Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ 24 (2008) 23-27 Nghiên cứu phương pháp sử dụng enzyme peroxidase tách chiết từ củ cải trắng ñể xác ñịnh hàm lượng thủy ngân nước ô nhiễm Trần Thị Hồng*, Trần Hoàng Thanh, Nguyễn Thị Hà Giang Trường ðại học Khoa học Tự nhiên, ðại học Quốc gia Hà Nội, 334 Nguyễn Trãi, Hà Nội, Việt Nam Nhận ngày 29 tháng 12 năm 2007 Tóm tắt Bài báo ñã tiếp thu thành tựu lĩnh vực công nghệ enzyme xử lý môi trường nước, nghiên cứu sử dụng Enzyme Peroxidase (POD) tách chiết từ củ cải trắng ñể xác ñịnh hàm lượng thủy ngân nước ô nhiễm Kết nghiên cứu cho thấy, hàm lượng protein củ cải 0,1269 mg/g; Enzyme POD hoạt ñộng mạnh giá trị pH = 6,5; Ion Hg2+ ảnh hưởng ñến hoạt tính POD, enzyme hoàn toàn hoạt tính giá trị nồng ñộ 5mg/l Hg2+ ðây hướng nghiên cứu thân thiện với môi trường, có giá trị thực tiễn cao với phạm vi áp dụng rộng rãi Mở ñầu∗ E-mail: tthong@vnu.edu.vn máy lọc dầu, sản xuất sản phẩm cao su, chưng cất than ñá này…[2] Củ cải trắng tên khoa học Raphanus sativus L., thuộc họ cải Brassicaceae Củ cải trắng chứa 92% nước, 1,5% protit, 3,7% glucit, 1,8% cellulose Trong củ cải tươi có chứa glucose, pentosan, adenin, arginin, histidin, cholin, trigonellin, diastase… vitamin A, B, C Rễ chứa glucosit enzyme methyl mercaptan Củ cải có vị cay, ñắng, tính bình ñộc, có tác dụng long ñờm, trừ viêm [1] Nước bị ô nhiễm thủy ngân vấn ñề môi trường ñược quan tâm nghiên cứu ñộc tính tác ñộng thủy ngân ñối với thủy sinh vật người Trong báo nghiên cứu sử dụng enzyme peroxidase tách chiết từ củ cải trắng ñể xác ñịnh hàm lượng thủy ngân nước ô nhiễm nhằm phát triển phương pháp sinh học dùng enzyme ñể phát ion Hg 2+ môi trường, ứng dụng có giá trị loại củ cải ñược trồng phổ biến Việt Nam Enzyme Peroxidase (POD) enzyme có nhiều củ cải trắng loại họ ðậu POD ñược sử dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực, ñặc biệt xử lý môi trường POD ñược sử dụng ñể xúc tác cho trình xử lý chất ô nhiễm khó phân hủy phenol thường có mặt nước thải công nghiệp nhà Thực nghiệm 2.1 Hóa chất thiết bị nghiên cứu a Hóa chất _ ∗ Tác giả liên hệ ðT: 84-4-5583001 + (NH4)2SO4 tinh khiết 23 24 T.T Hồng nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 23-27 + Dung dịch Na2SO3 0,05% + Dung dịch ñệm photphat (pH = 5,7 8,0) + Dung dịch chuẩn Casein 0,1% + Chỉ thị Indigocacmin (Ind) 0,1% + Dung dịch H2O2 3% b Thiết bị Máy xay sinh tố Máy li tâm, Ranetki T30 (Nga) Máy ño pH Hanan (ðức) Máy UV - VIS (Labomed, INC) 2.2 Phương pháp chiết dung dịch enzyme Cân 100g củ cải tươi, thái nhỏ, cho vào máy xay sinh tố, thêm 20 ml nước cất, xay nhuyễn thành dung dịch keo ñặc Thêm 100ml dung dịch Na2SO3 0,05%, khuấy ñều, lọc bỏ cặn thô Sau ñó, ñem ly tâm dung dịch lọc với tốc ñộ 3000 vòng/phút vòng 10 phút Thu lấy dịch loại bỏ cặn, xác ñịnh thể tích dung dịch (V) sau ly tâm, ta ñược dung dịch enzyme tủa thu ñược túi xelophan với môi trường ñệm axetat Na 0,01N Sau 2h lại thay ñổi dung dịch ñệm Na Tiếp tục cho ñến không phản ứng NH4+ dung dịch ñệm sau trình thẩm tích kết thúc 2.4 Phương pháp xác ñịnh hoạt ñộ enzyme [4,5] Sử dụng dung dịch enzyme tách ñược nồng ñộ (NH4)2SO4 thích hợp ñể xác ñịnh hoạt ñộ enzyme Lấy dãy bình tam giác 100ml, dãy ñối chứng dãy thí nghiệm cho vào bình 2ml nước cất, 2ml ñệm photphat (pH = 6,0), thêm 3ml dung dịch enzyme, 1ml thuốc thử Indigocacmin 0,1%, lắc ñều Sau ñó cho 2ml H 2O 3% theo dõi trình màu Indigocacmin tính theo thời gian từ bắt ñầu cho H2O2 ñến dung dịch chuyển sang màu vàng xanh 2.5 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng Protein [6] Lấy dãy ống nghiệm 10 ml, sử dụng dung 2.3 Phương pháp tách enzyme [3] Cân 20g (NH4)2SO4 tinh khiết, hòa tan dần vào 80ml dung dịch enzyme thu ñược cho ñến (NH 4)2SO tan hết, ta ñược dung dịch enzyme chứa 20% (NH4)2SO4 Sau ñó, ñể lạnh 30 phút ly tâm Thu ñược dịch I kết tủa I Cho thêm (NH 4)2SO vào dịch I thu ñược ñến nồng ñộ 40%, ñể lạnh 30 phút, li tâm thu ñược dịch II kết tủa II Thêm (NH 4)2SO vào dịch II cho ñến nồng ñộ 60%, ñể lạnh 30 phút, li tâm, gạn lấy dịch III kết tủa III Sau kết thúc trình kết tủa tiến hành xác ñịnh hoạt tính POD ñể xem POD tách tốt giai ñoạn Tiến hành thẩm tích kết dịch Casein chuẩn (0,01%) pha thành dung dịch có nồng ñộ khác ðo ñộ hấp thụ dãy dung dịch chuẩn bước sóng 280 nm Dựa vào ñộ hấp thụ dãy dung dịch chuẩn, xây dựng ñường chuẩn ñể xác ñịnh hàm lượng protein mẫu 2.6 Phương pháp xác ñịnh hàm lượng Hg2+ [3] Peroxidase xúc tác cho trình oxy hóa Ind có mặt H2O2: Ind + H O → Ind + H O + O (màu xanh) (màu vàng) Khi enzyme bị ức chế Hg2+, tốc ñộ oxy hóa chất nhỏ ñi, thời gian màu dài Như vậy, thời gian màu tỉ lệ thuận với nồng ñộ Hg2+ ức chế enzyme T.T Hồng nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 23-27 Chuẩn bị dãy bình tam giác 100ml, cho vào bình 10ml dung dịch enzyme, 2ml dung m1 = 10 ×( ( ) = ,0 0423( ) ) 25 dịch Hg2+ có nồng ñộ từ 0,5 ñến 5mg/l 1ml dung dịch thuốc thử Ind 0,1% lắc ñều Sau ñó, cho 2ml H 2O 3% Tiến hành ño mật ñộ quang dãy dung dịch bước sóng 670nm Thể tích dung dịch chiết thu ñược từ 200g nguyên liệu 300ml Hàm lượng protein trong 1g nguyên liệu ñược xác ñịnh theo công thức: theo dõi trình màu dãy dung dịch So sánh thời gian màu dãy dung dịch với thời gian màu bình ñối chứng mprotein = V .N V a mg/l Sử dụng ñồ thị chuẩn ñể xác ñịnh hàm lượng enzyme dịch chiết Kết Trong ñó: 3.1 Khảo sát hàm lượng protein củ cải trắng V1: Thể tích dịch chiết thu ñược sau ly tâm; Xây dựng ñường chuẩn ñể xác ñịnh hàm lượng protein dịch chiết trình tách enzyme ðồ thị chuẩn ñược xây dựng với dung dịch Casein có nồng ñộ: 1; 2; 3; 4; 5; m1 : Khối lượng protein V2 ml mẫu ño; V2 : Thể tích mẫu ñem ño N : Hệ số pha loãng a : Khối lượng nguyên liệu chiết tách ban ñầu (g) mprotein = ( ) O D1 0.8 y = 0.1415x - 0.0251 0.6 R = 0.9971 0.4 0.2 0 Casein (mg/l) Hình ðồ thị xác ñịnh hàm lượng protein theo lượng Casein Phương trình ñường chuẩn Casein là: y = 0,1415x - 0,0251 Trong ñó: y mật ñộ quang; x hàm 3.2 Xác ñịnh pH tối ưu cho hoạt ñộ POD Tiến hành xác ñịnh hoạt ñộ enzyme POD môi trường ñệm photphat có pH khác (pH = 5,5 - 8,0) Kết hoạt ñộ POD hình lượng protein Hình Ảnh hưởng pH ñến hoạt ñộ POD Mật ñộ quang dung dịch enzyme mẫu ño ñược y1 = 0,574 Qua hình ta thấy, pH tối ưu cho phản ứng Hàm lượng protein 10 ml mẫu phân tích là: xúc tác POD khoảng 6,5 Chúng tiến hành nghiên cứu giá trị pH = 6,5 26 T.T Hồng nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 23-27 3.3 Ảnh hưởng nồng ñộ Hg2+ ñến hoạt ñộ POD ðể ñánh giá ảnh hưởng Hg2+ ñến hoạt ñộ POD, tiến hành phản ứng ức chế với nồng ñộ Hg2+ từ 0,5 - 5,0 mg/l Kết ñược hình Kết luận Kết nghiên cứu cho thấy: - Hàm lượng protein củ cải 0,1269 mg/g Enzyme POD hoạt ñộng mạnh giá trị pH = 6,5 - Ion Hg 2+ ảnh hưởng ñến hoạt tính POD, giá trị nồng ñộ Hg2 mg/l +, enzyme hoàn toàn hoạt tính A (%) 100 90 80 70 60 50 40 30 20 10 Kết rằng, dùng POD ñể xác ñịnh hàm lượng ion Hg2+ nước ô nhiễm với nồng ñộ 0,5 - 5,0 mg/l Hg2+ (mg/l) Hình ðồ thị biểu diễn phụ thuộc hoạt ñộ peroxidase vào nồng ñộ Hg2+ Kết phân tích hình cho thấy, hoạt ñộ enzyme (A) tỷ lệ nghịch với hàm lượng ion Hg2+ khoảng nồng ñộ 0,5 5mg/l, nồng ñộ Hg2+ ñạt ñến mg/l, enzyme hoàn toàn bị hoạt tính (A = 0%) Thử nghiệm xác ñịnh nồng ñộ Hg 2+ mẫu nước thải ðể thử nghiệm sử dụng POD xác ñịnh hàm lượng ion Hg2+ nước ô nhiễm, lấy mẫu nước thải chưa qua xử lý Nhà máy khóa Việt Tiệp, tiến hành phản ứng ức chế enzyme POD theo bước tương tự với dung dịch chuẩn Hg2+ Dựa vào thực nghiệm ñường chuẩn, tính toán ñược nồng ñộ Hg 2+ mẫu nước thải chưa qua xử lý Nhà máy khóa Việt Tiệp 0.8 mg/l, phù hợp với kết phân tích Bộ môn Hóa học phân tích, Khoa Hóa học, Trường ðại học Khoa học Tự nhiên Củ cải trắng nguồn nguyên liệu phổ biến, rẻ sẵn có Ngoài ra, hóa chất sử dụng trình nghiên cứu không mang tính chất ñộc hại Vì vậy, ñây hướng nghiên cứu thân thiện với môi trường, có giá trị thực tiễn cao, phạm vi áp dụng rộng Công trình ñược hoàn thành hỗ trợ kinh phí Chương trình Nghiên cứu Khoa học Tự nhiên Tài liệu tham khảo [1] Báo Khoa học Phổ thông 8/2004 [2] Kwang-SooShinI, Young Hwan Kimz, LongSoon Lim3, Purification and Characterization of Manganese Peroxidase, The Journal of Microbiology, Vol 43, No.6 (2005) 503 [3] Trần ðình Toại, ðỗ Ngọc Lanh, Mai Hữu Tuyên, Nguyễn Thị Vân Hải, Nguyễn Thu Hoài, 1998, Nghiên cứu phương pháp sinh học sử dụng enzyme ñể ñánh giá môi trường bị ô nhiễm kim loại nặng, Tuyển tập báo cáo khoa học Trung tâm nhiệt ñới Việt - Nga, - sinh thái nhiệt ñới công nghệ sinh học, 1998, tr.155-167 [4] Nguyễn Văn Mùi, Xác ñịnh hoạt ñộ Enzyme, NXB Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội, 2002 [5] Trần ðình Toại, Nguyễn Thị Vân Hải, ðộng học trình xúc tác sinh học, NXB Khoa học Kĩ thuật, Hà Nội, 2005 [6] Н.П Мешковa; Севeрина С.Е., Практикум по биохимии Издательство Университет, 1979, 87-88 Московского T.T Hồng nnk / Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự Nhiên Công nghệ 24 (2008) 23-27 27 Study of the application of peroxidase enzyme extracted from white radish in determination of mercury in contaminated water Tran Thi Hong, Tran Hoang Thanh, Nguyen Thi Ha Giang College of Science, VNU, 334 Nguyen Trai, Hanoi, Vietnam We report the study of the application of peroxidase enzyme (POD) extracted from the white radish in determination of the mercury in contaminated water The results showed that the amount of protein in white radish was 0,1269 mg/g; the activation of POD was achieved at the pH = 6,5 and the concentration of Hg2+ ions that deactivated the POD was mg/l Hg2+ This study is environmentfriendly and has direct application in wide aspects