp trích pha rắn silica gel Bột khô (1,64 kg) Ngâm trích với etanol Lọc, cô quay thu hồi dung môi Cao etanol (100,92 g) Giải ly eter dầu hỏa Cô quay thu hồi dung môi Cao eter dầu hỏa (3,21 g) Cột lại Giải ly cloroform Cô quay thu hồi dung môi Cao cloroform A (3,91 g) Cao cloroform B (5,49 g) Cột lại Giải ly etyl acetat Cô quay thu hồi dung môi Cao etyl acetat A (5,98 g) Cao etyl acetat B (112 mg) Cao etyl acetat C (8,96 g) Cao metanol (50,83 g) Cột lại Giải ly metanol Cô quay thu hồi dung môi Cột bỏ 15 Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu kết NMR loại tín hiệu Trong phổ đồ cho thấy loại tín hiệu nên H5 vị trí xích đạo • Proton 4,77 ppm (2H, m, H5 H6) xuất dạng mũi gần giống với hai mũi triplet, mũi có số ghép nhỏ Hz suy H6 ghép cặp H1, H5 với số ghép Jae ≈ Jee , H6 vị trí xích đạo Những liệu trên, cho thấy hợp chất Dichoto-Ace4 D-pinitol L-pinitol • Theo tác giả Peter M Collins [13] , lực triền quang hai đối phân có giá trị sau: H OH HO HO H3CO OH H H H H H H H HO OH OH 3-O-Metyl-D-chiro-inositol [30] OH H H OH H OH OCH3 H 3-O-Metyl-L-chiro-inositol [30] D-(+)-Pinitol L-(-)-Pinitol [α ] + 67 (c = 2,5; H2O) [α ] - 65 (c = 2,5; H2O) 20 20 D D Hợp chất Dichoto-Ace4 có lực triền quang [α ]D + 65,3 (c = 1,9; H2O), 20 Dichoto-Ace4 3-O-metyl-D-chiro-inositol [hay D-(+)-pinitol] H OH HO HO H3CO H H H H H OH OH 3-O-Metyl-D-chiro-inositol [hay D-(+)-pinitol] (Dichoto-Ace4) 2.4.2 Khảo sát cấu trúc hóa học hợp chất Dichoto-Me1 Hợp chất Dichoto-Me1 thu từ cao metanol có đặc điểm sau: • Chất bột màu trắng 16 Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu kết • Nhiệt độ nóng chảy: 256 - 257 oC (kết tinh cloroform : metanol 1:1) • [α ] = + 64, (c = 0,4; H2O) • Sắc kí lớp mỏng: giải ly hệ dung môi cloroform : metanol : nước 20 D (14:6:1), thuốc thử hình dung dịch acid H2SO4 50%, sấy cho vết màu hồng với giá trị Rf = 0,48 (hình 2.2) • Phổ MS (phụ lục 2.1): cho mũi ion giả phân tử với m/z = 937,9 mũi [M+H2O+K]+, tương ứng với công thức phân tử C46H72O16 (M = 880) Phổ 1H-NMR (pyridin-d5, 500 MHz) (phụ lục 2.2): Độ dịch chuyển hóa học • proton trình bày bảng 2.5 Phổ 13C-NMR (pyridin-d5, 125 MHz) kết hợp với phổ DEPT (phụ lục 2.3, 2.4) • so sánh với tài liệu tham khảo [14], hợp chất có 46 carbon với độ dịch chuyển hóa học carbon trình bày bảng 2.5 • Phổ COSY (phụ lục 2.5) cho thấy tương quan proton proton trình bày bảng 2.5 • Phổ HSQC (phụ lục 2.6) HMBC (phụ lục 2.7) cho thấy tương quan proton carbon trình bày bảng 2.5 Biện luận cấu trúc Phổ 1H-NMR (δ ppm) cho thấy hợp chất có ba tín hiệu proton olefin 5,35 • (1H, brs, H12); 4,64 (1H, s, H29a); 4,59 (1H, s, H29b) Kết hợp với phổ 13C-NMR (δ ppm), có ba tín hiệu carbon olefin 144,8 (>C=, C13); 121,8 (-CH=, C12); 105,9 (=CH2, C29), carbon olefin tứ cấp lại bị lẫn mũi dung môi khoảng 150,0 ppm đặc trưng khung acid 30-norolean-12,20(29)-dien-28-oic [14] Bảng 2.5: Dữ liệu phổ NMR hợp chất Dichoto-Me1 so sánh với số liệu phổ β-D-glucopyranosyl 3-O-[β-D-glucopyranosyl-(1→2)-α-L-arabinopyranosyl(3→1)-α-L-rhamnopyranosyl]-30-norolean-12,20(29)-dienoat (hay guaiacin D) [14] Vị trí Dichoto-Me1 (pyridin-d5, δ ppm) H (J, Hz) 13 C HMBC COSY Guaiacin D (pyridin-d5) 13 C 17 Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu kết (1H→13C) (1H→1H) 38,7 38,7 1,70 (m); 1,86 (m) 26,1 26,2 3,19 (dd; 11,5; 3,5 Hz) 88,1 88,6 39,1 39,5 55,7 55,8 18,1 18,4 32,8 33,0 39,3 39,8 47,8 47,9 10 36,6 36,9 11 1,76 (m) 23,3 12 23,7 12 5,35 (s) 121,8 11 123,2 13 144,7 143,3 14 41,8 42,0 15 28,1 28,1 16 23,8 23,5 17 48,1 47,2 18 3,19 (dd; 11,5; 3,5 Hz) 47,8 19 47,6 19 2,14 (m); 2,54 (m) 42,2 18 41,6 20 - 148,4 21 30,3 30,0 22 38,3 37,5 23 1,08 (s) 28,1 3, 4, 5, 24 28,1 24 0,97 (s) 16,6 3, 4, 5, 23 16,9 25 0,73 (s) 15,2 1, 5, 9, 10, 15,5 26 1,17 (s) 17,9 8, 14 17,4 27 1,17 (s) 25,8 8, 14 26,0 28 29 Ara 4,64 (s) 4,59 (s) 105,9 175,7 19, 21 19, 21 107,2 18 Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu kết 1’ 4,77 (d; 5,5 Hz) 103,9 2’ 4,40 (m) 71,5 3’ 4,27 (dd; 7,5; 3,5 Hz) 81,2 4’ 4,47 (s) 4,20 (dd; 12,0; 5,0 Hz) 3,75 (d; 9,5 Hz) 67,2 5’ 1’ 105,2 2’ 75,3 82,2 5’ 4’ 4’ 63,8 68,6 64,7 Glu 1” 4,95 (d, 8,0 Hz) 103,5 3’ 2” 104,3 2” 3,85 (m) 74,2 1” 1”, 3” 73,9 3” 4,08 (t; 8,5 Hz) 77,1 2”, 4” 2”, 4” 78,0 4” 3,93 (t; 9,0 Hz) 70,6 3”, 5” 3” 71,1 5” 3,85 (m) 4,32 (d; 12,0 Hz) 4,08 (d; 13,0 Hz) 77,5 1” 6” 61,7 78,0 62,4 4” Rha 1”’ 5,88 (s) 100,9 4”, 3”’, 5”’ 2”’ 102,0 2”’ 4,55 (s) 71,3 4”’ 1”’ 72,1 3”’ 4,40 (m) 74,0 4”’ 72,1 4”’ 4,13 (t; 9,0 Hz) 73,0 2”’, 5”’ 73,9 5”’ 4,37 (m) 69,5 6”’ 28Glu 1,50 (d; 6,0 Hz) 17,2 4”’, 5”’ 6”’ 70,3 5”’ 18,0 95,8 75,0 78,3 71,2 78,7 62,4 Phổ 1H-NMR cho thấy hợp chất có ba tín hiệu proton anomer δ ppm • 5,88 (1H, s, H1”’); 4,95 (1H, d, J = 8,0 Hz, H1”); 4,77 (1H, d, J = 5,5 Hz, H1’) Phổ 13 C-NMR (δ ppm), có ba tín hiệu carbon anomer tương ứng 103,9 (C1”’); 19 Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu kết 103,5 (C1”); 100,9 (C1’) có 13 carbon carbinol vùng 61 – 83 ppm, nên hợp chất Dichoto-Me1 có hai đơn vị đường hexose đơn vị đường pentose So sánh phần aglycon hợp chất Dichoto-Me1 với phần aglycon hợp chất guaiacin D (đã cô lập chi Hedyotis nudicaulis), nhận thấy có tương hợp, bên cạnh tương quan HMBC, COSY giúp chứng minh cấu trúc khung acid 30-norolean-12,20(29)-dien-28-oic Vì đề nghị phần aglycon Dichoto-Me1 acid 30-norolean-12,20(29)-dien-28-oic H 20 19 12 18 26 11 28 17 COOH 14 15 10 16 27 21 22 13 25 H 29 O H 23 24 Hình 2.4: Tương quan HMBC phần aglycon Dichoto-Me1 • Phần đường Dichoto-Me1 gần tương tự guaiacin D (bảng 2.15), gồm đường: α-L-arabinose, β-D-glucose, α-L-rhamnose; khác DichotoMe1 có nhóm –COOH tự do, không liên kết với D-glucose khác vị trí liên kết ba đường 29 19 20 12 13 O 25 OH OH HO HO O 4" O OH HOH2C H3C HO O HO HO HO 6"' O O OH OH Guaiacin D • O HO O H3 C HO 4"' 5"' 3"' 1"' O 2"' 2" O OH 1" O 5' 3' 2' 1' COOH 16 O OH 15 10 4' O 5" 28 17 14 OH 6" 3" 11 26 OH O O 21 22 18 27 H 23 24 H HO OH Dichoto-Me1 Các tương quan HMBC, COSY giúp xác định vị trí proton carbon đường 20 Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth • Nghiên cứu kết Ở đường thứ nhất, proton anomer mũi đôi với số ghép JH1’-H2’ = 5,5 Hz giá trị số ghép JH2’-H3’ = 7,5 Hz, JH3’-H4’ = 3,5 Hz giúp nhận biết đường α-L-arabinose • Ở đường thứ hai, với giá trị số ghép JH1”-H2” ≈ JH2”-H3” ≈ JH3”-H4” ≈ JH4”-H5” ≈ 8,0 – 9,0 Hz giúp nhận biết đường β-D-glucose • Đường thứ hai, xuất nhóm metyl 1,50 ppm (3H; d; J =6,0 Hz) giá trị số ghép JH1”’-H2”’ ≈ JH2”-H3” ≈ 0; JH3”-H4” ≈ JH4”-H5” ≈ 9,0 Hz giúp suy đường α-L-rhamnose • Phổ HMBC cho thấy proton H1”’, H1”, H1’ tương quan với C4”, C3’ C3 nên phần đường Dichoto-Me1 α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-Dglucopyranosyl-(1→3)-α-L-arabinopyranosyl phần đường gắn vào C3 phần aglycon qua cầu nối eter OH 1"' 5"' 3"' HO O HO OH 2" 1" 3" H 2"' 4"' 5" HO 4' O O 1,50 6"' (d; 6,0 Hz) H3C OH 6" 4" 5,88 (s) O O 5' C 2' 1' 3' O OH OH H 4,95 (d; 8,0 Hz) H 4,77 (d; 5,5 Hz) Hình 2.5: Tương quan HMBC đơn vị đường với phần aglycon Dichoto-Me1 Như Dichoto-Me1 acid 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-Dglucopyranosyl-(1→3)-α-L-arabinopyranosyl]-30-norolean-12,20(29)-dien-28-oic 21 Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu kết 29 19 20 12 13 25 OH 4" O HO 6"' H3C HO 5"' 3"' 4"' 3" O 2" O OH O 5' 3' 1" 2' 1' OH 15 COOH 16 O 28 17 10 4' O 5" 18 14 OH 6" 1"' 11 26 21 22 27 H 23 24 H 2"' HO OH Acid 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)α-Larabinopyranosyl]-30-norolean-12,20(29)-dien-28-oic (Dichoto-Me1) Hợp chất acid 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)- α-L-arabinopyranosyl]-30-norolean-12,20(29)-dien-28-oic chất kiểm tra Scifinder đại học Dược Kobe, Nhật vào ngày 25/08/2009 2.5 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC ™ Thử nghiệm độc tính Brine Shrimp Thực Bộ môn Hóa Hữu cơ, Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên Thành phố Hồ Chí Minh Tiến hành thử nghiệm độc tính Brine Shrimp cao trích Ấu trùng thử nghiệm Artemia salina Leach Mỗi mẫu thử ba lần thử với nhiều nồng độ khác Kết trình bày bảng 2.5 với liều LC50 liều mà cao trích pha nồng độ xác định giết chết 50% ấu trùng Brine shrimp 24 Một cao xem không độc Brine shrimp liều chết LC50 > 1000 μg/ml Một cao xem có nhiều hứa hẹn có hoạt tính liều LC50 < 200 μg/ml 22 Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Nghiên cứu kết Bảng 2.6: Kết thử nghiệm Brine Shrimp loại cao trích STT Mẫu cao LC50 (μg/ml) Cao eter dầu hỏa 250 Cao cloroform A 250 Cao cloroform B 150 Cao etyl acetat A 150 Cao etyl acetat B 100 Cao etyl acetat C 150 Metanol 500 Acid ursolic (mẫu chứng) 10 Nhận xét: Theo tài liệu [4], loại cao cloroform B, etyl acetat có liều LC50 < 200 μg/ml, có hoạt tính hứa hẹn nên chọn tiếp tục thử nghiệm nghiên cứu sâu Chương KẾT LUẬN 23 Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Kết luận 3.1 KẾT LUẬN Quá trình nghiên cứu An điền lưỡng phân Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth thuộc họ Cà phê (Rubiaceae) thu hái tỉnh Bình Phước, thu số kết sau • Cô lập hợp chất hữu Từ 15 kg An điền lưỡng phân thu 1,64 kg bột khô Bột trích kiệt etanol theo phương pháp ngâm dầm thu cao etanol thô 100,92 g Sử dụng phương pháp trích pha rắn silica gel để phân chia cao etanol thành loại cao khác Thu suất cao so với cao etanol ban đầu: cao eter dầu hỏa (3,21 g; 3,18%), cao cloroform A (3,91 g; 3,87%), cao cloroform B (5,49 g; 5,44%), cao etyl acetat A (5,98 g; 5,93%), cao etyl acetat B (0,112 g; 0,11 %), cao etyl acetat C (8,96 g; 8,88%) cao metanol (50,83 g; 50,37 %) Một số cao lựa chọn để nghiên cứu luận văn Từ cao etyl acetat C cô lập hợp chất, ký hiệu Dichoto-Ace4 Từ cao metanol cô lập hợp chất, ký hiệu Dichoto-Me1 Sử dụng phương pháp hóa lý đại NMR, MS, kết hợp so sánh với tài liệu tham khảo, xác định cấu trúc hợp chất cô lập sau: Dichoto-Ace4 3-O-metyl-D-chiro-inositol [hay D-(+)-pinitol] Dichoto-Me1 acid 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl(1→3)-α-L-arabinopyranosyl]-30-norolean-12,20(29)-dien-28-oic • Thử nghiệm hoạt tính sinh học Thử nghiệm độc tính Brine Shrimp Thử nghiệm độc tính Brine Shrimp loại cao eter dầu hỏa, cloroform A, cloroform B, etyl acetat A, etyl acetat B, etyl acetat C, metanol, kết cho thấy loại cao cloroform B, cao etyl acetat có độc tính vừa phải với Brine Shrimp loại cao lại có độc tính yếu 24 Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Kết luận CẤU TRÚC CÁC HỢP CHẤT CÔ LẬP ĐƯỢC OH HO HO H3CO OH OH 3-O-Metyl-D-chiro-inositol [hay D-(+)-pinitol] (Dichoto-Ace4) 29 19 20 12 13 25 OH 4" O HO 6"' H3C HO 5"' 3"' 4"' 1"' O 2" O OH O 5' 3' 2' 1" 1' OH 15 O COOH 16 28 17 10 4' O 5" 18 14 OH 6" 3" 11 26 21 22 27 H 23 24 H 2"' HO OH Acid 3-O-[α-L-rhamnopyranosyl-(1→4)-β-D-glucopyranosyl-(1→3)- α-L-arabinopyranosyl]-30-norolean-12,20(29)-dien-28-oic (Dichoto-Me1) 3.2 HƯỚNG NGHIÊN CỨU TIẾP THEO Trong thời gian tiếp theo, khảo sát cao lại đặc biệt phân đoạn cao metanol Đồng thời tiến hành thử nghiệm hoạt tính kháng khuẩn độc tính dòng tế bào ung thư hợp chất cô lập Chương THỰC NGHIỆM 25 Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Thực nghiệm 4.1 TRÍCH LY CÔ LẬP MỘT SỐ HỢP CHẤT HỮU CƠ 4.1.1 Hóa chất • Dung môi dùng sắc kí cột, sắc kí điều chế mỏng gồm: eter dầu hỏa (60 – 90 oC), cloroform, etyl acetat, aceton, metanol, etanol hóa chất Trung Quốc (Xilong), Việt Nam (Chemsol) làm khan Na2SO4 sử dụng lại • Thuốc thử để hình chất sắc kí mỏng: dung dịch H2SO4 50%, dung dịch FeCl3/EtOH, đèn UV • Silica gel 60G F254 loại dùng cho sắc kí lớp mỏng, Merck Silica gel 60 (0,040 – 0,063 mm), Merck Sắc kí lớp mỏng, sắc kí điều chế 25DC - Alufolien 20 x 20 cm Kieselgel F254 Merck 4.1.2 Thiết bị • Lọ thủy tinh, becher, cột sắc kí, phễu xốp thủy tinh, fiol, hệ thống máy hút chân không • Máy cô quay chân không Buchi-111, RE 111 Rotavapor bếp cách thủy Buchi 461 Water Bath • Thiết bị đo nhiệt độ nóng chảy: khối Maquenne máy Polytherma-Wagner and munz (Phòng Thí nghiệm Hợp chất Tự nhiên Hóa dược) • Thiết bị đo lực triền quang: triền quang kế KRUSS-Germany, Phòng Thí nghiệm Hợp chất Tự nhiên Hóa dược, Khoa Hóa, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên • Các thiết bị ghi phổ: Phổ MS: ghi máy 5989B Serie II máy AGILENT 1100 LC-MSD trap spectrometer Phổ 1H-NMR (500 MHz), 13 C-NMR (125 MHz), DEPT- NMR 90 135, HSQC, HMBC, COSY: ghi máy cộng hưởng từ hạt nhân Bruker Avance 500 Tất phổ ghi Phòng Phân Tích Cấu Trúc, Viện Hóa Học Khoa Học Công Nghệ, Số 18 Hoàng Quốc Việt, Quận Cầu Giấy, Hà Nội 26 Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth Thực nghiệm 4.1.3 Điều chế loại cao Cây An điền lưỡng phân thu hái tỉnh Bình Phước, rửa sạch, phơi khô, cắt nhuyễn, thu bột khô 1,64 kg Bột cho vào bình thủy tinh, ngâm với etanol 95o Sau ngày dung môi trích rót ra, lọc qua giấy lọc, cô quay thu hồi dung môi, bột lại rót dung môi vào Tiếp tục trình trích thu cao etanol Cao etanol trích pha rắn silica gel, giải ly đơn dung môi từ không phân cực đến phân cực: eter dầu hỏa, cloroform, etyl acetat, metanol Sau cô quay thu hồi dung môi, thu loại cao eter dầu hỏa, cloroform A, cloroform B, etyl acetat A, etyl acetat B, etyl acetat C, metanol 4.1.4 Cô lập số hợp chất hữu Tiến hành sắc kí cột cổ điển, sắc kí điều chế loại cao thu hợp chất Dichoto-Ace4 (từ cao etyl acetat C), Dichoto-Me1 (từ cao metanol) Toàn trình theo dõi sắc kí lớp mỏng, thuốc thử hình dung dịch H2SO4 50%, dung dịch FeCl3/EtOH, đèn UV 4.2 THỬ NGHIỆM HOẠT TÍNH SINH HỌC ™ Thử nghiệm độc tính Brine Shrimp Thực phòng thí nghiệm Bộ môn Hóa Hữu cơ, Khoa Hóa, Đại học Khoa học Tự nhiên • Dụng cụ hóa chất - Trứng Brine Shrimp - DMSO, nước biển - Becher 500 ml dùng để ấp trứng, becher 250 ml dùng để chứa ấu trùng - Pipet pasteur để bắt ấu trùng - Pipetteman sử dụng cone 10 – 100 μl, 100 – 1000 μl - Đèn pin - Giá đỡ ống nghiệm có dung tích lớn ml 27 Hedyotis dichotoma Koen.ex Roth • Thực nghiệm Cách thử Thử nghiệm loại cao điều chế được, loại thử nghiệm với nhiều nồng độ khác nhau, nồng độ thử ba lần Mỗi ống nghiệm thử chứa 10 ấu thể Artemia salina Từ dung dịch mẫu 20 (mg/ml) hút lấy 500, 250, 125, 75, 50, 25 μl cho vào ống thử (sau ống tích dung dịch tổng cộng ml tương ứng với nồng độ 1000, 500, 250, 150, 100, 50 μg/ml Dùng pipet pasteur hút 10 ấu trùng cho vào ống thử Thêm dung dịch nước biển cho đủ 5ml/ống Khay che sơ lại ủ nhiệt độ phòng Sau 24 giờ, đếm số lượng ấu trùng chết, suy tỷ lệ ấu trùng chết dung dịch thử nghiệm nồng độ • Kết Kết trình bày liều LC50 liều mà cao trích pha nồng độ xác định giết chết ấu trùng Brine Shrimp vòng 24