Nghiên cứu định lượng atenolol và các đồng phân đối quang trong một số chế phẩm thuốc và trong dịch sinh học

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TẠ MẠNH HÙNG NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG ATENOLOL VÀ CÁC ĐỒNG PHÂN ĐỐI QUANG TRONG MỘT SỐ CHẾ PHẨM THUỐC VÀ TRONG DỊCH SINH HỌC Chuyên ngành: KIỂM NGHIỆM THUỐC VÀ ĐỘC CHẤT Mã số: 62720410 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC Hà Nội, năm 2016 Công trình hoàn thành tại: TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI VIỆN KIỂM NGHIỆM THUỐC TRUNG ƯƠNG Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS Trịnh Văn Lẩu PGS.TS Nguyễn Thị Kiều Anh Phản biện 1: ……………………………………………………… ……………………………………………………… Phản biện 2: ……………………………………………………… ……………………………………………………… Phản biện 3: ……………………………………………………… ……………………………………………………… Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại: ……………………………………………………………… ……………………………………………………………………… ……………………………………………………………………… Vào hồi ………giờ………ngày…….tháng……năm 2016 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Thư viện Trường đại học Dược Hà Nội A – GIỚI THIỆU LUẬN ÁN Tính cấp thiết luận án Theo thống kê, khoảng 50% số hoạt chất lưu hành thị trường dược phẩm hợp chất có đồng phân đối quang (ĐPĐQ) gần 1/3 số này, ĐPĐQ dược chất có đặc tính dược lý, dược lực học, độc tính… không giống Atenolol (ATN) dẫn chất benzenacetamid, có tác dụng ức chế chọn lọc β–adrenergic, dùng điều trị tăng huyết áp số dược chất có đặc điểm nêu Trong hai ĐPĐQ, đồng phân tả tuyền (S-ATN) có tác dụng ức chế β–adrenergic cao khoảng 50 lần tác dụng phụ so với đồng phân hữu tuyền (R-ATN) Để giảm lượng dược chất đưa vào thể, giảm tác dụng không mong muốn R-ATN trì quyền bảo hộ, nhiều công ty dược nghiên cứu sản xuất chế phẩm thuốc có dược chất S-ATN với hàm lượng 1/2 thuốc ATN racemic Xu hướng nghiên cứu chuyển thuốc có ĐPĐQ tác dụng dược lý khác dạng racemic thành thuốc chứa ĐPĐQ hướng phát triển ngành công nghiệp dược năm gần Hướng phát triển này, đòi hỏi phải có phương pháp phân tích ĐPĐQ kiểm tra chất lượng, nghiên cứu sinh khả dụng (SKD) đánh giá tương đương sinh học (TĐSH) thuốc Tuy nhiên, ĐPĐQ có cấu tạo hóa học giống nhau, nhiều tính chất lý-hóa tương tự nên phân tích ĐPĐQ chế phẩm thuốc đặc biệt dịch sinh học gặp nhiều khó khăn Do vậy, luận án “Nghiên cứu định lượng atenolol đồng phân đối quang số chế phẩm thuốc dịch sinh học” thực Mục tiêu luận án Luận án thực với mục tiêu nghiên cứu phương pháp phân tích ATN ĐPĐQ chế phẩm thuốc huyết tương (HT) nhằm góp phần kiểm soát chất lượng thuốc so sánh SKD, TĐSH thuốc ATN lưu hành thị trường Để đạt mục tiêu này, luận án thực nội dung sau: 1) Nghiên cứu xây dựng, thẩm định phương pháp phân tích ĐPĐQ ATN chế phẩm thuốc 2) Nghiên cứu xây dựng, thẩm định phương pháp phân tích ATN ĐPĐQ huyết tương 3) Ứng dụng phương pháp phân tích (PPPT) đồng phân kiểm tra chất lượng nghiên cứu SKD, đánh giá TĐSH số chế phẩm thuốc ATN lưu hành thị trường Những đóng góp luận án  Lần Việt Nam, xây dựng thành công phương pháp điện di mao quản (CE), sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC), sắc ký lỏng– khối phổ (LC-MS/MS) phân tích ATN ĐPĐQ chế phẩm thuốc HT người - Phương pháp CE phân tách ĐPĐQ ATN chế phẩm với cột mao quản silica nung chảy dung dịch điện ly chứa tác nhân hoạt quang carboxymethyl-β-cyclodextrin (CM-β-CD) đáp ứng yêu cầu Dược điển Việt Nam, Anh, Mỹ - Phương pháp HPLC sử dụng cột sắc ký chứa pha tĩnh đối quang cellobiohydrolase có thời gian phân tích ngắn (dưới phút), độ phân giải pic đồng phân lớn (Rs > 5), giới hạn định lượng nhỏ (0,273 ppm) phù hợp để phân tích ĐPĐQ ATN chế phẩm thuốc mà thích hợp để xác định hàm lượng tạp chất đối quang R-ATN mẫu nguyên liệu chế phẩm thuốc đơn đồng phân S-ATN với mức giới hạn thấp (dưới 0,1%) - Phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần HT người với cột C18 có kích thước hạt nhồi nhỏ xác định nồng độ ATN MS/MS với nguồn ion hóa ESI (+) có thời gian phân tích ngắn (2,5 phút), giới hạn định lượng nhỏ (5 ppb) - Phương pháp LC-MS/MS phân tích ĐPĐQ ATN HT người LC-MS/MS với cột sắc ký chứa pha tĩnh đối quang xác định nồng độ ATN mẫu MS/MS với nguồn ESI (+) có thời gian phân tích ngắn, độ phân giải pic đồng phân lớn, giới hạn định lượng nhỏ (2,5 ppb) Phương pháp LC-MS/MS định lượng ĐPĐQ ATN HT người nghiên cứu luận án công bố lần đầu  Lần Việt Nam, kiểm tra chất lượng nghiên cứu SKD in vivo số thuốc ATN (dạng racemic dạng S-ATN) lưu hành phương pháp phân tích đồng thời ĐPĐQ - Các mẫu thuốc S-ATN có hàm lượng tạp ĐPĐQ liên quan R-ATN không giống nhau, mẫu có hàm lượng tạp > 2,0% - SKD R-ATN S-ATN người tình nguyện (NTN) tương tự nhau, chuyển dạng đồng phân S-ATN thuốc đơn đồng phân có SKD cao so với S-ATN thuốc racemic Các thuốc ATN racemic có Cmax, AUC Tmax tương đương Các thuốc S-ATN có Cmax AUC khác Ý nghĩa luận án Phân tích ĐPĐQ chế phẩm đặc biệt phân tích ĐPĐQ dịch sinh học chủ đề phân tích khó khăn Việt Nam mà nhiều nước khác Việc xây dựng thành công phương pháp phân tích ĐPĐQ ATN chế phẩm thuốc HT giúp nâng cao lực kiểm tra, giám sát chất lượng thuốc đối quang hệ thống kiểm nghiệm nước Kết kiểm tra chất lượng, nghiên cứu SKD đánh giá TĐSH số chế phẩm thuốc ATN lưu hành thị trường cho thấy cần thiết phải có phương pháp phân tích ĐPĐQ để đảm bảo chất lượng, hiệu điều trị công thương mại thuốc đối quang dạng racemic dạng đơn đồng phân Bố cục luận án Luận án gồm chương, 58 bảng, 66 hình, 206 tài liệu tham khảo với 19 tài liệu tiếng Việt, 187 tài liệu tiếng Anh phụ lục Luận án dài 148 trang, gồm phần chính: Đặt vấn đề (2 trang); Chương 1: Tổng quan (46 trang); Chương 2: Nguyên liệu, trang thiết bị, nội dung phương pháp nghiên cứu (13 trang); Chương 3: Kết nghiên cứu (68 trang); Chương 4: Bàn luận (16 trang); Kết luận kiến nghị (3 trang) B – NỘI DUNG LUẬN ÁN CHƯƠNG TỔNG QUAN Đã trình bày tập hợp có hệ thống nội dung liên quan đến luận án bao gồm: - Khái niệm thuốc chứa dược chất đối quang; tầm quan trọng phân tích ĐPĐQ; tình hình nghiên cứu phân tích ĐPĐQ nước; nguyên lý phân tích ĐPĐQ phương pháp phân tích ĐPĐQ thường gặp - Kỹ thuật xử lý, chiết tách hoạt chất cần phân tích mẫu dịch sinh học; phân tích thuốc dịch sinh học LC-MS/MS yêu cầu thẩm định PPPT thuốc dịch sinh học USFDA EMA - Tổng quan atenolol; nghiên cứu phân tích ATN ĐPĐQ chế phẩm thuốc dịch học từ trước đến Việt Nam giới ĐPĐQ hai đồng phân không gian dạng ảnh vật qua gương, chúng có công thức hóa học hoàn toàn giống khác cách bố trí không gian nhóm quanh trung tâm bất đối xứng phân tử Sự khác cấu trúc không gian nhóm làm cho dạng đồng phân có tương tác khác với thụ thể sinh học xác định (tương tự phản ứng đặc hiệu “chất mang-thụ thể” enzym) Lịch sử y văn giới ghi nhận thảm họa y học liên quan đến ĐPĐQ tả tuyền thuốc thalidomid dạng racemic (hội chứng phocomelia) số lượng thuốc chứa dược chất đối quang không ngừng gia tăng qua năm vừa qua Theo thống kê, khoảng 50% số hoạt chất lưu hành thị trường dược phẩm hợp chất có tính đối quang gần 1/3 số này, ĐPĐQ dược chất có đặc tính sinh học thể sống không giống Các thuốc có doanh số bán chạy toàn cầu năm 2006 – 2012 thuốc chứa dược chất đối quang Xu hướng đòi hỏi phải có PPPT phù hợp nghiên cứu phát triển sản phẩm kiểm tra chất lượng, nghiên cứu SKD đánh giá TĐSH thuốc đối quang Các ĐPĐQ có công thức cấu tạo hóa học giống nhiều tính chất lý-hóa tương tự nên thực tế phân tích phương pháp HPLC, GC CE thông thường Đặc điểm thường sử dụng để phân tách hai ĐPĐQ hỗn hợp racemic PPPT hóa lý khả tương tác khác ĐPĐQ chất chọn lọc hoạt quang xác định Trong dung dịch, tương tác tác nhân chọn lọc hoạt quang (Re-S) đồng phân hữu tuyền (R-A) tả tuyền (S-A) mô tả phương trình phản ứng: R - A  Re S  KR  R   A(Re S ) KS S  - A  Re S  S   A(Re S ) Hỗn hợp phức hợp phi đối quang tạo thành có lượng độ bền liên kết khác phụ thuộc vào cấu tạo đồng phân tác nhân hoạt quang Sự khác biệt số tạo phức KR, KS khác biệt độ bền phức hợp tạo thành sở hóa lý việc phân tích đồng phân đối quang phương pháp sắc ký điện di Tùy theo chế tạo phức đặc điểm PPPT, tác nhân chọn lọc hoạt quang thêm vào hệ thống phân tích theo hai cách trực tiếp gián tiếp Atenolol dẫn chất benzenacetamid (CTPT: C14H22N2O3, KLPT: 266,3 g/mol) có tên khoa học 4-[2-hydroxy-3-[(1metyletyl)amino]propoxy] benzeneacetamid Do phân tử có cấu tạo bất đối xứng, công thức cấu tạo phân tử, nguyên tử carbon bất đối mạnh nhánh liên kết nhóm khác nên ATN có ĐPĐQ tả tuyền hữu tuyền Trong hai ĐPĐQ, S-ATN có tác dụng ức chế chọn lọc β–adrenergic cao tác dụng phụ loạn nhịp, đánh trống ngực so với R-ATN ATN số dược chất đối quang, Cơ quan quản lý thuốc số nước đồng ý cấp phép cho lưu hành song song hai dạng ATN racemic S-ATN Các thuốc đơn đồng phân S-ATN có hàm lượng 1/2 hàm lượng thuốc ATN racemic Tuy vậy, ATN dược chất có SKD không cao, nồng độ dược chất máu thấp dao động mạnh cá thể đồng thời SKD S-ATN so với ATN racemic chưa nghiên cứu, thiết lập đầy đủ Do đó, cần thiết phải xây dựng PPPT ĐPĐQ ATN chế phẩm thuốc dịch sinh học nhằm đánh giá chất lượng so sánh SKD thuốc đối quang ATN Việc nghiên cứu phân tích quản lý chất lượng thuốc đối quang ATN nói riêng số thuốc đối quang khác nói chung Việt Nam nhiều hạn chế quan tâm số năm gần Dược điển Việt Nam lần xuất thứ IV năm 2009, có 03 chuyên luận quy định mức giới hạn tạp chất đối quang cho dược chất dexclopheniramin, lamivudin timolol Trong năm gần có khoảng 10 nghiên cứu phân tích tạp chất đối quang chế phẩm thuốc tiến hành Chưa có nghiên cứu nào, phân tích ĐPĐQ ATN chế phẩm dịch sinh học công bố CHƯƠNG NGUYÊN LIỆU, TRANG THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu, trang thiết bị 2.1.1 Dung môi, hóa chất chất chuẩn - Chất chuẩn: Atenolol – VKNTTW, hàm lượng 100,17%, độ ẩm 0,11%; SKS: 0102093 S-ATN – Sigma, hàm lượng 99,3%, lô: 021M4620V R-ATN – Sigma, hàm lượng 99,9%, lô: STBD2674V - Các dung môi, hóa chất thuốc thử dùng nghiên cứu: Đạt tiêu chuẩn LC-MS, HPLC tinh khiết hóa học tùy theo loại - Các mẫu HT Viện huyết học truyền máu TW cung cấp dùng xây dựng thẩm định PPPT dịch sinh học 2.1.2 Thiết bị, dụng cụ phân tích - Tất thiết bị kiểm tra, hiệu chuẩn định kỳ đáp ứng yêu cầu GLP ISO-IEC 17025, bao gồm thiết bị phân tích: Máy HPLC: (Shimadzu–Nhật Bản); máy UPLC-MS/MS (Thermo Scientific–Mỹ); máy CE (Agilent–Mỹ) Ngoài thiết bị phân tích nêu có cân phân tích (d = 0,01 0,1 mg), máy đo pH, máy thử độ hòa tan, thiết bị xử lý, chiết tách bảo quản mẫu như: Máy lắc siêu âm, lắc học, ly tâm, tủ lạnh sâu bảo quản mẫu… - Các dụng cụ phân tích bao gồm: Cột điện di mao quản silica nung chảy; cột HPLC có thành phần pha tĩnh hoạt quang khác nhau; micropipet loại dụng cụ thủy tinh xác, dụng cụ thủy tinh pha xử lý mẫu… 2.2 Đối tượng nghiên cứu 2.2.1 Mẫu thuốc nghiên cứu - Thuốc viên nén ATN dạng racemic: 03 thuốc Việt Nam sản xuất 01 thuốc biệt dược gốc (Ternomin 50mg – AstraZeneca, Anh) - Thuốc viên nén S-ATN: 01 thuốc AhGook Pharm Ltd., Hàn Quốc sản xuất 03 thuốc Emcure Pharmaceutical Ltd., Ấn Độ 2.2.2 Mẫu huyết tương người chứa atenolol - Các mẫu HT tự tạo chứa ATN: Hòa tan chuẩn ATN chuẩn RATN hay chuẩn S-ATN HT trắng với nồng độ khác - Mẫu thử: Các mẫu HT NTN tham gia nghiên cứu khảo sát SKD/TĐSH thuốc ATN (racemic hay S-ATN) mẫu HT bệnh nhân sử dụng chế phẩm thuốc ATN 2.3 Nội dung phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Nghiên cứu định lượng atenolol ĐPĐQ chế phẩm 2.3.1.1 Khảo sát xây dựng phương pháp - Phương pháp CE: Nghiên cứu phân tách ĐPĐQ phương pháp điện di mao quản vùng cột mao quản silica nung chảy với dung dịch điện ly chứa tác nhân chọn lọc hoạt quang khác Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố thành phần, pH, nồng độ dung dịch đệm; chất, nồng độ tác nhân chọn lọc hoạt quang… đến khả tách đồng phân ATN để lựa chọn điều kiện điện di phù hợp - Phương pháp HPLC: nghiên cứu phân tích ĐPĐQ ATN với cột sắc ký chứa pha tĩnh đối quang có thành phần chất khác Đối với loại cột, tiến hành khảo sát: thành phần, tỷ lệ thành phần pha động; ảnh hưởng pH dung dịch đệm đến khả phân tách ĐPĐQ 2.3.1.2 Thẩm định phương pháp Tiến hành thẩm định PPPT theo hướng dẫn thẩm định dược điển với tiêu: Độ thích hợp hệ thống; độ đặc hiệu-chọn lọc; khoảng nồng độ tuyến tính; giới hạn LOD, LOQ; độ đúng; độ chụm 2.3.1.3 Ứng dụng PPPT kiểm tra chất lượng thuốc atenolol - Xác định hàm lượng ĐPĐQ ATN số chế phẩm thuốc lưu hành phương pháp HPLC, CE nghiên cứu xây dựng thẩm định Phân tích thống kê, so sánh kết định lượng ATN phương pháp So sánh kết định lượng ATN toàn phần phương pháp nghiên cứu luận án với phương pháp Dược điển Mỹ - Phân tích xác định hàm lượng tạp chất R-ATN chế phẩm SATN phương pháp nghiên cứu luận án Từ kết phân tích, so sánh chất lượng sản phẩm - Đánh giá tương đương độ hòa tan in vitro thuốc theo hướng dẫn WHO, US-FDA sử dụng PPPT nghiên cứu luận án để xác định hàm lượng ATN ĐPĐQ thuốc hòa tan môi trường thử 2.3.2 Nghiên cứu định lượng atenolol ĐPĐQ huyết tương 2.3.2.1 Khảo sát xây dựng phương pháp LC-MS/MS - Quy trình xử lý mẫu HT: Nghiên cứu kỹ thuật xử lý mẫu khác tủa protein chiết lỏng–lỏng với dung môi hữu Từ kết thực nghiệm, lựa chọn quy trình xử lý mẫu đơn giản, thu hồi ATN chất chuẩn nội với hiệu suất cao ổn định đồng thời không gây ảnh hưởng mẫu phân tích MS - Nghiên cứu điều kiện sắc ký: Khảo sát với điều kiện sắc ký khác - Khoảng nồng độ tuyến tính từ 20–70 µg/ml ĐPĐQ từ 40–140 µg/ml R,S-ATN, hệ số tương quan r > 0,99 - Độ phương pháp S-ATN 98,9 ± 0,51% (n = 9) R-ATN 99,5 ± 0,89% (n = 9) - Giá trị RSD% độ lặp lại S-ATN, R-ATN 1,35 1,59% (n = 6) Giá trị RSD% độ xác trung gian S-ATN, RATN 1,18 1,32% (n = 9) 3.1.2 Định lượng ĐPĐQ ATN chế phẩm HPLC 3.1.2.1 Nghiên cứu xây dựng phương pháp HPLC Tiến hành nghiên cứu khả phân tách ĐPĐQ ATN cột HPLC chứa pha tĩnh đối quang khác nhau: Cột Ultron ES – OVM (ovomucoid protein), Chiralcel AGP (α1-acid glycoprotein), Chirex 3022 (tác nhân hoạt quang kiểu Pirkle), Astec Cyclobond I (dẫn chất βCD tự nhiên) Chiralpak CBH (cellobiohydrolase) Từ kết thực nghiệm phân tích khả phân tách hệ sắc ký xây dựng phương pháp HPLC sử dụng đầu dò mảng diode cột sắc ký đối quang phân tích ĐPĐQ ATN chế phẩm:  Phương pháp 1: - Cột Chirex 3022 (4,0 x 250 mm; 5µm) - Pha động: n-hexan – 1,2 diclorometan – MeOH – acid TFA, tỷ lệ 57,5 : 35 : 7,5 : 0,2 (v/v/v/v) Tốc độ dòng ml/phút  Phương pháp 2: - Cột Chiralpak CBH (4,0 x 150 mm; 5µm) - Pha động: 2-propanol – dung dịch đệm amoni acetat 10 mM, pH 5,9 tỷ lệ 10 : 90 (v/v) Tốc độ dòng 0,7 ml/phút Sắc ký đồ phân tích mẫu chuẩn R,S-ATN hai phương pháp HPLC trình bày Hình 3.12 Hình 3.13 Phân tích cột Chiralpak CBH, độ phân giải pic ĐPĐQ lớn (Rs > 5), thời gian phân tích ngắn (dưới min) Do vậy, luận án trình bày kết thẩm định PPPT ĐPĐQ ATN chế phẩm phương pháp HPLC với cột Chiralpak CBH 11 Hình 3.12 SKĐ phổ UV mẫu R,S-ATN phân tích cột Chirex mAU 230nm,4nm (1 00) 25 S-Atenolol/5.526 R-Atenolol/3.771 30 20 15 10 -5 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 Hình 3.13 SKĐ mẫu R,S-ATN phân tích cột Chiralpak CBH 3.1.2.2 Thẩm định phương pháp HPLC Tiến hành thẩm định theo hướng dẫn dược điển cho kết quả: - Phương pháp đặc hiệu-chọn lọc với ATN SKĐ mẫu giả dược pic Phân tích 06 mẫu chuẩn R,S-ATN, SKĐ pic ĐPĐQ tách với Rs = 5,298; tR R- S-ATN 3,772 5,524 (RSD < 0,5%) Các pic cân đối, RSD diện tích, chiều cao pic < 1,0% SKĐ mẫu thử pic có tR phổ UV tương ứng với pic SKĐ mẫu chuẩn - Khoảng nồng độ tuyến tính ĐPĐQ từ 2,5 đến 50 µg/ml, hệ số tương quan r > 0,999 - Giới hạn phát phương pháp ĐPĐQ khoảng 12 0,08 µg/ml; giới hạn định lượng R-ATN 0,272 µg/ml (tương đương với mức giới hạn 0,02% so với hàm lượng S-ATN) - Phương pháp có độ  99,0% (min: 98,1%; max: 99,6%) Độ xác với RSD < 2,0% 3.1.3 Phân tích ATN ĐPĐQ chế phẩm 3.1.3.1 Định lượng ATN ĐPĐQ chế phẩm - Tiến hành phân tích xác định hàm lượng ATN ĐPĐQ mẫu thuốc (4 mẫu racemic, mẫu S-ATN) phương pháp HPLC, CE nghiên cứu Các mẫu thuốc đạt yêu cầu % hàm lượng hoạt chất so nhãn (nằm giới hạn 90 – 110%) - Hàm lượng ATN ĐPĐQ mẫu thử xác định HPLC CE khác ý nghĩa thống kê (p = 0,05) Hai phương pháp có độ xác tương đương - Phân tích ANOVA (Bảng 3.13), hàm lượng ATN toàn phần mẫu thử xác định phương pháp nghiên cứu luận án hàm lượng ATN toàn phần xác định phương pháp HPLC Dược điển Mỹ (điều kiện sắc ký không tách ĐPĐQ) không khác biệt Bảng 3.13 So sánh kết định lượng ATN phương pháp Nguồn Tổng bình Bậc Trung bình FTN P biến thiên phương tự bình phương value value Giữa PP 0,421333 0,210667 0,34 0,72 Trong PP 7,516000 12 Tổng 7,937333 14 0,626333 3.1.3.2 Xác định hàm lượng tạp R-ATN mẫu thuốc S-ATN Phân tích xác định hàm lượng tạp ĐPĐQ liên quan R-ATN 04 mẫu thuốc S-ATN phương pháp HPLC nghiên cứu luận án Kết có mẫu thuốc giới hạn tạp chất đạt yêu cầu, mẫu thuốc có giới hạn tạp chất > 2,0% 3.1.3.3 Định lượng ATN ĐPĐQ so sánh độ hòa tan in vitro Kết thực nghiệm cho thấy, phương pháp HPLC xây dựng phù hợp để xác định ATN ĐPĐQ hòa tan môi trường thử độ 13 hòa tan Các đồng phân S- R-ATN thuốc racemic có tỷ lệ hòa tan thời điểm tương tự Độ hòa tan in vitro thuốc tương đương Biểu đồ hòa tan thuốc môi trường thử độ hòa tan pH 1,2 trình bày Hình 3.19 Hình 3.19 Biểu đồ hòa tan thuốc môi trường pH 1,2 3.2 Phân tích atenolol ĐPĐQ huyết tương 3.2.1 Định lượng ĐPĐQ ATN HT LC-MS/MS 3.2.1.1 Nghiên cứu xây dựng phương pháp Tiến hành nghiên cứu khảo sát quy trình xử lý mẫu HT, điều kiện sắc ký điều kiện MS/MS Mục 2.3.2.1 Từ kết thực nghiệm, xây dựng phương pháp LC-MS/MS định lượng ĐPĐQ ATN HT sau:  Quy trình xử lý mẫu HT: 1,0 ml HT, thêm 50 µl dung dịch IS 500 µl NH4OH 0,1M Chiết với ml cloroform Lắc học, ly tâm 3000 vòng/phút x phút Lấy lớp cloroform, cô bay dung môi đến cắn Hòa cắn 1,0 ml pha động sắc ký  Điều kiện sắc ký: Cột Chiralpak CBH (4,0 x 150 mm; µm) Pha động: 2-PrOH – amoni acetat 10 mM (pH 5,9) tỷ lệ 10:90 Tốc độ 0,7 ml/phút Thể tích tiêm mẫu µl  Điều kiện khối phổ: Phổ khối Triple Quadrupole MS/MS, nguồn ion hóa ESI (+) Các thông số thiết bị khối phổ Bảng 3.17 14 Bảng 3.17 Điều kiện khối phổ định lượng atenolol chuẩn nội Hoạt chất R-ATN S-ATN Esomeprazol (IS) Thông số Điện nguồn phun 3200 V 3200 V 3200V o o Nhiệt độ nguồn phun 200 C 200 C 50oC Áp suất khí mang 40 psi 40 psi 40 psi Nhiệt độ mao quản 360oC 360oC 360oC Ion ban đầu, m/z 267,0 267,0 346,1 Thế phân mảnh ion 17 V 17 V 11V Ion tạo thành, m/z 190,0 190,0 198,0 3.2.1.2 Thẩm định phương pháp Tiến hành thẩm định theo hướng dẫn US-FDA EMA Kết quả: - Phương pháp đặc hiệu-chọn lọc với S-, R-ATN SKĐ mẫu HT trắng, mẫu HT chứa chuẩn S-, R-ATN nồng độ 2,5 ng/ml trình bày Hình 3.29 Trên SKĐ, pic ĐPĐQ tách hoàn toàn Rs > không bị ảnh hưởng thành phần tạp có mẫu RT : 0.00 - 7.50 1.94 100 RT : 0.00 - 6.80 6.11 3.24 100 5.12 50 1.94 100 6.11 3.24 5.12 50 1.14 100 1.45 1.71 80 Relative Abundance Relative Abundance 50 3.37 4.70 60 100 RT : 3.56 RT : 5.63 50 100 RT : 4.29 50 5.88 40 0 T i m e (m i n) T i m e (m i n) Hình 3.29 SKĐ tính chọn lọc–đặc hiệu định lượng ĐPĐQ ATN HT LC-MS/MS: mẫu HT trắng (phải); mẫu HT chứa chuẩn R,S-ATN (trái) Chú giải hình: SKĐ tổng ion (TIC): cửa sổ cùng; SKĐ chọn lọc ion atenolol (SRM, m/z: 267  190): cửa sổ giữa; SKĐ chọn lọc ion chuẩn nội (SRM, m/z: 346  198): cửa sổ 15 - Phương pháp có khoảng tuyến tính rộng từ 2,5 – 500 ng/ml Giới hạn định lượng 2,5 ng/ml Độ đúng, độ xác đạt yêu cầu - Hiệu suất chiết ATN chuẩn nội quy trình xử lý mẫu  90% ATN ổn định trình xử lý mẫu, phân tích bảo quản đông lạnh mẫu HT -35 ± 5oC sau 60 ngày 3.2.2 Nghiên cứu định lượng ATN HT LC-MS/MS 3.2.2.1 Nghiên cứu xây dựng phương pháp Tiến hành nghiên cứu Mục 2.3.2.1 Từ kết thực nghiệm xây dựng phương pháp LC-MS/MS phân tích ATN HT sau:  Quy trình xử lý mẫu HT: Tương tự quy trình xử lý mẫu HT phương pháp LC-MS/MS định lượng ĐPĐQ ATN  Điều kiện khối phổ: Tương tự phương pháp LC-MS/MS phân tích ĐPĐQ nhiệt độ nguồn phun giảm 50oC, áp suất khí mang giảm 20 psi chuẩn nội diltiazem  Điều kiện sắc ký: Phân tích cột pha đảo C18 (2,0 x 50 mm; 1,8 µm) ổn định 40C Pha động chứa MeCN – dung dịch amoni acetat mM tỷ lệ 70 : 30 Tốc độ 0,2 ml/phút 3.2.2.2 Thẩm định phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN Tiến hành thẩm định theo hướng dẫn US-FDA EMA Kết quả: - Phương pháp đặc hiệu-chọn lọc với ATN SKĐ mẫu HT trắng, mẫu HT chứa chuẩn ATN nồng độ ng/ml trình bày Hình 3.31 RT : 0.00 - 2.85 0.12 0.28 100 1.42 80 RT : 0.00 - 3.20 1.89 100 2.81 50 40 0.18 100 1.35 0.72 80 1.66 2.82 60 0.12 100 0.28 0.72 90 1.63 1.89 80 2.81 Relative Abundance Relative Abundance 60 RT : 1.36 100 50 RT : 1.85 100 50 70 T i m e (m i n) T i m e (m i n) Hình 3.31 Độ đặc hiệu–chọn lọc phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần: mẫu HT trắng (trái); mẫu HT chuẩn (phải) Chú giải hình: SKĐ chọn lọc ion ATN (SRM, m/z: 267  190) - SKĐ chọn lọc ion diltiazem (SRM, m/z: 415  178) - 16 - Kết phân tích mẫu ATN có nồng độ thấp đường chuẩn không bị ảnh hưởng mẫu - Phương pháp có khoảng tuyến tính rộng từ – 1000 ng/ml Giới hạn định lượng ng/ml Độ đúng, độ xác đạt yêu cầu Tỷ lệ thu hồi chuẩn nội quy trình xử lý mẫu đạt 75,5% 3.2.3 Phân tích ATN ĐPĐQ HT bệnh nhân NTN 3.2.3.1 Định lượng ATN toàn phần HT Phân tích 20 mẫu HT tự tạo chứa ATN hai khoảng nồng độ thấp theo hai phương pháp LC-MS/MS xây dựng thẩm định Kết phân tích thống kê t-test, nồng độ trung bình ATN toàn phần mẫu HT xác định hai phương pháp LC-MS/MS khác ý nghĩa thống kê với mức độ tin cậy 95% 3.2.3.2 Phân tích ATN HT bệnh nhân Phân tích xác định nồng độ ĐPĐQ ATN 23 mẫu HT bệnh nhân điều trị bệnh tim mạch nội trú, phác đồ điều trị có định dùng thuốc ATN đồng ý tham gia nghiên cứu phương pháp LCMS/MS xây dựng Kết trình bày Bảng 3.38 Bảng 3.38 Nồng độ ĐPĐQ ATN HT bệnh nhân Bệnh Mẫu 0h Mẫu 2h Mẫu 24h Stt nhân R-ATN S-ATN R-ATN S-ATN R-ATN S-ATN T.V.H 0 178,6 175,6 9,1 9,3 H.T.T 15,5 14,7 124,6 122,4 * * T.V.C 21,2 22,6 88,6 90,4 24,8 23,5 H.V.S 12,7 12,1 102,4 100,1 11,8 12,5 N.V.S 0 138,3 134,2 7,8 8,3 L.T.V.A 18,4 19,5 91,8 94,3 21,2 20,4 N.T.T.H 0 73,2 70,1 9,0 10,2 L.T.T.H 8,2 9,1 56,7 58,2 7,7 7,6 Kết thực nghiệm cho thấy, phương pháp có độ đặc hiệu-chọn lọc độ cao Kết phân tích không bị ảnh hưởng thuốc sử dụng đồng thời phác đồ điều trị bệnh nhân Một số mẫu 17 HT thời điểm nồng độ ATN > bệnh nhân sử dụng thuốc ATN trước tham gia vào nghiên cứu 3.2.3.3 Phân tích ATN huyết tương NTN tham gia nghiên cứu so sánh SKD thuốc ATN Mười tám niên khỏe mạnh, tình nguyện tham gia nghiên cứu chia làm nhóm, nhóm người: Nhóm 1, so sánh SKD Atenolol Stada 50mg Ternomin 50mg (thuốc ATN racemic); nhóm 2, so sánh SKD hai thuốc S-ATN (Atpure® 25 S-atenolol 25mg); nhóm 3, so sánh SKD S-ATN thuốc ATN racemic (Ternomin 50mg) với thuốc S-ATN (Atpure® 25) Thiết kế nghiên cứu đơn liều, chéo x Trong nhóm, giai đoạn, NTN uống viên thuốc thử viên thuốc đối chứng theo trình tự sử dụng thuốc ngẫu nhiên hóa ngược hai giai đoạn Tiến hành cho NTN uống thuốc lấy mẫu máu Lấy 14 mẫu máu/giai đoạn x ml máu/mẫu NTN Nghiên cứu HĐĐĐ nghiên cứu Y sinh học phê duyệt đề cương trước tiến hành SKĐ phân tích LC-MS/MS xác định nồng độ ĐPĐQ ATN số mẫu HT NTN trình bày Hình 3.36; 3.38 RT : 0.00 - 7.00 RT : 0.00 - 7.00 RT : 3.70 100 100 RT : 5.89 50 RT : 3.70 100 RT : 5.89 50 RT : 4.34 100 Relative Abundance Relative Abundance 50 50 RT : 5.87 100 50 RT : 4.37 100 50 T ime (min) Hình 3.36 SKĐ mẫu HT NTN02 – 2,5h (ATN racemic) T ime (min) Hình 3.38 SKĐ mẫu HT NTN08 – 2,0 h (S-ATN) 18 Từ kết phân tích, xác định thông số DĐH SKD thuốc (Bảng 3.43) đường cong nồng độ dược chất - thời gian thuốc (Hình 3.40 Hình 3.41) Hình 3.40 Đường cong trung bình nồng độ S-ATN – thời gian chế phẩm thuốc người tình nguyện Việt Nam Hình 3.41 Đường cong trung bình nồng độ R,S-ATN – thời gian 19 Bảng 3.43 Thông số DĐH trung bình số thuốc ATN NTN T.số Thuốc Cmax (ng/ml) Tmax (h) AUC0-t AUC0-∞ -1 (ng.ml h) (ng.ml-1.h) T1/2 (h) Ternomin 50mg (n = 12) R-ATN 196,4 2,17 1478,0 1559,8 5,34 S-ATN 192,0 2,15 1428,0 1541,1 5,39 R,S-ATN 388,4 2,16 3137,0 5,37 2905,3 Atenolol – STADA 50mg (n = 6) R-ATN 182,7 2,25 1422,8 1495,1 5,25 S-ATN 177,8 2,25 1342,5 1414,8 5,31 R,S-ATN 360,5 2,25 2765,3 2909,9 5,28 2,31 1779,9 1906,1 5,24 1348,7 1429,2 5,19 ® Atpure 25mg (n = 12) S-ATN 259,3 Viên nén S-atenolol 25mg (n = 6) S-ATN 196,5 1,92 CHƯƠNG BÀN LUẬN 4.1 Phân tích ĐPĐQ ATN chế phẩm HPLC CE Các ĐPĐQ có công thức hóa học tính chất hóa lý giống nên phân tách với điều kiện phân tích thông thường Dựa nguyên tắc ĐPĐQ phản ứng với tác nhân đối quang thích hợp tạo phức hợp phi đối quang có lượng liên kết độ bền khác tùy thuộc vào tương tác đồng phân tác nhân, xây dựng phương pháp HPLC, CE phân tích ĐPĐQ ATN Phương pháp HPLC sử dụng cột sắc ký chứa pha tĩnh đối quang cellobiohydrolyse có chất protein, chất hoạt quang tự nhiên, phân tử lượng lớn có nhiều trung tâm bất đối xứng để tạo phức hợp với ĐPĐQ Phương pháp CE sử dụng tác nhân chọn lọc hoạt quang dẫn chất β-CD mang điện tích dung dịch điện ly để tương tác tạo phức “lồng” với đồng phân R- S-ATN So với phương pháp HPLC, phương pháp CE tốn hóa chất, thuốc thử cho xử lý mẫu chạy máy Dung dịch điện ly độc hại với 20 môi trường an toàn cho kiểm nghiệm viên Tác nhân hoạt quang thêm vào dung dịch điện ly nên việc thay đổi loại nồng độ tác nhân nghiên cứu khảo sát phân tách ĐPĐQ tương đối dễ thực Trong phương pháp HPLC sử dụng cột sắc ký chứa pha tĩnh hoạt quang, loại pha tĩnh hoạt quang thích hợp cho phân tách số ĐPĐQ định, nên việc khảo sát lựa chọn điều kiện sắc ký bị bó hẹp khó khăn Tuy vậy, kết thẩm định cho thấy HPLC có độ nhạy tốt so với CE Giá trị LOD LOQ phương pháp HPLC nhỏ khoảng 50 – 70 lần so với phương pháp CE Sở dĩ phương pháp CE có độ nhạy thấp đầu dò tích nhỏ, quang lộ ngắn (bằng với đường kính cột mao quản) thể tích tiêm mẫu Do để xác định tạp R-ATN nguyên liệu hay chế phẩm S-ATN phương pháp HPLC nên lựa chọn hàng đầu Phương pháp CE nghiên cứu luận án có thời gian phân tích rút ngắn từ – lần so với phương pháp CE phân tích ATN ĐPĐQ số tác giả công bố Mặc dù, thời gian phân tích rút ngắn, độ phân giải đồng phân S- R-ATN tương đương với phương pháp công bố đạt yêu cầu phép thử định lượng quy định dược điển Thời gian lần phân tích ngắn tạo nhiều thuận lợi kinh tế cho công tác kiểm tra giám sát chất lượng thuốc thực tế Phương pháp HPLC định lượng ĐPĐQ ATN nghiên cứu luận án, có thời gian phân tích ngắn (7,5 phút), độ phân giải độ phân giải đồng phân lớn (Rs > 5) LOQ nhỏ (0,273 µg/ml) So với số phương pháp HPLC định lượng ĐPĐQ ATN chế phẩm thuốc công bố, phương pháp HPLC nghiên cứu luận án có thời gian phân tích ngắn khoảng 1,5 – lần; Rs lớn 1,5 – 2,5 lần LOD, LOQ nhỏ khoảng – 50 lần Với giá trị LOQ nhỏ, phương pháp HPLC nghiên cứu phù hợp để xác định hàm lượng tạp chất R-ATN có mẫu nguyên liệu thuốc S-ATN 4.2 Phân tích ATN ĐPĐQ huyết tương LC-MS/MS  Phương pháp xử lý mẫu huyết tương: Có vai trò quan trọng phương pháp LC-MS/MS Xử lý mẫu HT giúp loại bỏ tạp chất, loại bỏ tác nhân ảnh hưởng đến trình ion hóa hoạt chất cần phân tích 21 nguồn ESI Kỹ thuật xử lý mẫu HT kết tủa protein đơn giản, hiệu suất thu hồi ATN cao (60–70%) song không loại bỏ tác nhân gây ảnh hưởng mẫu ATN base yếu (pKa = 9,6), độ tan dung môi hữu không phân cực tăng pH dung dịch mẫu tăng nên chiết ATN HT dung môi hữu không phân cực sau kiềm hóa mẫu So với SPE, chiết lỏng–lỏng có tỷ lệ thu hồi ATN cao (> 80%) không gây ảnh hưởng mẫu phân tích MS/MS lại đơn giản hơn; không đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt; dễ dàng triển khai nhiều phòng thí nghiệm, mang lại hiệu kinh tế cao áp dụng nghiên cứu phải phân tích số lượng lớn mẫu nghiên cứu SKD đánh giá TĐSH  Về phương pháp LC-MS/MS phân tích ATN HT: So với phương pháp HPLC định lượng thuốc dịch sinh học sử dụng đầu dò thông thường DAD, huỳnh quang, ECD đo độ dẫn phương pháp LC-MS/MS định lượng thuốc dịch sinh học có độ đặc hiệu-chọn lọc đặc biệt độ nhạy, giới hạn định lượng tốt nhiều lần Sở dĩ phương pháp LC-MS/MS có độ đặc hiệu-chọn lọc độ nhạy tốt phương pháp kết hợp ưu phương pháp HPLC phương pháp MS/MS Các phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN ĐPĐQ HT nghiên cứu luận án thẩm định đầy đủ đáp ứng yêu cầu PPPT thuốc dịch sinh học US-FDA EMA So với phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần HT công bố số tác giả, phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần nghiên cứu luận án có giá trị LOQ LLOQ thấp từ – 10 lần Đồng thời sử dụng cột sắc ký có kích thước hạt nhồi nhỏ (1,8 µm) hệ thống sắc ký lỏng siêu hiệu (UPLC) nên phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần nghiên cứu luận án có thời gian phân tích mẫu ngắn (chỉ 2,5 phút), ngắn nhiều so với phương pháp công bố Thời gian phân tích ngắn phù hợp cho ứng dụng cần phân tích số lượng lớn mẫu nghiên cứu SKD TĐSH Để phân tích ĐPĐQ cuả ATN dịch sinh học, tác giả thường sử dụng phương pháp HPLC với đầu dò UV huỳnh quang 22 Cho đến nay, chưa có nghiên cứu phân tích ĐPĐQ ATN HT phương pháp LC-MS/MS công bố Phương pháp LCMS/MS phân tích ĐPĐQ ATN nghiên cứu luận án có thời gian phân tích ngắn hơn, độ phân giải pic đồng phân lớn (Rs > 5) giá trị LOQ nhỏ nhiều so với phương pháp HPLC định lượng ĐPĐQ ATN dịch sinh học công bố  Kết kiểm tra chất lượng nghiên cứu SKD thuốc ATN: Kết xác định hàm lượng tạp ĐPĐQ liên quan R-ATN mẫu thuốc viên nén S-ATN cho thấy tiêu giới hạn tạp chất thuốc S-ATN lưu hành không giống Do vậy, cần thiết phải đánh giá hàm lượng tạp ĐPĐQ liên quan R-ATN PPPT thích hợp Cho đến nay, có nghiên cứu SKD, TĐSH ATN toàn phần công bố Các số liệu SKD DĐH S- R-ATN NTN chưa công bố Kết nghiên cứu SKD, TĐSH số thuốc ATN lưu hành cho thấy SKD S- R-ATN NTN Việt Nam tương tự nhau, dịch dạng ĐPĐQ lâm sàng SKD S-ATN thuốc chứa thành phần đối quang có xu hướng cao so với thuốc racemic Thuốc ATN racemic Việt Nam sản xuất nhiều khả TĐSH với thuốc biệt dược gốc thuốc S-ATN lưu hành thị trường nhiều khả không TĐSH Do vậy, để đảm bảo chất lượng, hiệu điều trị cần thiết phải triển khai nghiên cứu SKD, đánh giá TĐSH thuốc phương pháp phân tích ĐPĐQ dịch sinh học phù hợp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Luận án hoàn thành mục tiêu đề thu kết quả: Đã xây dựng phương pháp HPLC, CE định lượng ĐPĐQ ATN số chế phẩm thuốc:  Phương pháp HPLC: Phân tách ĐPĐQ cột sắc ký chứa pha tĩnh đối quang cellobiohydrolyse  Phương pháp CE: Phân tách ĐPĐQ cột mao quản silica nung chảy với dung dịch điện ly chứa CM-β-CD 8mM Phương pháp HPLC có giới hạn định lượng nhỏ (0,27 ng/ml) phù hợp để xác định hàm lượng tạp chất đối quang R-ATN có mẫu thuốc nguyên liệu S-ATN mức giới hạn nhỏ 0,1% 23 Đã xây dựng hai phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN ĐPĐQ HT người: Các phương pháp có trình xử lý mẫu HT, chiết ATN cloroform sau kiềm hóa mẫu Phân tích ATN toàn phần dịch chiết HPLC với cột pha đảo phân tích ĐPĐQ dịch chiết phương pháp HPLC với cột sắc ký chứa pha tĩnh đối quang cellobiohydrolyse Xác định nồng độ ATN ĐPĐQ dịch rửa giải sắc ký phương pháp MS/MS với nguồn ESI (+) Các phương pháp LC-MS/MS thẩm định đầy đủ đáp ứng yêu cầu Mỹ, châu Âu PPPT thuốc dịch sinh học Đã ứng dụng PPPT kiểm tra chất lượng nghiên cứu SKD, TĐSH số chế phẩm thuốc ATN: - Phân tích xác định hàm lượng ATN ĐPĐQ 08 mẫu thuốc HPLC CE Các phương pháp có độ đúng, độ xác tương đương Các mẫu thuốc đạt yêu cầu hàm lượng - Phân tích xác định hàm lượng tạp R-ATN 04 mẫu chế phẩm thuốc S-ATN phương pháp HPLC Một mẫu thuốc S-ATN có giới hạn tạp chất R-ATN vượt mức giới hạn chung 2,0% - Áp dụng phương pháp HPLC định lượng ATN ĐPĐQ hòa tan nghiên cứu so sánh độ hòa tan in vitro thuốc ATN Bốn mẫu thuốc có độ hòa tan in vitro tương đương - Phân tích LC-MS/MS xác định nồng độ ĐPĐQ ATN 23 mẫu HT bệnh nhân 504 mẫu HT 18 NTN S- R-ATN có SKD tương tự chuyển dạng đồng phân SKD thuốc S-ATN NTN có khác biệt Cmax, AUC so với thuốc ATN racemic Hai thuốc ATN racemic có Cmax, Tmax, AUC tương tự hai thuốc S-ATN có Cmax, AUC không giống KIẾN NGHỊ Để đảm bảo nâng cao chất lượng thuốc chứa dược chất ĐPĐQ nói chung ATN nói riêng lưu hành thị trường, có số kiến nghị sau: 1) Kiểm tra giới hạn tạp R-ATN thuốc S-ATN 2) Nghiên cứu đánh giá TĐSH thuốc S-ATN; ATN racemic so sánh SKD thuốc S-ATN với thuốc biệt dược gốc ATN racemic 24 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH NGHIÊN CỨU CỦA TÁC GIẢ ĐÃ CÔNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI LUẬN ÁN Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Nguyễn Thị Thu Hiền, Nguyễn Thị Kiều Anh (2013), “Nghiên cứu tách đồng phân quang học atenolol sắc ký lỏng hiệu cao với số pha tĩnh đối quang”, Tạp chí nghiên cứu dược thông tin thuốc, số 6/2013, tr 218 - 224 Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Đinh Thị Thanh, Vũ Ngân Bình, Nguyễn Thị Kiều Anh (2013), “Bước đầu nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang atenolol phương pháp điện di mao quản”, Tạp chí kiểm nghiệm thuốc, tập 11, số 42, tr 14 - 19 Tạ Mạnh Hùng, Phan Thị Nghĩa, Trịnh Văn Lẩu (2014), “Nghiên cứu định lượng atenolol huyết tương người phương pháp sắc ký lỏng khối phổ”, Tạp chí kiểm nghiệm thuốc, tập 12, số 44, tr - Tạ Mạnh Hùng, Ngô Minh Thúy, Vũ Ngân Bình, Lê Thị Hồng Hảo, Nguyễn Thị Kiều Anh (2014), “Nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang atenolol điện di mao quản”, Tạp chí nghiên cứu dược thông tin thuốc, số 6/2014, tr 212 - 217 Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Nguyễn Thị Kiều Anh (2015), “Nghiên cứu định lượng đồng thời đồng phân quang học atenolol số chế phẩm thuốc phương pháp HPLCDAD”, Tạp chí kiểm nghiệm thuốc, tập 13, số 49, tr 16 - 23 Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Nguyễn Thị Kiều Anh (2016), “Nghiên cứu định lượng đồng thời đồng phân quang học atenolol huyết tương người phương pháp LCMS/MS” Tạp chí Dược học, số 482, tr 56 - 60 [...]... HPLC và phương pháp MS/MS Các phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN và các ĐPĐQ trong HT nghiên cứu trong luận án đã được thẩm định đầy đủ và đáp ứng các yêu cầu đối với PPPT thuốc trong dịch sinh học của US-FDA và EMA So với các phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần trong HT đã công bố của một số tác giả, phương pháp LC-MS/MS định lượng ATN toàn phần nghiên cứu trong luận án có giá trị LOQ và. .. cellobiohydrolyse Xác định nồng độ ATN hoặc các ĐPĐQ trong dịch rửa giải sắc ký bằng phương pháp MS/MS với nguồn ESI (+) Các phương pháp LC-MS/MS đã được thẩm định đầy đủ và đáp ứng các yêu cầu của Mỹ, châu Âu đối với một PPPT thuốc trong dịch sinh học 3 Đã ứng dụng các PPPT kiểm tra chất lượng và nghiên cứu SKD, TĐSH một số chế phẩm thuốc ATN: - Phân tích xác định hàm lượng ATN và các ĐPĐQ trong 08 mẫu thuốc bằng... nghiên cứu dược và thông tin thuốc, số 6/2014, tr 212 - 217 5 Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Nguyễn Thị Kiều Anh (2015), Nghiên cứu định lượng đồng thời các đồng phân quang học của atenolol trong một số chế phẩm thuốc bằng phương pháp HPLCDAD”, Tạp chí kiểm nghiệm thuốc, tập 13, số 49, tr 16 - 23 6 Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Nguyễn Thị Kiều Anh (2016), Nghiên cứu định lượng đồng thời các đồng phân quang. .. thuận lợi và kinh tế cho công tác kiểm tra giám sát chất lượng thuốc trên thực tế Phương pháp HPLC định lượng các ĐPĐQ của ATN nghiên cứu trong luận án, có thời gian phân tích ngắn (7,5 phút), độ phân giải độ phân giải giữa các đồng phân lớn (Rs > 5) và LOQ nhỏ (0,273 µg/ml) So với một số phương pháp HPLC định lượng các ĐPĐQ của ATN trong chế phẩm thuốc đã được công bố, phương pháp HPLC nghiên cứu trong. .. ATN và ĐPĐQ trong các mẫu HT một số bệnh nhân bằng phương pháp LC-MS/MS đã nghiên cứu - Phân tích xác định nồng độ ATN và ĐPĐQ trong các mẫu HT của 18 NTN tham gia nghiên cứu khảo sát SKD hai thuốc ATN racemic; hai thuốc S-ATN và so sánh SKD của một thuốc S-ATN so với thuốc ATN racemic biệt dược gốc Từ các kết quả phân tích, xác định các thông số DĐH (Cmax, Tmax, AUC0-t; AUC0-∞, T1/2) của các ĐPĐQ và. .. (2013), Nghiên cứu tách các đồng phân quang học của atenolol bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với một số pha tĩnh đối quang , Tạp chí nghiên cứu dược và thông tin thuốc, số 6/2013, tr 218 - 224 2 Tạ Mạnh Hùng, Trịnh Văn Lẩu, Đinh Thị Thanh, Vũ Ngân Bình, Nguyễn Thị Kiều Anh (2013), “Bước đầu nghiên cứu định lượng đồng phân đối quang của atenolol bằng phương pháp điện di mao quản”, Tạp chí kiểm nghiệm thuốc, ... sánh SKD, TĐSH của các thuốc ATN racemic và S-ATN CHƯƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1 Phân tích atenolol và các ĐPĐQ trong chế phẩm thuốc 3.1.1 Nghiên cứu phương pháp CE phân tích ĐPĐQ atenolol 3.1.1.1 Khảo sát, lựa chọn các điều kiện điện di Đã nghiên cứu khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố như: thành phần dung dịch đệm, tác nhân đối quang trong dung dịch điện ly nền, ảnh hưởng của pH dung dịch đệm, hiệu điện... CE định lượng các ĐPĐQ của ATN trong một số chế phẩm thuốc:  Phương pháp HPLC: Phân tách các ĐPĐQ bằng cột sắc ký chứa pha tĩnh đối quang cellobiohydrolyse  Phương pháp CE: Phân tách các ĐPĐQ trên cột mao quản silica nung chảy với dung dịch điện ly nền chứa CM-β-CD 8mM Phương pháp HPLC có giới hạn định lượng nhỏ (0,27 ng/ml) phù hợp để xác định hàm lượng tạp chất đối quang R-ATN có trong các mẫu thuốc. .. hạn định lượng đối với R-ATN là 0,272 µg/ml (tương đương với mức giới hạn 0,02% so với hàm lượng S-ATN) - Phương pháp có độ đúng  99,0% (min: 98,1%; max: 99,6%) Độ chính xác với RSD < 2,0% 3.1.3 Phân tích ATN và các ĐPĐQ trong chế phẩm 3.1.3.1 Định lượng ATN và các ĐPĐQ trong chế phẩm - Tiến hành phân tích xác định hàm lượng ATN và các ĐPĐQ trong 8 mẫu thuốc (4 mẫu racemic, 4 mẫu S-ATN) bằng các phương... Phương pháp CE nghiên cứu trong luận án có thời gian phân tích được rút ngắn từ 2 – 4 lần so với các phương pháp CE phân tích ATN và các ĐPĐQ của một số tác giả đã công bố Mặc dù, thời gian phân tích rút ngắn, nhưng độ phân giải giữa các đồng phân S- và R-ATN vẫn tương đương với các phương pháp đã công bố và đạt yêu cầu của phép thử định lượng quy định trong dược điển Thời gian một lần phân tích ngắn