quá trình và thiết bị công nghệ sinh học - Chương 15

quá trình và thiết bị công nghệ sinh học

Chỉång 15 MẠY ÂIÃÛN DI Mạy âiãûn di dng âãø phạt hiãûn v xạc âënh ADN tãú bo vi sinh váût, thỉûc váût v âäüng váût 15.1 AXIT DEOXYRIBONUCLEIC (ADN) V NGUN TÀÕC XẠC ÂËNH Gen l âån vë di truưn cå bn Nọ l mäüt âoản ADN (âäi ARN) m hoạ thäng tin cho viãûc täøng håüp sn pháøm sinh hc xạc âënh (ch úu l protein) Nhỉỵng nghiãn cỉïu hiãûn âải vãư cáúu trục v chỉïc nàng ca ngun sinh cháút â måí nhỉỵng hiãøu biãút måïi vãư cáúu tảo v chỉïc nàng hoảt âäüng ca tãú bo Cáúu trục ADN cho phẹp gii thêch tải lải cọ kh nàng tng trỉỵ v di truưn thäng tin tỉì thãú hãû ny sang thãú hãû khạc mäüt cạch äøn âënh v bàịng cạch no thäng tin di tuưn åí dảng thỉï tỉû sàõp xãúp cạc gäúc nucleotit lải chuøn hoạ thnh phán tỉí protein chỉïc nàng Näüi dung nãu trãn liãn quan âãún giạo l trung tám ca di truưn phán tỉí gäưm âiãøm chênh: chẹp thäng tin di truưn tỉì ADN bäú mẻ sang ADN cại, chuøn âäøi m di truyóửn tổỡ ADN sang ARN - quaù trỗnh phión maợ (transcription) v dëch m di truưn (translation) - thäng tin di truyóửn tổỡ mARN õổồỹc chuyóứn sang trỗnh tổỷ sừp xãúp âàûc hiãûu ca axit amin phán tỉí protein Cäng nghãû ADN täø håüp - hiãûn l nãưn tng cho sỉû phạt triãøn v bo ca ngnh cäng nghãû sinh hc hiãûn âải Cạc phỉång phạp phán têch v täøng håüp hiãûn âải l tạch DNA, xạc âënh thỉï tỉû, täøng håüp, gàõn xen vo vë trê nháút âënh bãn såüi ADN khaïc âãø nhán lãn, v räưi lải tạch Hiãûn hon ton cọ thãø nháûn biãút chênh xạc nhỉỵng âoản ADN âàûc hiãûu qua cháøn âoaïn caïc bãûnh âàûc biãût Âäúi våïi caùc bóỷnh caùc gel chổa õổồỹc xaùc õởnh thỗ vióỷc chỏứn õoaùn keùm chờnh xaùc Mọỹt bọỹ doỡ tỗm âån gin chè l mäüt khục ADN (hồûc ARN) cọ thóứ tỗm khuùc bọứ sung vồùi noù bũng caùch lai (hybridization) Cọ thãø phạt hiãûn sỉû bàõt càûp ny bàịng nhiãưu cạch, nhỉng phäø biãún nháút l sỉí dủng phỉång phaùp tổỷ chuỷp phoùng xaỷ vồùi bọỹ doỡ tỗm coù 32p (hỗnh 15.1) 321 Vióỷc lai bọỹ doỡ tỗm ADN våïi âoản ADN tạch råìi gi l Southern Blotting âỉåüc mọ taớ trón hỗnh 15.1 Caùc õoaỷn ADN hỗnh thaỡnh sau ADN bë endonucleaza restrictaza càõt s âỉåüc tạch råìi bàịng phỉång phạp âiãûn di trãn gel agaroza Khong cạch di chuøn phủ thüc vo kêch thỉåïc âoản Cng nh chảy cng nhanh Sau â tạch råìi, ngỉåìi ta dng kiãưm âãø lm biãún cạc âoản âọ v chuøn chụng lãn mng nylon Táúm mng ny õổồỹc uớ vồùi dung dởch coù chỏỳt doỡ tỗm chỏỳt phọng xả, chè lai våïi cạc âoản ADN no chỉïa thỉï tỉû bäø sung Viãûc xạc âënh thỉï tỉû ARN (vờ duỷ mARN) cuợng coù thóứ theo trỗnh tổỷ tạch bàịng âiãûn di ARN trãn gel, chuøn lãn mng nylon v cho lai våïi ADN probe âàûc hiãûu Phỉång phạp ny gi l Northern Blotting Nhỉỵng âoản ADN sau càõt bàịng endonucleasa Tạch âiãûn di trãn gel agarosa Cạc âoản ADN tạch theo kêch thỉåïc Biãún bàịng kiãưm âãø tạch såüi trung ho Âënh vë ADN bàịng tia UV Ph bàịng mng nylon vãût cọ ADN nhán dng såüi âån v cọ gàõn phọng xả Rỉía v sỉû chủp phọng xảû Vë trê âoản ADN chổùa thổ tổỷ tổồng õọửng probe nhỏn doỡng Hỗnh 15.1 Lai bọỹ doỡ tỗm vồùi õoaỷn ADN, taùch bũng âiãûn di vaì chuyãøn sang táúm nylon (Southern blotting) 15.2 CÁÚU TRỤC CA MẠY ÂIÃÛN DI Mạy âiãûn di gäưm ba bọỹ phỏỷn cồ baớn: khay vỏỷn haỡnh (hỗnh 15.2), nàõp cọ âiãûn thãú cao v bưng gim xäúc 322 UV khay di âäüng suäút Khuän âuïc gel Miãúng boỹt õóỷm Hỗnh 15.2 Khay vỏỷn haỡnh Khay vỏỷn haỡnh bao gäưm khn âục gel, khay di âäüng sút v bt âãûm bàịng caosu Chøn bë khn gel sau: lọt miãúng bt âãûm vo âạy khay di âäüng v sau âọ áún mảnh miãúng âãûm vo cảnh khay (ẹp cho âạy khay di âäüng lt hon ton vo khay khn trỉåïc hn kên vo miãúng bt) Trãn nàõp cọ âáưu ca m mu, âỉåüc näúi våïi nguọửn õióỷn qua õióỷn cổỷc trón õóỳ maùy (hỗnh 15.3) Bưng gim xäúc cọ äúng näúi âiãûn cỉûc, bủc di chuøn v läù nảp etylen glycol / nỉåïc våïi t lóỷ 50/50 (hỗnh 15.4) Maợ maỡu õỏửu nọỳi õióỷn cỉûc trãn âãú mạy våïi ngưn âiãûn Nàõp thiãút bë Hỗnh 15.3 Nừp coù õióỷn thóỳ cao ng nọỳi õióỷn cỉûc Bủc di chuøn (häù tråü khay váûn hnh) Nåi (lọự) naỷp 50/50 etylen glycol / nổồùc vaỡo Hỗnh 15.4 Bưng gim xäúc 323 15.3 CÁÚU TRỤC VÁÛN HNH 15.3.1 Chuáøn bë dung dëch - Chuáøn bë 250 ml dung dëch âãûm Hai dung dëch âãûm âỉåüc sỉí dủng phäø biãún cho âiãûn di ADN âæåüc chuáøn bë theo cäng thỉïc pha chãú dỉåïi âáy 10X Tris- borate-EDTA Ngưn cung cáúp cháút âãûm: (0,89 M tris; 0,89 M axit boric; 20 mM EDTA; pH- 8,2; 1000 ml) Tris base(FW 121.1): 0,89 M 108, 0g Axit boric (FW61.8): 0,89M 55,0 g Dung dëch EDTA: (0,5M; pH 8,0) 0,02M 40,0 ml Nỉåïc â âỉåüc khỉí ion hoạ: 1000,0 ml pH ln ln giỉỵ åí 8,2 Trỉåïc sỉí dủng våïi dung dëch long 0,5 X våïi 45 mM base tris; 45 mM axit boric v mM EDTA thỉåìng dng pha loaợng bồới vỗ nổồùc coù nhióỷt õọỹ thỏỳp 1X vồùi 89 mM base tris; 89 mM axit boric vaì mM EDTA 10X Tris- acetate -EDTA Cung cáúp cho cháút âãûm (0,4 M tris; 0,2 M axit axetic; 10 mM EDTA; pH- 8,4; 1000 ml) Tris base(FW 121.1): 0,40 M 48,8 g Axit axetic (99,5%): 0,20 M 114,1 ml Dung dëch EDTA (0,5M; pH 0,8): 0,01M 20,0 ml Næåïc â âỉåüc khỉí ion hoạ: 1000,0 ml Khúy âãưu âỉìng lm gim pH Pha long tåïi 1X trỉåïc sỉí duûng tåïi 40 mM base tris; 20 mM axit axetic vaì mM EDTA Dung dëch EDTA (etylen diamin tetraaxetic axit): (0,5M; pH 8,0; 100 ml) Na2EDTA.2H2O; (FW 372,2) 0,5 M 18,6 g Nỉåïc â âỉåüc khỉí ion hoạ: 70,0 ml NaOH (10M) tåïi pH 8,0 5,0 ml Næåïc â âỉåüc khỉí ion hoạ: 100,0 ml - Chøn bë bäü âãûm taíi máùu Âãø chuáøn bë bäü âãûm máùu cáưn chøn bë máùu âãûm thỉí (dung dëch máùu) v bäü lỉåüc cọ dung têch khạc Máùu âãûm thỉí Dung dëch máùu (5X; 25% ficoll 400; 25% phenol bromua xanh; 10 ml) 324 Nỉåïc â âỉåüc khỉí ion hoạ: Ficoll 400: Phenol bromua xanh (F 691,9): Nỉåïc â âỉåüc khỉí ion hoạ: 7,0 ml 2,5 mg 25,0 mg 10,0 ml Chụ 1: Sucroza v glyxerol cọ thãø sỉí dủng âãø thay thãú cho ficoll 400 Chụ 2: Xylen cyanol (0,25 %) maì di chuyãøn cháûm hån phenol bromua xanh, thỗ coù thóứ tng thóm mọỹt lổồỹng nóỳu mong mún, sỉû cä cản dung dëch agaroza âỉåüc xạc âënh thãm vo cọ liãn quan âãún polynucleotit Thãø têch bãøø Bng 15.1 Nhỉỵng loải lỉåüc M säú lỉåüc 80 - 6051 - 88 80 - 6052 - 07 80 - 6051 - 50 80 - 6051 - 69 80 - 6050 - 74 80 - 6050 - 93 80 - 6051 - 12 80 - 6050 - 31 prep/2 ref prep/2 ref 8 12 12 16 16 Bãư dy, mm 1,0 1,5 1,0 1,5 1,0 1,5 1,0 1,5 Âäü räüng, mm 44/6 44/6 6,5 6,5 3,9 3,9 2,6 2,6 Dung têch Âäü sáu 44/6* 66/9* 6,5 9,7 3,9 5,8 2,6 3,9 - Chuáøn bë khoaíng ml dung dëch agaroza ỉïng våïi mäùi mililit chiãưu dy gel (vê dủ gel mm cáưn 0,3×7×10 = 21 ml) Hoaì tan agaroza dung dëch âãûm , âiãưu chènh nhiãût âäü häùn håüp Cho phẹp lm mạt dung dëch âãún 500C trỉåïc rọt vo khn Âãø quan sạt sỉû phán ly hiãûn tỉåüng âiãûn chuøn thỉåìng thãm 0,5 mg/ml etydi bromua vo dung dëch gel 15.3.2 Âuïc gel - Thiãút bë âàût khay di âäüng: Mäüt tay giỉỵ chàût khn âục, tay âàût âáưu khay di âäüng ạp vo miãûng bt âãûm v sau âọ tháúp räưi âàût lãn âoản cúi ca khn âục Âàût âáưu cn lải ca khay ạp sạt miãûng bt âãûm - Chøn bë lỉåüc: Làõp hai rnh lỉåüc vo giỉỵa nhỉỵng âáưu äúc v màût sau lỉåüc Siãút chàût äúc Âàût lỉåüc vo mẹp khn v chènh pháưn cúi ca lỉåüc âãø cạch khay di âäüng khong mm Siãút chàût äúc âãø giỉỵ chàõc lỉåüc - Di chuøn lỉåüc: Âàût khn làõp rạp lãn màût phàóng nàịm ngang Âàût äúng nivä lãn khay di âäüng, thiãút bë kiãøm tra xem khn cọ âụng trờ nũm ngang khọng 325 Hỗnh 15.5 Mỷt sau lỉåüc, làõp trãn vnh ca khn âục, vë trê lỉåüc gel Hai äúc hiãûu chènh læåüc Læåüc Màût sau lỉåüc Âãø tảo hai rnh, âàût lỉåüc thỉï hai vo giỉỵa gel ÄÚc (2) - Âäø dung dëch agaroza (âỉåüc lm lảnh âãún 500C) vo khn âục Âënh hỉåïng lỉåüc âãø cạc bãư màût lỉåüc gáưn miãúng âãûm bt nháút v âàût lãn cảnh khay Lỉåüc ln ln åí vo vë trê thàóng âỉïng âãø trạnh sỉû vàûn vẻo hỗnh daỷng óứ chaỷy lổồỹng mỏựu gỏỳp lỏửn, õỷt lỉåüc thỉï hai vo chênh giỉỵa khay Cho phẹp thåìi gian täúi thiãøu âãø gel âàûc lải l 30 - Khi gel â kãút lải, láưn lỉåüt thạo lỉåüc cáøn tháûn Nháúc mäüt pháưn v nghiãng nhẻ mäüt âáưu ca lỉåüc, sau âọ rụt tỉì tỉì gel (kẹo thàóng lỉåüc, tảo mäüt khong khäng âãø cọ thãø nháúc gel khay) - Thạo khay di âäüng v gel bàịng cạch nàõm láúy tay cáưm ca khay, áún âáưu ạp vo miãúng bt âãûm Khi khay õaợ saỷch õóỷm thỗ nhỏỳc Chuyóứn khay vaỡ gel tåïi chäù mạt 15.3.3 Váûn hnh âiãûn di Lm lảnh nãưn trỉåïc tiãún hnh, âàûc biãût dng âiãûn ạp cao hån hồûc sỉû phán ly quy âënh trãn 30 Chụ ï: Âãø tiãún hnh phán ly, hồûc l thãm 0,5 mg/ml etydi bromua vo dung dëch âãûm hồûc thãm 50 mg/ml etydi bromua vo bäü âãûm máùu Âãø quan sạt, hy càõt âiãûn, thạo pháưn nàõp v giỉỵ ân cỉûc têm gáưn gel Thãm tỉì tỉì etydi bromua vo dung dëch âãûm hay âãûm máùu Phạt hiãûn bàịng phỉång phạp ny khäng nhảy bàịng cạch nhuọỹm maỡu vaỡ nhỗn qua thióỳt bở soi ọứ dung dëch vo cạc khoang cho âãún âãûm cao hån gel khoaíng mm (khoaíng 220 ml) Nảp máùu Thãm máùu vo 5X bäü âãûm ti máùu v träün (1/5 thãø têch l âãûm nảp vo) Sỉí dủng micropipet âãø nảp máùu, chụ trạnh âám thng hồûc tảo nãn nhiãưu bong bọng Âàût nàõp âãø catot (−, dáy âen) åí âoản cúi gáưn máùu nháút (Máùu axit nucleic di chuyãøn vãö phêa anät, +, dáy â) Näúi cạc dáy mu (â våïi â, âen våïi âen) tåïi cạc ngưn âiãûn, l ESP 2A200 Âàût mỉïc âiãûn ạp v thiãút bë báúm giåì (nãúu cọ sàơn) theo mỉïc âäü phán ly 326 Nhanh, âiãûn ạp cao Nhỉỵng ỉïng dủng no âọ, l kiãøm tra cạc máùu, cọ thãø thỉûc hiãûn nhanh dỉåïi âiãưu kiãûn âiãûn ạp cao Lm lảnh (−200C ) v giåïi hản thåìi gian váûn hnh hồûc êt hån åí âiãûn aïp 500 V Cháûm hån, âiãûn aïp cao hån Mäüt gradient âiãûn ạp 12V/cm (150V) 30 ÷ 40 (sỉí dủng dung dëch âãûm 1% gel agaroza v 0,5 X TBE) càõt Hind III ca lamda ADN thnh cạc âoản 0,1 ÷ 23 kb Hồûc, dng dung dëch váûy, máùu ny cọ thãø chảy åí 24 V/cm (300V) thỗ coù thóứ phỏn cừt 20 ữ 30 Lm lảnh thiãút bë trỉåïc tiãún hnh Chụ : - Nãúu khäng âäø thãm mu vo cháút lng laỡm nguọỹi thỗ õỷt trón nóửn tọỳi õóứ quan saùt dãù dng hån - Âàût thiãút bë cn nọng lãn nãưn âỉåüc lm lảnh cọ thãø nh hỉåíng âãún nhiãût âäü xung quanh Nãúu sỉû quạ nhiãût khäng âỉåüc kiãøm soạt, gel s tan hồûc thiãút bë s cong - Etydi bromua l cháút àn da mảnh, nãn cáưn mang bao tay - Âeo kênh chàõn tia UV v bo vãû da sỉí dủng ân UV - Tênh gradient âiãûn ạp, chia âiãûn ạp âàût vo cho khong cạch giỉỵa cạc cỉûc 12,7 cm Bng 15.2 Âiãûn ạp âàût vo v thåìi gian âãư nghë (1) Âiãûn ạp, V Gradient, V/cm Thåìi gian, 500 40 (1) 400 31 10 (1) 300 24 20 (1) 200 16 30 ÷ 40 150 12 30 ÷ 60 Ghi chuï: (1) Âãø thåìi gian chảy êt hån hồûc bàịng 20 phụt, sỉí dủng 0,5X TBE v lm lảnh nãưn âãún −200C trỉåïc sỉí dủng Sau phán ly 1- Ngàõt âiãûn, thaïo dáy dáùn, thaïo nàõp 2- Nãúu khäng thãm etydi bromua vo gel hồûc máùu trỉåïc chảy, nhüm gel dung dëch 0,5 ÷ mg/ml etydi bromua nỉåïc hồûc âãûm 3- Lm sảch thiãút bë 327 Váûn hnh Cạc loải gel agaroza âỉåüc chøn bë láưn âáưu khn âục gel Nhỉỵng máùu âỉåüc nảp vo cạc bãø chỉïa v âỉåüc phán ly Thúc nhüm hunh quang C12H20BrN3 cọ thãø âỉåüc thãm vo cháút âãûm õióỷn di hoỷc gel hoỷc caớ hai õóứ tỗm dỏỳu hióỷu cuớa quaù trỗnh phỏn ly Sau õióỷn di, gel cọ thãø cho mu, ghi lải mu, tháúm mu thãm hồûc sáúy tỉû âäüng - Âäø âáưy läù våïi cháút ti lảnh D khäng lm lảnh âi nỉỵa thỗ õióửu quan troỹng laỡ phaới õọứ õỏửy lọự vồùi dung dëch lm lảnh âàûc trỉng trỉåïc sỉí dủng vỗ dung dởch cung cỏỳp nguọửn nhióỷt cỏửn thióỳt Chuỏứn bë 600 ml våïi 50/50 C2H2(OH)2/H2O - Âãø giuïp xem cạc bãø chỉïa âỉåüc r rng hån nảp máùu, thãm hồûc git thúc nhüm ho tan hoỷc maỡu thổỷc phỏứm vaỡo dung dởch laỡm laỷnh Tỗm hai läù hng nảp nỉåïc åí pháưn trãn ca läù Âäø âáưy läù hng âãún mỉïc cọ thãø cháút lm lảnh bàịng äúng phun hồûc mạy båm våïi 50 ml Báúm nụt caosu mu náu vo mäùi läù - Sàõp xãúp dung dëch â chøn bë thng âạ hồûc bãn mạy lảnh hồûc t lảnh âãø khäng dỉåïi 200C khong giåì trỉåïc sỉí dủng (hoạ cháút âỉåüc dỉû trỉỵ phng lảnh hay t lảnh) Chụ : - Khäng âäø âáưy läù våïi cháút chäúng âäng thỉång mải, dung mäi hỉỵu cå hồûc nỉåïc cáút - Khäng cáưn thiãút thay thãú cháút lm lảnh 15.3.4 Tênh kãút qu Hiãûn tỉåüng âiãûn di cháút gel cọ thãø sỉí dủng nhỉỵng mnh nh ADN khong 0,1 kb hay nh hån loải gel polyacrylamit thỉåìng sỉí dủng nhỉỵng mnh nh hån kb Tênh âiãûn di cuớa ADN Nọửng õọỹ agaroza qui õởnh cho quaù trỗnh phán ly thnh nhỉỵng mnh våỵ våïi nhỉỵng kêch thỉåïc khạc âỉåüc cho bng 15.3 Bng 15.3 Näưng âäü âãø âiãûn di ca cạc mnh våỵ ADN âäúi våïi cạc loải cháút khạc 0,5 0,7 Hiãûu qu ca nhổợng õoaỷn thúng õọỳi vồùi sổỷ phỏn giaới 1,0 ữ 3,0 0,8 ÷ 12 1,0 0,5 ÷ 10 1,2 0,4 ÷ 1,5 0,2 ÷ Âiãûn di, % 328 Nhỉỵng nhán täú khạc nh hỉåíng âãún kãút qu quạ trỗnh phỏn ly bao gọửm: chỏỳt õóỷm, õióỷn aùp õỷt vo, nhiãût âäü , cáúu tảo v sỉû cọ màût ca etydi brommua, cạc agaroza âàûc biãût cọ sàơn Tiãu chuáøn chung cho âoaûn Hind III phage λ Loaûi cho mnh våỵ sàõp xãúp khong tỉì 0,1 âãún 23 kb cho mäùi càûp såüi Âãø phán giaíi täút, di chuøn trãn âoản 10 cm máút 45 1% gel agaroza gel 0,5 X TBE åí âiãûn ạp 150V Tênh âiãûn di ca ARN ARN cọ thãø phán chia âỉûa theo kêch thỉåïc cå bn Âãø trạnh tạc âäüng âãún thåìi k chuøn hoạ cáúu trục ARN âỉåüc biãún trỉåïc hay sút thåìi gian âiãûn di Vê dủ: âoản ARN â biãún trỉåïc våïi glyoxal v âimetyl sunfoxit cọ thãø gel agaroza âäüc láûp, hay ARN cọ thãø bë càõt phán âoản Gel agaroza chỉïa hydroxyt thu ngán II metyl hay focmaldehyt 15.3.5 Sỉû phạt hiãûn ADN ADN cọ thãø âỉåüc phạt hiãûn nhåì sỉû phạt hunh quang ca liãn kãút etydi bromua (C2H10BrN3) hay nhåì phỉång phạp chủp nh bàịng tia X ca âäưng vë phọng xả ADN Etydi bromua (0,5 µg/ml) cọ thãø âỉåüc thãm vo dung dëch âãûm di chuøn, âãø quan saùt sổỷ bióỳn õọỹng cuớa mỏựu, vỗ sổỷ phaùt huyỡnh quang ca thúc nhüm dỉåïi tạc dủng ca tia cỉûc têm s âỉåüc biãøu hiãûn åí dảng di (âãø xạc âënh âỉåüc sỉû biãún âäøi âọ; tàõt ngưn cung cáúp nàng lỉåüng v chuøn âäøi thnh pháưn agaroza c nàõp thiãút bë âënh tia cỉûc têm gáưn khay váûn hnh Âàût nàõp lải v báût ân âãø bàõt lải sỉû âiãûn di) Ngoi ra, sau âiãûn di, gel biãún maìu dung dëch hoaì tan (etydi bromua 10,5 µg/ml H2O) khong tỉì 10 âãún 60 räưi quan sạt v chủp nh máùu bàịng phỉång phạp chiãúu tia cỉûc têm Âãø chủp nh gel, dng phỉång phạp chiãúu tia cỉûc têm trãn bãư màût tải mäùi vë trê åí âéa váûn hnh hồûc di chuøn nhẻ bn gel trãn bãư màût s quan sạt âỉåüc täúi âa (Âéa váûn hnh cọ 95 % ạnh sạng tràõng våïi bỉåïc sọng 254 nm v 40 % ạnh sạng tràõng våïi bỉåïc sọng 254 nm) Quan sạt máùu bàịng tia cỉûc têm åí bỉåïc sọng 366 nm hồûc lm gim cỉåìng âäü tia cỉûc têm xúng 302 nm âãø gim sỉû phạt hunh quang ca etydi bromua khäng liãn kãút, gel cọ thãø bë máút mu båíi sỉû hụt áøm ca våïi MgCl2 0,01M hồûc giåì våïi MgSO4 0,001M Sỉû máút mu â tảo âiãưu kiãûn dãù dng âãø phạt hiãûn hm lỉåüng ADN nh 15.3.6 Nhỉỵng chụ cáưn thiãút Nàõp an ton phi âỉåüc làõp trỉåïc näúi ngưn âiãûn våïi ngưn cung cáúp nàng lỉåüng 329 Tàõt táút c cạc cäng tàõc âiãûn v ngàõt ngưn cung cáúp âiãûn trỉåïc thạo nàõp an ton Trỉåïc sỉí dủng láưn âáưu, lm âáưy läù våïi lỉåüng 600 ml 50/50 etylen glycol/ nỉåïc âãø ngàn chàûn sỉû täøn tháút khäng thãø häưi phủc cho thiãút bë Läù chỉïa lỉåüng trãn cọ thãø âäø âáưy c khäng cáưn lm lảnh theo u cáưu Khäng sỉí dủng nỉåïc cáút, cháút chäúng âäng thỉång mải hồûc báút k dung mäi hỉỵu cå no âãø âäø vo läù âọ Nỉåïc âỉåüc láúy âọng bàng Nãúu khäng bë hụt vo bãn dung dëch v phạ våỵ liãn kãút Dung mäi hỉỵu cå s gáy sỉû täøn tháút hoạ cháút khäng thãø häưi phủc cho thiãút bë Khäng lm lảnh lỉåüng dung dëch cho vo läù âọ dỉåïi −200C (−40F) Cọ thãø lm lảnh lỉåüng dung dëch âọ thng âạ, mạy lm lảnh hồûc t lảnh Khäng âiãưu chènh nhiãût âäü dung dëch âãûm hoàûc gel trãn 500C Ngàn chàûn sỉû âun nọng quạ nhiãût bàịng cạch lm lảnh lỉåüng dung dëch âọ trỉåïc sỉí dủng Âãø ngàn chỷn sổỷ õun noùng quaù nhióỷt quaù trỗnh keùo di chảy âiãûn ạp cao, thay thãú lỉåüng dung dëch thỉï nháút bàịng lỉåüng dung dëch thỉï â âỉåüc lm lảnh Sỉû âun nọng quạ nhiãût s gáy sỉû täøn tháút khäng thãø häưi phủc cho thiãút bë Lm sảch Sau mäùi láưn sỉí dủng, lm sảch thiãút bë bàịng cháút táøy nhẻ v nỉåïc, sục cáøn tháûn våïi nỉåïc cáút v lm khä bàịng khäng khê Khäng âỉåüc âàût thiãút bë vo dung dëch hồûc khê thåm hồûc cạc hydrocacbon halogen hoạ, xeton, este, alcol (trãn 30%) hồûc axit âàûc (trãn 25%) Âãø trạnh lm báøn DNaza v ARNza, ngám cạc khoang chỉïa âãûm hồûc khn âục khong 10 dung dëch H2O2 3%, sau âọ sục cáøn tháûn våïi DEPC âỉåüc xỉí l räưi cho vo näưi háúp (dng nỉåïc â âỉåüc ion hoạ âãø háúp) Thay thãú miãúng bt âãûm Thạo nhỉỵng miãúng bt âãûm mn Thạo v miãúng âãûm måïi Sàõp âãûm cho thàóng v âãø vo vë trê cúi ca khay dc theo cảnh ngàõn (7 cm), màût sau ca tỉåìng v sau âọ ẹp vo âụng vë trê Làûp lải våïi miãúng âãûm thỉï hai trãn tỉåìng âäúi diãûn våïi miãúng âãûm thỉï nháút 15.3.7 Âiãưu chènh thiãút bë âiãûn di Bãø chàõn máùu Âãø cho gel âàûc laûi täúi thiãøu l 30 v giỉỵ åí nhiãût âäü phng trỉåïc thạo lỉåüc Khi thạo lỉåüc giỉỵ åí cảnh ngàõn v náng nhẻ âãø trạnh gáùy gel Giỉỵ âãø khäng hng bãø chỉïa, dng pipet âãø láúy máùu, cäú gàõng cho vo giỉỵa bãø v khäng lm thng âạy bãø 330 Máùu thỉí khäng chảy dc theo cäüt Nãúu chaớy thaỡnh sồỹi trón khay bở hoớng thỗ phaới thay thãú Gim âiãûn ạp Chn cháút âãûm våïi näưng âäü v hm lỉåüng dung dëch âãûm thêch håüp (lỉåüng dung dëch âãûm TBE chỉïa nhiãưu hån loải TAE) Nãúu cháút õóỷm bở thaùo hóỳt thỗ ngổng hoaỷt õọỹng, thaùo nàõp, dng äúng hụt láúy cháút âãûm tỉì läù khạc cho vo bãn läù âäúi diãûn âãún âáưy cháút âãûm Nãúu cháút gel khäng âäöng nháút, âàût khuän âục nàịm ngang trỉåïc âäø däưn gel (âãø lm ho láùn vo nhau) Càûp khn âục Lỉåüc phi âàût thàóng âỉïng âãø trạnh lm biãún dảng bãø chỉïa Gim låïp âãûm mm tỉì bãư màût åí phêa trãn gel, gim gradien nhiãût âäü Tại tảo gel khäng â cháút lỉåüng Thãm ficoll, glyxerol hay âỉåìng (mêa) vo nhiãưu dung dëch láúy máùu âãø baío âaím máùu làõng xuäúng âạy bãø (chn cháút ficoll) Chàõc chàõn máùu thỉí âỉåüc ho tan hon ton Gim âiãûn thãú Gim näưng âäü máùu thỉí Gim thãø têch máùu Cáưn êt nháút mm gel dỉåïi âạy lỉåüc âãø trạnh máùu rè tỉì âạy bãø Gim näưng âäü múi máùu thỉí Kiãøm tra âäü enzim, máùu thỉí cọ thãø cáưn tạc õọỹng lỏu (xuùc taùc xaớy quaù trỗnh) vaỡ mọỹt loải cháút âãûm khạc hản chãú sỉû di chuøn Pha chãú máùu måïi nãúu nghi ngåì máùu bë nhiãùm báøn Choün loaûi agaroza våïi täúc âäü tháøm tháúu cháûm Âàût khay âụng vë trê, khäng áún mảnh vo bãn 331 ... polynucleotit Thãø têch bãøø Bng 15. 1 Nhỉỵng loải lỉåüc M säú lỉåüc 80 - 6051 - 88 80 - 6052 - 07 80 - 6051 - 50 80 - 6051 - 69 80 - 6050 - 74 80 - 6050 - 93 80 - 6051 - 12 80 - 6050 - 31 prep/2 ref prep/2... 15. 3 Nừp coù âiãûn thãú cao ÄÚng näúi âiãûn cỉûc Bủc di chuøn (häù tråü khay váûn hnh) Nåi (läù) nảp 50/50 etylen glycol / nổồùc vaỡo Hỗnh 15. 4 Buọửng giaớm xọỳc 323 15. 3 CÁÚU TRỤC VÁÛN HNH 15. 3.1... 89 mM base tris; 89 mM axit boric vaì mM EDTA 10X Tris- acetate -EDTA Cung cáúp cho cháút âãûm (0,4 M tris; 0,2 M axit axetic; 10 mM EDTA; pH- 8,4; 1000 ml) Tris base(FW 121.1): 0,40 M 48,8 g Axit