Chương 3 Enzym

CHƯƠNG III: ENZYM I KHÁI NIỆM CHUNG VỀ ENZYM Đònh nghóa Enzym chất xúc tác sinh học có chất protein (biocatalisateur) Enzym loại protein nên có đầy đủ tính chất protein MEnzym = 10.000 – 1.000.000 D, ngắn ribonuclease 12.700 D Dễ tan, có cấu trúc hình cầu, Đã khám phá khoảng 2000 Enzym 200 Enzym thu dạng tinh thể Cấu tạo Enzym Phân loại (1) Enzym thành phần (Enzym cấu tử, Enzym đơn giản): cấu tạo từ acid amin, từ chuỗi polypeptid (protein đơn giản) (2) Enzym thành phần (Enzym cấu tử, Enzym phức tạp): chuỗi polypeptid có phần phi protein (protein phức tạp)  Chuỗi polypeptid: chất mang, Apoenzym, Apoferment  Phi protein: nhóm hoạt hóa, Coenzym – cofactor, Coferment • Coenzym: phần phi protein có liên kết lỏng lẻo với apoenzym, dễ dàng tách dùng phương pháp thẩm tích (đa số vitamin) • Cofactor (nhóm ngoại): phần phi protein gắn với apoenzym liên kết đồng hóa trò bền vững, tách độc lập (ion kim loại nhóm ngoại) Cấu tạo  Điểm khác biệt so với protein bình thường hình thành trung tâm hoạt động Trung tâm hoạt động (TTHĐ) Phần cấu trúc mà nơi trực tiếp xảy phản ứng xúc tác gọi trung tâm hoạt động Enzym  Enzym cấu tử  TTHĐ thường nhóm đònh chức có hoạt tính cao, không tham gia vào việc tạo thành trục chuỗi polypeptid Các nhóm xa vơí cấu trúc bậc 3,4 chúng tiến lại gần hình thành TTHĐ  Nhóm –SH cystein  Nhóm –OH serin, tyrosin  Nhóm ε-NH2 lysin  Nhóm –COOH acid glutamic, aspartic  Vòng himidazol histidin N NH  Indol tryptophan  Cấu trúc không gian Enzym bò biến đổi khả hoạt động TTHĐ bò biến đổi hoạt tính Enzym bò biến đổi  Một Enzym có hay nhiều TTHĐ Các TTHĐ Enzym giống khác cấu tạo chức  Enzym hai cấu tử: TTHĐ thường bao gồm nhóm ngoại hay coenzym nhóm chức acid amin • Coenzym đònh kiểu phản ứng hóa học trực tiếp tham gia kết hợp với chất (thủy phân, oxy hóa, tổng hợp, phân ly,…)  Apoenzym chọn lọc chất ảnh hưởng đến cường độ phản ứng (protein, lipid, glucid,…) Cơ chế ổ khóa, chìa khóa (mô hình Fisher) TTHĐ Enzym có cấu tạo đònh cho phép chất có cấu tạo tương ứng kết hợp vào, chìa khóa tra vào ổ khóa  Không giải thích kiểu đặc hiệu nhóm Cơ chế Koshland (mô hình tiếp xúc cảm ứng)  TTHĐ Enzym hình thành trình tiếp xúc Enzym chất  Khi chưa có chất, nhóm chức TTHĐ chưa tư sẵn sàng hoạt động  Khi tiếp xúc với chất đó, cảm ứng không gian biến đổi hình dạng Enzym, nhóm chức đònh hướng thích hợp xác cấu trúc không gian TTHĐ thay đổi để gắn với chất, thực trình xúc tác  Giải thích thỏa đáng tính đặc hiệu nhóm Trung tâm dò lập thể (TTDLT) Ngoài TTHĐ làm chức xúc tác, trung tâm khác có nhiệm vụ điều chỉnh hoạt tính Enzym gọi trung tâm điều chỉnh hay trung tâm dò lập thể Đây cấu trúc riêng biệt, có tác dụng tương hỗ  TTDLT dương: kết hợp với chất dò lập thể làm tăng hoạt tính Enzym Enzym từ trạng thái không hoạt thành hoạt động  TTDLT âm: kết hợp với chất dò lập thể, Enzym giảm hay hoạt tính Phức hợp Enzym  Nhiều chu trình chuyển hóa thể sinh vật gồm nhiều phản ứng liên tiếp nhau, sản phẩm phản ứng lại chất phản ứng sau  Mỗi phản ứng Enzym xúc tác, chu trình có nhiều loại Enzym hoạt động  Các Enzym hoạt động riêng lẻ, kết hợp với thành phức hợp Enzym  Phức hợp Enzym tổ hợp nhiều Enzym xúc tác cho trình sinh hóa Tiền Enzym (Proenzym, zimogen) Phần lớn Enzym tổng hợp thể thành phân tử Enzym có sẵn hoạt tính sinh học Có Enzym tổng hợp dạng trung gian chưa có hoạt tính xúc tác gọi tiền Enzym (zimogen hay proenzym) Đa số Enzym cấu tử, Enzym hệ tiêu hóa thường tồn trạng thái chưa hoạt động (Pepsinogen bao tử, Trypsinogen thành ruột, Protrombin gây đông tụ máu) Cơ chế chuyển zimogen thành Enzym hoạt động: Tác nhân hoạt hóa tiền Enzym thường Enzym khác, pH 3 Tên gọi Enzym Tên thông dụng  Tên gọi quen dùng, thường tên người tìm tùy tiện theo ý tác giả, không theo quy ước không nói lên kiểu phản ứng  Pepsin, trypsin, catalase, amilase, rennin, bromelin, papain, … Tên hệ thống  Được Hội nghò Sinh Hóa Quốc tế lần thứ (1961) qui đònh: Tên chất + tên phản ứng + ase (aza, az) Pyruvat decarboxylase - khử CO2 acid pyruvic Glucophosphat isomerase - chuyển đồng phân gốc phosphate dẫn xuất glucose  Nếu phản ứng bao gồm hai chuyển hóa tương hỗ người ta thêm vào sau phần thứ hai tên gọi dấu ngoặc COOH COOH H2N CH + O2 L-acidamin oxydoreductaza (deamin) R L-acid amin  Mỗi Enzym có mã số C O + NH3 + R E C X X X X (1) (2) (3) (4) chữ X số (1): nhóm (lớp) (2): nhóm phụ (phân lớp) (3): phân nhóm phụ (tổ) (4): tên Enzym, thứ tự E phân nhóm phụ I : oxihóa khử oxydoreductase II : chuyển hóa dạng đồng phân, isomerase (EC.2.7.7.16 - ribonuclease) III : phản ứng thủy phân, hydrolase (EC 3.1.1.3 - thủy phân chất béo) IV : phân cắt tạo nối đôi, liase V : trình chuyển nhóm chức, transferase VI : tổng hợp từ chất đơn giản, ligase (synthetase) H2O II VAI TRÒ XÚC TÁC CỦA ENZYM Cơ chế tác dụng Enzym GĐ 1: tạo phức ES Xảy nhanh chóng cần lượng hoạt hóa thấp Phức ES không bền, tồn thời gian ngắn GĐ 2: hoạt hóa chất S Khi tạo thành phức ES, phân tử chất có chuyển hóa: phân bố lại nội có chuyển vò electron, phá vỡ liên kết đồng hóa trò, hình thành liên kết phân tử chất, làm chất bò kích thích sẵn sàng chuyển hóa tạo sản phẩm Mức lượng hoạt hóa giai đoạn không cao GĐ 3: tạo sản phẩm protein Cơ chất sau hoạt hóa biến đổi chất để hình thành chất phân ly khỏi Enzym tạo thành sản phẩm protein TD: xét phản ứng thủy phân Enzym thủy phân thường có trung tâm hoạt động AB + HOH AOH + BH Hydrolase So sánh với chất xúc tác hóa học Điều kiện phản ứng Xúc tác hóa học Xúc tác Enzym p suất cao, nhiệt độ cao, p suất thường, nhiệt độ thường, thời gian dài, nồng độ xúc thời gian ngắn, nồng độ xúc tác tác cao, hiệu suất thấp nhỏ, hiệu suất triệt để acid đặc, nhiệt độ cao, áp suất, thiết bò hiệu suất thấp Cellulose Glucose E cellulase Vài giờ, điều kiện bình thường (bao tử bò nhai lại) Hiệu lượng Cao Saccharose Thấp Q = 32.000 cal/mol Fructose + Glucose Acid, Q = 25.000 cal/mol E invertase, Q = 9.400 cal/mol Mạnh Cường Yếu mol Fe3+ xúc tác phân ly 10-6 mol/phút độ 2H2O2 2H2O + O2 phản ứng phân tử catalase có nguyên tử Fe phân ly 5.10 mol/phút Vận tốc phản ứng Chậm Tính đặc hiệu chất xúc tác xúc Có khả chọn lọc chất tác cho nhiều phản ứng cao Một Enzym xúc tác cho vài phản ứng hay phản ứng có khả tác dụng Thay đổi hoạt tính tác động giống nhau, thân yếu tố môi trường, t 0, pH, chúng hợp chất hóa yếu tố hóa học Có thể tách từ học, hợp chất thể sinh vật bảo toàn hoạt sinh học tính thể Hoạt tính xúc tác Tinh bột Nhanh Amylase, nhiệt độ thường, vài phút Acid, đun sôi vài III HOẠT TÍNH CỦA ENZYM Glucose Đònh nghóa  Hoạt tính Enzym khả chuyển hóa chất thành sản phẩm  Hoạt tính cao lượng sản phẩm tạo thành đơn vò thời gian nhiều, tốc độ phản ứng nhanh Xác đònh hoạt tính Enzym Phản ứng Enzym: E+S [ES] E+P [1] Xác đònh vận tốc chuyển hóa chất: lượng chất S đơn vò thời gian [2] Xác đònh vận tốc tạo thành sản phẩm: lượng sản phẩm tạo thành đơn vò thời gian [3] Xác đònh nồng độ thấp E để chuyển hóa hết lượng chất xác đònh Hoạt tính Enzym: Số đơn vò hoạt động đơn vò chế phẩm Enzym Đơn vò hoạt động Enzym (UI): Lượng Enzym tối thiểu cần thiết để chuyển hóa 1µmol chất sau phút điều kiện tiêu chuẩn (là điều kiện t 0, pH,…thích hợp để Enzym hoạt động) Hoạt tính riêng (hoạt độ riêng): Số đvò hoạt động đơn vò khối lượng hay thể tích chế phẩm Biểu thò độ tinh Enzym Hoạt độ riêng cao, chế phẩm Enzym tinh TD: Enzym papain vỏ đu đủ g vỏ đu đủ 30 UI/g 1g chế phẩm I (đã loại tạp chất lần I) 3000 UI/g 1g chế phẩm II (loại tạp chất lần II) Hoạt tính phân tử Số đơn vò hoạt động mol Enzym 300000 UI/g Đơn vò dùng số trường hợp đặc biệt Enzym tinh chế đến dạng tinh khiết xác đònh phân tử lượng TD: urease có M = 480000 Hoạt tính toàn phần Tổng số hoạt độ toàn chế phẩm Enzym, dùng để tính hiệu suất tinh chế TD: 1kg vỏ đu đủ 5g chế phẩm I 0.03g chế phẩm II 30 UI/g 3000 UI/g 300000 UI/g TA = 30000 đv TA = 15000 đv TA = 9000 đv Các yếu tố ảnh hưởng đến hoạt tính Enzym (tốc độ phản ứng E) Ảnh hưởng nồng độ Enzym Thừa chất S: vận tốc phản ứng tăng tuyến tính đến toàn Enzym tham gia phản ứng Nồng độ Enzym lớn: vận tốc phản ứng tăng đến hết chất S Ảnh hưởng nồng độ chất S Phương trình Michaelis – Menten: biểu diễn mối quan hệ vận tốc phản ứng nồng độ chất [S] E K+1 K-1 K+2 + K -1 [ES] K +2 E + P số tốc độ phản ứng tạo phức [ES] số tốc độ phản ứng phân ly phức [ES] ngược lại số tốc độ phản ứng phân ly phức thành sản phẩm v = Vmax Km S K +1 [S] Km + [S] Với Km = K-1 + K+2 K+1 số lực Enzym chất S Nếu có lúc nhiều Enzym tác động lên chất, Enzym có Km nhỏ Enzym tác động xúc tác chuyển hóa chất Ảnh hưởng nhiệt độ • Nhiệt độ tăng: vận tốc phản ứng tăng • Với đa số Enzym: T0opt = 40-600C (T0opt E.ĐV thường thấp E.TV) • Khi nhiệt độ tăng cao, có chất protein nên E bò biến tính hoạt tính xúc tác T0 = 700C E bắt đầu hoạt tính o T = 100 C E hoàn toàn hoạt tính • Enzym chòu t0 cao: papain T0opt = 800C, termamyl T0opt = 900C • Ứng dụng yếu tố nhiệt độ T0opt tốc độ phản ứng cao nhất, cần thu sản phẩm p.ứng T thấp bảo quản E, Vpư = 0, Enzym không biến tính T0 > 40, 50 vô hoạt Enzym, nhiệt độ trùng Ảnh hưởng pH pHopt pH mà tốc độ phản ứng xảy cực đại pH opt E dao động khoảng gọi vùng pHopt Đối với đa số Enzym, pHopt vùng acid yếu, kiềm yếu gần vùng trung tính Một số Enzym có pHopt vùng acid hay kiềm (Pepsin - pHopt = 2; Trypsin - pHopt = – 9) Vùng pH biến tính thuận nghòch: vùng pH mà hoạt tính E đi, đưa pHopt, hoạt tính E lại khôi phục Vùng pH bất thuận nghòch: vùng pH mà hoạt tính E khôi phục lại Phản ứng Enzym thuận nghòch pHopt(T) ≠ pHopt(N) CH3 HC OH COOH acid lactic CH3 pHopt=8 C O pHopt=6 COOH acid pyruvic Enzym lactat dehydrogenase (coenzym NAD NADH2) Tuỳ chất mà pHopt Enzym thay đổi Pepsin: S hemoglobin pHopt=1,8 / S casein pHopt=2,2 Ứùng dụng yếu tố pH  Tăng tốc độ phản ứng  Tách chiết Enzym, tinh Enzym  Vô hoạt Enzym thuận nghòch Ảnh hưởng chất kích thích (chất hoạt hóa) pHopt pH thuận nghòch pH bất  Chất có khả làm tăng thêm tốc độ phản ứng E, biến E từ trạng thái không hoạt động sang trạng thái hoạt động  Các chất hoạt hóa có chất khác nhau:  Coenzym (vit): có mặt chúng E có hoạt tính xúc tác  Ion kim loại: hoạt hóa trực tiếp tham gia vào thành phần trung tâm hoạt động cầu nối E S (Ca 2+cần để hoạt hóa E amylase, trypsin,… K +, Na+, Mg2+,Fe2+, Fe3+, Mo4+ chất hoạt hóa cho nhiều loại E, TTHĐ Ascorbat oxydase Cu) Ảnh hưởng chất kìm hãm (chất ức chế) Chất bổ sung vào phản ứng làm giảm tốc độ phản ứng E, vô hoạt Enzym, ký hiệu I (Inhibitor)  Kìm hãm thuận nghòch: có mặt chất kìm hãm I, hoạt động E yếu đi, loại bỏ I hoạt tính E trở lại cũ  Kìm hãm bất thuận nghòch: có mặt chất kìm hãm I, hoạt động E yếu đi, loại bỏ I, E không trở lại hoạt tính ban đầu  Kìm hãm cạnh tranh: I có cấu tạo hóa học gần giống cấu tạo hóa học chất, tranh giành kết hợp với TTHĐ E làm cho lượng chất S phản ứng với E bò giảm xuống, tốc độ phản ứng giảm Nồng độ I cao, vận tốc phản ứng giảm, cần tăng nồng độ chất S để loại bỏ tác dụng I COOH COOH CH2 CH2 CH2 COOH (I) acid malonic COOH E.Succinat dehydrogenase COOH acid succinic  Kìm hãm không cạnh tranh: CH CH COOH acid fumaric  Chất kìm hãm I có cấu tạo hóa học khác với cấu tạo hóa học chất  Không liên kết với E TTHĐ mà làm thay đổi cấu trúc không gian TTHĐ làm cho E không tác dụng với chất  Vận tốc phản ứng E lúc tùy thuộc vào nồng độ I mà cách khắc phục • • •  Thí dụ I không cạnh tranh Thuốc Sulphamid trò đau bụng tiêu chảy TTHĐ VSV đường ruột chứa p-aminobenzoic, sulphamid chỗ p.a.s làm E bò vô hoạt dẫn đến VSV chết Hợp chất CN kết hợp với Fe E citocromoxydase (E điều khiển hô hấp) làm vô hoạt E này, ta bò ngạt thở chết Cơ chất S sản phẩm P thừa chất kìm hãm không cạnh tranh ức chế hoạt động E IV TÍNH ĐẶC HIỆU CỦA ENZYM Đònh nghóa: Mỗi E xúc tác chuyển hóa hay số chất đònh theo kiểu phản ứng đònh, tùy vào cấu tạo TTHĐ Sự lựa chọn E gọi tính đặc hiệu E Đặc hiệu quang học  Mỗi E xúc tác với dạng đồng phân quang học Fumarat hydratase tác dụng lên dạng L-acid malic mà không tác dụng với D- Theo chiều ngược lại, tác dụng lên dạng trans-a fumaric mà không tác dụng với dạng cis COOH +H2O CH CH COOH acid fumaric (trans) -H2O COOH HO CH CH2 COOH L-acid Malic  Có E xúc tác cho phản ứng chuyển hóa qua lại dạng đồng phân quang học Lactat-transmerase xtác pứng chuyển D-a lactic thành L-a lactic Đặc hiệu kiểu phản ứng Mỗi E xúc tác cho kiểu phản ứng chuyển hóa đònh (E thủy phân, tổng hợp, chuyển vò, đồng phân hóa, oxy hóa khử, …) Đặc hiệu kiểu chất ∗ Đặc hiệu nhóm tương đối: Chỉ cần điều kiện – chất liên kết (bromelin, lipase) ∗ Đặc hiệu nhóm tương đối: Cần điều kiện – liên kết cấu tạo cấu tử tạo thành liên kết (aminopeptidase; carboxylpeptidase; tripsin/lkết peptid, R1=Arg, Lys; Chimotrypsin/ lkết peptid, R1=Phe, Tryp, Tyr; Pepsin/lkết peptid, R2=Phe, Leu) ∗ Đặc hiệu tuyệt đối: Cần điều kiện - liên kết cấu tạo cấu tử tạo thành liên kết (glucoxydase, ascorbat-oxydase, arginase, urease,…) Phân loại Enzym theo tính đặc hiệu Thể qua cách gọi tên hệ thống ký hiệu nhóm [1] Oxydoreductase (E xúc tác phản ứng oxy hóa khử) Tên chất cho H+: tên chất nhận H+ + oxydoreductase [2] Transferase: (E xúc tác phản ứng chuyển vò) ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ ∗ Tên nhóm chuyển vò + transferase Acyltransferase: chuyển vò nhóm acyl qua CoA Glucotransferase: chuyển vò nhóm đường (pentose, hexose) Aminotransferase: chuyển vò nhóm NH2 (amin) Phosphotransferase: chuyển vò gốc P Metyltransferase: chuyển vò gốc –CH3 Carboxyltransferase: chuyển vò gốc –CO2 [3] Hydrolase: (E xúc tác phản ứng thủy phân) ∗ Peptihydrolase: thủy phân liên kết peptid ∗ Esterase: xúc tác phản ứng thủy phân liên kết ester (lipase, phosphatase, lecithinase,…) ∗ Glucosidase: thủy phân liên kết ester gốc đường [4] Liase: (E xúc tác phản ứng phân cắt H2O) Tên chất + tên nhóm bò cắt + Liase ∗ Decarboxylase: cắt CO2 ∗ Hydratase: loại bỏ kết hợp H2O [5] Isomerase: (E xúc tác phản ứng đồng phân hóa)  Glucophosphatisomerase [6] Ligase /synthetase: (E xúc tác phản ứng tổng hợp)  Asparagin synthetase: tổng hợp asparagin  Glutamin synthetase: tổng hợp glutamin VI ỨNG DỤNG CỦA ENZYM (trong công nghệ thực phẩm) Phản ứng thủy phân Phản ứng thủy phân vừa có nhiều ứng dụng việc chế biến sản phẩm thực phẩm vừa nguyên nhân gây hư hỏng thực phẩm Đặc điểm phản ứng thủy phân ∗ Cơ chất: protein, glucid, lipid,… ∗ Enzym: Enzym cấu tử, có nhiều trung tâm hoạt động, cấu trúc bậc 4, số monomer chẵn Một số Enzym thủy phân [1] Protease: thủy phân protein thành peptid acid amin + Enzym phân cắt từ mạch: endopeptidase: pepsin, T, … + Enzym phân cắt từ đầu mạch: exopeptidase, carboxylpeptidase Các loại + + + • • • • • • • • • • protease Enzym Enzym Enzym có nhiều ứng dụng: Rennin = chimotrypsin (trong dày) Bromelin (trong dứa) Papain (trong vỏ đu đủ) Tương: dung dòch acid amin từ protein đậu nành Nước mắm: dung dòch acid amin từ protein cá Làm mềm thòt: hỗn hợp papain bromelin protease VSV Trong công nghệ thuộc da: làm mềm da, lông, bóng da Trong công nghệ tơ tằm: phá bỏ protein cericin để tách sơò tơ làm tơ bóng Trong công nghệ mỹ phẩm: lượng nhỏ protease làm da tóc mềm mại, tẩy bỏ dễ dàng lớp tế bào già Xà giặt chứa protease dễ dàng tẩy vết bẩn khó giặt máu, sữa vải Công nghệ sữa: protease rennin dùng để làm phomai Trong y học: protease dùng để sản xuất môi trường dinh dưỡng nuôi vi sinh vật, sản xuất huyết miễn dòch Trong công nghệ làm bánh: protease đưa vào để thủy phân phần protein bột mì, tạo acid amin để tham gia phản ứng melanoidin tạo hương vò, lớp vỏ nâu dòn cho sản phẩm bánh nướng [2] Amilase: Có dạng α , β γ amilase CH OH CH 2OH O H H H OH OH H H OH CH 2OH O O H H H H O OH H H OH O OH H H OH OH liên kết 1,4-glucozit CH 2OH AM AP = CH 2OH O H H OH OH H H OH O H AM : Amilo H O OH H H OH CH 2OH CH2 O H OH H H OH AP: Amilo pectin CH 2OH O H H OH liê n kết 1,6-glucozit O O H H H H O OH H H OH O OH H H OH O liên kết 1,4-glucozit α-amilase (3.2.1.1): endoglucozidase • Có nước bọt, hạt nảy mầm, tụy tạng, nấm mốc, vi khuẩn • Bền nhiệt: t0 > 700C, bền với acid • Cắt liên kết trừ liên kết kế bên gốc khử 1,4-glucoside, không cắt liên kết 1,6-glucoside • Sản phẩm thủy phân: glucose, alpha dextrin (mạch ngắn) • Làm độ nhớt dòch hồ giảm nhanh nên gọi E dòch hóa β-amylase (3.2.1.2) : exoglucozidase • Có thực vật (hạt,củ) • T0opt thấp = 50 – 600C, t0=700C hoạt tính, bền acid • Cắt đứt liên kết 1,4-glucoside từ đầu không khử gốc, phân giải 40-50% tinh bột, gọi E đường hóa • Sản phẩm thủy phân: maltose, beta dextrin (mạch dài) γ-amylase (3.2.1.3): glucoamylase • Có vi sinh vật, gan động vật • pHopt = 3.5-5.5 , t0= 60-700C • Thủy phân gốc glucose, thủy phân liên kết 1,4 1,6-glucoside • Sản phẩm thủy phân: glucose Ứng dụng E.amylase • Trong công nghệ sản xuất rượu bia dùng để đường hóa tinh bột, thường ta dùng malt, malt vừa có amilase vừa có tinh bột, bia từ malt ngon • Sản xuất mạch nha, đường glucose từ tinh bột • Làm cơm rượu , bánh mì, mạch AM AP bò cắt phần bánh bung, nở xốp hơn, cắt nhiều bò xẹp bánh • Trong công nghệ dệt, amilase dùng để tẩy lớp hồ vải, làm cho vải mềm hơn, dễ tẩy trắng, dễ bắt màu nhuộm Người ta dùng amilase để wash vải jean thay cho lực học [3] Pectinase Pectin dòch trái làm cho độ nhớt dòch tăng lên, sản xuất dòch ép bò hiệu suất thu hồi thấp E pectinesterase COOCH COOH O OH H H OH H H OH H O H O H COOCH O O OH H H OH O H H OH H H OH O H OH H H OH E polygalacturonase E pectinase = E pectinesterase + E polygalacturonase thủy phân pectin làm độ nhớt dòch giảm rõ rệt (ƯD công nghệ chế biến nước [4] Cellulase Thủy phân cellulose tạo sản phẩm đường, bổ sung vào SP thực phẩm người động vật giúp thức ăn dễ tiêu hóa Phá hủy màng tế bào thực vật, làm tăng hiệu suất trích ly chất bên tế bào Thủy phân phế liệu gỗ làm thức ăn gia súc Cellulase có bao tử ĐV nhai lại, thu nhận từ canh trường nấm mốc Asp Oryzae, Asp Awamori, … Phản ứng oxy hóa khử Sử dụng E oxy hóa khử để tạo màu sắc, hương vò đặc trưng cho sản phẩm  Sản xuất trà (tannin - xanh, vàng, đỏ, đen)  Sản xuất chocolate từ cacao (polyphenol, phản ứng Maillard)  Sản xuất thuốc (nicotin  Sản xuất rượu, bia, giấm, acid hữu cơ,… Các loại E oxy hóa khử  E Ascorbatoxydase (oxy hóa vitamin C)  E Polyphenoloxydase (oxy hóa polyphenol)  Glucooxydase (oxy hóa glucose, loại oxy SP giàu protein) VI THU NHẬN ENZYM Nguyên liệu: Tế bào động vật, thực vật vi sinh vật (n.mốc, VK) Quá trình: Nuôi cấy lấy sinh khối hay canh trường Tách E khỏi nguyên liệu (phá vỡ vỏ tế bào, trích ly) Tinh E (dùng muối bão hòa, tinh phương pháp màng membrane, sắc ký cột, sắc ký điện di,…) Bảo quản E (điều kiện lạnh, kín) Cố đònh Enzym: Hấp phụ lên chất mang có phân tử lượng lớn Gắn mạng gel Gắn liên kết đồng hóa trò Encapsul hóa VII XÁC ĐỊNH HOẠT TÍNH ENZYM Xác đònh hoạt tính amilase theo wohlgemuth Nguyên tắc − Phương pháp Wohlgemuth dựa vào việc tìm nồng độ Enzym thấp để thủy phân tinh bột đến sản phẩm không màu với Iod − Đơn vò Wohlgemuth lượng Enzym cần thiết để thủy phân 1mg tinh bột sau 30 phút 37oC có Cl- làm chất hoạt hóa Tiến hành khảo sát hoạt tính amilase − Chuẩn bò dãy 10 ống nghiệm với nồng độ E giảm dần (giảm lần ống sau) có chất hoạt hóa NaCl lượng chất tinh bột 10 ống o − Tiến hành phản ứng E tủ điều nhiệt 37 C Sau 30 phút lấy ra, thêm vào ống nghiệm 1ml H 2SO4 10% (để chấm dứt hoạt tính Enzym) giọt I2/KI, lắc − Ghi nhận ống nghiệm có nồng độ enzym nhỏ xảy thủy phân hoàn toàn tinh bột, tức ống màu vàng, sau ống có màu đỏ tím (chưa thủy phân hoàn toàn) Tính kết m ×V V2 V1 – Thể tích dòch chiết E cho vào ống nghiệm V2 – Thề tích dòch chiết E, mL m – Lượng mẫu cân vật phẩm chứa Enzym [mg] Lượng Enzym cho vào ống nghiệm đầu tiên: − Một đơn vò Wohlgemuth (W) : W= n= n F ×5 F – độ pha loãng ống nghiệm có nồng độ E nhỏ thủy phân hoàn toàn tinh bột (ống nghiệm có màu vàng) − Số đơn vò Wohlgemuth 1mL dòch chiết E (Nw) : Nw = n V ×W Khảo sát hoạt tính protease bromelin Nguyên tắc Tiến hành phản ứng thủy phân chất protein (hemoglobin, casein, albumin,…) E Bromelin Xác đònh lượng sản phẩm acid amin tạo thành từ phản ứng thông qua lượng Tyrosin tạo thành Do peptid sản phẩm thủy phân có chứa Tyr Đònh lượng Tyr tạo thành cách so sánh lượng Tyr với lượng Tyr chuẩn, biết trước nồng độ Dùng thuốc thử Folin, so màu máy quang phổ so màu Tính kết − Hoạt tính enzym Bromelin biểu thò số µg tyrosin sinh thủy phân Hb (Alb) enzym có 1mL dung dòch hay 1mg hỗn hợp chứa Bromelin phút − Công thức tính hoạt tính Bromelin 450 × ∆ODm x1 × × [UI / ml ] ∆ODt 10 x x1 – số ml dung dòch tysosin chuẩn x2 – số ml dung dòch chứa enzym ∆ODm = ODm – ODk ∆ODt = ODt – ODk ODm – độ hấp thu ống mẫu ODt – độ hấp thu ống tyrosin chuẩn ODk – độ hấp thu ống không