Kiểm tra chất lượng cà phê

Mục lụcDANH MỤC VIẾT TẮT7DANH MỤC BẢNG8DANH MỤC HÌNH9CHƯƠNG I : TỔNG QUAN VỀ CÀ PHÊ101.1. Lịch sử phát triển của cây cà phê101.1.1. Trên thế giới101.1.2. Ở Việt Nam101.2. Đặc điểm thực vật học của cây cà phê121.2.1. Coffea Arabica (Cà phê chè):131.2.2. CoffeaRobusta(Cà phê vối):151.2.3. Coffea exelsa chari (Cà phê mít):161.3. Cấu tạo quả cà phê161.3.1. Vỏ quả171.3.2. Thịt quả171.3.3. Vỏ thóc171.3.4. Nhân171.4. Thành phần hóa học của quả cà phê171.4.1. Caffeine171.4.2. Protein và acid amin181.4.3. Các enzyme181.4.4. Carbonhydrate181.4.5. Lipid191.4.6. Các acid hữu cơ191.4.7. Các chất thơm191.4.8.Các chất khoáng19CHƯƠNG II : CÁC CHỈ TIÊU VÀ PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA CHẤT LƯỢNG CÀ PHÊ NHÂN NGUYÊN LIỆU THEO TCVN212.1. Chỉ tiêu chất lượng:212.1.1. Xác định hàm lượng nước theo TCVN 6537 : 2007 ( ISO 1446:2001 )212.1.2. TCVN 9723:2013 về Cà phê và sản phẩm cà phê Xác định hàm lượng cafein bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Phương pháp chuẩn262.1.3. Xác định hàm lượng tro tổng số và tro không tan trong axit clohydric theo TCVN 5253:1990322.1.4. Xác định hàm lượng xơ thô của cà phê nhân tham khảo TCVN 5714:2007332.1.5. Xác định hàm lượng nitơ tổng số và tính hàm lượng protein tham khảo TCVN 11033:2015372.2. Chỉ tiêu độc tố nắm mốc422.2.1. Xác định Ochratoxin A (OTA) trong cà phê nhân bằng sắc ký lỏng theo TCVN 8426:2010422.2.2. AOAC Official Method Surplus 970.46 Aflatoxins in Green Coffee, (Aflatoxins trong Cà phê nhân. Phương pháp sắc kí bản mỏng)472.3. Chỉ tiêu kim loại nặng và các nguyên tố vi lượng552.3.1. Xác định hàm lượng asen bằng phương pháp bạc dietyldithiocacbamat theo TCVN 7601 : 2007552.3.2. Xác định hàm lượng cadimi bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử theo TCVN 7603 : 2007592.3.3. Xác định hàm lượng thủy ngân bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử không ngọn lửa theo TCVN 7604 : 2007622.3.4. Xác định hàm lượng chì bằng phương pháp quang phổ hấp thụ nguyên tử theo TCVN 7602:2007662.3.5. Xác định hàm lượng kẽm trong thực phẩm bằng đo quang phổ hấp thụ nguyên tử theo TCVN 10915 : 2015692.4. Chỉ tiêu vi sinh732.4.1. Sử dụng đĩa đếm Petrifilm để định lượng tổng vi sinh vật hiếu khí theo TCVN 9977 : 2013732.4.2. Sử dụng đĩa đếm PetrifilmTM để định lượng coliform và Escherichia coli theo TCVN 9975 : 2013762.4.3. Phương pháp phát hiện và định lượng Staphylococcus aureus (S. aureus) bằng kỹ thuật tính số có xác suất lớn nhất (MPN) theo TCVN 7927:2008792.4.4. Xác định tổng nấm men và nấm mốcbằng phương pháp sử dụng màng khô có thể hoàn nước theo TCVN 7852:2008832.4.5. Xác định Clostridium botulinum trong thực phẩm bằng phương pháp vi sinh theo TCVN 9049 : 2012862.5. Chỉ tiêu cảm quan912.5.1. Phương pháp kiểm tra ngoại quan, xác định tạp chất lạ và khuyết tật theo TCVN 4808 : 200791TÀI LIỆU THAM KHẢO94

BỘ CÔNG THƯƠNG TRƯỜNG ĐẠI HỌC CÔNG NGHIỆP THỰC PHẨM THÀNH PHỐ HỒ CHÍ MINH KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM  ĐỒ ÁN HỌC PHẦN PHÂN TÍCH THỰC PHẨM ĐỀTÀI: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA CHỈ TIÊU CHẤT LƯỢNG CÀ PHÊ NHÂN NGUYÊN LIỆU LỚP: 04DHDB2 Tp.HCM, tháng 06, năm 2016 LỜI CẢM ƠN Trước tiên em xin gởi lời cảm ơn chân thành tri ân sâu sắc thầy cô trường Đại học Công nghiệp Thực phẩm Thành phố Hồ Chí Minh, đặc biệt cô….đã giúp đỡ em nhiệt tình thời gian qua Nhờ dẫn tận tình cô mà em hoàn thành đồ án này.Và qua thời gian làm đề tài đồ án cung cấp cho em nhiều thông tin cần thiết cho ngành học sau học thêm nhiều kỹ mềm có ích cho việc tự lập sau như: kỹ làm việc độc lập, kỹ tra cứu thông tin internet, kỹ quản thời gian, rèn cho có tinh thần trách nhiệm công việc chịu trách nhiệm trước việc làm… Không vậy, làm việc độc lập giúp em học hỏi nhiều điều hay thú vị, nhờ mà gắn kết tình bạn, giúp đỡ nhiều học tập Trong trình làm đồ án, khó tránh khỏi sai sót, mong Thầy, Cô bỏ qua Đồng thời trình độ lý luận kinh nghiệm thực tiễn hạn chế nên báo cáo tránh khỏi thiếu sót, em mong nhận ý kiến đóng góp Thầy, Cô để em học thêm nhiều kinh nghiệm hoàn thành tốt đồ án tới NHẬN XÉT CỦA GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN GIÁO VIÊN HƯỚNG DẪN Mục lục DANH MỤC VIẾT TẮT TCVN : Tiêu Chuẩn Việt Nam AOAC : Association of Official Analytical Chemists TLC : Thin – Layer Chromatography QCVN : Quy Chuẩn Việt Nam ISO : International Organization for Standardization HPLC : High Performance Liquid Chromatography DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Diện tích cà phê Việt Nam qua số năm .11 Bảng 1.2 Tổng sản lượng xuất cà phê Việt Nam niên vụ từ 2000/01 đến 2010/2011 12 Bảng 2.1 Các thể tích acid sulfuric đậm đặc .38 Bảng 2.2 Các thể tích acid clohydric đậm đặc 38 Bảng 2.3 Chuẩn bị acid chuẩn hiệu chuẩn 43 Bảng 2.4 – Các số có xác suất lớn (MPN) gam phần mẫu thử, sử dụng ống 82 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Cây cà phê Arabica 13 Hình 1.2 Lá, hoa Cà phê Arabica 13 Hình 1.3 Cà phê nhân nguyên liệu Arabica (Chưa rang) 14 Hình 1.4 Cà phê nhân nguyên liệu Arabica (Đã rang) 14 Hình 1.5 Cây cà phê Robusta .15 Hình 1.6 Lá hoa cà phê Robusta .15 Hình 1.7 Quả cà phê Robusta 15 Hình 1.8 Cà phê nhân nguyên liệu Robusta 15 Hình 1.9 Cây cà phê exelsa chari 16 Hình 1.10 Lá cà phê exelsa chari 16 Hình 1.11 Quả cà phê exelsa chari 16 Hình 1.12 Nhân cà phê exelsa chari 16 Hình 2.1 – Thiết bị phân tích quang phổ hấp thụ nguyên tử không lửa 65 CHƯƠNG I : TỔNG QUAN VỀ CÀ PHÊ 1.1 Lịch sử phát triển cà phê 1.1.1 Trên giới Theo nghiên cứu ,cây cà phê phát kaffa, có ghi nhận kỷ XIV người buôn nô lệ mang cà phê từ Ethiopia sang xứ Ả Rập Tới kỷ XV Cà phê trở thành thức uống truyền thống người Ả Rập nơi trồng cà phê độc quyền với trung tâm giao dịch cà phê thành phố cảng Mocha, hay gọi Mokka Người Ả Rập tự hào phát minh loại thức uống giữ bí mật để bảo tồn độc quyền loại sản phẩm Từ đầu năm 1900, cà phê trở thành đồ uống phổ thông nhiều nước giới Đức, Mỹ, Úc ngày Trên giới có 75 nước trồng cà phê, có 51 nước xuất Đứng đầu giới diện tích sản lượng Brazil, Colombia, Việt Nam… Diện tích, sản lượng cà phê toàn giới dao động mức 11,3÷11,5 triệu 6,7÷8,0 triệu tấn, cà phê chè chiếm tới 70% diện tích Thị phần thương mại xuất nhập toàn cầu hàng năm khoảng 5,2÷5,7 triệu tấn, nước trồng cà phê tiêu thụ khoảng 1,6 triệu tấn, 20÷22% sản lượng, gần 80% để xuất Giá cà phê xuất có biến động lớn phụ thuộc vào thời tiết, sách dự trữ lượng tồn kho nước xuất nhập 1.1.2 Ở Việt Nam Lần cà phê đưa vào Việt Nam vào năm 1875, giống Arabica người Pháp mang từ đảo Bourbon (bây đảo Reunion, nằm phía đông Madagascar) sang trồng phía Bắc sau lan tỉnh miền Trung Quảng Bình, Quảng Trị … Sau thu hoạch chế biến thương hiệu “Arabica du Tonkin”, cà phê nhập Pháp Năm 1925, lần trồng Tây Nguyên, sau giải phóng diện tích cà phê nước khoảng 20.000 ha, nhờ hỗ trợ vốn từ quốc tế, cà phê dần trọng, đến năm 1980 diện tích đạt 23.000 ha, xuất 6000 Bản kế hoạch ban đầu xây dựng năm 1980 đặt mục tiêu cho ngành cà phê Việt Nam có khoảng 180 nghìn với sản lượng 200.000 Sau đó, kế hoạch nhiều lần sửa đổi Các số cao dừng lại mức 350.000 với sản lượng 450.000 (VICOFA, 2002) Cho đến sản lượng cà phê nước chiếm 8% sản lượng nông nghiệp, chiếm 25% giá trị xuất nước xuất cà phê Robusta lớn giới với hai tỉnh có diện tích canh tác lớn ĐăkLăk Gia Lai, mang lại việc làm ổn định, thu nhập cao cho hàng triệu người góp phần ổn định kinh tế xã hội vùng xa xôi hẻo lánh, dân tộc người… Việt Nam nước sản xuất cà phê lớn thứ giới sau Brazil đứng đầu giới xuất cà phê vối Diện tích cà phê Việt Nam qua số năm thống kê kê Bảng 1.2 Bảng 1.1 Diện tích cà phê Việt Nam qua số năm Đơn vị: Nghìn hecta Diện tích cà phê VN 2005 Diện tích gieo trồng 497,4 Diện tích cho sản phẩm 483,6 Diện tích trồng 13,8 Nguồn: Tổng cục thống kê GSO 2006 488,7 481,2 7,5 2007 508,8 488,7 20,1 2008 530,9 500,2 30,7 2009 537,0 504,1 32,9 Theo kế hoạch phát triển đến năm 2020 cho ngành cà phê thảo luận hội thảo Bộ Nông nghiệp phát triển thôn tổ chức vào ngày 22 tháng năm 2012 Buôn Ma Thuột, Việt Nam lên kế hoạch cắt giảm 13,5% diện tích cà phê từ 555.000 hecta xuống 480.000 hecta, giữ sản lượng ổn định vào cuối thập kỷ vào khoảng 1,1 triệu tấn, 18,33 triệu bao (bao 60 kg) cà phê năm, tương tự sản lượng vụ mùa 2010/2011 Bảng 1.2 Tổng sản lượng xuất cà phê Việt Nam niên vụ từ 2000/01 đến 2010/2011 Niên vụ Sản lượng Xuất 2000/01 14841 14606 2001/02 13093 11966 2002/03 11574 11555 2003/04 15337 14497 2004/05 14370 13994 2005/06 13842 13122 2006/07 19340 18090 2007/08 16467 15774 2008/09 18500 17386 2009/10 18200 14591 2010/11 19467 16850 Nguồn: ©InternationalCoffeeOrganizatio A: Cà phê chè (Arabica) R: Cà phê vối (Robusta)  Các định hướng ngành cà phê Việt Nam nay: - Chuyển dịch cấu trồng - Hạ giá thành sản xuất, nâng cao hiệu kinh doanh - Áp dụng công nghệ sau thu hoạch tiên tiến, đổi thiết bị, nâng cao chất lượng sản - phẩm kết hợp với bảo vệ môi trường Xây dựng ban hành tiêu chuẩn cấp Nhà nước cà phê Mở rộng thị trường cho cà phê Việt Nam nước ngoài, xúc tiến việc tiêu thụ cà phê - thị trường nội địa Phát triển ngành cà phê bền vững 1.2 Đặc điểm thực vật học cà phê  Phân loại Cây cà phê thuộc hệ thống phân loại thực vật sau: Ngành: Magnoliophyta Lớp: Magnoliopsida Bộ: Gentianales Họ: Rubiaceae 10 Bảng 2.4 – Các số có xác suất lớn (MPN) gam phần mẫu thử, sử dụng ống có phần mẫu thử tương ứng 0,1 g, 0,01 g 0,001 g Các ống dương tính Các ống dương tính Các ống dương tính Các ống dương tính 0,1 0,01 0,00 MPN 0,1 0,01 0,00 MPN 0,1 0,0 0,001 MPN 0,1 0,01 0,00 MPN 0 110 a a a a Các kết không chắn cao muốn nói có mặt yếu tố làm ảnh hưởng đến độ thu hồi nhận dạng dịch pha loãng thấp Do đó, giá trị MPN thấp nhiều so với nồng độ thực  Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm thông tin đây: - Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; Viện dẫn tiêu chuẩn phương pháp sử dụng; Kết đơn vị biểu thị kết quả; Ngày tháng lấy mẫu phương thức lấy mẫu (nếu có); Ngày tháng nhận mẫu phòng thử nghiệm; Ngày tháng thử nghiệm; Các điểm đặc biệt quan sát trình thử nghiệm; Mọi thao tác không quy định tiêu chuẩn coi tùy chọn, với chi tiết cố ảnh hưởng đến kết 78 2.4.4 Xác định tổng nấm men nấm mốcbằng phương pháp sử dụng màng khô hoàn nước theo TCVN 7852:2008  Nguyên tắc Phương pháp sử dụng đĩa cấy chứa môi trường khô bổ sung kháng sinh, thuốc nhuộm để tăng khả quan sát phát triển chất tạo đông tan nước lạnh Các dung dịch huyền phù chưa pha loãng pha loãng cho vào đĩa với lượng ml/đĩa Dàn dung dịch huyền phù diện tích khoảng 30 cm2 Có thể dùng chất tạo đông để làm đông đặc đĩa, ủ ấm đếm nấm men nấm mốc  Thuốc thử Trong trình phân tích, sử dụng thuốc thử tinh khiết phân tích nước cất nước có chất lượng tương đương, trừ có qui định khác  Nước pha loãng, dung dịch nước đệm phosphat Cho 34 g KH2PO4 vào 500 ml nước đựng bình định mức lít Dùng natri hydroxit để chỉnh pH đến 7,2 pha loãng nước đến vạch Khử trùng dung dịch 15 nồi hấp áp lực 121 °C Bảo quản dung dịch gốc tủ lạnh Chuẩn bị dung dịch mẫu trắng pha loãng cách dùng pipet lấy 1,25 ml dung dịch gốc cho vào bình định mức I pha loãng nước đến vạch Phân phối 90 ml ± ml 99 ml ± ml dung dịch vào chai Khử trùng chai 15 nồi hấp áp lực 121 °C       Kali dihydro phosphat (KH2PO4) Natri hydroxit (NaOH), dung dịch M (40 g/L) Dung dịch clotetraxyclin Dung dịch cloramphenicol Chất tạo đông tan nước lạnh Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm thông thường thiết bị, dụng cụ sau đây:  Đĩa đếm nấm men nấm mốc Các đĩa chứa chất dinh dưỡng bổ sung clotetraxyclin, cloramphenicol, chất tạo đông tan nước lạnh thuốc nhuộm màu nhạy với phosphataza (5-brom-4-clo-3indolyl phosphat) để tăng khả quan sát phát triển nấm men nấm mốc 79 Khoanh tròn vùng phát triển đĩa có ba mươi ô vuông cm x cm màng mỏng  Que dàn mẫu chất dẻo, để dàn huyền phù lên khắp vùng phát triển đĩa  Pipet, dùng cho huyết học pipet dạng xylanh phân phối 1,0 ml  Dụng cụ đếm khuẩn lạc, loại chuẩn loại có độ khuếch đại tương đương 1,5 lần  Bộ trộn Bộ trộn có tốc độ cao từ 10 000 vòng/min đến 12 000 vòng/min loại túi nhu động     Binh định mức I Nồi hấp áp lực Chuẩn bị Yêu cầu chung Bảo quản túi đĩa đựng đĩa đếm nấm men nấm mốc chưa mở nhiệt độ °C Sau mở, để đĩa chưa sử dụng vào lại túi Đóng kín túi cách gấp cuộn đầu mỏ Bảo quản túi đựng đóng kín lại nhiệt độ °C, nơi khô Các đĩa sau mở dùng tháng Để đĩa đếm nấm men nấm mốc tiếp xúc với nhiệt độ cao 25 °C độ ẩm tương đối cao 50 % ảnh hưởng đến tính đĩa Sau sử dụng, đĩa chứa khuẩn lạc nấm men và/hoặc nấm mốc mà phát triển được, nên trước thải bỏ cần khử trùng hấp áp lực 15 121 °C  Chuẩn bị huyền phù thử nghiệm Chuẩn bị huyền phù từ sản phẩm thực phẩm điều kiện vô trùng với độ pha loãng 1/10 lớn nước Trộn trộn túi nhu động đổ đĩa Chuẩn bị dung dịch pha loãng tiếp theo, cần  Cách tiến hành Đặt đĩa đếm nấm men nấm mốc lên bề mặt mặt phẳng Nhấc màng mỏng phía ra, giữ pipet vuông góc với đĩa cấy cẩn thận ml huyến phù thử nghiệm vào mảng mỏng Đậy màng mỏng phía xuống chất cấy 80 Dùng tay nhấc que dàn mẫu chất dẻo Dóng thẩng tâm que dán mẫu với tâm dĩa Dàn huyền phù cách ấn nhẹ que dàn mẫu xuống tâm đĩa Không gạt que dàn mẫu từ bên sang bẽn màng mỏng Lấy que dàn mẫu để yên đĩa cho đông đặc lại Đặt đĩa vào tủ ấm theo phương nằm ngang, hướng lên trên, không chồng cao 20 đĩa Ủ đĩa năm ngày nhiệt độ từ 20 °C đến 25 °C Đếm đĩa sau giai đoạn ủ Các khuẩn lạc nhỏ có màu xanh lục trắng nhạt nấm men Các khuẩn lạc nấm mốc thường có màu xanh có sắc tố tự nhiên chúng (ví dụ: màu đen, vàng, xanh lục), chúng có khuynh hướng lớn khuếch tán nhiều so với khuẩn lạc nấm men Để tính số nấm men nấm mốc, nhân số lượng tổng số nấm men nấm mốc/đĩa (hoặc số lương trung bình khuẩn lạc/đĩa, đếm đĩa kép độ pha loãng) với hệ số pha loãng tương ứng Khi đếm khuẩn lạc đĩa kép độ pha loãng kế tiếp, tính số lượng trung bình khuẩn lạc cho độ pha loãng trước xác định trung bình số đếm nấm men nấm môc Các số đếm ước tính thực đĩa có nhiều 150 khuẩn lạc phải ghi số ước tính Trong việc đếm thế, xác định số đếm trung bình/1 cm nhân với 30 (diện tích phát triển khoảng 30 cm 2) Với số lượng lớn khuẩn lạc nấm men làm cho toàn diện tích phát triển trở thành màu xanh Với số lượng lớn khuẩn lạc nấm mốc làm cho toàn diện tích phát triển trở thành màu xanh, màu đen, màu vàng Khi đó, có số đếm ước tính, pha loãng tiếp đổ đĩa huyền phù thử nghiệm để thu số đếm xác  Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải bao gồm thông tin đây: - Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; Viện dẫn tiêu chuẩn phương pháp sử dụng; Kết đơn vị biểu thị kết quả; Ngày tháng lấy mẫu phương thức lấy mẫu (nếu có); Ngày tháng nhận mẫu phòng thử nghiệm; Ngày tháng thử nghiệm; Các điểm đặc biệt quan sát trình thử nghiệm; Mọi thao tác không quy định tiêu chuẩn coi tùy chọn, với chi tiết cố ảnh hưởng đến kết 81 2.4.5 Xác định Clostridium botulinum thực phẩm phương pháp vi sinh theo TCVN 9049 : 2012  Nguyên tắc Dịch chiết từ thực phẩm chứa liều tối thiểu gây chết (MLD) từ độc tố botulinum tiêm vào phúc mạch chuột, vật chết vòng 48 h sau có biểu triệu chứng nhiễm độc botulinum Kháng độc tố tương đồng bảo vệ chuột khỏi triệu chứng đó, kháng độc tố khác lại không, dựa vào để xác định typ huyết Các bào tử sống thực phẩm phát triển môi trường nuôi cấy thích hợp sinh độc tố, độc tố phát định typ  Thuốc thử môi trường Chỉ sử dụng thuốc thử loại tinh khiết phân tích nước cất nước khử khoáng có độ tinh khiết tương đương, trừ có quy định khác  Canh thang từ thịt từ gan, vô trùng - Canh thang gan Nghiền nhỏ 500 g gan bò tươi 800 ml nước Đun đến sôi để h Để nguội, chỉnh pH đến 7,0 đun sôi 10 Lọc qua vải thưa, ép loại bỏ phần chất lỏng Cho vào canh thang 10 g pepton, g dikali hydrophosphat (K2HPO4) g tinh bột hòa tan Chỉnh đến pH 7,0 pha loãng nước đến lít Lọc qua giấy thô Canh thang bảo quản riêng rẽ tủ lạnh để sử dụng sau này, cần Phân phối vào ống nghiệm kích thước 18 mm x 150 mm 20 mm x 150 mm, lượng gan với chiều cao từ cm đến cm chất lỏng từ 10 ml đến 12 ml Hấp áp lực 20 121 °C - Canh thang thịt Có thể sử dụng canh thang có bán sẵn thị trường có thành phần sau: 454 g tim bò, 20 g pepton proteoza, 2g dextroza g natri clorua Hòa 12,5 g môi trường vào 100 ml nước lạnh Trộn kỹ để yên hạt thấm kỹ nước (khoảng 15 min) Cách khác, thêm 1,25 g môi trường đặc vào ống nghiệm, thêm 10 ml nước lạnh trộn kỹ hạt thấm ướt nước Hấp áp lực 15 121 °C pH cuối phải 7,2 ± 0,1  Canh thang dịch chiết nấm men trypticaza-pepton-glucoza (TPGY) TPGY với trypsin (TPGYT) Chỉ sử dụng TPGYT để thay vi sinh vật nghi ngờ thuộc chủng typ B, E, F không phân giải protein Hòa tan 50 g trypticaza, 5g bacto-pepton, 20 g chất chiết nấm men, g dextroza g natri thioglycollat lít nước phân phối với lượng 15 ml vào ống nghiệm đựng môi trường kích thước 20 mm x 150 mm lượng 100 ml vào 82 chai đựng quy định Hấp áp lực 10 ống nghiệm 15 chai đựng 121 °C pH cuối phải 7,2 ± 0,1 Bảo quản tủ lạnh loại bỏ không sử dụng vòng tuần Ngay trước sử dụng, đun sôi hấp để loại bỏ oxi làm nguội nhanh, sau cách vô trùng thêm 1,0 ml dung dịch trypsin cho 15 ml canh thang Chuẩn bị dung dịch trypsin cách hòa tan 1,5 g trypsin 100 ml nước Khử trùng cách lọc qua màng lọc cỡ lỗ 0,45 µm tương đương để tủ lạnh  Thạch lòng đỏ trứng-thịt-gan bê thạch lòng đỏ trứng kị khí - Thạch lòng đỏ trứng-thịt-gan bê (LVEY) Rửa trứng bàn chải cứng làm nước Ngâm trứng dung dịch thủy ngân(II) clora (HgCl2) 0,1 % (khối lượng/thể tích h Để dung dịch thủy ngân(II) clorua ngâm trứng etanol 70% khoảng 30 Lấy trứng ra, cách vô trùng đập vỡ vỏ loại bỏ lòng trắng Dùng xyranh lấy lòng đỏ cho vào vật đựng vô trùng thêm lượng thể tích tương tự dung dịch natri clorua 0,85 % (khối lượng/thể tích), trộn kỹ Cứ 500 ml thạch gan-thịt bê khô khử trùng có bán sẵn thị trường 50 °C thêm 40 ml huyền phù lòng đỏ trứng-natri clorua Trộn kỹ đổ đĩa Làm khô đĩa ngày nhiệt độ phòng 24 h 35 °C Loại bỏ đĩa bị nhiễm bẩn bảo quản đĩa vô trùng tủ lạnh - Thạch trứng kị khí Hòa tan g chất chiết nấm men, g trypton, 20 g pepton proteoza, 5g natri clorua 20 g thạch lít nước Chỉnh pH đến 7,0, phân phối lượng 500 ml vào bình cầu lít hấp áp lực 20 121 °C Cho 40 ml huyền phù lòng đỏ trứng-natri clorua chuẩn bị 3.3.1 vào 500 ml thạch làm tan chảy đến khoảng từ 45 °C đến 50 °C Trộn đổ đĩa Làm khô đĩa bảo quản 3.3.1  Dung dịch đệm gel-phosphat, pH 6,2 Hòa tan g gelatin g dinatri hydrophosphat (Na2HPO4) lít nước có đun nóng nhẹ Phân phối vào chai 100 ml Hấp áp lực 20 121 °C  Các chế phẩm kháng độc tố Clostridium botulinum Các typ từ A đến F kháng thể đa dòng từ A-F CHÚ THÍCH: Các chế phẩm sinh học mua Biological Products Branch, Office of Scientific Services, Centers for Disease Control and Prevention, Atlanta, GA 30333, USA  Dung dịch natri hydroxit, M  Dung dịch axit clohydric, M  Dung dịch trypsin bão hòa 83 Hòa tan g trypsin vào 10 ml nước ống nghiệm  Dung dịch natri clorua, 0,85 %  Thiết bị, dụng cụ Sử dụng thiết bị, dụng cụ phòng thử nghiệm vi sinh thông thường cụ thể thiết bị, dụng cụ sau:  Dụng cụ mở hộp  Bình kị khí 1)  Đĩa Petri, đường kính 100 mm Làm khô đĩa thạch chuẩn bị khoảng 24 h 35 °C trước cấy           Máy li tâm lạnh, tốc độ cao Xyranh, dung tích 1,0 ml 3,0 ml, có mũi kim 15,9 mm để tiêm chuột Pipet, vô trùng Bình định mức, dung tích lít Bếp điện Ống nghiệm, kích thước 15 mm x150 mm 20 mm x 150mm Cối chày, vô trùng Kẹp, vô trùng Vòng cấy, vô trùng Lấy mẫu Mẫu gửi đến phòng thử nghiệm phải mẫu đại diện Mẫu không bị hư hỏng thay đổi suốt trình vận chuyển bảo quản  Cách tiến hành  Chuẩn bị mẫu thử - Kiểm tra sơ Giữ mẫu trạng thái đông lạnh Đối với loại thực phẩm đóng hộp chưa mở, trừ bị phồng có nguy bị nổ, không cần bảo quản lạnh Ghi lại mã số tình trạng vật chứa Làm nhận biết vật chứa mẫu - Thực phẩm dạng rắn Chuyển cách vô trùng phần mẫu sang cối giã vô trùng Thêm lượng tương tự dung dịch đệm gel-phosphat nghiền chày vô trùng Cách khác, dùng kẹp vô trùng (4.11) cấy miếng mẫu thử nhỏ trực tiếp vào canh thang tăng sinh - Kiểm tra cảm quan 1)1) Có thể sử dụng sản phẩm GasPak (Becton Dickinson Microbiology Systems, Lovton Circle, Sparks, MD 21152, USA, No 219511) tương đương Thông tin tạo thuận lợi cho người sử dụng tiêu chuẩn tiêu chuẩn không ấn định phải sử dụng sản phẩm nêu 84 Ghi lại kết quan sát bên ngoài, mùi chứng phân hủy, có CHÚ Ý: Không thử nếm sản phẩm - Phần mẫu thử dự phòng Sau cấy xong, cách vô trùng lấy phần mẫu thử cho vào bình vô trùng để dùng cho phép thử tiếp theo, cần  Phát C botulinum sống  Tăng sinh Loại oxi hòa tan khỏi môi trường trước nuôi cấy cách đun cách thủy ống đựng canh thang từ 10 đến 15 làm nguội nhanh, không lắc ống Cấy vào ống nghiệm, 15 ml canh thang thịt lấy từ g đến g mẫu dạng rắn từ ml đến ml mẫu dạng lỏng dịch chiết, đưa chất cấy từ từ vào bề mặt canh thang Ủ nhiệt độ 35 °C Tương tự, cấy vào ống nghiệm đựng canh thang TPGY ủ nhiệt độ 26 °C  Kiểm tra Sau ngày, kiểm tra ống nghiệm cấy độ đục, sinh khí, phân hủy hạt thịt mùi Ngoài ra, cần kiểm tra tiêu sau nhuộm Gram, tím tinh thể, xanh metylen kính hiển vi có vật kính dầu Quan sát hình thể vi sinh vật ghi lại có mặt tế bào clostridia điển hình, kích thước số lượng tương đối bào tử, vị trí bào tử tế bào  Xử lí Thông thường, sau ngày nuôi cấy độc tố sinh có nồng độ cao nhất, hình thành bào tử Giữ lại dịch cấy tủ lạnh để phân lập khuẩn lạc khiết Nếu sau ngày không thấy phát triển ủ tiếp 10 ngày để phát khả sinh bào tử chậm C botulinum trước loại bỏ dịch cấy  Phân lập khuẩn lạc khiết Nếu hình thành bào tử tốt C botulinum dễ dàng phân lập từ hệ vi sinh hỗn hợp môi trường tăng sinh từ mẫu gốc - Xử lí sơ Thêm thể tích tương tự cồn tuyệt đối lọc để khử trùng vào khoảng từ ml đến ml dịch cấy phần mẫu thử đựng ống nghiệm vô trùng có nắp vặn Trộn kỹ ủ nhiệt độ phòng h Cách khác, đun từ ml đến ml dịch cấy tăng sinh 80 °C 85 khoảng từ 10 đến 15 để diệt tế bào sinh dưỡng Không xử lí nhiệt typ C botulinum không phân giải protein - Ria cấy Dùng vòng cấy vô trùng lấy hai vòng đầy dịch cấy xử lý cồn nhiệt, pha loãng cần, ria cấy vào đĩa thạch lòng đỏ trứng kị khí (3.3.2) thạch lòng đỏ trứng-thịt-gan bê khô, cho thu khuẩn lạc phân lập tốt Ủ đĩa bình kị khí 35 °C khoảng 48 h - Chọn khuẩn lạc Cách khuẩn lạc điển hình khuẩn lạc lồi dẹt, trơn nhám, thường mọc lan tỏa có mép không Trên môi trường thạch lòng đỏ trứng, khuẩn lạc thường có bề mặt óng ánh kiểm tra ánh sáng xiên Vùng óng ánh giống “lớp ngọc trai” Vùng thường mở rộng đường viền khuẩn lạc không Ngoài vùng ngọc trai, khuẩn lạc typ C, D E thường bao quanh vùng kết tủa màu vàng đường kính từ mm đến mm Các khuẩn lạc typ A B thường cho thấy có vùng kết tủa bao quanh nhỏ Chỉ có số loài Clostridium có đặc tính hình thái điển hình không sinh độc tố - Chủng cấy Dùng vòng cấy vô trùng, cấy 10 khuẩn lạc chọn vào ống đựng môi trường vô trùng sau: - canh thang TPGY C botulinum typ E, ủ ngày 26 °C; - canh thang thịt vô trùng typ độc tố khác, ủ ngày 35 °C Sử dụng chủng cấy để khẳng định, phát nhận dạng độc tố - Khẳng định Cấy ria dịch cấy thu lặp lại hai lần đĩa thạch lòng đỏ trứng, ủ đĩa bình kị khí đĩa bình hiếu khí 35 °C Nếu tìm thấy khuẩn lạc điển hình C botulinum đĩa kị khí không thấy phát triển đĩa hiếu khí dịch cấy chủng Việc phân lập không C botulinum từ khuẩn lạc chọn cho thấy số lượng vi khuẩn nuôi cấy tăng sinh thấp Việc lặp lại bước tăng sinh bổ sung cho đủ số lượng để phân lập Bảo quản chủng cấy khiết tủ lạnh viên thủy tinh bảo quản phương pháp đông khô  Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: 86 - Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu thử; Viện dẫn tiêu chuẩn phương pháp sử dụng; Kết đơn vị biểu thị kết quả; Ngày tháng lấy mẫu phương thức lấy mẫu (nếu có); Ngày tháng nhận mẫu phòng thử nghiệm; Ngày tháng thử nghiệm; Các điểm đặc biệt quan sát trình thử nghiệm; Mọi thao tác không quy định tiêu chuẩn coi tùy chọn, với chi tiết cố ảnh hưởng đến kết 2.5 Chỉ tiêu cảm quan 2.5.1 Phương pháp kiểm tra ngoại quan, xác định tạp chất lạ khuyết tật theo TCVN 4808 : 2007  Lấy mẫu Lấy 300 g mẫu phòng thử nghiệm chuẩn bị theo TCVN 6539 (ISO 4072) Với mẫu phòng thử nghiệm sau kiểm tra ngoại quan dùng để phân tích kích cỡ hạt [xem TCVN 4807 (ISO 4150)] miễn mẫu đủ điều kiện để tiến hành phép thử  Kiểm tra khứu giác  Cách tiến hành - Tiến hành kiểm tra khứu giác mẫu phòng thử nghiệm trước tiến hành kiểm tra tiêu khác - Sau ghi nhận thông tin mẫu ghi nhãn, mở bao gói, để mũi sát mẫu hít mạnh  Đánh giá - Đánh giá mùi ghi lại sau: • “Mùi bình thường”, không phát mùi lạ mùi khó chịu khác với cà phê; • “Mùi không bình thường”, phát mùi lạ mùi khó chịu khác với cà phê Nếu nhận biết được, mô tả mùi khó chịu đó, chất gây mùi lưu lại mùi lạ - Trong trường hợp nghi ngờ, nghi ngờ mùi không bình thường, dùng vật chứa sạch, không mùi, cho cà phê từ mẫu phòng thử nghiệm vào đầy nửa vật chứa này, đậy kín, giữ nhiệt độ phòng tối thiểu Mở vật chứa đánh giá lại mùi cà phê 87  Kiểm tra mắt  Cách tiến hành Sau kiểm tra khứu giác, dàn mẫu phòng thử nghiệm bề mặt phẳng màu da cam màu đen ánh sáng khuyếch tán ban ngày (không dùng ánh nắng trực tiếp) ánh sáng nhân tạo tương đương ánh sáng ban ngày  • • • • • • •   Đánh giá Kiểm tra trạng thái chung bên mẫu phòng thử nghiệm để đánh sau: Nguồn gốc thực vật học cà phê (ví dụ: arabica, canephora); Màu sắc độ đồng màu sắc Ghi lại màu quan sát sau: Xanh lục nhạt, Xanh nhạt, Xanh xám, Trắng nhạt, Vàng nhạt, nâu nhạt Xác định tạp chất lạ khuyết tật Nguyên tắc Tạp chất lạ nhân khuyết tật tách theo loại cân Việc biểu thị kết cuối cho thấy ảnh hưởng chất lượng khuyết tật tìm thấy được, theo định nghĩa TCVN 7032:2007 (ISO 10470:2004) định lượng theo Đơn vị Ảnh hưởng Chất lượng Áp dụng định nghĩa TCVN 4334:2007 (ISO 3509:2005) liên quan đến tạp chất lạ khuyết tật   - Thiết bị, dụng cụ Cân, cân xác đến 0,1 g Cách tiến hành Trong trường hợp khuyết tật mà không đếm cân được, chúng xác định cách cân - Cân mẫu phòng thử nghiệm (xem điều 4) xác đến 0,1 g để làm phần mẫu thử - Dàn phần mẫu thử bề mặt phẳng màu da cam màu đen kiểm tra ánh sáng khuyếch tán ban ngày (không dùng ánh nắng trực tiếp) ánh sáng nhân tạo tương đương ánh sáng ban ngày Để việc nhận dạng tốt xác hơn, xem phụ lục C TCVN 7032:2007 (ISO 10470:2004), có minh họa hình ảnh khuyết tật tạp chất lạ - Nhặt tất tạp chất lạ nhân khuyết tật phân loại theo TCVN 7032:2005 (10470:2004) Để riêng cho vào vật chứa khác - Cân loại tạp chất lạ khuyết tật xác đến 0,1 g  Biểu thị kết 88 Ghi lại khối lượng tạp chất lạ khuyết tật tìm thấy phần mẫu thử, tính gam Xác định phần mẫu thử tạp chất lạ khuyết tật, w, phần trăm, theo công thức sau đây: w= m0 × m 100% Trong m0 khối lượng tổng số tạp chất lạ khuyết tật, tính gam; m khối lượng phần mẫu thử, tính gam Nhân phần khối lượng loại khuyết tật tạp chất lạ với hệ số “0”, “0,5” “1” tương ứng với khuyết tật cụ thể hệ số hao hụt khối lượng và/hoặc liên quan đến cảm quan, qui định TCVN 7032:2007 (10470:2004) Ví dụ phép xác định điển hình nêu phụ lục A  Báo cáo thử nghiệm Báo cáo thử nghiệm phải ghi rõ: - Mọi thông tin cần thiết để nhận biết đầy đủ mẫu; Phương pháp lấy mẫu sử dụng, biết; Phương pháp thử nghiệm dùng, viện dẫn tiêu chuẩn này; Mọi chi tiết thao tác không quy định tiêu chuẩn điều coi tùy ý cố mà ảnh hưởng đến kết thử; Kết thử nghiệm thu được, thỏa mãn yêu cầu độ lặp lại, nêu kết cuối thu TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt [1] Bài giảng Công nghệ chế biến kiểm soát chất lượng Chè, Cà phê, Ca cao - Trường ĐHCNTP.TPHCM 89 [2] Đoàn Triệu Nhạn ( Chủ biên ) (2000), Cây cà phê Việt Nam - NXB Nông Nghiệp [3] QCVN 01–26:2010/BNNPTNT cà phê nhân – tiêu vệ sinh an toàn thực phẩm [4] TCVN 4334:2007 Cà phê sản phẩm cà phê - Thuật ngữ định nghĩa [5] TCVN 6537:2007 cà phê nhân - xác định hàm lượng nước (phương pháp chuẩn) [6] TCVN 9723:2013 Cà phê sản phẩm cà phê- Xác định hàm lượng cafein sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) - Phương pháp chuẩn [7] TCVN 5702:1993 cà phê nhân - lấy mẫu [8] TCVN 7595-1:2007 thực phẩm - xác định ocratoxin A ngũ cốc sản phẩm ngũ cốc - Phần 1: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao làm silica gel [9] TCVN 7595-2:2007 thực phẩm - xác định ocratoxin A ngũ cốc sản phẩm ngũ cốc - Phần 2: Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao làm bicacbonat [10] TCVN 7596:2007 thực phẩm - xác định Aflatoxin B1, hàm lượng tổng số Aflatoxin B1, B2, G1 G2 ngũ cốc, loại hạt sản phẩm chúng phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao [11] TCVN 4193:2014 cà phê nhân [12] 46/2007/QĐ-BYT Quy định giới hạn tối đa ô nhiễm sinh học hóa học thực phẩm [13] TCVN 6928 : 2007 (ISO 6673 : 2003) Cà phê nhân – Xác định hao hụt khối lượng 105°C [14 ] Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 6537:2007 cà phê nhân - xác định hàm lượng nước (phương pháp chuẩn) [15] Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 9723:2013 Cà phê sản phẩm cà phê- Xác định hàm lượng cafein sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) - Phương pháp chuẩn [16] Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5253:1990 cà phê - phương pháp xác định hàm lượng tro [17] Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 5714:2007 chè - xác định hàm lượng xơ thô 90 [18] Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 11033:2015 Sản phẩm cacao - Xác định hàm lượng nitơ tổng số tính hàm lượng protein thô - Phương pháp Kjeldahl [19] Tiêu chuẩn quốc gia TCVN 8426:2010 Cà phê nhân - Xác định ochratoxin A phương pháp sắc ký lỏng có làm cột lực miễn nhiễm [20] Tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 7601:2007 thực phẩm - xác định hàm lượng asen phương pháp bạc dietyldithiocacbamat Tiếng Anh [21] AOAC Official Method 920.88, Green coffee [22] AOAC Official Method 975.38, Ochratoxin A in Green Coffee [23] AOAC Official Method 970.43, Mycotoxins [24] AOAC Official Method 973.37, Ochratoxins in Barley [25] AOAC Official Method 968.22, Aflatoxins in Peanuts and Peanut Products [26] AOAC Official Method 965.25, Caffeine in Green Coffee [27] AOAC Official Method 950.40, Caffeine in Roasted Coffee [28] AOAC Official Method 960.25, Caffeine in Roasted Coffee [29] AOAC Official Method 970.46, Aflatoxins in Green Coffee 91 92