Luận văn nghiên cứu phân tích một số hợp chất hữu cơ vòng bé bằng phương pháp HPLC MS và NMR

Vì vậy trong luận văn này, chúng tôi tập trung vào việc phân tích cấu trúc và xác định độ chọn lọc lập thể của các hợp chất β-lactamlactams, thu được từ phản ứng tổng hợp theo phương phá

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI

LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC

Người hướng dẫn khoa học:

PGS TS NGUYỄN VĂN TUYẾN

Hà Nội

MỤC LỤC

DANH MỤC CÁC CÁC HÌNH i

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ii

MỞ ĐẦU 1

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN 2

1.1 BETA LACTAM 2

1.2 TỔNG HỢP BETA LACTAM 3

1.2.1 Phản ứng Staudinger 3

1.2.2 Cơ chế phản ứng và điều khiển độ chọn lọc lập thể 4

1.3 PHÂN TÍCH CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG 7

1.3.1 Phương pháp tách các đồng phân đối quang bằng enzym 7

1.3 2 Tách các đồng phân đối quang nhờ tác nhân bất đối bổ trợ 8

1.3.3 Tách đồng phân đối quang bằng các phương pháp hóa lý hiện đại 8

1.3.4 Phân tích các đối quang nhờ phương pháp NMR 9

1.4 SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) 17

1.4.1 Khái niệm 17

1.4.2 Phân loại 17

1.4.3 Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo 17

1.4.4 Pha động trong sắc ký pha đảo 18

1.4.5 DETECTOR DAD 19

1.4.6 DETECTOR MS 20

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM 22

2.1 Phương pháp nghiên cứu và trang thiết bị 22

2.1.1 Các phương pháp tổng hợp hữu cơ 22

2.1.2 Dụng cụ và hóa chất 22

2.1.3 Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc kí lớp mỏng.23 2.1.4 Các phương pháp phân tích cấu trúc 23

2.2 Tổng hợp các hợp chất β-lactamlactam 25

2.2.1 Tổng hợp dẫn xuất 2-lactamphenoxy clorua axetic 25

2.2.2 Tổng hợp dẫn xuất imine 26

2.2.3 Tổng hợp các dẫn xuất β-lactam lactam 27

2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1 H và 13C của các hợp chất 9a, 9b, 9c, 9d, 9e, 9f 28

CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 31

3.1 TỔNG HỢP CÁC HỢP CHẤT β-lactamLACTAM 31

3.2 PHÂN TÍCH CẤU TRÚC HỢP CHẤTcis-lactamβ-lactamLACTAM 32

3.2.1 Phân tích phổ 1H-lactamNMR của hợp chất 9a 32

3.2.2 Phân tích phổ 1H –NMR của hợp chất 9b 33

3.2.3 Phân tích phổ 1H-lactamNMR của hợp chất 9c 33

3.2.4 Phân tích phổ 1H-lactamNMR của hợp chất 9d 34

3.2.5 Phân tích phổ 1H-lactamNMR của hợp chất 9e 35

3.2.6 Phân tích phổ 1H-lactamNMR của hợp chất 9e 35

3.3 XÁC ĐỊNH TỈ LỆ CÁC ĐỒNG PHÂN LẬP THỂ BẰNG HPLC-lactamMS 37

3.3.1 Khảo sát bước sóng hấp thụ đối với các chất nghiên cứu 37

3.3.2 Khảo sát phổ MS 40

3.3.3 Khảo sát chương trình dung môi cho quá trình sắc ký 41

3.4.4 Kết quả và thảo luận quá trình phân tích sắc ký 43

KẾT LUẬN 48

TÀI LIỆU THAM KHẢO 49

PHỤ LỤC 51

DANH MỤC CÁC CÁC HÌNH

Hình 1.1 Cấu trúc cơ sở β-lactamlactam 3

Hình 1.2 Phổ 1H-lactamNMR của hỗn hợp este Mosher (S)-lactam1-lactamphenylbutan-lactam1-lactamol và (R)-lactam1-lactam phenylbutan-lactam1-lactamol 10

Hình 1.3 Phổ 1 H-lactamNMR của este Mosher (R)-lactam1-lactamphenylbutan-lactam1-lactamol và (S)-lactam1-lactam phenylbutan-lactam1-lactamol 10

Hình 1.4 Phổ 1 H-lactamNMR của (-lactam)-lactamenriched và hỗn hợp (-lactam)-lactamenriched với CSA 12

Hình 1.5 Tín hiệu 1 H-lactamNMR của CH 3 trong một số trường hợp 13

Hình 1.6 Cặp tín hiệu Fiedel 14

Hình 1.7 Sơ đồ tóm tắt quá trình phân tích cấu trúc bằng phương pháp X-lactamRay 14

Hình 1.8 Phổ CD của hợp chất A và B 16

Hình 1.9 Cấu trúc của cột ODS 18

Hình 1.10 Sơ đồ nguyên lý hệ điot quang 19

Hình 1.11 Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector (cải tiến flowcell) 20

Hình 3.1 Phổ 1H của hợp chất 9a 32

Hình 3.2 Phổ 1H của hợp chất 9b 33

Hình 3.3 Phổ 1H của hợp chất 9c 33

Hình 3.4 Phổ 1H của hợp chất 9d 34

Hình 3.5 Phổ 1H của hợp chất 9e 35

Hình 3.6 Phổ 1H của hợp chất 9f 35

Hình 3.7 Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9a 37

Hình 3.8 Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9b 38

Hình 3.9 Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9c 38

Hình 3.10 Phổ hấp thụ electron của hợp chất 9d 38

Hình 3.11 Phổ MS của hợp chất 9c khi để chế độ Positive 40

Hình 3.12 Phổ MS của hợp chất 9c khi để chế độ Negative 40

Hình 3.13 Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 1 42

Hình 3.14 Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 2 42

Hình 3.15 Sắc ký đồ của hợp chất 9c khi chạy với pha động Gradient 3 42

Hình 3.16 Sắc ký đồ của hợp chất 9a 43

Hình 3.17 Phổ MS của pic 1 (hợp chất 9a) 44

Hình 3.18 Phổ MS của pic 2 (hợp chất 9a) 44

Hình 3.19 Sắc ký đồ của hợp chất 9b 45

Hình 3.20 Sắc ký đồ của hợp chất 9c 46

Hình 3.21 Sắc ký đồ của hợp chất 9d 47

DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ

Sơ đồ 1.1 Phản ứng Staudinger 3

Sơ đồ 1.2 Cơ chế phản ứng Staudinger 4

Sơ đồ 1.3 Con đường hình thành β –lactam 5

Sơ đồ 1.4 Sử dụng muối (12) tổng hợp β-lactamlactam 6

Sơ đồ 1.5 Sorbyl clorua (16) tổng hợp β-lactamlactam 6

Sơ đồ 1.6 Tổng hợp β-lactamlactam từ imine và vinylketene 7

Sơ đồ 2.1 Tổng hợp dẫn xuất 2-lactamphenoxy clorua axetic 26

Sơ đồ 2.2 Tổng hợp dẫn xuất imin 26

Sơ đồ 2.3 Tổng hợp dẫn xuất cis-lactamβ-lactamlactam 27

Sơ đồ 3.1 Tổng hợp dẫn xuất 2-lactamphenoxy clorua axetic 31

Sơ đồ 3.2 Cơ chế hình thành chất 5a,b 32

MỞ ĐẦUVới sự biến đổi không ngừng của vi khuẩn, hàng loạt thuốc kháng sinhkhông còn sử dụng được hoặc phổ tác dụng hẹp lại do khả năng kháng thuốc của

vi khuẩn Làm giảm hiệu quả điều trị bệnh và gây ra những biến chứng khôngmong muốn cho người bệnh

Azetidin-lactam2-lactamones (β-lactamlactams) đại diện cho nhóm thuốc kháng sinh quan trọng [9] và ứng dụng làm các synthon trong tổng hợp hữu cơ [13] Để tạo ra

những loại thuốc mới, có hiệu lực điều trị cao và chưa bị vi khuẩn kháng lại, thì

việc tổng hợp và bán tổng hợp β-lactamlactam mới là một việc làm rất quan trọng.

Mặt khác, như ta đã biết hoạt tính sinh học của các đồng phân quang học(đồng phân đối quang hoặc đồng phân lập thể không đối quang) là rất khác nhau

và việc tách các đồng phân đó thì rất tốn kém, tốn rất nhiều thời gian Vì vậyviệc tổng hợp chọn lọc lập thể các đồng phân quang học là rất quang trọng, làmgiảm chi phí cho thực hiện quá trình tách, tăng hiệu quả điều trị

Vì vậy trong luận văn này, chúng tôi tập trung vào việc phân tích cấu trúc

và xác định độ chọn lọc lập thể của các hợp chất β-lactamlactams, thu được từ phản

ứng tổng hợp theo phương pháp Staudinger, bằng các phương pháp hiện đại nhưHPLC-lactamMS và NMR

CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN

1.1 BETA LACTAM

β-lactamlactam được phân loại dựa theo cấu trúc vòng cơ sở và được chia thành

4 nhóm:

 β-lactamlactam kết hợp với vòng 5 cạnh bão hòa.

o β-lactamlactam có chứa vòng thiazolidine được gọi tên là penams (A)

o β-lactamlactam có chứa vòng pyrrolidine được gọi tên là carbapenams (B)

o β-lactamlactam hợp nhất để oxazolidine vòng được gọi tên là oxapenams

hoặc clavams (C)

 β-lactamlactam kết hợp với vòng năm cạnh không bão hòa:

o β-lactamlactam có chứa vòng thiazol 2,3-lactamdihydro được gọi tên là penems

(D)

o β-lactamlactam có chứa vòng 2,3-lactamdihydro-lactam1H-lactampyrrole được gọi tên là

carbapenems (E)

 β-lactamlactam kết hợp với vòng 6 cạnh chưa bão hòa:

o β-lactamlactam có chứa vòng 3,6-lactamdihydro-lactam2H-lactam1,3-lactamthiazine được gọi tên là

Hợp chất chứa vòng β-lactamlactam được ứng dụng chủ yếu trong thực tế là làm

thuốc kháng sinh

1.2 T NG H P BETA LACTAM ỔNG HỢP BETA LACTAM ỢP BETA LACTAM

Azetidin-lactam2-lactamones(β-lactamlactams) đại diện cho một nhóm các hợp chất rất quan

trọng do hoạt tính sinh học nổi tiếng của chúng [9] và là hợp chất trung gian

trong tổng hợp hữu cơ [13] Nhiều phương pháp tổng hợp β-lactamlactam đã được

phát triển như: phản ứng cộng vòng [2+2], phản ứng tạo vòng, phản ứng gắnthêm carbene, và phản ứng sắp xếp lại các hợp chất dị vòng [14].,[9]

1.2.1 Phản ứng Staudinger

Phản ứng Staudinger, phản ứng của ketene với các hợp chất chứa chức

imine, là phương pháp tổng hợp quan trọng nhất điều chế β–lactam Kể từ khi

được phát hiện ra bởi Staudinger [15]., phản ứng này từ lâu đã được nghiên cứuthực nghiệm và lý thuyết để hiểu cơ chế của nó và là cơ sở cho việc chọn lọc lập

thể Nó được áp dụng để tổng hợp một loạt các cấu trúc β-lactamlactam (Sơ đồ 1.1).

Hiện nay phản ứng này vẫn là một trong những phương pháp tốt nhất cho quá

trình tổng hợp β –lactam [14]

Sơ đồ 1.1 Phản ứng Staudinger

1.2.2 Cơ chế phản ứng và điều khiển độ chọn lọc lập thể

Cơ chế của phản ứng Staudinger được đưa ra bởi Hegedus là cơ chế mô tảtốt nhất [15] Imine, tác nhân nucleophile tấn công orbital nguyên tử trống(LUMO) của nhóm đồng phẳng carbonyl ketene tạo ketene thế Quá trình tấncông xảy ra ở bên phía ít cản trở (cách tiếp cận exo), với mặt phẳng của imine

vuông góc với ketene, tạo ra các trung gian zwitterion (5) (sơ đồ 1.2).

R2

R3

R1

Sơ đồ 1.2 Cơ chế phản ứng Staudinger

Hợp chất trung gian này đã được phát hiện và đặc trưng bởi quang phổ IR[22] Chuyển động quay của các imine đi vào mặt phẳng của ketene xảy ra

đồng thời với việc đóng vòng conrotatory tạo ra sản phẩm β –lactam (6) trong

đó nhóm imine R1 và nhóm L của ketene là cis Khi nhóm thế trên carbon sp2của imine (R1 trong sơ đồ) ổn định điện tích dương, hợp chất trung gian

zwitterioncó thể bị đồng phân hóa tạo thành dạng cis của liên kết iminium vàtạo

ra sản phẩm trans-lactamβ-lactamlactam (9) Tỷ lệ tương đối của các quá trình sẽ xác định

sản phẩm hóa học lập thể của phản ứng ketene/imine

Tính toán ab initio xác định sự có mặt của hợp chất trung gian zwitterion

và đóng vòng conrotatory [25] Nghiên cứu tiếp theo [9] khẳng định bản chấthai bước của quá trình và chứng minh một số điểm tương đồng với mô hình đềxuất bởi Houk cho phản ứng conrotatory của cyclobutenes [18]

Gần đây, nghiên cứu mới của nhóm Xu [9] đề xuất một cơ sởđể giải thíchkết quả lập thể của phản ứng, xem xét lại mô hình được mô tả bởi Hegedus và

chỉ ra nguồn gốc động học của tỷ lệ cis/trans của sản phẩm β –lactam Con đường được đề xuất cho sự hình thành β –lactam được mô tả dưới đây (Sơ đồ

1.3)

Sơ đồ 1.3.

Con

đường hình thành β –lactam Khi sử dụng ketene dẫn xuất một lần thế thường cho tấn công exo là ưu

thế Sản phẩm hóa học lập thể cuối cùng chịu ảnh hưởng bởi bản chất của cácketene và các hợp chất chức imine, vì nó là kết quả của sự cạnh tranh phản ứngđóng vòng (k1) và phản ứng đồng phân hóa imine (k2) Tỷ lệ k1/k2 xác định tỷ lệ

cis/trans của sản phẩm β –lactam Các tác giả đề xuất [9]., bước đóng vòng có

thể xảy ra dễ dàng hơn khi thêm vào một tác nhân nucleophile của một enolatenhóm chức của imine hơn là quá trình electrocyclic Tăng mật độ điện tử choketene thế và giảm mật độ điện tử cho imine thế làm tăng phản ứng đóng vòng(tăng k1), dẫn đến hình thành chủ yếu cis-lactam β –lactam Mặt khác, làm giảm mật độ

electron của ketene thế và làm tăng mật độ electron imine sẽ làm giảm giá trị k

và có lợi cho phản ứng đồng phân hóa, dẫn đến hình thành chủ yếu trans-lactam β –

lactam Các hiệu ứng điện tử của các nhóm thế trên đồng phân là một yếu tố nhỏtrong chọn lọc lập thể Cuối cùng, sau khi so sánh các phản ứng tương tự thựchiện trong các điều kiện khác nhau, các tác giả cũng thừa nhận rằng không cóảnh hưởng của sóng viba [15] hoặc ánh sáng trong độ chọn lọc lập thể của phảnứng Staudinge [21]

Độ chọn lọc lập thể cũng chịu ảnh hưởng bởi tính chất của dung môi, các

dung môi không phân cực có lợi cho sự hình thành cis-lactam β –lactam, trong khi dung môi phân cực thuận lợi cho sự hình thành trans Ngoài ra, cách ketene

được hình thành và thứ tự của bổ sung các tác nhân, cũng ảnh hưởng đến độchọn lọc lập thể của sản phẩm [27] Sự xuất hiện của các orbital liên hợp giữaketene và tác nhân imine ảnh hưởng đến độ chọn lọc lập thể của sản phẩm tương

tự như nhiệt độ [19]

Một phương pháp rất hiệu quả để thu được trans-lactam β -lactamlactam được phát

triển bởi Lectka và đồng nghiệp bằng cách sử dụng muối (12) như một anion

xúc tác ái nhân (Sơ đồ 1.4) Trên thực tế, biện pháp này không hiệu quả với acylclorua béo [28]

Sơ đồ 1.5 Sorbyl clorua (16)tổng hợp β-lactamlactam

Việc chọn lọc trans cũng thu được trong phản ứng Staudinger giữa imine

và vinylketene chứa một γ – heteroatom Cấu hình Z của nhánh vinyl của đồng

đồng phân lập thể có tác dụng ổn định vinylketene và sản phẩm chính là trans-lactam3-lactam vinyl -lactam β –lactam (Sơ đồ 1.6) [23]

Sơ đồ 1.6 Tổng hợp β-lactamlactam từ imine và vinylketene

1.3 PH N T CH C C ÂN TÍCH CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG ÍCH CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG ÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG NG PH N ÂN TÍCH CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG ĐỐI QUANG I QUANG

Phân tích các đồng phân đối quang là tách một hỗn hợp raxemic bằng các

phương pháp vật lý và hóa học Thông thường, sự tách được thực hiện sau khi

chuyển từ đồng phân đối quang sang đồng phân “dia”; do các đồng phân đối

quang có các tính chất vật lý và hóa học giống nhau nên chúng không thể tách

bằng cách trực tiếp Trong khi đó, các đồng phân “dia” có thể tách được bằng

các phương pháp kết tinh chọn lọc, phương pháp sắc ký hoặc phương phápNMR

1.3.1 Phương pháp tách các đồng phân đối quang bằng enzym

Hầu hết các enzym có tính đặc hiệu với một loại cơ chất nhất định Dựavào tính chất này, người ta đã sử dụng các enzym để chuyển hóa chọn lọc một

trong hai đối quang trong hỗn hợp Ví dụ phản ứng thủy phân hỗn hợp raxemic

của este bằng enzym pig liver estease Dưới tác dụng của enzym này, chỉ có

đồng phân S được thủy phân Nhờ đó mà người ta tách được hai đồng phân này

ra khỏi nhau

1.3 2 Tách các đồng phân đối quang nhờ tác nhân bất đối bổ trợ

Hỗn hợp raxemic hoặc hai đồng phân của các hợp chất đối quang có một

tâm bất đối thường không thể tách ra khỏi nhau Tuy nhiên, khi tham gia phản

ứng với các chất bổ trợ chiral có từ một hoặc nhiều tâm bất đối, tạo thành sản

phẩm có từ hai tâm bất đối trở lên, có thể tách được bằng các phương pháp hóa

lý khác nhau Dựa vào tính chất quan trong này năm 1953, Pasteur đã tách được

đôi đồng phân đối quang của axit tactaric nhờ sự tạo muối “dia” của hỗn hợp hai

đối quang với (+)-lactamcinchotoxin, có độ tan khác nhau nên có thể tách ra khỏi nhau

bằng phương pháp kết tinh Phương pháp này vẫn được sử dụng hiệu quả để

tách hỗn hợp hai đồng phân đối quang ra khỏi nhau

Ngoài ra, có thể chuyển hóa các đối quang của các hợp chất có một tâm bất đối

thành các đồng phân “dia” nhờ phản ứng với tác nhân bất đối bổ trợ khác Các

đồng phân “dia” nhận được có thể tách ra bằng các phương pháp hóa lý khác

nhau Cuối cùng các tác nhân bất đối bổ trợ được loại bỏ, thu được các đồng

phân đối quang tinh khiết

muèi (+)-axit tactaric (+)-cinchotoxin tan

muèi (-)-axit tactaric (+)-cinchotoxin

+

kh«ng tan

(-)-axit tactaric + (+)-cinchotoxin

thñy ph©n

1.3.3 Tách đồng phân đối quang bằng các phương pháp hóa lý hiện đại

Các đối quang có thể được tách nhờ các phương pháp sắc ký khí (GC),

sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) có sử dụng các cột chiral Bản chất của các

phương pháp này là các hỗn hợp đối quang tương tác với pha tĩnh (tâm bất đối

trên cột chiral), nghĩa là chỉ một trong các đối quang có tương tác mạnh hơn với

tâm bất đối của cột Đối quang có tương tác yếu sẽ được rửa giải nhanh nhờ phađộng, kết quả là hai đối quang được tách ra khỏi nhau Phương pháp này thườngđược sử dụng để xác định độ chọn lọc đối quang trong của các phản ứng Nếuphản ứng nhận được hỗn hợp có hai đồng phân đối quang A và B

(ee=enantiomer excess, de=diasteroisomer excess), độ chọn lọc đối quang được

xác định theo công thức:

1.3.4 Phân tích các đối quang nhờ phương pháp NMR

Để xác định tỉ lệ các đồng phân lập thể có thể sử dụng nhiều phương phápkhác nhau, nhưng phổ NMR là một phương pháp hữu ích và phổ biến, vì nókhông làm thay đổi tỉ lệ của các đồng phân trong hỗn hợp và chỉ cần lượng nhỏhỗn hợp hai đồng phân đối quang Các đồng phân khác nhau được xác định nhờ

+

O

O O

O O

S

O O

di teroisomerA di teroisomerB







độ dịch chuyển hóa học và hằng số tương tác spin-spin của những nguyên tử

hydro trong từ trường

Trong phổ NMR, phần lớn hạt nhân của 1H và 13C của hai đồng phân

“dia” sẽ có tín hiệu chuyển dịch hóa học khác nhau Tỉ lệ của các đồng phân có

mặt trong hỗn hợp có thể tính toán được bằng sự phân tích các tín hiệu này Nếu

trong hỗn hợp có nhiều hơn hai đồng phân “dia” thì việc xác định tỉ lệ các đồng

phân bằng phổ NMR sẽ gặp khó khăn hơn, đặc biệt là các đồng phân chiếm tỉ lệnhỏ

a) Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch (Shift reagent) Mosher

Đối với các hợp chất có một tâm bất đối thì hai cấu hình của chúng sẽkhông phân biệt được bằng phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân, do tínhiệu của chúng không được phân tách trong từ trường Để phân biệt được haicấu hình của các hợp chất có một tâm bất đối, người ta phải chuyển hợp chất

nghiên cứu thành đồng phân dia Cơ sở của phương pháp Mosher là chuyển hợp chất có một tâm bất đối thành đồng phân dia bằng cách thực hiện phản ứng của hợp chất nghiên cứu với axit R-lactamMosher để tạo thành este hoặc thành amit… Sau

đó, nghiên cứu cấu hình của các hợp chất dia này sẽ đưa ra được cấu hình của

chất ban đầu Ví dụ, để xác định cấu hình tuyệt đối của hợp chất 1-lactamphenylbutan-lactam

1-lactamol có một tâm bất đối, Mosher đã tổng hợp este của nó với axit R-lactamMosher để tạo ra hai đồng phân dia như mô tả trong sơ đồ dưới đây

hạt nhân proton Tín hiệu của proton bậc ba tại trung tâm bất đối của dẫn xuất

este Mosher của (R)-lactam1-lactamphenylbutan-lactam1-lactamol sẽ dịch chuyển về phía trường cao, trong khi tín hiệu proton bậc ba tại tâm bất đối của dẫn xuất (S)-lactam1-lactamphenylbutan-lactam

1-lactamol sẽ dịch chuyển về phía trường thấp Như vậy, người ta có thể xác định được

phenylbutan-lactam1-lactamol và (S)-lactam1-lactamphenylbutan-lactam1-lactamol

Ngoài axit R-lactamMosher, hiện nay người ta đang nghiên cứu sử dụng một số

tác nhân bổ trợ khác để xác định cấu hình tuyệt đối của một số hợp chất ancol,amin và axit cacboxylic có một tâm bất đối, ví dụ như các tác nhân bổ trợ sau

b) Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch Chiral Pirkle ancol (CSA)

Chiral aryltrifluorometyl carbinol (chiralPirkle ancol) là những tác nhân

hữu dụng nhất, cho phép xác định nhanh tỷ lệ của các đồng phân lập thể Khi cómặt của chất này, các đối quang của lacton, amin và ancol trong từ trường tạo raphổ không tương đương Có thể là do cả hydroxyl và các hydro cacbinyl củachất CSA tạo ra các tương tác với các tâm bazơ Ưu điểm của của phương phápnày là không cần phải thực hiện các phản ứng chuyển hóa thành các dẫn xuất

OHH

MeO

O

OHH

MeO

O

OEtH

MeO

O

OHH

BocN

O

với tác nhân bổ trợ nên hạn chế được quá trình raxemat hóa, đặc biệt là có thể sử

dụng để xác định cấu hình của các chất có hàm lượng nhỏ

hai đối quang oxaziridin nhờ tác nhân bổ trợ CSA, kết quả do tương tác cầu

hydro của oxazirindin với CSA tạo thành phức dia, dẫn đến một số tín hiệu của

hai đối quang được tách biệt trong từ trường Nghiên cứu của phổ 1H-lactamNMR củahỗn hợp hai đồng phân (-lactam)-lactamoxaziridin khi không có tác nhân chuyển dịch CSAthì các tín hiệu proton không phân biệt được trong từ trường, nhưng khi cho kết

hợp với (S)-lactam(+)-lactamCSA thì các tín hiệu của metyl, metin được tách ra Dựa vào phổ

này, người ta có thể xác định được tỷ lệ hai đồng phân đối quang của oxaziridin

Hình 1.4 Phổ 1H-lactamNMR của (-lactam)-lactamenriched

và hỗn hợp (-lactam)-lactamenriched với CSA

c) Phương pháp sử dụng tác nhân chuyển dịch Eu(hfc) 3 )

Eu(hfc)3 là phức của kim loại thuận từ với ligand hữu cơ có tâm bất đối Khi tácnhân Eu(hfc)3 kết hợp với nhóm chức (NH2, OH, SH …) trong phân tử có một

trung tâm bất đối sẽ tạo thành đồng phân “dia” Phức dia tạo thành có một số

proton được tách ra trong từ trường và chuyển về trường thấp Sự tách biệt và độchuyển dịch về phía trường thấp của một số proton phụ thuộc vào nồng độ củatác nhân phức Eu(hfc)3

CF3

HO H

s

CSA

O N

Ví dụ, nghiên cứu phổ 1H-lactamNMR của hỗn hợp hai đối quang (R,S)-lactam1-lactam

axetyl-lactam1-lactamphenylbutan, các tín hiệu proton của hai đối quang không phân biệtđược trong từ trường Tuy nhiên, khi được tạo phức với tác nhân chuyển dịchEu(hfc)3 thì có sự tách tín hiệu Nhóm metyl (triplet) được tách thành hai triplet

có cường độ tương đương nhau Sự tách tín hiệu của proton trong từ trường phụthuộc vào bản chất của chất nghiên cứu và nồng độ của tác nhân chuyển dịch

Qua ví dụ trên ta thấy, tín hiệu proton ở nhóm CH3 của hỗn hợp (R,S)-lactam1-lactam

axetyl-lactam1-lactamphenylbutan khi tạo phức với Eu(hfc)3 đều được tách ra và có độchuyển dịch hóa học chuyển về phía trường thấp Sự tách tín hiệu và độ chuyểndịch hóa học proton ở nhóm CH3 của hai đối quang có sự khác biệt rõ ràng Đối

với (R)-lactam1-lactamaxetyl-lactam1-lactamphenylbutan, tín hiệu proton của nhóm CH3 được chuyển

dịch về phía trường cao so với (S)-lactam1-lactamaxetyl-lactam1-lactamphenylbutan Như vậy, có thể phân biệt và xác định được tỷ lệ hai đồng phân (R)-lactam1-lactamaxetyl-lactam1-lactamphenylbutan và (S)-lactam1-lactam

axetyl-lactam1-lactamphenylbutan nhờ 1H-lactamNMR của chúng khi tạo phức với tác nhân chuyểndịch Eu(hfc)3 (xem hình 5)

R1

O

Hình 1.5 Tín hiệu 1H-lactamNMR của CH3 trong một số trường hợp

1.3.5 X-ray tinh thể

a Giới thiệu chung

Phương pháp X-lactamray phân tử là phương pháp hiện đại nhất để xác định cấutrúc phân tử của một hợp chất hữu cơ Từ phương trình Bragg, người ta tính toán

độ dài của các cạnh tế bào cơ sở (a,b,c), chỉ số Miler (h,k,l), góc giữa các trục

tinh thể (α,β,γ), thể tích tế bào tinh thể cơ sở (V) và số lượng phân tử (n) xây

dựng nên tế bào cơ sở

Phương trình Bragg: 2d.sin(θ) = nλ ) = nλ

Thể tích tế bào cơ sở: V = abc(1-lactamcos2α-lactamcos2β-lactamcos2γ+2cosαcosβcosγ)1/2

Số lượng phân tử trong một tế bào cơ sở n = V.d.6,023.1023 (d: tỷ trọng g/

cm3)

Mặt khác, khi chiếu bức xạ tia X vào phân tử, ở mỗi trung tâm liên kết sẽphát ra một cặp tín hiệu Friedel phản xạ theo hai hướng (h,k,l) và hướng ngược

lại (-lactamh,-lactamk,-lactaml) Cường độ của tín hiệu Friedel (Fhkl, F-lactamh,-lactamk-lactaml) được tính toán nhờcường độ của tín hiệu nhiễu xạ (Ihkl) (|Fhkl| = (Ihkl)1/2)

Hình 1.6 Cặp tín hiệu Fiedel

Mật độ electron tại một điểm trong tế bào cơ bản sẽ được tính toán bằngcông thức:

ρ(x,y,z) = [ Σhkl Fhkl exp{-lactam2p(hx + ky + lz)}] / V] / VBằng cách đo cường độ của tất cả các tín hiệu nhiễu xạ Ihkl theo mặt h,k,lkhi đã biết được các thông số cơ bản của tế bào cơ sở theo phương trình Bragg ởtrên, người ta sẽ tính toán được mật độ electron tại mọi điểm trong không giancủa tế bào cơ sở, từ đó có thể xây dựng được bản đồ mật độ điện tích của phântử.Từ dữ liệu bản đồ mật độ electron, chương trình máy tính sẽ dựng được cấutrúc không gian ba chiều của phân tử Quá trình xác định cấu trúc của hợp chấthữu cơ bằng phương pháp X-lactamray phân tử có thể được tóm tắt như sau:

Hình 1.7 Sơ đồ tóm tắt quá trình

phân tích cấu trúc bằng phương pháp X-lactamRay

b Xác định cấu hình tuyệt đối

Phương pháp X-lactamray tinh thể có khả năng xác định chính xác cấu hìnhtuyệt đối của một phân tử, nếu trong phân tử có nguyên tử có tán xạ tia X bấtthường Để xác định cấu hình tuyệt đối của phân tử bằng phương pháp X-lactamraytinh thể người ta sử dụng phương pháp của Bijvoet và phương pháp so sánh chỉ

số R

Phương pháp Bijvoet: Do mỗi trung tâm bất đối khi được chiếu bức xạ tia

X sẽ phát ra một cặp tín hiệu bất thường Friedel, lợi dụng nguyên tắc này

H,K,L

-lactamH,-lactamK,-lactamL

Bijvoet đã so sánh tín hiệu tán xạ của một nguyên tử đánh dấu với tín hiệu củacặp bức xạ Friedel ở trung tâm bất đối phản xạ theo hướng (h,k,l) và hướngngược lại (-lactamh,-lactamk,-lactaml), để xác định cấu hình tuyệt đối.

Phương pháp so sánh chỉ số R: Chỉ số R được xây dựng trên cơ sở hàmthống kê Hamilton từ toàn bộ dữ liệu của các cặp đồng phân đối quang và được

so sánh với các tính toán Bijvoet để xác định kiểu đồng phân đối quang Nếu giátrị của chỉ số R có sự sai khác, dù rất nhỏ (±0,1%) thì phải đánh giá lại các giátrị này bằng phương pháp thống kê

Như vậy, cả hai phương pháp này chỉ dựa vào tia phản xạ đặc biệt cócường độ cao do ảnh hưởng của cấu trúc ở những trung tâm bất đối của phân tử

mà chưa so sánh được những tia tán xạ yếu Những yếu tố tán xạ yếu chỉ được

sử dụng khi dữ liệu X-lactamray có số lượng lớn Phương pháp X-lactamray tinh có thể sửdụng hữu hiệu nhất đối với các hợp chất không chứa nguyên tử nặng hơn oxi

Với những chất quang hoạt không tồn tại ở dạng đơn tinh thể, người ta cóthể xác định cấu hình tuyệt đối của chúng bằng cách cho chúng phản ứng vớimột chất khác có chứa một hay nhiều trung tâm bất đối đã biết cấu hình tuyệtđối Các hợp chất có cấu hình tuyệt đối đã biết được chọn để nghiên cứu trongphương pháp này là những chất có khả năng dễ kết tinh để nhận được dạng đơntinh thể Việc xác định cấu hình tuyệt đối của các hợp chất quang hoạt bằngphân tích X-lactamray được thực hiện dựa vào phần cấu hình tuyệt đối của chất gắn kếtvới chất nghiên cứu Ngoài ra, việc đưa nhóm nguyên tử nặng như halogen (Cl,

Br, I) vào phân tử hợp chất quang hoạt cũng cho phép xác định cấu hình tuyệtđối của chất đó nhờ phương pháp Bijvoet ở trên

tuyệt đối được chuyển thành este với axit Mosher để tạo thành đồng phân dia.

Trong trường hợp chất tạo thành thu được dưới dạng đơn tinh thể, cấu hình tuyệt

OO

H

OHH

OCHPh3

R

R S S

đối của hydroxy lacton được xác định thông qua cấu hình tuyệt đối đã biết củaphần tác nhân Mosher thông qua phân tích phổ X-lactamray.

1.3.6 Phổ CD

Phương pháp phổ CD cũng dựa trên nguyên tắc cơ bản của hiệu ứngCotton, cơ sở của phương pháp này là nghiên cứu bước chuyển ở trung tâm bấtđối (circular dichroism) hay còn gọi là phổ nhị sắc tròn Việc xác định phổ CDrất phức tạp, vì nó phụ thuộc vào bản chất của hợp chất nghiên cứu, chỉ cónhững hợp chất có bước chuyển n-lactam-lactam-lactam-lactam>π* và π >π* (có nhóm mang màu) mớiπ* và π-lactam-lactam-lactam-lactam>π* và π >π* (có nhóm mang màu) mớiπ* (có nhóm mang màu) mới

đo được hiệu ứng Cotton Trong trường hợp chất cần nghiên cứu không có bướcchuyển n-lactam-lactam-lactam-lactam>π* và π >π* (có nhóm mang màu) mớiπ* và π-lactam-lactam-lactam-lactam>π* và π >π* (có nhóm mang màu) mớiπ* cần phải gắn thêm một nhóm mang màu vào phân

tử Xác định cấu hình tuyệt đối của một hợp chất hữu cơ được thực hiện nhờ sosánh hiệu ứng Cotton của nó với hiệu ứng Cotton của chất có cấu trúc tương tự

đã biết về cấu hình tuyệt đối Như vậy, cần phải có nhiều hợp chất có cấu trúctương đồng đã biết để so sánh và xác định cấu hình tuyệt đối của chất cầnnghiên cứu

Ví dụ, khi muốn xác định cấu hình của flavan mới, người ta phải so sánhhiệu ứng Cotton của hợp chất cần nghiên cứu với hiệu ứng Cotton flavan đã biếttrước cấu hình tuyệt đối Hợp chất flavan B đã biết cấu hình tuyệt đối, hợp chấtflavan A chưa biết cấu hình tuyệt đối, hiệu ứng Cotton của A và B trên phổ CD

là tương tự nhau nhưng có chiều ngược nhau, nên cấu hình tuyệt đối của A làngược so với B

Hình 1.8 Phổ

CD của hợp chất A và

B

Ngoài ra, với các

phân tử hữu cơ quang

OHHO

O

OHOHOH

OH

HO

A

B

1.4 S C KÝ L NG HI U N NG CAO (HPLC) ẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) ỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) ỆU NĂNG CAO (HPLC) ĂNG CAO (HPLC)

1.4.1 Khái niệm

Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) ra đời năm 1967-lactam1968trên cơ sở phát triển và cải tiến từ phương pháp sắc ký cột cổ điển HPLC là mộtphương pháp chia tách trong đó pha động là chất lỏng và pha tĩnh chứa trong cột

là chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lênmột chất mang rắn, hay một chất mang đã được biến bằng liên kết hóa học vớicác nhóm chức hữu cơ Phương pháp này ngày càng được sử dụng rộng rãi vàphổ biến vì nhiều lý do: có độ nhạy cao, khả năng định lượng tốt, thích hợp táchcác hợp chất khó bay hơi hoặc dễ phân hủy nhiệt

Phạm vi ứng dụng của phương pháp HPLC rất rộng, như phân tích cáchợp chất thuốc trừ sâu, thuốc kháng sinh, các chất phụ gia thực phẩm trong lĩnhvực thực phẩm, dược phẩm, môi trường…

1.4.2 Phân loại

Dựa vào sự khác nhau về cơ chế tách chiết sử dụng trong HPLC, người tachia HPLC thành 4 loại:

 Sắc ký hấp phụ hay sắc ký lỏng rắn (adsorption/liquid chromatography)

 Sắc ký phân bố (partition chromatography)

 Sắc ký ion (ion chromatography)

 Sắc ký rây phân tử (size exclusion/gel permeation chromatography)

Riêng SKPB được chia thành hai loại dựa trên độ phân cực tương đối giữapha tĩnh và pha động: sắc ký pha thường – SKPT (normal phasechromatography) và sắc ký pha đảo – SKPĐ (reversed phase chromatography)

Trong đó, sắc ký pha đảođược sử dụng nhiều hơn cả

1.4.3 Pha tĩnh trong sắc ký pha đảo

Trong sắc ký phân bố nói chung, pha tĩnh là những hợp chất hữu cơ được gắn lên chất mang rắn silica hoặc cấu thành từ silica theo hai kiểu:

 Pha tĩnh được giữ lại trên chất mang rắn bằng cơ chế hấp phụ vật lý → sắc ký lỏng-lactamlỏng (liquid-lactamliquid chromatography)

 Pha tĩnh liên kết hóa học với chất nền → sắc ký pha liên kết (bonded phase chromatography)

Trong quá trình sử dụng, người ta nhận thấy sắc ký pha liên kết có nhiều

ưu điểm hơn sắc ký pha lỏng-lactamlỏng vì một số nguyên nhân sau:

o Pha tĩnh trong hệ sắc ký lỏng-lactamlỏng dễ bị hòa tan bởi pha động nên

dễ bị mất mát pha tĩnh trong thời gian sử dụng và gây nhiễm đối với hợp chất phân tích

o Do pha tĩnh của sắc ký lỏng-lactamlỏng dễ tan trong pha động nên người

ta không thể ứng dụng phương pháp rửa giải gradient dung môi

Vì vậy, người ta thường chỉ quan tâm đến loại sắc ký phân bố pha liên kết

và phần lớn các loại cột sử dụng hiện nay trong sắc ký phân bố đều có cấu trúc dạng này

Trong SKPĐ, nhóm thế R trong hợp chất siloxan hầu như không phân cựchoặc ít phân cực Đó là các ankyl mạch dài như C8 (n-lactamoctyl), C18 (n-lactamoctadecyl)còn gọi là ODS (octadecylsilan) hoặc các nhóm alkyl ngắn hơn như C2; ngoài racòn có cyclohexyl, phenyl trong đó nhóm phenyl có độ phân cực cao hơn nhómalkyl Người ta nhận thấy các alkyl mạch dài cho kết quả tách ổn định hơn cácloại khác nên đây là loại được sử dụng nhiều nhất

Hình 1.9 Cấu trúc của

cột ODS1.4.4 Pha động trong sắc ký pha đảo

Pha động trong sắc ký lỏng nói chung phải đạt những yêu cầu sau:

 Hòa tan mẫu phân tích

 Phù hợp với đầu dò

 Không hòa tan hay làm mòn pha tĩnh

 Có độ nhớt thấp để tránh áp suất dội lại cao

 Tinh khiết dùng cho sắc ký

Trong sắc ký pha đảo, dung môi pha động có độ phân cực cao Trên lýthuyết chúng ta có thể sử dụng khá nhiều dung môi nhưng kinh nghiệm thực tế

cho thấy nước, methanol, acetonitrile, tetrahydrofuran là đạt yêu cầu nhất Trong

đó nước là một dung môi được cho vào các dung môi hữu cơ để giảm khả năngrửa giải

Trong quá trình tách của SKPĐ, sự tương tác giữa hợp chất cần phân tích

và pha động phụ thuộc rất nhiều vào moment lưỡng cực, tính acid hoặc tính basecủa dung môi Do đó độ phân cực và độ rửa giải của dung môi có tác động lớnlên khả năng phân tách của sắc ký

Thông thường pha động trong SKPĐ bao gồm một hỗn hợp nước hoặcdung dịch đệm với một hoặc nhiều dung môi hữu cơ phân cực tan được trongnước

Thành phần pha động có thể cố định trong suốt quá trình chạy sắc ký (chế

độ isocratic) hoặc được thay đổi theo một chương trình đã định sẵn (chươngtrình gradien dung môi) để có hiệu quả tách tốt hơn

1.4.5 DETECTOR DAD

Trung tâm của thiết bị là một dãy diot hàng trăm chiếc (những máy hiệnnay có thể lắp 1024 diot) được sắp xếp cạnh nhau liên tục thành dãy trên tấmsilicon tinh khiết, kích thước 1-lactam6 cm, độ rộng của mỗi diot riêng là 0,0015 –0,050 mm

Hình 1.10.

Sơ đồnguyên lý

hệ điotquang

Trên mỗi tấm silicon còn có một tụ điện, một công tắc cho mỗi diot Hệthống được điều khiển bằng computer luôn ngắt mỗi công tắc làm cho tụ điệnđược tích – 5V Khi bức xạ chiếu vào mặt diot làm đóng mạch điện và tụ điệnphóng điện Sự nạp điện lại được tiếp tục ở chu kỳ tiếp theo Kết quả là dòngđiện tỷ lệ với lượng bức xạ chiếu vào, khuếch đại, số hóa và ghi lại vào bộ nhớ

a) đường quang chữ Z, b) đường quang bong bóng,

c) đường quang phản xạ nhiều lần Hình 1.11 Các biện pháp cải tiến tăng độ nhạy của detector (cải tiến flowcell).

1.4.6 DETECTOR MS

Phương pháp khối phổ (Mass Spectrometry-lactamMS) là phương pháp nghiêncứu các chất bằng cách đo, phân tích chính xác khối lượng phân tử của chất đódựa trên sự chuyển động của các ion nguyên tử hay ion phân tử trong điệntrường hoặc từ trường nhất định Tỉ số giữa khối lượng và điện tích (m/z) có ảnhhưởng rất lớn đối với chuyển động này của ion Nếu biết được điện tích của ionthì ta dễ dàng xác định được khối lượng của ion đó

Do quá trình phân tích với đầu dò MS đòi hỏi mức độ chân không cao,nhiệt độ cao, các chất khảo sát phải ở trạng thái khí, vận tốc dòng chảy nhỏ;trong khi hệ thống LC lại hoạt động ở áp suất cao với một lượng dung môitương đối lớn, nhiệt độ tương đối thấp, các chất phân tích ở thể lỏng Điều nàygây rất nhiều khó khăn trong việc tìm cách giải quyết được sự tương thích giữa

hệ thống sắc ký lỏng và đầu dò khối phổ

Để khắc phục những khó khăn trên, cần phải có một kỹ thuật trung giangọi là giao diện Rất nhiều kỹ thuật giao diện (interface technology) như chùmtia hạt (FB), bắn phá nguyên tử nhanh dòng liên tục (CF-lactamFAB),… đã đượcnghiên cứu và ứng dụng, nhưng mãi cho đến cuối thập nhiên 80, mới có sự độtphá thật sự với kỹ thuật ion hóa tại áp suất khí quyển (Atmospheric PressureIonization – API)

Ưu điểm nổi bật của API là khả năng hình thành ion tại áp suất khí quyểnngay trong buồng ion hóa Điều này khác biệt với các kiểu ion hóa sử dụng

trước đó cho LC/MS như bắn phá nguyên tử nhanh với dòng liên tục(continuous flow-lactam fast atom bombardment CF-lactamFAB) hay như tia nhiệt(thermospray – TS) đều đòi hỏi áp suất thấp Một thuận lợi nữa của API là sựion hóa mềm (soft ionization), không phá vỡ cấu trúc của hợp chất cần phân tíchnhờ đó thu được khối phổ của ion phân tử Ngoài ra, với kỹ thuật này, người ta

có thể điều khiển được quá trình phá vỡ ion phân tử để tạo ra những ion con tùytheo yêu cầu phân tích

Có ba kiểu hình thành ion ứng dụng cho nguồn API trong LC/MS:

* Phun mù điện tử (ESI)

* Ion hóa hóa học tại áp suất khí quyển (APCI)

* Ion hóa bằng photon tại áp suất khí quyển (APPI)

Trong đó, hai kỹ thuật APCI và ESI, đặc biệt là ESI được sử dụng nhiềuhơn cả

c Các loại đầu dò khối phổ

Có các loại tổng quát sau:

* Sự uấn cong nhờ từ trường (Magnetic field deflection)

-lactam Máy khối phổ đơn giản sử dụng từ trường (a single focussing magneticsector mass spectrometer): máy có độ phân giải thấp

-lactam Máy khối phổ nhị tiêu (double focussing mass spectrometer): sự uốncong nhờ từ trường và điện trường, máy có độ phân giải cao

* Máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass spectrometer)

-lactam Máy khối phổ tứ cực (quadrupole mass filter)

-lactam Bẫy ion (quadrupole ion storage; ion trap)

* Máy khối phổ sử dụng kỹ thuật thời gian bay (time of flight massspectrometry)

* Máy khối phổ cộng hưởng cyclotron-lactamion, sử dụng phép biến đổi Fourier(Fourier transform-lactamion cyclotron resonance mass spectrometry: FTMS)

Trong đó, Máy khối phổ tứ cực; máy khối phổ sử dụng kỹ thuật thời gianbay; máy khối phổ cộng hưởng cyclotron-lactamion, sử dụng phép biến đổi

CHƯƠNG 2 THỰC NGHIỆM

2.1 Ph ương pháp nghiên cứu và trang thiết bị ng pháp nghiên c u v trang thi t b ứu và trang thiết bị à trang thiết bị ết bị ị.

2.1.1 Các phương pháp tổng hợp hữu cơ

Sử dụng phản ứng đóng vòng Staudinger và một số phương pháp khác tạiphòng thí nghiệm Hoá dược-lactam Viện Hoá học-lactam Viện Khoa học & Công nghệ ViệtNam

2.1.2 Dụng cụ và hóa chất.§

Nguyên liệu đầu: phenol, m-lactamclophenol, este 2-lactambrom metylaxetat, benzylamin, p-brom benzandehit….

Dung môi: axeton, metanol, etanol, n-lactamhexan, diclometan, etyl axetat,nước

Dung dịch hiện màu: dragendoff, ceri sunfat/ axit sunfuric đặc

Các chất xúc tác và dung môi khác cho các phản ứng được mua của hãng Merck (Đức) và Aldrich (Mỹ)

Bột silica gel cho sắc kí cột kích thước 0,01÷0,02 mm (Merck), bông y tếdùng nhồi cột

Bản mỏng sắc kí silica gel đế nhôm tráng sẵn Art 5554 DC – AlufolienKiesel 60 F254 , dày 0,2 mm, kích thước 20 x 20 cm (Merck)

Cột sắc kí thuỷ tinh, giá ống nghiệm, ống capila, bình triển khai sắc kí bảnmỏng

Bình cầu phản ứng 250 ml, con khuấy từ, máy khuấy từ, giá kẹp bìnhphản ứng

Phễu chiết 250 ml, cốc mỏ vịt, natri sunfat để làm khô

2.1.3 Định tính phản ứng và kiểm tra độ tinh khiết của dẫn xuất bằng sắc kí lớp mỏng.§

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) được sử dụng để định tính chất đầu và sảnphẩm Thông thường chất đầu và sản phẩm với giá trị Rf khác nhau, màu sắc và

sự phát quang khác nhau… Dùng sắc kí lớp mỏng để biết được phản ứng xảy

ra, không xảy ra, kết thúc phản ứng… dựa vào các vết trên bản mỏng, cùng cácgiá trị Rf tương ứng Giá trị Rf của các chất phụ thuộc vào bản chất và phụ thuộcvào dung môi làm pha động Dựa trên tính chất đó, chúng ta có thể tìm đượcdung môi hay hỗn hợp dung môi để các chất tách ra xa khỏi nhau (Rf khác xanhau) hay tìm được hệ dung môi cần thiết để tinh chế các chất

Quy trình chạy sắc kí lớp mỏng:

Cho chất lên bản sắc kí: Hòa tan hoàn toàn chất nghiên cứu bằng dung

môi dùng để điều chiết sao cho dung dịch thu được không quá loãng hay quáđặc Dùng capila thủy tinh lấy chất rồi chấm lên trên bản mỏng sao cho các vệtchấm phải tròn, gọn và các mép bên của bản mỏng 0,5 cm; cách chân bản mỏng0,7 cm Các vết chất cách nhau 0,5 cm Chiều cao bản mỏng 7 cm

Tiến hành sắc kí lớp mỏng:

Pha hệ dung môi với tỷ lệ thích hợp cho vào bình sắc kí có nút nhám vàlắc kỹ Đặt một mảnh giấy lọc vào thành bình để bão hòa dung môi Lượng dungmôi lấy sao cho khi triển khai SKLM không để cho dung môi ngập vết chất

Cho bản mỏng đã chấm vào bình sắc kí, bản mỏng được đặt nghiêng mộtgóc 15 Bình sắc kí phải để yên trong suốt quá trình triển khai Khi tiền tuyếndung môi cách mép trên 0,3 cm thì lấy bản mỏng ra Làm khô bản mỏng, sau đóhiện sắc phổ dưới đèn tử ngoại rồi bằng thuốc hiện

2.1.4 Các phương pháp phân tích cấu trúc

Để xác định cấu trúc các chất hữu cơ tổng hợp được, chúng tôi tiến hành các phương pháp sau:

-lactam Xác định nhiệt độ nóng chảy

Nhiệt độ nóng chảy của các chất tổng hợp được đo trên máy Gallenkampcủa Anh tại phòng thí nghiệm Tổng hợp hữu cơ -lactam Viện Hoá học -lactam Viện Khoa học

& Công nghệ Việt Nam

-lactam Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (NMR)

Phổ 1H-lactamNMR (500MHz) và 13C-lactamNMR (125MHz) của các chất nghiêncứu được đo trên máy Bruker XL-lactam500 tần số 500 MHz với dung môi CDCl3 vàTMS là chất chuẩn, tại phòng Phổ cộng hưởng từ hạt nhân -lactam Viện Hoá Học -lactamViện Khoa học & Công nghệ Việt Nam

- M Y HPLCÁY HPLC

+ Hóa chất, thiết bị dùng cho máy HPLC

Dung môi: Kênh A: H2O (PA); Kênh B: Metanol (PA)

Pha tĩnh: Cột thép không gỉ (25 cm x 4,6 mm) được nhồi octadecylsilaylsilica gel (C18)

Thiết bị:LC-lactamMSD Agilent 1100 Series (USA)

+ Đặt điều kiện cho hệ thống

Detector DAD: đặt ở bước sóng 260nm

Detector MS:

-lactam Source: ESI

-lactam Capilary: 3000V; 17nA

-lactam End Plate Offset: 500V; 435nA

-lactam Dry Gas: 5,0 l/min-lactam Dry Temp: 325 ºC-lactam Skimmer: 40.0V

-lactam Cap Exit: 200.0V-lactam Polarity: PositiveFlow: 0,25 ml/min

Stop time: 30 min

Thể tích tiêm: 20 – 50 µl (tùy vào lượng mẫu)

Min

Gradient pha độngGradient 1 Gradient 2 Gradient 3

15303050100100100100

20306080100100100100

2.2 T ng h p các h p ch t ổng hợp các hợp chất ợp các hợp chất ợp các hợp chất ất β-lactam

2.2.1 Tổng hợp dẫn xuất 2-lactamphenoxy clorua axetic

Hỗn hợp của phenol (5,1 mmol) 1a, DMF (3 ml) và Na2CO3 (5,1 mmol)được đun hồi lưu ở 140oC, trong thời gian 10 phút Sau đó thêm este 2-lactambrommetyl axetat (4,6 mmol) và tiếp tục đun hồi lưu ở 140oC, trong khoảng 4h Hỗnhợp sau phản ứng được cho thêm dung dịch HCl 10% đến môi trường axit, sau

đó thêm dung dịch NaHCO3 đến môi trường trung tính và được chiết ba lầnbằng CH2Cl2 Dịch chiết CH2Cl2 được làm khô bằng Na2SO4 và loại bỏ dung môi

ở áp suất thấp thu được sản phẩm thô 2a, sau đó thêm 8 ml NaOH 1N và 8 ml

MeOH/H2O (1:1), tiếp tục đun hồi lưu ở 140oC trong 24h Hỗn hợp sau phảnứng được chiết bằng CH2Cl2, dịch chiết được làm khô bằng Na2SO4 và loại bỏdung môi ở áp suất thấp thu được sản phẩm thô Sản phẩm thô được làm sạchbằng sắc ký cột với hệ dung môi rửa giải là n-lactamhexan/EtOAc (9:1) thu được axit

3a hiệu suất 70% Axit 3a là các chất rắn màu trắng có điểm chảy là 98-lactam100oC

Dung dịch của hỗn hợp gồmaxit 3a (0,36 mmol), (COCl)2(1,8 mmol) và0,1 ml DMF trong 5ml CH2Cl2 được khuấy ở nhiệt độ thường trong 24h Kếtthúc phản ứng, loại bỏ dung môi CH2Cl2ở áp suất thấp thu được sản phẩm 2-lactam

phenoxy clorua axetat 4a

Dẫn xuất 2-lactam(m-lactamclo phenoxy) clorua axetat 4b được tổng hợp tương tự như 4a Nguyên liệu đầu là m-lactamclophenol 1b, thu được axit 3b với hiệu xuất 50%,

điểm nóng chảy tương ứng là 108-lactam110oC

Sơ đồ 2.1 Tổng hợp dẫn xuất 2-lactamphenoxy clorua axetic

2.2.2 Tổng hợp dẫn xuất imine

Dung dịch của benzylamin(18,7 mmol) 6a, p-brom benzanđehit (18,7

mmol) 7a và Na2SO4 (37,4 mmol) được đun hồi lưu ở 50-lactam60oC trong dung môi

CH2Cl2, trong thời gian 4h Hỗn hợp sau phản ứng được chiết hai lần bằng

CH2Cl2, làm khan bằng Na2SO4 và loại bỏ dung môi ở áp suất thấp thu được các

dẫn xuất imine 8a, được sử dụng ngay cho phản ứng tiếp theo.

Dẫn xuất imine 8b được tổng hợp tương tự như 8a Nguyên liệu đầu là 6a

và dẫn xuất p-lactammetoxy benzanđehit 7b.

Dẫn xuất imine 8c được tổng hợp tương tự như 8a Nguyên liệu đầu là 6b

và dẫn xuất p-lactammetoxy benzanđehit 7b.

MeOH/H2O, 140oC

R

O (COCl)2, CH2Cl2

DMF

4 1a, R=H

2b, R=Cl

3a, R=H 3b, R=Cl

Sơ đồ 2.2 Tổng hợp dẫn xuất imine

2.2.3 Tổng hợp các dẫn xuất β-lactam lactam

Hợp chất 4a (0,75 mmol) được hòa tan vào 5 ml toluen sau đó dung môi

toluen được cất loại ở áp suất thấp để loại bỏ (COCl)2 còn dư, tiếp theo làm lạnh

và thêm Et3N (1,125 mmol) thu được dẫn xuất ketene 5a, sau đó cho thêm chất 8a (0,75 mmol)và dung môi CH2Cl2(5 ml), đun hồi lưu ở 55oC trong 24h Hỗnhợp sau phản ứng được chiết hai lần bằng CH2Cl2, làm khan bằng Na2SO4 vàloại bỏ dung môi ở áp suất thấp Sau đó làm sạch bằng cột silica gel với hệ dung

môi hexan và EtOAc (9:1) thu được dẫn xuất 9a với hiệu suất 73%

Dẫn xuất 9b được tổng hợp tương tự như 9a, với nguyên liệu đầu là 4b và 8a, thu được với hiệu suất 67%.

Dẫn xuất 9ccũng được tổng hợp tương tự như 9a, với nguyên liệu đầu là 4b và 8b, thu được với hiệu suất 69%.

Dẫn xuất 9dcũng được tổng hợp tương tự như 9a, với nguyên liệu đầu là 4a và 8b, thu được với hiệu suất 71%.

Dẫn xuất 9e được tổng hợp tương tự như 9a, với nguyên liệu đầu là 4b và 8c, thu được với hiệu suất 68%.

Dẫn xuất 9f cũng được tổng hợp tương tự như 9a, với nguyên liệu đầu là 4a và 8c, thu được với hiệu suất 65%.

Sơ đồ 2.3 Tổng hợp dẫn xuất cis-lactamβ-lactam

2.3 Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H và 13C của các hợp chất 9a, 9b, 9c, 9d, 9e,

9f

Các chất sau khi được tổng hợp, được đo phổ cộng hưởng từ proton 1H-lactamNMR (500 MHz) và cacbon 13C-lactamNMR (125 MHz) được đo trên máy cộng

hưởng từ hạt nhân Avance 500 (Bruker, CHLB Đức)

a) Hợp chất 9a: là chất rắn màu trắng có nhiệt độ nóng chảy: toC: 105-lactam106oC

1 H NMR (CDCl3, 500 MHz)δ ppm: 7,41 (2H, d, J = 8,0 Hz, H-lactam3’, H-lactam5’);

7,31-lactam7,34 (3H, m, H-lactam4’’, H-lactam2’’’, H-lactam6’’’); 7,11-lactam7,15 (6H, m, H-lactam2’’, H-lactam3’’, H-lactam5’’,

H-lactam6’’, H-lactam3’’’, H-lactam5’’’); 6,89 (1H, t, J = 7,0 Hz, H-lactam4’’’); 6,72 (2H, d, J = 8,0 Hz,

H-lactam2’, H-lactam6’); 5,40 (1H, d, J = 4,5 Hz, H-lactam3); 4,87 (1H, d, J = 14,5 Hz, H-lactam5a); 4,70

(1H, d, J = 4,5Hz, H-lactam4); 3,87 (1H, d, J = 14,5 Hz, H-lactam5b)

13 C NMR (CDCl3, 125 MHz)δ ppm: 165,42 (C=O); 156,82 (C-lactam1’’’);

134,53 (C-lactam1’); 131,51(C-lactam3’); 130,30 (C-lactam5’); 129,30 (C-lactam3’’’); 128,94 (C-lactam6’’’);

128,68 (C-lactam2’’); 128,11 (C-lactam6’’); 122,84 (C-lactam4’); 122,21 (C-lactam4’’’); 115,53 (C-lactam2’’’,

C-lactam6’’’); 82,10 (C-lactam3); 60,91 (C-lactam4); 44,4 (C-lactam5)