Nghiên cứu về listeria monocytogenes trong các sản phẩm thuỷ sản

Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản CHƯƠNG I GIỚI THIỆU SVTH: Võ Thành Hưng Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản 1.1 Đặt vấn đề Các bệnh lý nhiễm trùng nguyên nhân gây tử vong hàng đầu giới Không có bệnh nhiễm trùng phát sinh mà bệnh nhiễm trùng cũ gây chết người biết từ lâu tái xuất Hơn tỉ lệ vi khuẩn gây bệnh đề kháng kháng sinh ngày tăng cao nguy lớn cho sức khỏe cộng đồng Những chứng gần cho thấy tác nhân gây bệnh khác sử dụng phương thức chung để phát động trình nhiễm trùng gây bệnh Những chế tạo nên độc lực (virulence) vi khuẩn Tìm hiểu chế mà vi khuẩn sử dụng để xâm nhập gây bệnh có ý nghĩa quan trọng chiến chống lại tác nhân bé nhỏ Listeria monocytogenes tác nhân gây bệnh listeriosis Vi khuẩn xếp tác nhân gây bệnh đứng thứ ba thuộc nhóm B sau Streptococcus E coli Đồng thời nguồn lây nhiễm bệnh cho người sản phẩm bảo quan lạnh, vi sinh vật có khả tồn tăng trưởng sản phẩm suốt trình bảo quản lạnh Đối với vi sinh vật ngộ độc thực phẩm khác, chúng sẻ phát bệnh người hấp thu đủ liều lượng, sau thời gian ủ bệnh triệu chứng lâm sàn biểu Trong Listeria monocytogenes diện với số lượng nhỏ thực phẩm, vào thể chúng không bị đào thải mà tích lũy chờ hội Mặc dù bệnh Listeria monocytogenes gây tầng số thấp, - trường hợp triệu người năm, tỉ lệ chết vi khuẩn cao, 25 - 30% trường hợp tử vong ca nhiễm bệnh Đối tượng bị nhiễm bệnh Listeria monocytogenes gây thường gặp trẻ em, trẻ sơ sinh, người già, thai phụ người có hệ miễn dịch Listeria monocytogenes gây bệnh nhiễm trùng máu, viêm màng não sốt viêm dày ruột, đồng thời nguyên nhân gây trẻ chết sau sinh, đẻ non sẩy thai phụ nữ Do đó, với tính phân bố rộng khả gây tác hại nghiêm người bị nhiễm L Monocytogenes chấp thuận khoa Môi trường Công SVTH: Võ Thành Hưng Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản nghệ sinh học, tiến hành thực đề tài “Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản” 1.2 Mục đích Cấu trúc chế gây bệnh Listeria monocytogenes 1.3 Nội dung nghiên cứu  Khảo sát cấu trúc Listeria monocytogenes  Khảo sát phân bố Listeria monocytogenes  Tình hình nhiễm Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản giới Việt Nam  Một số phương pháp xác định Listeria monocytogenes SVTH: Võ Thành Hưng Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản CHƯƠNG II TỔNG QUAN SVTH: Võ Thành Hưng Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản 2.1 Tổng quan số vi sinh vật nhiễm thực phẩm 2.1.1 Salmonella sp Hình 2.1: Salmonella vi khuẩn chuyên chở bệnh thương hàn 2.1.1.1 Phân loại  Giới: Bacteria  Nghành: Proteobacteria  Lớp: Gamma Proteobacteria  Bộ: Enterobacteriales  Họ: Enterobacteriaceae  Chi: Salmonella  Loài: Salmonella sp 2.1.1.2 Đặc điểm Salmonella trực khuẩn Gram âm Hầu hết loài Salmonella có lông xung quanh thân (trừ Salmonella gallinarum Salmonella pullorum), có khả di động, không sinh bào tử Có kích thước tế bào vào khoảng 0,5 – m Salmonella vi khuẩn hiếu khí hay hiếu khí tùy nghi, thích hợp 370C, pH tối ưu 7,2 - 7,6 Để mọc môi trường thông thường SVTH: Võ Thành Hưng Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản  Đặc điểm sinh hóa: Salmonella lên men glucose có sinh (trừ Salmonella typhi lên men glucose không sinh hơi) không lên men lactose, Indol âm tính, Methyl Red dương tính, VP âm tính, Citrat thay đổi, Urease âm tính, H2S dương tính (trừ Salmonella paratyphi A: H2S âm tính) Lên men sinh đường glucose, manit, sorbitol, lên men không sacharose, không lên men đường lactose, salicin, raffinose … (Tô Minh Châu Trần Bích Liên, 1999) 2.1.1.3 Cấu trúc kháng nguyên  Kháng nguyên O Mỗi Salmonella có nhiều yếu tố kháng nguyên Hiện người ta biết có 67 yếu tố kháng nguyên O Việc xác định yếu tố kháng nguyên O quan trọng để định nhóm định type  Kháng nguyên H Chỉ có Salmonella có lông Kháng nguyên H Salmonella tồn pha  Pha đặc hiệu (phase 1): yếu tố có tính chất đặc hiệu cho loài vi khuẩn Salmonella, gồm 28 kháng nguyên lông kí hiệu chữ a, b, c, g,…  Pha không đặc hiệu (phase 2): kí hiệu số 1, 2, 3,… (Tô Minh Châu Trần Thị Bích Liên, 2001)  Kháng nguyên Vi Là kháng nguyên bề mặt bao bên vách tế bào vi khuẩn, dạng màng mỏng không nhìn thấy kính hiển vi thường Kháng nguyên Vi có type huyết Salmonella typhi S paratyphi C Người ta dựa vào khác cấu trúc kháng nguyên để xếp loại Salmonella SVTH: Võ Thành Hưng Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản Bảng 2.1: Phân biệt kháng nguyên O, H, Vi: Kháng nguyên Tính chịu nhiệt O Ổn nhiệt 2h30 1000C Vi H Tác động Formol 50% alcohol 50% Kháng Bị ngăng trở ngưng kết Biến nhiệt 15’06” 1000C Nhạy cãm Kháng Biến nhiệt 2h 1000C Nhạy cãm Kháng Hình 2.2: Các kháng nguyên bề mặt Salmonella 2.1.1.4 Yếu tố độc lực Có hai loại độc tố nội độc tố ngoại độc tố Ngoại độc tố đường ruột (entero toxin) có hai loại LT ST  Độc tố LT không bền với nhiệt, LT hoạt hóa enzyme adenylcuclase tế bào niêm mạc ruột, làm gia tăng c-AMP (cyclo adenosine 5-monophosphate), c-AMP SVTH: Võ Thành Hưng Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản kích thích tiết Cl- HCO3- khỏi tế bào, đồng thời ức chế Na+ vào bên tế bào Hậu tích nước ống ruột dẫn đến tiêu chảy  Độc tố ST bền với nhiệt, chế tác động tương tự LT ST hoạt hóa enzyme guanosylcyclase làm tăng c-GMP (cycle guanosine 5-monophosphate) tế bào dẫn tới tượng tiêu chảy 2.1.1.5 Khả gây bệnh Salmonella xâm nhập vào thể qua đường miệng hầu hết ăn phải thức ăn bị nhiễm thực phẩm, sữa, nước uống… Sau xuyên qua hàng rào acid dày, vi khuẩn di động phía ruột non sinh sản đó, tiếp tục chui qua màng nhày vào thành ruột Các tế bào Paneth niêm mạc ruột tiết loại peptide có tính chống lại xâm nhập tác nhân gây bệnh Salmonella nhiễm vào thể từ hai nguồn: từ phân người động vật, từ người bệnh Trong phải kể đến tác động động vật lông vũ, trứng phân chúng làm cho việc lan truyền Salmonella dễ dàng Ngoài chuột, mèo, ruồi tác nhân gián tiếp dẫn đến việc Salmonella lan rộng rãi phân chúng nhiễm vào thực phẩm không bảo quản kỹ trình giết mổ củng cần đề phòng nhiễm Salmonella không thực quy trình an toàn thực phẩm  Bệnh thương hàn Hình 2.3: Viêm dày – ruột SVTH: Võ Thành Hưng Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản Ở nước ta, bệnh thương hàn chủ yếu S typhi, sau đến S paratyphi A, S paratyphi B S paratyphi C gặp Bệnh lây từ người sang người khác, qua thức ăn, nước uống bị nhiễm khuẩn Sau khỏi bệnh mặt lâm sàng, khoảng 5% bệnh nhân trở thành người lành mang vi khuẩn kéo dài hàng tháng hàng năm Ở họ, ổ chứa Salmonella đường mật vi khuẩn tiếp tục đào thải theo phân ngoại cảnh Người lành mang vi khuẩn nguồn lan truyền bệnh quan trọng Sinh bệnh học: Trực khuẩn thương hàn vào thể qua đường tiêu hóa đến ruột non chui qua niêm mạc ruột vào hạch mạc treo ruột Ở chúng nhân lên phần vi khuẩn bị dung giải, giải phóng nội độc tố Nội độc tố kích thích thần kinh giao cảm bụng, gây thương tổn mảng Peyer, xuất huyết tiêu hóa, gây thủng ruột Ngoài ra, nội độc tố theo máu lên kích thích trung tâm thần kinh thực vật não thất ba, gây trạng thái sốt kéo dài, li bì, gây biến chứng trụy tim mạch Từ hạch mạc treo ruột vi khuẩn lan tràn vào máu gây nên nhiễm khuẩn huyết lan khắp thể, vi khuẩn vào mật từ quay trở lại ruột Vi khuẩn theo phân ngoại cảnh  Các bệnh khác Các bệnh thương hàn Salmonella gây thường nhiễm trùng giới hạn ống tiêu hóa trường hợp nhiễm trùng nhiễm độc thức ăn mà Salmonella typhimurium tác nhân hay gặp nhất, sau Salmonella enteritidis Nhiễm trùng nhiễm độc Salmonella có thời gian nung bệnh từ 10 đến 48 Bệnh biểu có sốt, nôn, tiêu chảy Bệnh khỏi sau - ngày, biến chứng Ngoài ra, Salmonella gây nên tổn thương đường tiêu hóa viêm màng não, thể nhiễm trùng huyết đơn thuần, nhiễm trùng phổi  Khả gây bệnh số loài:  Salmonella typhi : Chỉ gây bệnh cho người Ở nước ta bệnh thương hàn chủ yếu S.typhi gây  Salmonella paratyphi A : Chỉ gây bệnh thương hàn cho người hay gặp nước ta sau S typhi SVTH: Võ Thành Hưng Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản  Salmonella paratyphi B : Gây bệnh thương hàn chủ yếu cho người, súc vật Bệnh thường gặp nước châu Âu  Salmonella paratyphi C : Gây bệnh thương hàn, viêm dày ruột nhiễm khuẩn huyết Bệnh thường gặp nước Đông Nam Á  Salmonella typhimurium Salmonella enteritidis : Gây bệnh cho người gia súc, gặp toàn giới Chúng nguyên nhân gây nhiễm trùng, nhiễm độc thức ăn ăn phải thức ăn nhiễm Salmonella  Salmonella cholerae suis : Loại hay gây nhiễm khuẩn huyết 2.1.2 Campylobacter sp Hình 2.4: Phẩy khuẩn Campylobacter 2.1.2.1 Phân loại  Giới: Bacteria  Nghành: Proteobacteria  Lớp: Gamma Proteobacteria  Bộ: Eubateriales  Họ: campylobacteriaceae  Chi: Campylobactes  SVTH: Võ Thành Hưng Loài: Campylobactes sp 10 Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản theo nhiệt độ tương đối thấp (540C) để kích hoạt trình bắt cặp nucleotide mạch khuôn, sau 720C phép chép DNA polymerase mẫu Toàn trình lặp lặp lại 25 - 30 chu kỳ để mẫu DNA biến thành hàng tỷ vòng - Gel điện di thường sử dụng để phát sản phẩm khuếch đại Khi hết mồi xunh quanh DNA khuôn, khối lượng kích thước gel đích dự đoán phát với vết DNA (Wang et al., 1993; Manzano et al., 2000; Volokhov et al, 2002.) Bằng cách xác định khác biệt phân tử gen 16S 23S rRNA, vùng gel đệm, hly, inlA, inlB, IAP gen khác L monocytogenes nhanh chóng phân biệt xác giữ Listeria khác loài vi khuẩn thông thường PCR khảo nghiệm đa thành phần sử dụng để khuyếch đại cách chọn lọc gene IAP tạo thuận lợi cho việc xác định khác biệt tất sáu loài Listeria thử nghiệm đơn (Bubert et al., 1999) Tuy nhiên, nên cần thận trọng để xác định kích thước sản phẩm khuếch đại, thấy khác biệt kích thước loài Listeria Như vậy, xác định gen mục tiêu cho loài Listeria tốt hơn, cung cấp biểu độc lập xác nhận loài (Gilot nội dung, năm 2002; Liu et al., 2003b, 2004a, 2004b, 2004c, 2005b) Nếu đồng diện số loài vi khuẩn Listeria làm phức tạp việc xác định L monocytogenes, khảo nghiệm đa thành phần hữu ích để nhận dạng đặc tính vi khuẩn phân lập Việc sử dụng đoạn mồi PCR nhóm cụ thể, cung cấp công cụ bổ sung để xác định L monocytogenes (Jinneman Hill, 2001; Borucki Call, 2003; Doumith et al , 2004a) Tất DNA polymerase cần mồi chuyên biệt để tổng hợp mạch DNA từ mạch khuôn Mạch khuôn thường trình tự DNA gen định đặc trưng cho loài vi sinh vật mục tiêu gen quy định việc tổng hợp loài độc tố chuyên biệt Mồi đoạn DNA ngắn có khả bắt cặp bổ sung với đầu mạch khuôn nhờ hoạt động DNA polymerase đoạn mồi nối dài để hình thành mạch Khi cung cấp hai nguồn mồi chuyên biệt bắt cặp bổ sung với hai đầu trình tự DNA, với điều kiện DNA polymerase hoạt động phản ứng PCR, SVTH: Võ Thành Hưng 50 Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản đoạn DNA nằm hai đầu mồi tạo nên Như để khuếch đại trình tự DNA xác định, ta có thông tin tối thiểu trình tự đủ để tạo cac mồi bổ sung chuyên nghiệp Các mồi gồm mồi xuôi (sens primer) mồi ngược (antisens primer) so với chiều phiên mã gen Phản ứng PCR chuỗi nhiều chu kỳ nối tiếp Mỗi chu kỳ gồm bước: biến tính (denaturation), lai (anealation), tổng hợp (elongation) Phân tích sản phẩm khuếch đại điện di gel agarose Đặc trưng phản ứng khuếch đại vi sinh vật mục tiêu thông qua kích thước sản phẩm khuếch đại SVTH: Võ Thành Hưng 51 Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản Sơ đồ phản ứng PCR: SVTH: Võ Thành Hưng 52 Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản  Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) với cặp mồi LM-F LM-R:  Chủng vi sinh vật: L monocytogenes  Chuẩn bị thí nghiệm:  Trình tự gen hlyA chủng L monocytogenes công bố ngân hàng gen  Phần mềm BLAST dung để xác định trình tự gen đích hlyA L monocytogenes (Kanamyxin, Xgal, Eco RI, kit tách dòng Topo TA Cloning Kit, kit tách tinh plasmid QIA prep Spin Miniprep Test Kit),kit xác định trình tự BigDye Terminator v3.1  Cặp mồi LM-F LM-R thiết kế bao gồm 20 bp/mồi cho sản phẩm PCR 468 bp  Hoá chất sử dụng cho tách chiết DNA tổng số, hoá chất cho điện di gel agarose, thang DNA chuẩn 100 bp 1000bp Các hoá chất khác độ tinh khiết phân tích  Phương pháp tiến hành thí nghiệm : Mồi cho phản ứng PCR Dựa trình tự gen hlyA chủng L monocytogenes công bố ngân hàng gen, cặp mồi LM-F LM-R thiết kế bao gồm 20 bp/mồi cho sản phẩm PCR 468 bp Xác định tính đặc hiệu mồi Khả bắt cặp xác mồi khẳng định cách phân tích trình tự sản phẩm PCR theo phương pháp Sanger cộng so sánh với trình tự gen đích hlyA L monocytogenes theo phần mềm BLAST Tính đặc hiệu mồi khảo sát cách kiểm tra khả bắt cặp mồi thiết kế với khuôn DNA vi khuẩn L monocytogenes L monocytogenes phản ứng PCR Phản ứng PCR DNA khuôn từ L monocytogenes thu nhận cho phản ứng PCR cách tách làm DNA với chloroform xử lý nhiệt tế bào 100 0C 10 phút Tối ưu hoá điều kiện PCR nồng độ Mg2+ (1,5 - 4,0 mM), nồng độ mồi (0,1 - 0,5 pmol/mồi) nồng độ dNTPs (100 - 250 mM/mỗi loại) Phản ứng PCR thực SVTH: Võ Thành Hưng 53 Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản với thể tích hỗn hợp 25 ml với chu trình nhiệt gồm 94 0C - phút, (94 0C phút, 60 C 1phút, 72 0C phút) x 30 trình, 72 0C- phút 0C - phút Đánh giá kết phản ứng PCR dựa phân tích sản phẩm PCR gel agarose 1% với ml sản phẩm Xác định độ nhạy phương pháp Môi trường nuôi qua đêm L monocytogenes môi trường LEB định lượng, pha loãng tới mật độ thích hợp Ly tâm thu sinh khối ml canh trường hòa tan 100 ml TE, xử lý nhiệt thu DNA cho phản ứng PCR 3ml dịch tế bào qua xử lý nhiệt sử dụng làm khuôn cho phản ứng PCR Đánh giá kết phản ứng PCR nhờ phân tích sản phẩm điện di agarose 1% DNA gen DNA gen từ L monocytogenes tách làm dùng làm khuôn cho phản ứng PCR khuyếch đại đoạn gen mục tiêu hlyA với cặp mồi LM-F LM-R, Kết phản ứng PCR với khuôn DNA tinh cho thấy băng DNA có kích thước nằm khoảng kích thước sản phẩm PCR thiết kế.Với mục đích thu nhận DNA mẫu cho phản ứng PCR cách đơn giản hơn, huyền phù L.monocytogenes xử lý nhiệt 100 0C 10 phút để phá vỡ tế bào, giải phóng DNA, ly tâm 10000 vòng/phút x 10 phút, thu dịch ly tâm chứa DNA làm khuôn cho phản ứng PCR Kiểm tra tính đặc hiệu cặp mồi LM-F, LM-R Để khẳng định khả bắt cặp xác cặp mồi LM-F, LM-R với gen hlyA L monocytogenes, trình tự sản phẩm PCR cặp mồi xác định so sánh với kết xử lý plasmid trình tự gen đích hlyA L monocytogenes Sản phẩm PCR sau khuếch đại cặp mồi LM-F,LM-R gắn trực tiếp vào vectơ pCR4 – TOPO DNA plasmid chứa sản phẩm PCR tách dòng E.coli DH5a Tiến hành tách chiết tinh plasmid tái tổ hợp (sử dụng kit QIA prep Spin Miniprep Test Kit), kiểm tra sản phẩm agarose 1% Kết điện di cho thấy plasmid khuẩn lạc trắng có kích thước lớn so với đối chứng Sản phẩm PCR gắn plasmid kiểm tra cách cắt với EcoRI Tái tổ hợp với EcoRI cho thấy đoạn DNA chèn vào plasmid có kích thước tương ứng với kích thước sản phẩm PCR Trình tự sản phẩm PCR xác định thiết bị xác định trình SVTH: Võ Thành Hưng 54 Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản tự tự động ABI 3100 Avant Trình tự so sánh với trình tự hlyA cácL monocytogenes công bố Kết so sánh cho thấy sản phẩm PCR khuyếch đại cặp mồi LM-F, LM-R có kích thước 468 bp, đạt độ tương đồng trình tự >98 % với trình tự hl yA 53 chủng L Monocytogenes công bố Như vậy, cặp mồi LM-F, LM-R thiết kế cho phép nhận xác đoạn gen hlyA L monocytogenes Xác định điều kiện tối ưu cho PCR  Nồng độ Mg 2+ : Phản ứng PCR thực nồng độ cuối Mg 2+ từ 1,5 mM đến 4,0mM  Nồng độ dNTPs: Phản ứng PCR thực với nồng độ dNTPs từ 100 mM đến 250 mM  Nồng độ mồi PCR thực nồng độ mồi khác từ 0,1 đến 0,5 pmol Dịch tế bào xác định mật độ phương pháp đếm khuẩn lạc Pha loãng dịch vi khuẩn tới nồng độ khác , xử lý nhiệt dịch huyền phù vi khuẩn 3ml dịch sinh khối vi khuẩn sau xử lý nhiệt dùng làm khuôn cho phản ứng PCR cho thấy phản ứng PCR cho kết dương tính với mẫu có mật độ tế bào 6x102 /phản ứng tương ứng với mật độ tế bào từ 2.104 CFU/ml Như vậy, phương pháp PCR phát L Monocytogenes có độ nhạy tương đương với kít thương mại BAXTM Qualicon Inc., (104 CFU/ ml) nhỏ Listeria monocytogenes LightCycler Roche (103 CFU/ ml) Cặp mồi LM-F, LM-R thiết kế đặc hiệu với L monocytogenes, cho phép phát vi khuẩn gây bệnh L monocytogenes mật độ 6.102 CFU/phản ứng (2 104 CFU/ml)  Bộ kit PCR:Với độ nhạy cao với vi khuẩn, 25g mẫu thực phẩm có vi khuẩn cần tìm PCR phát chúng Điều đặc biệt kít không gọi tên loại vi sinh vật gây ngộ độc thực phẩm mà chúng phát 12 loại vi khuẩn khác như: e.coli, e coli 0157:h7, salmonella spp, shigella spp, nấm mốc Tùy thuộc vào loại thực phẩm số loại tiêu vi khuẩn gây bệnh cần kiểm soát loại thực phẩm, quy trình Kit PCR cho phép SVTH: Võ Thành Hưng 55 Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản xét nghiệm gọi tên tất vi khuẩn nêu vòng 24 (trừ Clostridium botulinum, cần thời gian nuôi cấy tăng sinh dài) Chúng thiết kế cho 50 phản ứng PCR với 50 ống phản ứng, chứa đầy đủ thành phần dung dịch đệm PCR, mồi, nước để giúp kiểm tra xác mức độ nhiễm vi sinh vật trầm trọng hay không So với phương pháp nuôi cấy truyền thống, phương pháp cho hiệu xác hay chỗ, phát nhiều vi khuẩn gây bệnh tốn thời gian Ưu điểm phương pháp PCR:  Thời gian cho kết nhanh  Có thể nhận diện vi sinh vật khó nuôi cấy việc nuôi cấy tăng sinh đơn giản có không cần thiết  Hóa chất cần cho phản ứng PCR sẵn có dễ tồn trữ so với trường hợp huyết học Không cần dụng cụ môi trường chẩn đoán phức tạp, thực trường  Ít tốn mặt nhân Có thể tự động hóa để làm giảm chi phí phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm Mặc dù phương pháp số khuyết điểm cần khắc phục:  Sự ức chế hoạt tính Tag DNA polymerase thành phần mẫu vật mẫu thực phẩm thường có thành phân phức tạp việc chiết tách tinh chế DNA từ thực phẩm hai môi trường trước thực phương pháp PCR cho phép loại bỏ hợp chất ức chế Tuy nhên vài quy trình phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm PCR không cần tách chiết, tinh chế DNA  Mật độ vi sinh vật gây bệnh diện mẫu thực phẩm thường thấp, nê đa số trường hợp cần có bước nuôi cấy làm giàu để có mật độ đủ để phát PCR  Phương pháp không phân biệt tế bào sống hay tế bào chết dẫn đến trường hợp dương tính giả DNA từ tế bào chết Ngược lại phương pháp cho phép phát bào tử, dạng tiềm sinh, hay tế bào chết vi sinh vật gây bệnh ngộ độc 2.3.2.3 Phương pháp lai phân tử SVTH: Võ Thành Hưng 56 Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản Hiện nhiều hệ thống thiết lập dựa DNA để định lượng vi sinh vật độc tố Tuy nhiên, có phương pháp lai phân tử (hay gọi phương pháp mẫu dò, probes) phương pháp PCR thương mại hóa dạng kit phát vi sinh vật gây bệnh thực phẩm Phương pháp sử dụng mẫu dò để phát vi sinh vật thực phẩm dựa phát đoạn gen đặc trưng vi sinh vật Cơ sở việc sử dụng mẫu dò phương pháp lai phân tử Quá trình bao gồm tách rời hai mạch đôi chuỗi xoắn kép DNA nhiệt độ vượt nhiệt độ nóng chảy (Tm) phân tử DNA tái bắt cặp trình tự nucleotide bổ sung nhiệt độ trở lại bình thường Sự lai phân tử xảy đoạn mồi có trình tự nucleotide bổ sung với vùng trình tự DNA mục tiêu gặp chuyển động nhiệt nhiệt độ môi trường thấp Tm vài độ Quá trình lai phân tử chiu ảnh hưởng nhiều yếu tố: nồng độ DNA môi trường, nhiệt độ thời gian phản ứng, kích thước trình tự lai lực ion môi trường Ví dụ: hệ thống dò Gen – trak (Framingham, USA), hệ thống sử dụng que thử với mẫu dò để phát Listeria mẫu bơ sữa mẫu môi trường mẫu dò đoạn oligomer DNA đánh dấu hóa chất phát quang Quy trình phân tích chia làm bước: Phá vỡ tế bào thu nhận rRNA Mẫu dò phát chứa fluorescein isothiocyanate đầu 5` 3` phân tử đặt vào phản ứng Que thử bao bọc polydeoxythymidine (dT) để gắn với oligodA mẫu dò Que thử đặt ống đo chứa mẫu dò phát đánh dấu enzyme Sau rửa loại phần enzyme thừa, que thử đặt vào ống đo chứa chất tạo màu Sau ủ để màu, màu phát bước sóng 450nm SVTH: Võ Thành Hưng 57 Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản CHƯƠNG III KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ SVTH: Võ Thành Hưng 58 Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản 3.1 Kết luận Mặc dù bệnh Listeria monocytogenes gây tần số thấp, 2-5 trường hợp triệu người năm, tỉ lệ chết vi khuẩn cao, 25-30% trường hợp tử vong ca nhiễm bệnh  Phương pháp truyền thống: Thường quy kỹ thuật định lượng listeria monocytogenes thực phẩm -Ưu điểm :phương pháp đơn giản dễ thực -Khuyết điểm: tốn nhiều thời gian (vài ba ngày đến vài ba tuần).Độ xác không cao người thực có sai xót trình thí nghiệm  Pương pháp đại:  Kỹ thuật PCR (Polymerase Chain Reaction) với cặp mồi LM-F LM-R:  Ưu điểm :có thể phát nhanh thực phẩm nhiễm trực khẩn Listeria monocytogenes với nồng độ thấp khoảng 102 CFU/g người trưởng thành 10 CFU/g trẻ em phụ nữ mang thai  Khuyết điểm: Gía thành kinh tế dùng để thực cao hầu hết thiết bị sử dụng thí nghiệm phải nhập từ nước ngoài.Bên cạnh thí nghiệm đòi nhiều kĩ thuật phức tạp nên khả ứng dụng không thực tế không cao Bộ kit PCR:  Ưu điểm: + Cho phép xét nghiệm gọi tên hầu hết tất vi khuẩn vòng 24 + Qúa trình thực nhanh gọn,cho độ xác cao  Khuyết điểm: Không sử dụng với Clostridium botulinum vi khuẩn cần thời gian nuôi cấy tăng sinh dài  Kỹ thuật ELISA : Đây phương pháp đại cho phép xác định Listeria monocytogenes cách xác nhanh chóng SVTH: Võ Thành Hưng 59 Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản 3.2 Kiến nghị Các phương pháp xác định L monocytogenes thực phẩm nhiều hạn chế mặt thời gian độ xác khẳng định có mặt loài thực phẩm nên sử dụng phương pháp xác định đại PCR, ELISA phân lập xác định vi khuẩn nhằm đảm bảo độ xác cao Đề tài khảo sát số sản phẩm thủy sản đề nghị tiếp tục tiến hành nhiều sản phẩm khác để áp dụng phương pháp rộng SVTH: Võ Thành Hưng 60 Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] PGS.TS Nguyễn Phùng Tiến, GS.TS Bùi Minh Đức, GS.TS Nguyễn Văn Dịp _ Vi sinh vật thực phẩm – kỹ thuật kiễm tra tiêu đánh giá chất lượng an toàn thực phẩm [2] Trần Linh Thước _ Phương pháp phân tích vi sinh vật nước, thực phẩm mỹ phẩm [3] Hồ Huỳnh Thùy Dương, 1998 _ Sinh học phân tử, NXB Giáo dục [4] Vũ Thị Việt Hoa, Tô Minh Châu, Vũ Thị Lâm An, Lâm Thanh Hiền, Nguyễn Thị Ngọc Diệp, Nguyễn Thúy Hương, 2000 _ Vi sinh vật học đại cương, tủ sách trường ĐH Nông lâm Thành Phố Hồ Chí Minh [5].http://www.biosyth.com/index.asp?topic_id=178&g=19&m=256 [6].http://www.cdc.gov/epo/dphsi/annsum/1998/98graphs/9844.htm [7].http://www.en.wikipedia.org/wiki/Listeria [8].http://www.fda.gov/Food/ScienceResearch/LaboratoryMethods/BacteriologicalAnal yticalManualBAM/UCM071400 SVTH: Võ Thành Hưng 61 Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản PHỤ LỤC Một số môi trường phương pháp truyền thống nuôi cấy phân lập L monocytogenes  Thạch OXFORD  Code: CM856  Columbia blood agar base 39.0  Aesculin 1.0  Ferric ammonium citrate 0.5  Lithium chloride 15.0  pH:7.0 ± 0.2 Cân 27.75g thạch Oxford 500ml nước cất Hoà tan thạch nước nóng Hấp ướt 1210 trong15 phút Làm nguội xuống 50 0C cho thêm ống Listeria Selective Supplement SR:140 hoà với 5ml cồn/nước cất vô trùng(1:1) Trộn đều, đổ đĩa  Thạch máu cừu  Tryptone 14.0  Peptone Neutralised 4.5  Yeast extract 4.5  Sodium chloride 5.0  Agar 12.5  pH:7.3 ± 0.2 Cân 40g thạch máu cừu lít nước cất Hoà tan thạch nứơc nóng Hấp ướt 121 0C phút Làm nguội xuống 50 0C cộng thêm 7% máu cừu vô trùng  Thạch TRYPTONE SOYA (với 0.6% yeast extract)  Tryptone 15.0 SVTH: Võ Thành Hưng 62 Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản  Soya Peptone 5.0  Sodium chloride 5.0  Yeast extract 6.0  Agar 15.0  pH:7.3 ± 0.2 Cân 40g thạch Tryptone Soya lít nước cất Hoà tan thạch nước nóng Hấp ướt 121 0C phút  Môi trường SIM:  Tryptone 20.0  Peptone 6.1  Ferrouss ammonium sulphate 0.2  Sodium thiosulphate 0.2  Agar 3.5 Cân 30g môi trường Sim lít nước cất, đun tan, đóng ống, hấp ướt 121 0C trong15 phút Canh thang đường  Peptone 10.0  NaCl 5.0  Nước cất lít  2% Alconolic B.C.P Solotion ml  Đường 50.0 (Sucrose/manitol .) Hoà tan chất chỉnh pH:7.2-7.5 San ống 16 x125mm ống 9ml có chứa ống Durhams Hấp ướt 121 0C 15 phút Ghi chú: loại đường dùng phương pháp lọc vô trùng, không hấp  Môi trường Clark -Lubs  Peptone 5.0  Glucose 5.0 Đệm SVTH: Võ Thành Hưng 63 Nghiên cứu Listeria monocytogenes sản phẩm thủy sản  Phosphate buffer 5.0  pH: 7.5 ± 0.2 Cân 15g môi trường Clark -Lubs lít nước cất Hấp ướt 121 0C trong15 phút  Canh thang TRYPTONE SOYA  Tryptone 15.0  Soya peptone 5.0  Sodium chloride 5.0  Yeast extract 6.0  pH:7.3 ± 0.2 Cân 3g môi trường canh thang Trytone Soya lít nước cất Hấp ướt 121 0C trong15 phút  Nước Pepton  Pepton 1.0g  Nước cất 1000ml shy; pH=7.2 Cân 1g pepton lít nước cất Hấp ướt 121 0C trong15 phút  Listeria selective supplement (Oxford) (Bổ sung vào môi trường thạch Oxford )  Cycloheximide 200 mg  Colistin sulfate 10 mg  Acriflavine 2.5 mg  Cefotetan 1.0 mg  Fosfomycin 5.0 mg Lấy ml nước cất vô trùng cồn (pha theo tỷ lệ 1:1), cho vào lọ lắc đều, sau đổ lẫn vào bình cầu chứa 500 ml thạch Oxford hấp tiệt trùng để nguội 50 0C Trộn đổ vào đĩa vô trùng SVTH: Võ Thành Hưng 64