Tỷ giá hối đoái thực và cán cân thương mại của Việt Nam

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM NGUYỄN HỮU QUÂN NGUYỄN HỮU QUÂN TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH TUYỂN CHỌN, NUÔI CẤY CHỦNG ASPERGILLUS ORYZAE SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE VÀ XÁC ĐỊNH TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA NÓ Chuyên ngành: Sinh học thực nghiệm Mã số: 60.42.30 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC SINH HỌC Ngƣời hƣớng dẫn khoa học: TS Quyền Đình Thi Thực tại: Viện Công nghệ Sinh học Viện Khoa học công nghệ Việt Nam HÀ NỘI-2009 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên HÀ NỘI-2009 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn LỜI CẢM ƠN MỤC LỤC Trƣớc hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Quyền Đình Thi MỞ ĐẦU trƣởng phòng Công nghệ sinh học Enzyme, Phó viện trƣởng Viện Công nghệ CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU sinh học, Viện Khoa học Công nghệ Việt Nam, định hƣớng ý tƣởng 1.1 ĐỊNH NGHĨA nghiên cứu, tận tình hƣớng dẫn nghiên cứu, sửa luận văn tạo điều kiện 1.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI hóa chất nhƣ trang thiết bị nghiên cứu để hoàn thành luận văn 1.2.1 Nguồn gốc Tôi xin chân thành cảm ơn TS Đỗ Thị Tuyên, CN Đào Thị Tuyết 1.2.2 Phân loại enzyme tập thể cán Phòng Công nghệ Sinh học Enzyme, Viện Công nghệ Sinh học 1.3 CẤU TRÚC tận tình hƣớng dẫn thí nghiệm, thƣờng xuyên bảo kiến thức chuyên 1.3.1 Cấu trúc bậc môn, sửa luận văn tạo điều kiện tốt giúp học tập rèn luyện 1.3.2 Cấu trúc không gian suốt trình thực tập 1.4 CƠ CHẾ XÚC TÁC Tôi xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo khoa Sinh trƣờng 1.5 Khái quát Aspergillus oryzae 10 ĐHSP - Đại học Thái Nguyên giảng dạy tạo điều kiện chu đáo cho 1.6 Ứng dụng 11 suốt trình học tập hoàn thành khóa luận 1.6.1 Trong công nghiệp sản xuất giấy bột giấy 11 Bên cạnh đó, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè ngƣời 1.6.2 Trong công nghiệp chế biến thực phẩm 12 thân động viên giúp đỡ suốt trình học tập để có đƣợc kết 1.6.3 Trong công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi 13 nhƣ ngày hôm 1.6.4 Trong công nghiệp sản xuất dung môi hữu 14 Với lòng biết ơn sâu sắc, xin chân thành cảm ơn tất giúp đỡ quí báu ! 1.6.5 Trong công nghệ sử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh 14 1.7 ẢNH HƢỞNG CỦA ĐIỀU KIỆN MÔI TRƢỜNG ĐẾN KHẢ NĂNG SINH TỔNG HỢP ENDO-β-1,4-GLUCANASE 16 Thái Nguyên, tháng 10 năm 2009 1.7.1 Nguồn carbon 16 Học Viên 1.7.2 Nguồn nitrogen 17 1.7.3 Nhiệt độ nuôi cấy 18 1.7.4 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng 18 1.8 TÍNH CHẤT LÝ HÓA CỦA ENZYME 19 Nguyễn Hữu Quân 1.8.1 Ảnh hƣởng nhiệt độ 19 1.8.2 Ảnh hƣởng pH 20 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.8.3 Ảnh hƣởng ion kim loại 20 3.3.3 Ảnh hƣởng nguồn carbon 41 1.8.4 Ảnh hƣởng dung môi hữu chất tẩy rửa 21 3.3.4 Ảnh hƣởng nồng độ carbon 43 Chƣơng NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 22 3.3.5 Ảnh hƣởng nguồn nitrogen 44 2.1 NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT 22 3.3.6 Ảnh hƣởng nồng độ nitrogen 45 2.1.1 Chủng giống 22 3.3.7 Nhiệt độ nuôi cấy 46 2.1.2 Thiết bị 22 3.3.8 Ảnh hƣởng pH nuôi cấy 47 2.1.3 Hóa chất 22 3.4 Tinh sơ endo-β-1,4-glucanase 48 2.1.4 Dung dịch đệm phá tế bào 23 3.5 Tính chất lý hóa endo-β-1,4-glucanase 50 2.1.5 Môi trƣờng 24 3.5.1 Nhiệt độ phản ứng tối ƣu 50 2.2 PHƢƠNG PHÁP 25 3.5.2 pH phản ứng tối ƣu 51 2.2.1 Nuôi cấy sinh tổng hợp enzyme 25 3.5.3 Độ bền nhiệt 52 2.2.2 Định tính endo-β-1,4-glucanase 25 3.5.4 Độ bền pH 54 2.2.3 Xác định hoạt tính endo-β-1,4-glucanase 25 3.5.5 Ảnh hƣởng dung môi hữu 55 2.2.4 Nghiên cứu ảnh hƣởng số yếu tố môi trƣờng lên khả sinh 3.5.6 Ảnh hƣởng số chất tẩy rửa 56 tổng hợp endo-β-1,4-glucanase 27 3.5.7 Ảnh hƣởng ion kim loại 57 2.2.5 Tinh sơ endo-β-1,4-glucanase 29 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 59 2.2.6 Điện di SDS-PAGE 30 KẾT LUẬN 59 2.2.7 Xác định tính chất lý hóa endo-β-1,4-glucanase 30 KIẾN NGHỊ 59 2.2.8 Các phƣơng pháp sinh học phân tử 32 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 36 TIẾNG VIỆT 61 3.1 Sàng lọc chủng nấm mốc có khả sinh tổng hợp endo-β-1,4- TIẾNG ANH 64 glucanase cao 36 PHỤ LỤC 69 3.2 Phân loại chủng nấm sợi A oryzae VTCC-F-045 dựa vào đoạn gene 28S rRNA 37 3.3 Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase 39 3.3.1 Khả sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian 39 3.3.2 Ảnh hƣởng nồng độ chất cảm ứng 40 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Bảng 4.10 Ảnh hƣởng pH nuôi cấy tới khả sinh endo-β-1,4- DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng 2.1 Thiết bị đƣợc sử dụng thí nghiệm 22 Bảng 2.2 Các hóa chất đƣợc sử dụng thí nghiệm 23 Bảng 2.3 Danh sách dung dịch đệm đƣợc sử dụng thí nghiệm 23 Bảng 3.1 Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase 35 chủng A oryzae 37 Bảng 3.3 Ảnh hƣởng nguồn carbon đến khả sinh tổng hợp endo-β1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 42 Bảng 3.2 Tóm tắt trình tinh endo-β-1,4-glucanase từ chủng A oryzae VTCC-F-045 49 Bảng 3.4 Ảnh hƣởng ion kim loại lên độ bền endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 57 Bảng 4.1 Đƣờng chuẩn glucose 69 Bảng 4.2 Trình tự nucleotide đoạn gene 28S rRNA từ chủng A oryzae VTCC-F-045 69 glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 73 Bảng 4.11 Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 73 Bảng 4.12 Ảnh hƣởng pH phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 74 Bảng 4.13 Độ bền nhiệt endo-β-1,4-glucanase 75 Bảng 4.14 Độ bền pH endo-β-1,4-glucanase 76 Bảng 4.15 Ảnh hƣởng chất tẩy rửa tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 77 Bảng 4.16 Ảnh hƣởng dung môi hữu tới hoạt tính endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 77 Bảng 4.17 Ảnh hƣởng ion kim loại tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 78 Bảng 4.3 Khả sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian 70 Bảng 4.4 Ảnh hƣởng nồng độ CMC tới khả sinh endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 70 Bảng 4.5 Ảnh hƣởng nguồn cacbon tới khả sinh endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 71 Bảng 4.6 Ảnh hƣởng nồng độ lactose tới khả sinh endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 71 Bảng 4.7 Ảnh hƣởng nguồn nitrogen tới khả sinh endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 72 Bảng 4.8 Ảnh hƣởng nồng độ bột đậu tƣơng tới khả sinh endo-β1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 72 Bảng 4.9 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy tới khả sinh endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 72 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Hình 3.9 Ảnh hƣởng nhiệt độ tới khả sinh tổng hợp enzyme endo- DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1.1 Cấu trúc không gian từ xuống (A) từ bên sang (B) Cel12A từ H grisea Hình 1.2 Cấu trúc vùng liên kết enzyme - chất Cel12A từ H grisea Hình 1.3 Cơ chế thủy phân cellulose (A) phức hệ cellulose (B) cellulase Hình 1.4 Sự thủy phân loại enzyme phức hệ cellulase 10 Hình 1.5 Cấu trúc gene A oryzae 11 Hình 2.1 Đƣờng chuẩn glucose 26 Hình 2.2 Quy trình tinh endo-β-1,4-glucanase từ chủng A oryzae VTCC-F-045 29 Hình 3.1 Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase số chủng A oryzae 36 Hình 3.2 Điện di đồ sản phẩm PCR từ khuôn DNA chủng A oryzae (A); Sản phẩm Plasmid (B) Sản phẩm cắt vector tái tổ hợp XhoI XbaI (C) 38 Hình 3.3 Cây phân loại chủng A oryzae VTCC-F-045 39 Hình 3.4 Khả sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian chủng A oryzae VTCC-F-045 40 β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 47 Hình 3.10 Ảnh hƣởng pH môi trƣờng tới khả sinh tổng hợp endo-β1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 48 Hình 3.11 Sắc kí đồ cột Sephadex G100 (A) Điện di đồ SDS-PAGE chủng A oryzae VTCC-F-045 (B) 49 Hình 3.12 Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 51 Hình 3.13 Ảnh hƣởng pH phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 52 Bảng 3.14 Ảnh hƣởng nhiệt độ lên độ bền endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 53 Hình 3.15 Ảnh hƣởng pH lên độ bền endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 54 Hình 3.16 Ảnh hƣởng dung môi hữu lên độ bền endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 55 Hình 3.17 Ảnh hƣởng chất tẩy rửa lên độ bền endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 56 Hình 3.5 Ảnh hƣởng nồng độ CMC đến khả sinh tổng hợp endo-β1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 41 Hình 3.6 Ảnh hƣởng nồng độ lactose đến khả sinh tổng hợp endoβ-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 44 Hình 3.7 Ảnh hƣởng nguồn nitrogen đến khả sinh tổng hợp endo-β1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 45 Hình 3.8 Ảnh hƣởng nồng độ bột đậu tƣơng đến khả sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 46 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT MỞ ĐẦU g Microgram l Microliter nhóm enzyme thủy phân, có khả phân cắt liên kết β-1,4-glucosidie APS Cel Ammonium persulphate Cellulose cách ngẫu nhiên bên phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide CMC Carboxyl methyl cellulase cs EDTA kb Cộng Ethylene diamine tetraacetic acid Kilobase kDa M Kilo Dalton Marker (thang protein chuẩn) MTK MW Môi trƣờng khoáng Molecular Weight OD PCR SDS-PAGE Optical density Polymerase chain reaction Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis TEMED N,N’,N,N’- Tetramethyl ethylene diamine Tris U v/v w/v Tris-(hydroxymethyl)-aminomethane Unit Volume/volume Weight/volume Endo-β-1,4-glucanase ba dạng cellulase Chúng thuộc số chất tƣơng tự khác có cầu nối β-glucan Endo-β-1,4-glucanase phân giải mạnh mẽ cellulose vô định hình Endo-β-1,4-glucanase đƣợc sinh tổng hợp từ nhiều nguồn khác nhƣ động vật (thuộc nhóm thân mềm, lợn, gà); thực vật (mầm hạt ngũ cốc nhƣ đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) vi sinh vật Tuy nhiên, nguồn thu enzyme chủ yếu từ vi sinh vật Vi sinh vật sinh enzyme đa dạng nhƣ nấm sợi (Aspergillus niger, A oryzae, A aculeatus, Trichoderma viride) vi khuẩn (thuộc họ Bacillus) Endo-β-1,4-glucanase đƣợc ứng dụng rộng rãi vào nhiều ngành khác nhƣ công nghiệp sản xuất giấy bột giấy; công nghiệp chế biến thực phẩm; công nghiệp sản xuất thức ăn chăn nuôi; công nghiệp chế biến dung môi hữu cơ; hay công nghiệp xử lý rác thải sản xuất phân bón vi sinh Với tiềm ứng dụng to lớn endo-β-1,4-glucanase nguồn vi sinh vật tổng hợp enzyme đa dạng, đồng thời nhằm tận dụng phế phụ phẩm nông nghiệp, chọn đề tài: Tuyển chọn, nuôi cấy chủng Aspergillus oryzae sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase xác định tính chất lý hóa Với mục tiêu: a) Tuyển chọn chủng nấm A oryzae sinh tổng hợp endo-β1,4-glucanase cao; b) Tối ƣu điều kiện sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase ngoại bào từ chủng A oryzae xác định tính chất hóa lý endo-β-1,4glucanase Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn CHƢƠNG I TỔNG QUAN TÀI LIỆU Hƣơng and Hoàng Đình Hòa, 2003) Ngoài có loài ƣa kiềm nhƣ Cephalosporium sp RYM-202 (Kang and Rhee, 1995) 1.1 ĐỊNH NGHĨA Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase ba dạng cellulase Các nhóm xạ khuẩn thuộc chi Actinomyces griseus (Nguyễn Đức Lƣợng Chúng thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết β-1,4-glucoside bên phân and Đặng Vũ Bích Hạnh, 1999, Lê Thị Thanh Xuân et al., 2005) tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide số chất tƣơng tự khác để Streptomyces reticuli có khả tổng hợp mạnh enzyme giải phóng cellulosedextrin, cellobiose glucose Enzyme thể Các loại nấm mốc thuộc chi Aspergillus nhƣ A.niger (Coral et al., 2002, hoạt tính mạnh mẽ cellulose vô định hình Hoàng Quốc Khánh et al., 2003, Omojasola and Jilani, 2008), A candidus 1.2 NGUỒN GỐC VÀ PHÂN LOẠI (Hong et al., 2001, Milala et al., 2009), A flavus (Ojumu et al., 2003), A fumigatus (Dahot and Noomrio, 1996), A oryzae chủng 1.2.1 Nguồn gốc Trichoderma (Claeyssens et al., 1989, de la Mata et al., 1992, Cao Cƣờng and Endo-β-1,4-glucanase đƣợc thu từ nhiều nguồn nguyên liệu khác Nguyễn Đức Lƣợng, 2003) có khả sinh enzyme Các nhóm thuộc nhƣ động vật (các nhóm thân mềm, lợn, bò, gà); thực vật (trong hạt ngũ cốc chi Penicillium (Claeyssens et al., 1989, Bhat et al., 1990, Trịnh Đình Khá, nảy mầm đại mạch, yến mạch, lúa mì, mạch đen) vi sinh vật (nấm sợi, 2006, Chinedu et al., 2008) có khả tổng hợp enzyme cao nấm men, xạ khuẩn vi khuẩn) Tuy nhiên, vi sinh vật nguồn thu enzyme chủ yếu thời gian sống ngắn nên thu đƣợc nhiều lần năm chủ động sử dụng nguồn nguyên liệu rẻ tiền để nuôi nhƣ dễ dàng điều khiển có 1.2.2 Phân loại enzyme 1.2.2.1 Phân loại theo hội đồng danh pháp quốc tế định hƣớng nguồn enzyme gia tăng lƣợng enzyme Ngày nay, với Endo-β-1,4-glucanase hay CMCase (EC 3.2.1.4) ba dạng phát triển mạnh mẽ khoa học kỹ thuật nên dễ dàng áp dụng phƣơng enzyme hệ cellulase, thuộc nhóm enzyme thủy phân liên kết -1,4-glucoside pháp sinh học phân tử để tạo chủng mang đặc điểm bên phân tử cellulose, oligosaccharide, disaccharide số chất tƣơng bật mà đối tƣợng động vật, thực vật áp dụng nhƣ gây đột biến nhân tạo tự khác để giải phóng cellulosedextrin, cellobiose glucose (Chellapandi et Trong vi sinh vật, nhiều chủng vi khuẩn, xạ khuẩn, nấm mốc số loài nấm men có khả sinh tổng hợp endo-β-1,4-glucanase al., 2008) Dựa đặc tính cấu trúc, endo-β-1,4-glucanase đƣợc gọi Các loài vi khuẩn hiếu khí lẫn kị khí có khả sinh endo-β-1,4- endoglucanase 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase hay CMCase (EC glucanase nhƣ Bacillus subtilis, B licheniformis, B pumilis (Gordon et 3.2.1.4) Endo-β-1,4-glucanase thuộc vào dạng phức hệ celulase Dạng al.,1973), Acidothermus cellulobuticus (Bergquist et al., 1999, Nguyễn Lan exoglucanase, gồm 1,4--D-glucan-4-glucanohydrolase (giống nhƣ cello dextrinase) (EC 3.2.1.74) 1,4--D-glucan cellobiohydrolase (cellobio Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn hydrolase) (EC 3.2.1.91) Dạng -glucosidase -glucoside peptide Sự phiên mã gene CbhA CbhB đƣợc cảm ứng D-xylose Ở glucohydrolase (EC 3.2.1.21) Endoglucanase thủy phân ngẫu nhiên bên chủng A kawachi, (Hara et al., 2003) phát ba gene mã hóa phân tử cellulose tạo loại oligosaccharide có chiều dài khác endoglucanase cel5A, cel5B cel61A Trong đó, cel5A cel61A có liên Exoglucanase thủy phân liên kết đầu khử đầu không khử chuỗi kết CBD1; cel5A cel5B thuộc glycosyl hydrolase nhóm (GH5), cellulose để giải phóng glucose (glucanohydrolase) cellobiose cel5B có cấu trúc giống cel5A, nhƣng thiếu CBD1 liên kết Cel5A (cellobiohydrolase) (Lee et al., 2002) gồm đoạn intron, cel5B gồm đoạn intron, cel61A thuộc nhóm GH61 1.2.2.2 Phân loại theo đặc điểm phân tử intron Endo-β-1,4-glucanase đƣợc phân chia dựa vào đặc điểm phân tử nhƣ Dựa vào cấu trúc bậc bản, phức cellulase đƣợc chia làm họ A, B, C, D, E F (Henrissat et al., 1989) Dựa vào trung tâm xúc tác phức khối lƣợng phân tử, điểm đẳng điện cấu trúc tinh thể Dựa theo đặc tính trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự do, nhóm cellulase đƣợc chia làm họ A, B, C, D, E, F, G, H I (Gilkes et al., enzyme thủy phân cellulose đƣợc chia làm nhóm Cel-1, Cel-2 Cel-3 1991) Hiện nay, cellulase đƣợc xếp thành 12 họ khác 5, 6, 7, 8, 9, Trong Cel-1 Cel-3 endo-β-1,4-glucanase (EC 3.2.1.4) có khối lƣợng (10), 12, 44, 45, 48, 61 74 Trong đó, họ chứa cellulases vi khuẩn 62 kDa 34 kDa Cel-1 Cel-3 có trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự (hiếu khí kỵ khí), nấm, thực vật động vật (protozoa mối); họ gồm QQVGTTADAH QELAQYDSAS Trình tự amino acid Cel-1 hydrolase nấm họ gồm hydrolase vi khuẩn (Lee et al., 2002) giống với endo-β-1,4-glucanase CelB, enzyme thuộc họ cellulase có 1.3 CẤU TRÚC độ tƣơng đồng 72% với cellobiohydrolase I exo-cellobiohydrolase I Trình Endo-β-1,4-glucanase đƣợc tạo từ loài khác có thành phần tự amino acid Cel-3 có độ tƣơng đồng 90% với endo-β-1,4-glucanase cấu tạo cấu trúc khác Endo-β-1,4-glucanase từ nấm A oryzae có CelA, enzyme thuộc họ 12 cellulase Khối lƣợng phân tử Cel-1 khối lƣợng phân tử khoảng 34 kDa 62 kDa (Yamane et al., 2002), chủng Cel-3 giống với CelB CelA Cel-2 β-glucosidase (EC 3.2.1.21) có khối A oryzae KBN616 31 kDa 53 kDa (Kitamoto et al., 1996), chủng lƣợng phân tử 120 kDa trình tự amino acid chứa gốc nitơ tự Trametes hirsuta khoảng 40,6 kDa (Nozaki et al., 2007), chủng A terreus Cel-2 chƣa đƣợc xác định (Yamane et al., 2002) M11 khoảng 25 kDa (Gao et al., 2008) Khi nghiên cứu A niger hai gene mã hóa cellobiohydrolase (CbhA CbhB) (Gielkens et al., 1990) cho thấy, hai enzyme thuộc nhóm glycosyl hydrolase (GH7); CbhB bao gồm cấu trúc cellulose-bindingomin (CBD) với xúc tác riêng amino acid giàu liên kết peptide; CbhA gồm xúc tác, thiếu CBD liên kết Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 1.3.1 Cấu trúc bậc Nghiên cứu Nozaki cs (2007) cho thấy, endo-β-1,4-glucanase thuộc họ (GH 5) chứa CBM đầu nitơ, có trọng lƣợng phân tử khoảng 44 kDa đƣợc gọi ThEG ThEG từ chủng Trametes hirsuta chuỗi polypeptide có chứa 384 amino acid có độ tƣơng đồng cao với En-1 từ Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn chủng Irpex lacteus (73%); EG từ chủng Humicola grisea (46%) EglB từ trung lõi hai phiến β, nơi mà bề mặt xúc tác đƣợc tăng lên chủng A niger (49%) (Hình 1.1) Ở chủng A oryzae KBN616, Kitamoto cs (1996) nhân dòng phân Gốc cysteine 175 nằm chuỗi β A6 phiến nhỏ A tạo mấu lồi tử, tinh mô tả đặc điểm gene mã hóa endo-β-1,4-glucanase bề mặt enzyme gần cấu trúc xoắn α Chuỗi bên lõi hai phiến CelA CelB Gene CelA gồm 877 pb với đoạn intron Protein CelA mã β, liên kết với amino acid T85, T123, A144, F175, I177 F180 lực hóa gồm 239 amino acid đƣợc xếp vào họ cellulase H Gene CelB chứa vanderval Liên kết amino acid có kích thƣớc từ 3,5 đến 4,1 Å 1248 bp không chứa đoạn intron Protein CelB mã hóa gồm 416 amino (Hình 1.2A) Gốc cysteine 206 nằm gần trung tâm xúc tác Glu 205 chuỗi acid đƣợc xếp vào họ cellulase C Sau tinh sạch, protein CelA B4 Đầu chuỗi bên lõi phiến β, nơi có hệ thống tƣơng tác chặt chẽ với CelB có khối lƣợng phân tử khoảng 31 kDa 53 kDa chuỗi bên gốc Q34, W52, W54, S63, P65, Y91, A98 T204; Ở chủng nấm chịu nhiệt Humicola grisea, (Sandgren et al., 2003) có nghiên cứu chi tiết cấu trúc Cel12A, enzyme thuộc họ 12 (GH 12) endoglucanase chuỗi polypeptide gồm 224 amino acid cấu tạo nên chuỗi α, β vùng nối với tách rời nguyên tử chiều dài từ 3,3-4,9 Å (Hình 1.2B) Gốc cysteine 216 nằm chuỗi A4 phiến A, phiến làm tăng bề mặt xúc tác enzyme Gốc cysteine có chuỗi bên vùng lõi bên dƣới điểm hoạt động, nơi tƣơng tác với chuỗi bên gốc W48, V87, W89, F214 F219 có kích thƣớc từ 3,3 đến 4,8 Å (Hình 1.2C) 1.3.2 Cấu trúc không gian Phân tử Cel12A đƣợc cấu tạo 15 chuỗi β tạo thành phiến gấp nếp β A B Phiến A gồm chuỗi β (A1-A6) phiến B gồm chuỗi β (B1-B9) Hai phiến xếp chồng lên thành hình bánh kẹp Bề mặt lõm phiến B tạo nên khe dài 35 Å để liên kết với chất, khe chạy dọc bề mặt enzyme Trung tâm hoạt động enzyme hai gốc glutamyl 120 205 chủng H grisea Sáu gốc phía phân bố phía phân tử giống nhƣ gài amino acid tự Hai số gốc nằm đầu nitơ Các dải xoắn β đƣợc nối với vùng nối, có vùng nối với gốc từ 29-32, 40-47, 92-96 165-169; vùng nối tiếp tƣơng ứng với chuỗi β: B2 đến A2, A2 đến A3, A5 đến B5 A6 đến B7 Ba gốc cysteine C175, Hình 1.1 Cấu trúc không gian từ xuống (A) từ bên sang (B) Cel12A từ H Grisea (Sang et al., 2003) C206 C216 đƣợc định vị chuỗi β A6, B4 A4 Các chuỗi bên tập Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn chịu tác động exoglucanase đầu khử đầu không khử để giải phóng glucose (Lee et al., 2002) (Hình 1.3) Hình 1.2 Cấu trúc vùng liên kết enzyme - chất Cel12A từ H Grisea 1.4 CƠ CHẾ XÚC TÁC Hình 1.3 Cơ chế thủy phân cellulose (A) Endo-β-1,4-glucanase thủy phân ngẫu nhiên bên phân tử cellulose phức hệ cellulose (B) cellulase (Lee et al., 2002) tạo loại oligosaccharide có chiều dài khác Tuy nhiên, để thủy Ngoài ra, endo-β-1,4-glucanase enzyme khác nhƣ exo-β-1,4- phân cellulose thành glucose cần có hiệp đồng dạng enzyme glucozidase (cellobiase) tham gia thủy phân cellulose theo chế ban đầu phức hệ cellulase Mỗi dạng enzyme phức hệ cellulase thủy endo-β-1,4-glucanase tác động vào vùng vô định hình phân tử cellulose phân phân tử có liên kết β-1,4-glucosidie theo cách khác tạo đầu mạch tự Sau đó, exo-β-1,4-glucosidase cắt đoạn Ban đầu, endo-β-1,4-glucanase thủy phân sơ liên kết 1,4-β-glucan cellobiose Kết tạo cello oligosacharide mạch ngắn, cellobiose sợi cellulose để tạo nên phần tử nhỏ (sợi cellobiose) Sau sợi glucose Các cellobiase thủy phân tiếp tạo thành glucose (Hình 1.4) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn http://www.lrc-tnu.edu.vn Kết nghiên cứu phù hợp với số kết Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase tương đối (%) 120 nghiên cứu giới Hong cs (2001) tinh endo-β-1,4glucanase tái tổ hợp (Eng1) nấm men sau hai bƣớc tinh sạch: tủa ammonium sulfate (60-100%) đƣa qua cột DEAE-sephadex A-50 thu đƣợc Eng1 có độ 1,73 lần so với dịch enzyme thô, khối lƣợng phân tử khoảng 37 kDa Endo-β-1,4-glucanase (gồm Cel-1 Cel-3) từ chủng A oryzae có khối lƣợng phân tử lần lƣợt 62 34 kDa (Fukuda et al., 80 40 2002); Kitamoto cs (1996) tinh endo-β-1,4-glucanase (gồm CelA 20 30 40 50 60 70 80 90 Nhiệt độ Cel B) từ chủng A oryzae KBN616 sau qua cột DEAE (CelA) Hình 3.12 Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính SE-sephadex C50 có khối lƣợng lần lƣợt 31 kDa 53 kDa Endo-β-1,4- endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 glucanase (eng1) từ chủng Trametes hirsuta có khối lƣợng khoảng 40,6 kDa Theo nghiên cứu trƣớc đây, endo-β-1,4-glucanase từ chủng (Nozaki et al., 2007) A oryzae KBN616 Cel A Cel B có nhiệt độ tối ƣu lần lƣợt 55C 3.5 Tính chất lý hóa endo-β-1,4-glucanase 45C (Kitamoto et al., 1996); endo-β-1,4-glucanase gồm Cel-1 3.5.1 Nhiệt độ phản ứng tối ƣu Nhiệt độ phản ứng ảnh hƣởng mạnh tới tốc độ xúc tác thủy phân chất enzyme Mỗi enzyme có nhiệt độ phản ứng thích hợp Để khảo sát nhiệt độ tối ƣu endo-β-1,4-glucanase, dịch enzyme tinh chất Cel-3 A oryzae 50C 60C (Fukuda et al., 2002); endo-β-1,4glucanase (eng1) từ chủng A niger IFO31125 hoạt động tốt 70C (Hong et al., 2001); CMCase chủng A niger Z10 40C (Coral et CMC đƣợc ủ nhiệt độ khác từ 30-80°C, phút Hoạt tính al., 2002) tăng dần khoảng từ 19-100% dải nhiệt độ từ 30-55C đạt tối đa 3.5.2 pH phản ứng tối ƣu 67,69 U/mg 55C Khi nhiệt độ tiếp tục tăng hoạt tính enzyme giảm dần, pH môi trƣờng có ảnh hƣởng lớn tới hoạt tính xúc tác enzyme, ảnh hƣởng tới mức độ ion hóa chất, enzyme ảnh hƣởng tới độ bền đạt 63% 80C (Hình 3.12 Bảng 4.12) protein enzyme Để khảo sát pH tối ƣu endo-β-1,4-glucanase, phản ứng enzyme với chất CMC (CMC đƣợc pha đệm có pH khác từ 3,5-7,5) 55C sau phút ủ Hoạt tính đạt cực đại 95,88 U/mg pH 5,5 tƣơng đối cao dải pH từ 5,5-6,5 (48,03-95,88 U/mg) (Hình 3.13 Bảng 4.13) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 50 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 51 so với đối chứng Từ 6-8 ủ 45C 30C hoạt tính enzyme trì đƣợc từ 68-85% Ở nhiệt độ lại giảm mạnh, đạt 38% 50C (Hình 3.14 Bảng 4.14) Nhƣ vậy, endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae 80 VTCC-F-045 bền dải nhiệt độ 30-45C 150 pH phản ứng Hình 3.13 Ảnh hƣởng pH phản ứng lên hoạt tính endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 Theo nghiên cứu trƣớc đây, pH thích hợp để endo-β-1,4-glucanase chủng Trametes hirsuta hoạt động mạnh 5,0; endo-β-1,4-glucanase 150 Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase tương đối (%) 40 Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase tương đối (%) Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase tương đối (%) 120 100 50 50 0 pH rộng từ 3,0-9,0 hoạt động mạnh pH 4,5 7,5 (Coral et al., 2002) Thời gian ủ (giờ) 10 chủng A oryzae VTCC-F-0458 endo-β-1,4-glucanase Thời gian ủ (giờ) 30 2002) Endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae KBN616 gồm CelA CelB lần lƣợt 5,0 4,0; CMCase chủng A niger Z10 hoạt động dải Bảng 3.14 Ảnh nhiệt độ 30 hƣởng 45 50 55 60 lên độ bền chủng A oryzae gồm Cel-1 Cel-3 lần lƣợt 3,5 4,5 (Fukuda et al., 100 45 50 55 10 60 Kitamoto cs (2006) nghiên chủng A oryzae KBN616 cho CelA bền nhiệt độ dƣới 55C sau 20 ủ, nhiệt độ 60C CelA hoạt tính; CelB bền nhiệt độ dƣới 50C 3.5.3 Độ bền nhiệt hoạt tính nhiệt độ 55C Cũng chủng A oryzae sau ủ enzyme Dƣới tác động nhiệt độ, enzyme bị biến tính nhiều bị ảnh (Cel-1 Cel-3) dải nhiệt độ khác (10-80C) 30 phút, Yamane hƣởng tới hoạt tính Một số liên kết hydro tham gia vào giữ vững cấu trúc và cs (2002) nhận thấy Cel-1 bền dải nhiệt độ dƣới 50C Cel-3 bền dải trung tâm hoạt động enzyme bị đứt gãy nhiệt độ Mức độ ảnh hƣởng tùy thuộc vào thời gian nhiệt độ ủ enzyme Dịch enzyme tinh đƣợc ủ nhiệt độ khác 30, 45, 50, 55 60C Kết cho thấy, từ 0-4 nhiệt độ 30, 45, 55 60C hoạt tính đạt từ 47,61-68,81 U/mg Đặc nhiệt độ dƣới 60C Ở chủng A niger endo-β-1,4-glucanase sau ủ 80C hoạt tính lại 56% (Hong et al., 2001) Endo-β-1,4-glucanase chủng A terreus M11 trì đƣợc 60% hoạt tính sau ủ 70C (Gao et al., 2008) biệt 30C 55C hoạt tính đạt 65,74-68,81U/mg, tăng 21-27% Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 52 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 53 1996); Trong enzyme từ chủng A niger bền dải pH từ 3,0-10,0 sau 3.5.4 Độ bền pH pH ảnh hƣởng tới độ bền enzyme, nên việc lựa chọn pH thích hợp để bảo ủ (Hong et al., 2001) CMCase gồm C-I C-II chủng Cephalosporium quản enzyme quan trọng Tùy loại protein enzyme mà có độ bền sp RYM-202 bền dải pH rộng hoạt tính trì 80% pH 11 môi trƣờng pH định Ở đây, độ bền endo-β-1,4-glucanase đƣợc sau 24 ủ (Kang and Rhee, 1995) Endo-β-1,4-glucanase chủng khảo A terreus M11 bền dải pH từ 2,0-5,0 (Gao et al., 2008) sát đệm khác với dải pH 4,5-7,5 Kết cho thấy sau ủ, có pH 6,0 hoạt tính tƣơng đối enzyme 3.5.5 Ảnh hƣởng dung môi hữu Trong dung dịch enzyme, dung môi hữu làm giảm số điện môi pH 6,5 hoạt tính tƣơng đối đạt 60% Ở thời gian ủ 2, và tăng lực hút tĩnh điện phân tử protein enzyme Để đánh giá ảnh hoạt tính lại enzyme pH khảo sát giảm mạnh, giảm mạnh hƣởng dung môi hữu cơ, dịch enzyme đƣợc ủ với dung môi khác pH 6,5 hoạt tính đạt 53% giảm pH 6,0 hoạt tính đạt nhiệt độ phòng Kết cho thấy, dung môi khảo sát làm giảm 64% Nhƣ vậy, endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 bền hoạt tính endo-β-1,4-glucanase Trong đó, n-butanol ảnh hƣởng mạnh pH 6,0 sau ủ (Hình 3.15 Bảng 4.15) làm giảm hoạt tính tƣơng đối enzyme 43% Acetone ethanol làm hoạt tính tƣơng đối enzyme 56% 76% Isopropanol methanol làm 120 giảm hoạt tính so với đối chứng (80-81%) (Hình 3.16 Bảng 4.16) Nhƣ vậy, dung môi hữu khảo sát ảnh hƣởng tới hoạt tính endo-β- 80 120 1,4-glucanase trừ n-butanol 40 120 80 40 Thời gian ủ (giờ) Hình 3.15 Ảnh hƣởng pH lên độ bền endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae6 VTCC-F-045 pH 4.5 Thời gian ủ (giờ) pH 5.0 pH 5.5 pH 6,0 pH 7.5 Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase tương đối (%) tƣơng đối (%) Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase tƣơng đối (%) Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase giữ đƣợc 88%, pH lại giảm mạnh, giảm mạnh 80 40 ĐC Những nghiên cứu trƣớc cho thấy, endo-β-1,4-glucanase gồm CelA CelB chủng A oryzae KBN616 bền dải pH từ 3,0-7,0 sau 20 ủ MetOH EtOH IsOH Act n-BtOH Dung môi hữu Hình 3.16 Ảnh hƣởng dung môi hữu lên độ bền endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 30C, nhiên CelB không bền pH 3,0 7,0 giống CelA (Kitamoto et al., Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 54 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 55 3.5.6 Ảnh hƣởng số chất tẩy rửa 3.5.7 Ảnh hƣởng ion kim loại Các chất tẩy rửa có hoạt động bề mặt nhƣ Tween 20, Tween 80, Triton Để nghiên cứu ảnh hƣởng ion kim loại tới hoạt tính X-100, SDS ảnh hƣởng tới hoạt tính enzyme Để đánh giá ảnh hƣởng chất endo-β-1,4-glucanase, dịch enzyme đƣợc ủ với ion kim loại nồng độ tẩy rửa tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase, dịch enzyme đƣợc ủ với khác 4; 12 mM nhiệt độ phòng Sau ủ, hoạt tính lại chất tẩy rửa có nồng độ khác 0,4, 0,8, 1,2, 1,6 2,0% nhiệt độ enzyme đƣợc xác định 55°C Kết cho thấy, nồng độ phòng, sau ủ hoạt tính lại đƣợc xác định 55°C mM ion kim loại EDTA ảnh hƣởng tới hoạt tính enzyme Trong đó, ion K+ làm tăng nhẹ hoạt tính enzyme so với đối chứng (tăng 3%) Các enzyme giảm mạnh Tween 20, Tween 80, Triton X-100, SDS nồng ion kim loại khác EDTA làm hoạt tính enzyme giảm nhẹ Trong đó, ion độ làm giảm hoạt tính tƣơng đối enzyme so với đối chứng Hoạt tính Ag+ làm hoạt tính enzyme giảm (giảm 16%) Ở nồng độ 8-12% hoạt tƣơng đối enzyme ủ với Tween 20 nồng độ 0,4-0,8% tính enzyme đƣợc trì từ 70-99% ủ với ion kim loại Trừ Fe2+ trì đƣợc 63-77% so với đối chứng; nồng độ 1,2-2,0% làm hoạt 100 tính enzyme giảm mạnh, hoạt tính tƣơng đối đạt 31% nồng độ 2,0% Zn2+ làm giảm mạnh hoạt tính enzyme Zn2+ 57%, Fe2+ 58%) (Bảng 3.4 Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase tương đối (%) Kết cho thấy, nồng độ chất tẩy rửa cao hoạt tính Bảng 4.18) Tween 80, Triton X-100 SDS làm hoạt tính tƣơng đối enzyme giảm mạnh Đối với SDS hoạt tính enzyme bị ức chế rõ rệt SDS nồng độ 0,4% 75 hoạt tính đạt 15%, nồng độ 2,0% hoạt tính 4% so với đối chứng (Hình 3.17 Bảng 4.17) Bảng 3.4 Ảnh hƣởng ion kim loại lên độ bền endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 Ion kim loại (mM) 12 Ag+ 84 99 73 Ca2+ 90 81 73 Co 2+ 92 93 92 Cu 2+ 96 92 87 25 Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase tương đối (%) 100 50 75 50 T80 TX-100 71 87 64 58 + Hình 3.17 Ảnh hƣởng chất tẩy rửa lên độ bền T20 T80 TX-100 SDS endo-β-1,4-glucanase chủng Chất tẩy rửaA oryzae VTCC-F-045 0,8% 1.2% Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 1,6% 103 86 83 97 82 77 Ni2+ 95 92 70 2+ 87 62 57 Zn 2.0% http://www.lrc-tnu.edu.vn 56 K Mn2+ SDS Chất tẩy rửa 0.4% 89 Fe T20 96 2+ EDTA 25 Hoạt tính endo-β-1,4-glucanase sau ủ (%) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 57 Gao cs (2008) nghiên cứu endo-β-1,4-glucanase từ chủng A terreus M11 cho thấy, hoạt tính endo-β-1,4-glucanase giảm mạnh ủ với ion kim loại Hg2+, Cu2+; Pb2+ EDTA nồng độ 2,0 mM Hoạt tính đạt 77% ion Hg2+ 59% với ion Cu2+ Trong Sr2+, Zn2+ Mn2+ lại làm tăng hoạt tính enzyme Chinedu cs (2008) nghiên cứu chủng P chrysogemum PCL501 cho thấy ion kim loại Mn2+ Fe2+ nồng độ 2,0 mM làm tăng hoạt tính enzyme so với đối chứng (đạt 320% 162%) Trong Mn2+, Cu2+, Zn2+, Hg2+ EDTA ức chế mạnh hoạt động enzyme (đạt 20% với EDTA 43% với Hg2+) KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Chủng A oryzae VTCC-F-045 có khả sinh tổng hợp endo-β-1,4glucanase cao số 35 chủng đƣợc tuyển chọn Trình tự đoạn gene 28S rRNA chủng (đăng ký Genebank: GQ382276) tƣơng đồng 99,7% với chủng thuộc chi Aspergillus phân loại Điều kiện để chủng A oryzae VTCC-F-045 sinh tổng hợp endo-β-1,4glucanase tối ƣu là: Thời gian 120 giờ; nhiệt độ 28°C; pH ban đầu 5,5; môi trƣờng khoáng MTK với 1% CMC; 0,4% lactose (nguồn carbon) 1% bột đậu tƣơng (nguồn nitrogen) Qua hai bƣớc tinh tủa ammonium sulfate 65% cột sắc kí lọc gel Sephadex G-100, endo-β-1,4-glucanase tinh đƣợc có độ so với enzyme thô ban đầu 2,6 lần có khối lƣợng phân tử khoảng 36 kDa Endo-β-1,4-glucanase hoạt động tốt pH 5,5 nhiệt độ 55°C, bền 30-45°C có hoạt tính cao pH 6,0 Các dung môi hữu ảnh tới endo-β-1,4-glucanase trừ n-butanol Các chất tẩy rửa (Tween 20, Tween 80, Triton X-100 SDS), ion kim loại EDTA (nồng độ 4-12 mM hầu nhƣ làm giảm hoạt tính endo-β-1,4-glucanase KIẾN NGHỊ Thử nghiệm lên men lƣợng lớn với nguồn dinh dƣỡng bột đậu tƣơng, lõi ngô, CMC thành phần khoáng Tối ƣu quy trình tách chiết lƣợng lớn endo-β-1,4-glucanase từ môi trƣờng nuôi cấy Tạo chế phẩm enzyme bổ sung vào thức ăn chăn nuôi gia súc, nâng cao chất lƣợng vật nuôi Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 58 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 59 Nghiên cứu cấu trúc gene mã hóa endo-β-1,4-glucanase, tạo endo-β1,4-glucanase tái tổ hợp nhằm cải thiện suất có tính phù hợp mong muốn TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy, Tăng Thị Chính, Phan Tuyết Minh, Lê Thanh Xuân, Trần Quang Huy, Đào Ngọc Quang, Phạm Thị Cúc (1999) Sử dụng vi sinh vật có hoạt tính phân giải xenluloza cao để nâng cao chất lƣợng phân hủy rác thải sinh hoạt nông nghiệp, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội: 546-551 Tăng Thị Chính, Lý Kim Bảng, Lê Gia Hy (1999) Nghiên cứu sản xuất cellulase số chủng vi sinh vật ƣa nhiệt phân lập từ bể ủ rác thải, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội: 790-797 Cao Cƣờng, Nguyễn Đức Lƣợng (2003) Khảo sát trình cảm ứng enzyme chitinaza celluloza Trichoderma harzianum ảnh hƣởng hai enzyme lên nấm bệnh Sclerotium rolfsic, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội: 321-324 Vũ Duy Giảng (2009) Sử dụng enzyme để tăng hiệu sử dụng lƣợng giảm giá thành thức ăn chăn nuôi, Tạp chí Khoa học Công nghệ chăn nuôi-Viện chăn nuôi quốc gia: 16 Đặng Minh Hằng (1999) Nghiên cứu yếu tố ảnh hƣởng đến khả sinh tổng hợp cellulase số chủng vi sinh vật để xử lý rác, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội: 333-339 Nguyễn Lan Hƣơng, Hoàng Đình Hòa (2003) Hệ vi khuẩn có hoạt tính thủy phân tinh bột, protein, xenluloza dầu ô lƣu trình Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 60 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 61 phân hủy chất thải hữu cơ, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội: 288-291 Nguyễn Lan Hƣơng, Lê Văn Nhƣơng, Hoàng Đình Hoà (1999) Phân 13 Nguyễn Thị Thảo (2005) Tối ƣu điều kiện nuôi cấy chủng Serratia sp DT3 sinh tổng hợp protease ngoại bào xác định tính chất lý hóa, Luận văn thạc sỹ sinh học lập hoạt hóa vi sinh vật ƣa nhiệt độ có hoạt tính xenlulaza cao để bổ 14 Đặng Thị Thu, Lê Ngọc Tú, Tô Kim Anh, Phạm Thu Thủy, Nguyễn sung lại vào khối ủ, rút ngắn chu kỳ xử lý rác thải sinh hoạt, Báo cáo Xuân Sâm (2004) Công nghệ enzyme, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội: 531-536 Nội 15 Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng, Lê Minh Trí, Đỗ Trung Sỹ, Hoàng Thị Trịnh Đình Khá (2006) Tuyển chọn, nuôi cấy chủng vi sinh vật sinh Bích, Hoàng Thị Hà Giang (2008) Nghiên cứu sử dụng cellulase tách từ tổng hợp cellulase đánh giá tính chất lý hóa cellulase, Luận văn Actinomyces để xử lý phế thải nông nghiệp, Hội nghị khoa học toàn thạc sĩ khoa học, Trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc quốc lần thứ IV, Hội Hóa sinh Sinh học phân tử phục vụ Nông, Sinh, Gia Hà Nội Y học Công nghiệp thực phẩm, Nxb Khoa học Kỹ thuật: 901-903 Hoàng Quốc Khánh, Ngô Đức Duy, Nguyễn Duy Long (2003) Khả 16 Trần Đình Toại, Trần Thị Hồng (2007) Tƣơng lai ứng dụng enzyme sinh tổng hợp đặc điểm cellulase Aspergillus niger RNNL- xử lý phế thải, Tạp chí khoa học Đại học Quốc gia Hà Nội, Khoa 363, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb học Tự nhiên Công nghệ 23: 75-85 Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội: 304-307 17 Đỗ Thị Tuyên, Nguyễn Văn Thuật, Quyền Đình Thi (2008) Đánh giá 10 Phạm Thị Ngọc Lan, Phạm Thị Hòa, Lý Kim Bảng (1999) Tuyển chọn số chủng xạ khuẩn có khả phân giải cellulose từ mùn rác, Báo cáo khoa học, hội nghị viện Công Nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học Kĩ thuật Hà Nội: 177-182 số tính chất hóa lý xylanase từ chủng nấm Aspergillus oryzae DSM1863, Tạp chí Công nghệ sinh học, 6(3): 721-728 18 Lê Thị Thanh Xuân, Phan Thị Tuyết Minh, Trần Hà Ninh, Tăng Thị Chính (2005) Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn ƣa nhiệt sinh 11 Nguyễn Đức Lƣợng (2003) Sản xuất cà phê theo phƣơng pháp enzyme, tổng hợp xenllulaza cao, Báo cáo khoa học, Hội nghị toàn quốc, Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa Nghiên cứu khoa học sống, Nxb Khoa học Kỹ thuật, học Kỹ thuật, Hà Nội: 318-320 Hà Nội: 872-875 12 Nguyễn Đức Lƣợng, Đặng Vũ Bích Hạnh (1999) Khả sinh tổng hợp cellulase Actinomyces griseus, Báo khoa học, hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội: 804-809 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 62 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 63 de la Mata I, Estrada P, Macarron R, Dominguez JM, Castillon MP, TIẾNG ANH Acharya PB, Acharya DK, Modi HA (2008) Optimization for cellulase production by Aspergillus niger using saw dust as substrate, Afr J Trichoderma reesei QM 9414 pH-defrendence of kinetic parameters, Biochem, 283: 679-682 Biotechnol, 7: 4147-4152 Bergquist P, Gibbs M, Morris D, Teo V, Saul D, Morgan H (1999) Molecular diversity of thermophilic cellulolytic and hemicellulolytic 10 Fukuda H, Mikami S, Kizaki Y, Wakabayashi S (2002) Properties of cellulose-degrading enzymes from Aspergillus oryzae and their contribution to material utilization and alcohol yield in sake mash bacteria, FEMS Microbiol Ecol 28: 99-110 Bhat KM, Hay AJ, Claeyssens M, Wood TM (1990) Study of the mode of action and site-specificity of the endo-(1-4)-beta-D-glucanases of the fungus Penicillium pinophilum with normal, 1-3H-labelled, reduced fermention, Biosci and Bioeng, 95(5): 479-484 11 Galagan JE, Calvo SE, Cuomo C, Ma LJ, Wortman, JR, Batzoglou S, Lee SI, Basturkmen M (2005) Sequencing of Aspergillus nidulans and comparative analysis with Aspergillus fumigatus and Aspergillus and chromogenic cello oligosaccharides, Biochem J, 266: 371-378 Chellapandi P, Himanshu M, Jani (2008) Production of endoglucanase by the native strains of Steptomyces isolates in submerged oryzae, Nature, 438: 1105-1115 12 Gao JN, Weng HB, Xi Y, Zhu DH, Han SY (2008) Purification and characterization fermentation, Brazil Microbiol, 39: 122-127 Chinedu S, Nwinyi C, Okochi V (2008) Properties of endoglucanase of Penicillium chrysogemum PCL501, Austr Basic Appl Sci, 2(3): 738- of a novel endo-β-glucanase from the thermoacidophilic Aspergillus terreus, Biotechnol Lett, 30: 323-327 13 Gielkens M, Dekkers E, Visser J, Graaff L (1990) Two cellobiohydrolase-encoding gene from Aspergillus niger require D- 746 Claeyssens M, Tilbeurgh HV, Tomme P, Wood TM, McRae SI (1989) Fungal cellulase systems Comparison of the specificities of the cellobiohydrolases Acebal C (1992) Chemical mechanism of beta glucosidase from isolated from Penicillium pinophilum and xylose and the xylanolytic transriptional activator XlnR for thier expression, Appl Envirion Microbiol, 65: 4340-4345 14 Gilkes N, Henrissat B, Kilburn D, Miler R, Warren R (1991) Domains in microbial 1,4-glycanases: sequence consveration, function, and Trichoderma reesei, Biochem J, 216: 819-900 Coral G, Burhan A, Unaldi M, Guvenmez H (2002) Some properties of crude carboxymethyl cellulase of Aspergillus nige1r Z10 wild-type enzyme families, Microbial Rev, 55: 303-315 15 Hara Y, Hinoki Y, Shimoi H, Ito K (2003) Cloning and sequence analysis of endoglucanase genes from an industrial fungus Aspergillus strain, Turk J Biol, 26: 209-213 Dahot M, Noomrio M (1996) Microbial production of cellulase by Aspergillus fumigatus using wheat straw as a carbon source, J Islamic kawachi, Biosci Biotechnol Biochem, 67: 2010-2013 16 Henning J, Morkeberg A, Krogh K, Olsson L (2005) Production of cellulases and hemicellulases by three Penicillium species: effect of Acad Sci, 9: 119-124 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 64 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 65 substrate and evaluation of cellulase adsorption by capillary elechtrophoresis, Enzyme Microb Tech, 36:42-48 25 Macarron R, Acebal C, Castillon M, Dominguez M, Kata I, Pettersson G, Tomme P, Claeyssenst M (1993) Mode of action of endoglucanase 17 Henrissat B, Claeyssens M, Tomme P, Lemesle L, Mornon J (1989) Cellulase families revealed by hydrophobic cluster analysis, Gene, 81: 83-95 III from Trichoderma reesei, Biochem J, 289: 867-873 26 Machida M, Asai K, Sano M, Tanaka T, Kumagai T, Terai G, Kusumoto K, Terai G, Kusumoto K, Arima T (2005) Genome 18 Hong J, Tamoki H, Akiba S, Yamamoto K, Kumajai H (2001) Cloning of a gene encoding a highly stable endo-β-1,4-glucanase from Aspergillus niger and its expression in yeast, J Biosc and Bioengin, 92: 434-441 sequencing and analysis of Aspergillus oryzae, Nature, 438: 11571161 27 Milala M, Shehu B, Zanna H, Omosioda V (2009) Degradation of Agaro-Waste by Cellulase from Aspergillus candidus, Asian Journal of 19 Kang M, Rhee Y (1995) Caeboxymethyl cellulases active and stable at alkaline pH from alkalophilic cephalosporium sp RYM-202, Biotechnol Lette, 17: 507-512 Biotechnology, 1: 51-56 28 Narasimha G, Sridevi A, Buddolla V, Subhosh CM, Rajsekhar RB (2006) Nutrient effect on production of cellulolytic enzyme by 20 Kawamori M, Takayama K, Takasawa S (1987) Production of cellulase by a thermophilic fungus, Thermoascus aurantiacus A-131, Agric Biol Chem, 51: 647-654 Aspergillus oryzae, Afr J Biotechnol, 5: 472-476 29 Nelson N (1944) A photometric adaptation of the Somogyi mehtod for the determination of glucose, J Biol Chem, 153: 375-380 21 Khan M, Ali S, Fakhrul-Razi A, Alam Z (2007) Use of fungi for the 30 Nozaki K, Seki T, matsui K, Mizuno M, Kanda T, Amano Y (2007) bioconversion of rice straw into cellulase enzyme, J Environ Sci Structure and characteristics of an endo-beta-1,4-glucanase, isolated Health, 42: 381-386 from Trametes hirsuta, with high degradation to crystalline cellulose, 22 Kitamoto K (2002) Molecular biology of te Koij molds, Adv in Appl Microbiol, 51: 129-153 31 Ojumu TV, Solomon BO, Betiku EL, Stephen K, Amigun B (2003) 23 Kitamoto N, Go M, Shibayama T, Kimura T, Kito Y, Ohmiya K, Tsukagoshi N (1996) Biosci Biotechnol Biochem, 71(10): 2375-2382 Molecular cloning, purification Cellulase production by Aspergillus flavus Linn Isolate NSPR 101 and fermented in sawdust, bagasse and corncob, Afr Biotechnol, 2: 150-152 characterization of two endo-1,4-β-glucanases from Aspergillus oryzae 32 Omojasola P, Jilani O (2008) Cellulase production by Trichoderma KBN616, Appl Microbiol Biotechnol, 46: 538-544 longi, Aspergillus niger and Saccharomyces cerevisae cultured on 24 Lee R, Weimer P, Vanzyl W, Pretorius I (2002) Microbial cellulose utilization: fundamentals and biotechnolog, Microbiol Mol Biol Rev, 66: 506-577 waste from orange, Pakistan Biol Sci, 11: 2382-2388 33 Sandgren M, Guafetti, PJ, Paech, C, Paech S, Shaw A, Gross L, Saldajeno M, Berglund G, Jones T, Mitchinson C (2003) The Humicola Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 66 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 67 grisea Cel12A enzyme structure at 1.2 Å resolution and the impact of PHỤ LỤC its free cysteine residues on thermal stability, Protein Sci, 12: 2782– Bảng 4.1 Đƣờng chuẩn glucose 2793 STT glucose (μl ) Đệm natri acetate pH 5,0 (l) cellulase and structural gene The cel gene of Bacillus sp D04 has exo- 10 endoglucanase activity, J Biol chem, 270: 26012-26019 15 34 Sang J, Young J, Hyen S (1995) Characterization of a bifunctional 35 Tang X, He G, Chen Q, Zhang X, Ali M (2004) Medium optimization for the production of thermal stable beta-glucanase by Bacillus subtilis ZJF-1A5 using response surface methodology, Bioresour Technol, 20 490 Nồng độ (μg/ml) 20 OD (660nm) 0,112 485 30 0,188 480 40 0,256 0,319 25 475 50 30 470 60 0,401 40 460 80 0,566 93(2): 175-181 36 Yamane Y, Furita J, Izuwa S, Fukuchi K, Shimizu R, Hiyoshi A (2002) Properties of cellulose-degrading enzymes from Aspergillus oryzae and their contribution to material utilization and alcohol yield in sake mash Bảng 4.2 Trình tự nucleotide đoạn gene 28S rRNA từ chủng A oryzae VTCC-F-045 Trình tự nucleotide Vị trí fermention, Biosci Bioeng, 95(5): 479-484 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 68 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 69 Bảng 4.3 Khả sinh endo-β-1,4-glucanase theo thời gian Thời gian (giờ) Lần Lần Trung bình Hoạt tính (U/ml) 24 36 0,42 0,46 0,54 0,50 0,47 0,48 1,96 ± 0,062 1,99 ± 0,022 48 60 0,45 0,37 0,52 0,47 0,48 0,42 2,00 ± 0,033 1,73 ± 0,053 72 84 96 108 120 132 144 156 0,39 0,40 0,26 0,36 0,66 0,28 0,33 0,22 0,54 0,48 0,27 0,36 0,48 0,57 0,67 0,63 0,47 0,44 0,26 0,36 0,57 0,42 0,50 0,42 1,93 ± 0,075 1,81 ± 0,038 1,09 ± 0,002 1,49 ± 0,003 2,35 ± 0,091 1,75 ± 0,145 2,08 ± 0,170 1,76 ± 0,207 OD (660 nm) Bảng 4.5 Ảnh hƣởng nguồn cacbon tới khả sinh endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 % 101 103 104 90 100 94 56 77 122 90 107 91 Nguồn cacbon Hoạt tính CMC (%) Lần Lần Lần TB (U/ml) 0,5 0,7 1,0 1,5 0,42 0,49 0,51 0,43 0,39 0,48 0,59 0,41 0,44 0,48 0,56 0,43 0,42 0,48 0,55 0,42 8,52 ± 0,014 9,86 ± 0,002 11,27 ± 0,025 8,58 ± 0,008 2,0 2,5 2,7 0,30 0,21 0,18 0,31 0,22 0,16 0,30 0,24 0,20 0,31 0,22 0,18 6,21 ± 0,012 4,53 ± 0,008 3,66 ± 0,012 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 0,82 ± 0,028 35 Cao nấm men CMC Glucose Lactose Lõi ngô 0,87 0,27 0,57 0,40 0,42 1,12 0,26 0,41 0,35 0,50 0,99 0,26 0,49 0,38 0,46 2,32 ± 0,124 2,11 ± 0,005 2,61 ± 0,082 11,81 ± 0,022 2,29 ± 0,040 100 91 112 508 99 Sacarose Vỏ cà phê Vỏ lạc Vỏ quýt Trấu cám 0,61 0,66 0,26 0,65 0,51 0,61 0,68 0,38 0,94 0,62 0,61 0,67 0,32 0,80 0,57 1,93 ± 0,004 1,62 ± 0,009 1,01 ± 0,060 2,10 ± 0,0143 1,09 ± 0,055 83 70 43 90 47 Bảng 4.6 Ảnh hƣởng nồng độ lactose tới khả sinh endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 % Nồng độ lactose Hoạt tính OD (660 nm) % (%) Lần Lần Trung bình 100 116 132 101 73 0,1 0,2 0,11 0,20 0,10 0,11 0,11 0,15 4,25 ± 0,002 6,24 ± 0,043 100 147 0,4 0,6 0,8 0,49 0,22 0,04 0,27 0,16 0,06 0,38 0,19 0,05 15,47 ± 0,111 7,57 ± 0,030 2,08 ± 0,010 364 178 49 53 1,0 1,2 1,4 1,6 0,09 0,15 0,19 0,11 0,18 0,20 0,26 0,10 0,14 0,17 0,23 0,11 5,52 ± 0,044 6,92 ± 0,026 9,13 ± 0,033 4,29 ± 0,005 130 163 215 101 1,8 2,0 2,2 0,11 0,07 0,12 0,09 0,14 0,14 0,10 0,10 0,13 4,13 ± 0,009 4,09 ± 0,034 5,13 ± 0,013 97 96 121 43 http://www.lrc-tnu.edu.vn 70 % Bã mía endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 OD (660 nm) Hoạt tính (U/ml) Lần Trung bình 0,33 0,38 0,35 Bảng 4.4 Ảnh hƣởng nồng độ CMC tới khả sinh Nồng độ OD (660 nm) Lần Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên (U/ml) http://www.lrc-tnu.edu.vn 71 Bảng 4.7 Ảnh hƣởng nguồn nitrogen tới khả sinh Bảng 4.10 Ảnh hƣởng pH nuôi cấy tới khả sinh endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 Nguồn nitrogen Bột cá endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 Hoạt tính (U/ml) OD (660 nm) % Lần 0,14 Lần 0,20 TB 0,17 3,39 ± 0,033 50 0,63 0,32 0,32 0,31 0,15 0,63 0,36 0,48 0,38 0,13 0,63 0,34 0,40 0,34 0,14 12,92 ± 0,002 6,83 ± 0,020 8,13 ± 0,083 7,01 ± 0,036 2,79 ± 0,012 189 100 119 103 41 Bột đậu tƣơng Pepton Urea (NH4)2SO4 NaNO3 Bảng 4.8 Ảnh hƣởng nồng độ bột đậu tƣơng tới khả sinh endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 Nồng độ bột Hoạt tính OD (660 nm) % đậu tƣơng (%) Lần Lần TB (U/ml) 0,1 0,42 0,35 0,39 11,85 ± 0,034 100 0,5 1,0 1,5 0,11 0,57 0,21 0,22 0,50 0,24 0,16 0,54 0,22 4,99 ± 0,035 16,39 ± 0,02 6,83 ± 0,002 42 138 58 1,8 2,0 0,21 0,20 0,21 0,17 0,21 0,19 6,38 ± 0,001 5,67 ± 0,014 54 48 Bảng 4.9 Ảnh hƣởng nhiệt độ nuôi cấy tới khả sinh endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 Nhiệt độ Lần Lần TB Hoạt tính (U/ml) % Lần 28oC 30oC 0,39 0,28 0,34 0,28 0,32 0,26 0,35 0,27 14,23 ± 0,023 11,03 ± 0,008 100 78 37oC 0,17 0,14 0,12 0,15 5,86 ± 0,014 41 OD (660 nm) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 72 pH OD (660 nm) Hoạt tính (U/mg) % 3,5 Lần 0,39 Lần 0,42 Lần 0,45 TB 0,42 17,04 ± 0,015 54 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 0,75 0,78 0,70 0,81 0,77 0,84 0,78 0,67 0,89 0,83 0,92 0,70 0,67 0,91 0,82 0,83 0,75 0,68 0,87 0,81 34,12 ± 0,050 30,71 ± 0,026 27,66 ± 0,010 35,70 ± 0,030 32,97 ± 0,019 108 98 88 113 105 6,5 7,0 7,5 8,0 8,5 0,80 0,19 0,31 0,42 0,49 0,69 0,29 0,32 0,42 0,38 0,82 0,29 0,25 0,47 0,38 0,77 0,26 0,29 0,44 0,42 31,48 ± 0,039 10,36 ± 0,035 11,88 ± 0,022 17,84 ± 0,018 17,01 ± 0,036 100 33 38 57 54 Bảng 4.11 Ảnh hƣởng nhiệt độ phản ứng tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 o Nhiệt độ ( C) Hoạt tính OD (660 nm) % Lần Lần Trung bình 30 35 0,12 0,12 0,16 0,19 0,14 0,15 12,67 ± 0,021 14,23 ± 0,033 19 21 40 45 50 0,52 0,55 0,58 0,40 0,53 0,56 0,46 0,54 0,57 42,53 ± 0,060 49,58 ± 0,007 52,19 ± 0,009 63 73 77 55 60 65 70 0,75 0,73 0,53 0,45 0,73 0,71 0,55 0,46 0,74 0,72 0,54 0,46 67,69 ± 0,009 66,25 ± 0,007 49,67 ± 0,011 41,98 ± 0,006 100 97 73 62 75 80 0,50 0,49 0,51 0,44 0,51 0,47 46,60 ± 0,005 42,99 ± 0,026 69 63 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên (U/mg) http://www.lrc-tnu.edu.vn 73 Bảng 4.12 Ảnh hƣởng pH phản ứng tới hoạt tính Bảng 4.13 Độ bền nhiệt endo-β-1,4-glucanase endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 pH 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5 7,0 7,5 OD (660 nm) Lần 0,10 0,10 0,12 0,12 0,19 0,13 0,18 0,14 0,13 Lần 0,11 0,10 0,11 0,13 0,22 0,14 0,19 0,14 0,13 Trung bình 0,103 0,104 0,116 0,126 0,207 0,135 0,187 0,136 0,127 Hoạt tính (U/mg) % 48,03± 0,003 48,49± 0,001 54,21± 0,002 58,79± 0,002 95,88± 0,013 62,91± 0,001 86,49± 0,003 63,14± 0,001 59,02± 0,001 50 51 57 61 100 66 90 66 62 Nhiệt độ (oC) Thời gian ủ (giờ) Lần Trung bình Hoạt tính (U/mg) % Lần ĐC 0,58 0,59 0,59 54,20 ± 0,002 100 0,52 0,51 0,51 53,56 ± 0,003 99 0,23 0,21 0,17 0,14 0,23 0,21 0,18 0,15 0,23 0,21 0,18 0,14 56,90 ± 0,001 65,74 ± 0,004 37,17 ± 0,001 36,90 ± 0,004 105 121 69 68 0,58 0,57 0,57 52,78 ± 0,005 97 0,55 0,56 0,54 0,56 0,54 0,55 0,56 0,55 0,54 51,04 ± 0,002 50,54 ± 0,006 49,99 ± 0,004 94 93 92 0,55 0,45 0,50 45,92 ± 0,005 85 0,41 0,48 0,45 0,48 0,43 0,48 59,60 ± 0,016 44,27 ± 0,003 73 82 0,39 0,27 0,38 0,37 0,38 0,32 35,20 ± 0,003 29,48 ± 0,046 65 54 0,23 0,22 0,22 20,78 ± 0,005 38 0,59 0,45 0,52 47,61 ± 0,067 88 0,57 0,70 0,63 0,80 0,60 0,75 55,26 ± 0,028 68,81 ± 0,049 102 127 0,63 0,42 0,58 0,35 0,60 0,39 55,30 ± 0,026 35,48 ± 0,034 102 65 0,58 0,58 0,58 53,24 ± 0,001 98 0,55 0,56 0,56 51,09± 0,005 94 0,54 0,32 0,32 0,52 0,36 0,30 0,53 0,34 0,31 48,80 ± 0,014 31,45 ± 0,021 28,56 ± 0,006 90 58 53 30 45 50 55 60 Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 74 OD (660 nm) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 75 Bảng 4.14 Độ bền pH endo-β-1,4-glucanase pH ĐC 4,5 5,5 6,0 6,5 Thời gian ủ (giờ) Lần Lần 0,58 % Trung bình 0,59 0,59 112,3 ± 0,002 100 0,52 0,51 0,51 68,64 ± 0,003 61 0,23 0,21 0,17 0,23 0,21 0,18 0,23 0,21 0,18 67,03 ± 0,001 65,66 ± 0,004 59,96 ± 0,001 60 58 51 72 0,58 0,57 0,57 81,23 ± 0,005 0,55 0,56 0,56 80,31 ± 0,002 71 0,56 0,54 0,55 76,65 ± 0,006 68 0,54 0,55 0,54 57,42 ± 0,004 51 0,41 0,45 0,43 99,31 ± 0,016 88 0,48 0,48 0,48 75,50 ± 0,003 67 66 0,39 0,38 0,38 73,67 ± 0,003 0,27 0,37 0,32 72,07 ± 0,046 64 60 0,59 0,45 0,52 67,03 ± 0,067 0,57 0,63 0,60 64,06 ± 0,028 57 0,70 0,80 0,75 59,94 ± 0,049 53 0,63 0,58 0,60 59,25 ± 0,026 53 0,58 68,41 ± 0,001 61 0,56 67,95 ± 0,005 60 60 56 7,5 Bảng 4.15 Ảnh hƣởng chất tẩy rửa tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase chủng Hoạt tính (U/mg) OD (660 nm) 0,58 0,55 0,58 0,56 0,54 0,52 0,53 67,49 ± 0,014 0,32 0,36 0,34 63,14 ± 0,021 A oryzae VTCC-F-045 CTR ĐC http://www.lrc-tnu.edu.vn 76 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 0,4 0,8 1,2 1,6 2,0 Tween 20 Tween 80 Trixton X100 SDS OD (660 nm) Lần Lần TB 0,22 0,16 0,14 0,08 0,07 0,07 0,09 0,08 0,07 0,07 0,06 0,10 0,09 0,08 0,09 0,08 0,03 0,02 0,02 0,01 0,01 0,21 0,16 0,13 0,09 0,07 0,07 0,08 0,08 0,07 0,07 0,06 0,09 0,09 0,09 0,08 0,07 0,03 0,02 0,01 0,01 0,01 0,22 0,16 0,13 0,08 0,07 0,07 0,09 0,08 0,07 0,07 0,06 0,10 0,09 0,08 0,08 0,07 0,03 0,02 0,01 0,01 0,01 Hoạt tính (U/mg) % 99,54 ± 0,001 100 77 63 40 32 31 40 38 33 32 27 45 40 40 39 34 15 12 76,19 ± 0,000 62,68 ± 0,002 39,56 ± 0,002 32,23 ± 0,001 31,32 ± 0,001 40,02 ± 0,003 37,73 ± 0,000 32,92 ± 0,001 31,78 ± 0,002 26,97 ± 0,001 44,60 ± 0,004 40,02 ± 0,000 39,79 ± 0,001 38,87 ± 0,003 34,29 ± 0,003 15,29 ± 0,001 11,63 ± 0,001 7,51 ± 0,001 6,59 ± 0,001 4,30 ± 0,001 Bảng 4.16 Ảnh hƣởng dung môi hữu tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 o Nhiệt độ ( C) Lần TB Hoạt tính (U/mg) % Lần ĐC Metanol Ethanol 0,16 0,13 0,13 0,17 0,14 0,12 0,17 0,13 0,13 76,65 ± 0,004 62,00 ± 0,002 58,33 ± 0,002 100 81 76 Isopropanol 0,13 0,09 0,07 0,13 0,09 0,07 0,13 0,09 0,07 61,54 ± 0,000 42,99 ± 0,002 80 56 43 Aceton n-Butanol Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên Nồng độ (%) OD (660 nm) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 33,15 ± 0,001 http://www.lrc-tnu.edu.vn 77 Bảng 4.17 Ảnh hƣởng ion kim loại tới hoạt tính endo-β-1,4-glucanase chủng A oryzae VTCC-F-045 Ion kim loại Nồng độ (mM) Lần Lần TB Hoạt tính (U/mg) ĐC 0,30 0,29 0,29 135,26 ± 0,003 Ag+ 12 0,25 0,29 0,21 0,24 0,29 0,21 0,25 0,29 0,21 113,28 ± 0,001 131,42 ± 0,001 98,17 ± 0,002 Ca2+ 12 0,28 0,24 0,21 0,25 0,23 0,22 0,26 0,24 0,21 121,52 ± 0,017 109,16 ± 0,002 99,08 ± 0,004 0,27 0,27 0,27 124,50 ± 0,001 12 0,27 0,27 0,28 0,27 0,27 0,27 126,10 ± 0,003 124,73 ± 0,000 0,28 0,27 0,28 0,27 0,28 0,27 129,30 ± 0,000 124,27 ± 0,004 12 0,26 0,26 0,26 118,32 ± 0,001 12 0,25 0,25 0,20 0,31 0,27 0,21 0,28 0,26 0,21 129,30 ± 0,030 120,15 ± 0,010 95,42 ± 0,002 0,26 0,26 0,26 118,32 ± 0,000 0,19 0,18 0,19 86,26 ± 0,002 12 0,16 0,17 0,17 78,02 ± 0,002 0,30 0,25 0,30 0,26 0,30 0,25 138,69 ± 0,001 116,94 ± 0,002 12 0,24 0,24 0,24 111,90 ± 0,002 12 0,28 0,24 0,22 0,29 0,24 0,23 0,28 0,24 0,22 130,68 ± 0,003 111,45 ± 0,001 103,66 ± 0,004 0,28 0,28 0,28 127,93 ± 0,001 12 0,27 0,21 0,27 0,21 0,27 0,21 124,45 ± 0,001 94,96 ± 0,000 0,25 0,26 0,26 118,32 ± 0,002 0,17 0,19 0,18 83,25 ± 0,010 12 0,17 0,17 0,17 77,11 ± 0,001 Co2+ Cu2+ EDTA Fe2+ K+ Mn2+ Ni+ Zn2+ OD (660 nm) Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 78 http://www.lrc-tnu.edu.vn Số hóa Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên 79 http://www.lrc-tnu.edu.vn [...]... Endo-β-1,4-glucanase của Chủng Trametes hirsuta là 5,0 và chủng A oryzae gồm Cel-1 và Cel-3 lần lƣợt là 3,5 và 4,5 (Fukuda et al., 2002) CMCase của A niger Z10 hoạt động ở dải pH rộng từ 3,0-9,0 và hoạt động mạnh nhất ở pH 4,5 và 7,5 (Coral et al., 2002) 1.8.3 Ảnh hƣởng của các ion kim loại Các chất tẩy rửa và dung môi hữu cơ có ảnh hƣởng rất mạnh tới hoạt tính của enzyme, tùy từng loại enzyme mà sự ảnh hƣởng của các... al., 1995) Chinedu và cs (2008) nghiên cứu 1.8.2 Ảnh hƣởng của pH Hoạt độ của enzyme phụ thuộc vào pH môi trƣờng, những biến đổi dù trên chủng Penicillium chrysogemum PCL501 cho thấy ion kim loại Mn2+ và nhỏ trong nồng độ của các ion H+ và OH- cũng ảnh hƣởng rõ rệt đến tốc độ Fe2+ ở nồng độ 2,0 mM làm tăng hoạt tính enzyme so với đối chứng (đạt phản ứng của enzyme Tùy thuộc vào bản chất của các enzyme... và hoạt động mạnh nhất ở pH là 4,5 và 7,5 (Coral et al., 2002) 4 6 8 Thời gian ủ (giờ) 10 2 4 chủng A oryzae 6 VTCC-F-0458 endo-β-1,4-glucanase của Thời gian ủ (giờ) 30 2002) Endo-β-1,4-glucanase của chủng A oryzae KBN616 gồm CelA và CelB lần lƣợt là 5,0 và 4,0; CMCase của chủng A niger Z10 hoạt động ở dải 2 Bảng 3.14 Ảnh của nhiệt độ 30 hƣởng 45 50 55 60 lên độ bền 0 của chủng A oryzae gồm Cel-1 và. .. Endo-β-1,4-glucanase (gồm Cel-1 và Cel-3) từ chủng A oryzae có khối lƣợng phân tử lần lƣợt là 62 và 34 kDa (Fukuda et al., 80 40 0 2002); Kitamoto và cs (1996) đã tinh sạch endo-β-1,4-glucanase (gồm CelA 20 30 40 50 60 70 80 90 Nhiệt độ và Cel B) từ chủng A oryzae KBN616 sau khi qua cột DEAE (CelA) và Hình 3.12 Ảnh hƣởng của nhiệt độ phản ứng lên hoạt tính SE-sephadex C50 có khối lƣợng lần lƣợt là 31 kDa và 53 kDa Endo-β-1,4-... độ, enzyme đều bị biến tính ít nhiều và bị ảnh (Cel-1 và Cel-3) ở dải nhiệt độ khác nhau (10-80C) trong 30 phút, Yamane hƣởng tới hoạt tính Một số liên kết hydro tham gia vào giữ vững cấu trúc và và cs (2002) nhận thấy Cel-1 bền ở dải nhiệt độ dƣới 50C và Cel-3 bền ở dải trung tâm hoạt động của enzyme bị đứt gãy bởi nhiệt độ Mức độ ảnh hƣởng tùy thuộc vào thời gian và nhiệt độ ủ enzyme Dịch enzyme tinh... cung cấp năng lƣợng cho gia súc và gia cầm chủ yếu là quan nƣớc quả và giảm bớt một số công đoạn, việc bổ sung endoglucanase rất ngũ cốc và phụ phẩm của ngũ cốc Ngoài protein, lipit, chất dinh dƣỡng cung quan trọng Enzyme này là điểm mấu chốt cải thiện hiệu suất dịch hóa Sự kết cấp năng lƣợng chủ yếu của ngũ cốc và phụ phẩm là carbohydrate Trong đó, hợp của glucanase và pectinase sẽ phá hủy hoàn toàn...lipase, phytase và pectinase Ở Việt Nam A oryzae đƣợc sử dụng chủ yếu trong quá trình làm tƣơng Năm 2001, bộ gene di truyền của A oryzae đã đƣợc phân tích và giải mã Hệ gene gồm 8 nhiễm sắc thể với 12 ngàn gene và 37 triệu cặp base (Galagan et al., 2005, Machida et al., 2005) (Hình 1.5) Hình 1.4 Sự thủy phân của 3 loại enzyme trong phức hệ cellulase Hình 1.5 Cấu trúc bộ gene của A Oryzae (Machida... protein và số đơn vị hoạt tính enzyme đƣợc xác định trong mỗi phân đoạn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 28 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu – Đại học Thái Nguyên http://www.lrc-tnu.edu.vn 29 2.2.6 Điện di SDS-PAGE 2.2.7.2 Xác định độ bền nhiệt và độ bền pH Khối lƣợng tƣơng đối của enzyme tách chiết và độ tinh sạch của enzyme Để xác định độ bền nhiệt của endo-β-1,4-glucanase... đƣợc làm khô dƣới ánh sáng đèn và bổ sung 500 µl ethanol 70% để cấy đƣợc đặt vào đá lạnh 1 giờ, rồi ly tâm 10 phút ở 4°C với 6000 vòng/phút rửa DNA, loại muối và isopropanol Sau khi ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 Tủa tế bào đƣợc hòa đều trong 100 ml dung dịch 100 mM CaCl2 lạnh và vô phút, tủa đƣợc làm khô và hòa trong 40 µl đệm TE và bảo quản ở -20°C trùng, ủ đá 15 phút và ly tâm nhƣ trên Tủa tế bào... đƣợc tạo ra từ 3 chủng Trichoderma harzianam, Hình 3.5 Ảnh hƣởng của nồng độ CMC đến khả năng sinh tổng hợp Phanerochaete chrysosporium và Trichoderma spp cao nhất sau 4 ngày lên endo-β-1,4-glucanase của chủng A oryzae VTCC-F-045 men với hoạt tính lần lƣợt là 1,88; 2,4 và 1,53 U/ml (Khan et al., 2007) Cao Cƣờng và Nguyễn Đức Lƣợng (2003) khi sử dụng CMC, bột Ojumu và cs (2003) khi nghiên cứu khả năng sinh