Chị thị AFLP

Chị thị AFLP ( Amplified Fragments Length Polymorphinsm) GVHD: Trương Thị Hồng Hải SVTH: 1) Nguyễn Thị Hiền 2) Hồ Thị Phúc 3) Ôn Văn Thịnh 4) Trần Thị Yến 5) Nguyễn Phước Tuấn Giới thiệu • AFLP hiểu đa dạng đoạn DNA nhân lên có định hướng sau cắt enzim giới hạn, sử dụng phân đoạn DNA làm khn cho phản ứng khuếch đại PCR • AFLP cơng cụ hữu ích để xác định nhiều loci đa hình DNA mà khơng cần phải biết trước thơng tin trình tự DNA chúng, phương pháp đưa nhanh chóng ước lượng độ đa dạng di truyền quần thể với 2 Nguyên tắc • Dựa độ đặc hiệu enzyme cắt giới hạn vị trí nhận biết chúng DNA gen • AFLP không cần tiến hành lai phân tử • Gồm nội dung là: Cắt DNA enzim giới hạn có bổ sung adaptor đặc hiệu tạo nên đoạn mút giống nhau, đặc trưng cho đoạn mồi chọn trước Cặp enzyme thường dùng EcoRI- MseI Đoạn adaptor gồm phần: phần trình tự lõi phần trình tự đặc hiệu cho vị trí cắt enzyme Khuếch đại đoạn DNA kỹ thuật PCR ngắt quãng với hai loại mồi khác Mồi phản ứng PCR thiết kế dựa trình tự adaptor chứa trình tự chọn lọc khoảng vài nucleotide chọn lọc khuếch đại, trình tự chọn lọc làm giảm xuất sản phẩm PCR làm đơn giản trình phân tích 3 Quy trình thực kỹ thuật AFLP Quy trình thực kỹ thuật AFLP Bước 1: Digestion  Dùng enzyme EcoRI có trình tự nhận biết base MseI có trình tự nhận biết base để cắt DNA khuôn thành phân đoạn  Hai enzyme giới hạn dùng để xếp lại DNA nhờ kết hợp với adaptor có cấu trúc làm cho dây DNA khơng trở lại hình dạng ban đầu Vị trí cắt enzyme EcoR I Mse I Bước 2: Ligation Nối với EcoRI adaptor MseI adaptor, oligonucleotide sợi đôi gắn vào đầu phân đoạn DNA Cấu trúc adaptor sau: 5’CTCGTAGACTGCGTACC EcoRI-adaptor CTGACGCATGGAA- 5’ MseI-adaptor 5’- GACGATGAGTCCTGAG TACTCAGGACTCAT-5’ Bước 3: Tiền khuếch đại  Chạy PCR với đoạn mồi (primer) chọn lọc  Đoạn mồi cấu tạo gồm phần: Trình tự nịng cót (CORE) Trình tự theo enzyme (ENZ) Trình tự chọn lọc (EXT) Chỉ đoạn DNA ngắn có: +) Đầu primer MseI đầu primer EcoRI khuếch đại đáng kể +) Các đoạn có hai đầu EcoRI bị số lượng hai đầu MseI tự tạo thành vòng nhỏ DNA cạnh tranh với primer  Sản phẩm tiền phản ứng pha loãng dùng làm vật liệu để khuếch đại với đoạn mồi chọn lọc huỳnh quang Bước bước Bước khuếch đại o Sản phẩm PCR bước tiền khuếch đại dùng làm khuôn o sử dụng primer có gắn nucleotide chọn lọc đầu 3’ EcoRI primer đánh dấu huỳnh quang đầu 5’ ⇒ Vì vậy, sợi chứa EcoRI phát máy ABI 310 o Phản ứng bắt đầu với nhiệt độ cao gắn mồi tối hảo cho mồi chọn lọc Nhiệt độ giảm dần làm tăng kết hợp o Sử dụng primer gắn với nu chọn lọc giúp hạn chế việc bắt cặp sai nhân lên số lượng lớn băng chuyên biệt o Khuếch đại qua bước:Phổ diện rỏ tạo lượng lớn DNA khuôn cho khuếch đại dễ dàng hiệu Ưu điểm kỹ thuật AFLP  AFLP khảo sát toàn gen mà không phức tạp RFLP  Cần sử dụng lượng nhỏ DNA ban đầu  Không cần biết trước trình tự DNA gen cần nghiên cứu  Không cần sử dụng nhiều loại primer  Là kỹ thuật in dấu DNA lạ hiệu quả, in dấu DNA nguồn gốc phức tạp từ sinh vật sơ hạch, thực vật, động vật đến người  Khuếch đại có chọn lọc lượng lớn đoạn DNA đa hình phản ứng PCR, phù hợp cho việc phân tích đa dạng quần thể có quan hệ gần Nhược điểm kỹ thuật AFLP  Tuy nhiên AFLP marker trộn, điều làm hạn chế phân biệt cá thể đồng hợp dị hợp  Quy trình dài, phức tạp, tốn nhiều thời gian thực  Lệ thuộc vào thao tác bước đầu để có phổ diện phân đoạn DNA lý tưởng Ứng dụng • In dấu DNA, lập đồ thị DNA có hiệu so với thị phân tử khác • Tạo nhóm liên kết di truyền giống • Đánh giá mức độ liên hệ di truyền khác giống • Là cơng cụ hiệu để phát tính chất đa hình nên dễ dàng nhận biết khác biệt cá thể 6 Kết luận  AFLP dựa vào khuếch đại chọn lọc phân đoạn hạn chế sau phân giải DNA  AFLP thăm dị đa hình gây thay đổi điểm hạn chế hay vùng lân cận  AFLP tạo nên lượng lớn DNA lần chạy,và bước tiến hành đòi hỏi kỹ thuật cao ... khác biệt cá thể 6 Kết luận  AFLP dựa vào khuếch đại chọn lọc phân đoạn hạn chế sau phân giải DNA  AFLP thăm dị đa hình gây thay đổi điểm hạn chế hay vùng lân cận  AFLP tạo nên lượng lớn DNA... giảm xuất sản phẩm PCR làm đơn giản q trình phân tích 3 Quy trình thực kỹ thuật AFLP Quy trình thực kỹ thuật AFLP Bước 1: Digestion  Dùng enzyme EcoRI có trình tự nhận biết base MseI có trình... đại qua bước:Phổ diện rỏ tạo lượng lớn DNA khuôn cho khuếch đại dễ dàng hiệu Ưu điểm kỹ thuật AFLP  AFLP khảo sát tồn gen mà khơng phức tạp RFLP  Cần sử dụng lượng nhỏ DNA ban đầu  Khơng cần