Bài giảng công nghệ protein – enzyme chương 3

Bài giảng công nghệ protein – enzyme chương 3

Các phương pháp tinh protein - enzym Loại tạp chất Trong dịch chiết thơ thu ngồi protein enzyme cịn có protein tạp, chất cao phân tử khác polysaccharid, acid nucleic chất phân tử nhỏ đường monose, chất lipid, muối khoáng v.v Để loại bỏ chúng phải sử dụng phối hợp nhiều biện pháp khác Loại tạp chất Để loại bỏ muối khoáng loại đường tạp chất có phân tử lượng thấp người ta thường dùng phương pháp thẩm tích (dialysis) đối nước hay đối dung dịch đệm loãng cách lọc qua gel sephadex Loại tạp chất Để loại bỏ protein tạp tạp chất có phân tử lượng cao khác, người ta hay dùng kết hợp nhiều biện pháp khác nhau: phương pháp biến tính chọn lọc nhờ tác dụng nhiệt độ pH môi trường, phương pháp kết tủa phân đoạn muối trung tính dung mơi hữu cơ, phương pháp sắc ký trao đổi ion, điện di, phương pháp lọc gel Các kỹ thuật thông thường tinh protein Ly tâm Một kỹ thuật thiếu việc tách chiết tinh chế protein ly tâm Máy ly tâm sử dụng để tách phần khác khỏi dung dịch Người ta gọi pha lỏng chất lỏng bên kết tủa, pha rắn mà thường lắng kết xuống đáy ống ly tâm gọi kết tủa Thực chất, ly tâm tăng tốc độ kết tủa tiểu phần rắn nhờ lực ly tâm Sự sai khác tỷ trọng nguyên liệu lơ lững so với chất lỏng lớn tốc độ kết tủa cao Mặc dầu người ta coi số vòng quay phút đơn vị thông thường lực ly tâm, quy ước không thỏa mãn Ly tâm Có nguyên tắc để làm việc an toàn với máy ly tâm người thao tác nguyên liệu xử lý mà lúc thí nghiệm cần ý tuân thủ Đó nguyên tắc cân đối xứng ly tâm thăng máy ly tâm đặt máy làm việc Ly tâm Do tính chất khơng bền với nhiệt phần lớn protein enzyme, tách chiết tinh chế chúng, cần sử dụng máy ly tâm lạnh Trong trường hợp điều kiện thí nghiệm có hạn chế, sử dụng số phương cách nhằm đảm bảo trì mẫu nhiệt độ thấp Cần làm lạnh tốt mẫu ống ly tâm trước ly tâm Nếu máy có ổ đệm thay làm lạnh chúng tủ lạnh trước ly tâm Cần phải tiến hành ly tâm với thời gian tối thiểu để tránh nóng máy Có thể đặt trực tiếp máy ly tâm bé vào tủ lạnh, đưa dây dẫn qua lớp đệm cánh cửa tủ lạnh Thẩm tích Thẩm tích khuếch tán vi phân qua màng vốn không thấm chất keo hòa tan (protein, số polysaccharid) thấm dạng dịch tinh thể.Các tinh thể (các muối, hợp chất hữu có trọng lượng phân tử thấp ) khuếch tán qua màng theo định luật Fick Nước khuếch tán từ dung dịch có nồng độ thấp (thường dung dịch rửa) vào dung dịch keo, ion (cation anion) chất phân tử nhỏ chuyển vào dung dịch có nồng độ thấp (thường chuyển vào dung dịch rửa) Thẩm tích Trong q trình tách chiết tinh protein, để loại muối ammonium sulphate khỏi dung dịch protein cho dung dịch protein vào túi đặc hiệu làm nguyên liệu bán thấm Thông thường người ta hay dùng túi colodion cellophane (loại sau hay dùng hơn) Sau đặt túi vào bình chứa lượng lớn nước lượng lớn dung dịch đệm pha lỗng (ví dụ đệm phosphate có pH = 7, nồng độ 0,01M) Vì màng cellophane màng bán thấm, có kích thước lỗ cho chất có phân tử qua vào dung dịch đệm loãng theo định luật khuếch tán Như vậy, muối khuyến tán vào nước dung dịch đêm loãng (di chuyển theo hướng giảm nồng độ), cịn nước đệm lỗng di chuyển từ dung dịch rửa vào túi chứa protein Thẩm tích Protein đại phân tử khơng thể vượt qua túi thẩm tích giử lại túi Bằng cách thay đổi thường xuyên dung dịch rửa tẩy muối khỏi protein , q trình thẩm tích, dung dịch pha lỗng Có thể làm giảm bớt loại trừ pha loãng tiến hành thẩm tích áp suất, có nghĩa dung dịch xử lý nằm áp suất thủy tĩnh đầy đủ, để dòng thủy động học nước từ dung dịch cân khuếch tán phân tử vào dung dịch Phương pháp thường địi hỏi có thiết bị đặc biệt Thẩm tích 10 Phương pháp dùng chất hấp phụ đặc hiệu sinh học phương pháp sắc ký lực (affinity Chromatography) Chất mang (pha tĩnh) - Hồn tồn khơng hịa tan pha di động - Có độ bền hóa học sinh học - Có độ cứng học, có tính háo nước tính thấm -Khơng có tương tác phi đặc hiệu Có chứa nhiều nhóm chức có khả biến đổi hoạt hóa điều kiện nhẹ nhàng Các chất mang thường dẫn xuất cellulose, dextran gel, thủy tinh xốp Tuy nhiên, người ta hay dùng agarose gel hỗn hợp agarose polyacrylamide chúng có thêm khả lọc gel 32 Phương pháp dùng chất hấp phụ đặc hiệu sinh học phương pháp sắc ký lực (affinity Chromatography) Protein quan tâm Phối tử Phối tử gắn với hạt polymer Các protein không mong muốn rửa trôi qua cột Các protein quan tâm dung ly cách hòa tan phối tử Sơ đồ sắc ký lực 33 Sắc ký tương tác kỵ nước Sắc ký tương tác kỵ nước sử dụng tính chất kỵ nước protein bề mặt đặc điểm để chọn lọc Loại phân tách thích hợp tiến hành bước kết tủa ammonium sulphate, không cần thiết phải loại bỏ muối trước thực bước sắc ký Bằng cách dùng kỹ thuật hấp phụ khử hấp phụ bề mặt làm giảm mạnh thể tích dung dịch protein lượng protein cần tinh tăng lên từ 90-95% Chất lượng đủ cho hầu hết ứng dụng protein đặc biệt 34 Sắc ký tương tác kỵ nước Các protein phân tách tùy theo tương tác chúng với chất mang có chứa nhóm kỵ nước (ưa béo) Các protein chứa nhóm kỵ nước bề mặt, chất mang kỵ nước dung môi ưa nước tạo thành hệ ba thành phần tương tác với Hệ bị rối loạn thay đổi nhiệt độ, pH lực ion 35 Sắc ký tương tác kỵ nước Nói chung, tương tác mạnh ta tăng lực ion (ví dụ: dung dịch NaCl M) Các protein bị giữ lại, tiếp rửa giải cách chọn lọc cách giảm lực ion cách giảm độ phân cực dung môi rửa (thêm ethylene glycol chất tẩy rửa tăng pH dịch rửa) Có thể gắn nhóm khác lên chất mang Ví dụ octylsepharose (R) CL-4B phenylsepharose CL-4b, nhóm octyl phenyl đính lên đơn vị monosaccharide agarose liên kết ester khơng tích điện bền hóa học Ở chất mang khác sử dụng nhóm kỵ 36 nước khác Các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu suất cao (high performance liquid chromatographic techniques)-HPLC Còn gọi sắc ký lỏng cao áp (high pressure) hay sắc ký lỏng giá thành cao (high price) Đây phương pháp phân tách chất cách dùng áp suất để đẩy nhanh dung dịch qua cột sắc ký với hiệu suất cao Đầu tiên, kỹ thuật thiết kế để phân tách phân tử hữu nhỏ hòa tan dung mơi khơng phải nước, sau kỹ thuật nhanh chóng phát triển thành phương thức thích hợp để phân tách protein dung môi nước Tuy nhiên, đa số ứng dụng công bố với kỹ thuật sắc ký giới hạn quy mơ phịng thí nghiệm 37 Các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu suất cao (high performance liquid chromatographic techniques)-HPLC HPLC sử dụng loại cột chứa hạt nhỏ đồng nhất, có tác dụng cải thiện ổn định vật lý hóa học phân tách nhanh gel mềm truyền thống Cột sắc ký chứa vật liệu đệm kín có độ phân giải cao (8, 15 40 µm) cho phép sản xuất phân đoạn cô đặc Các hạt nhỏ có sức bền cao dịng chảy chất lỏng để thiết bị thiết kế hoạt động áp suất tương đối cao Dung môi phân phối vào cột bơm với dịng khơng có xung, không thay đổi áp suất ngược cao Cột có khả chịu đựng tăng áp suất Đầu dị (detector) có thời gian phản ứng nhanh đỉnh protein trải qua vài giây Ưu điểm hệ thống HPLC có thời gian chạy nhanh nhiều so với phương pháp sắc ký khác nhược điểm hệ thống đắt tiền nên khó áp dụng quy 38 mô lớn Các kỹ thuật sắc ký lỏng hiệu suất cao (high performance liquid chromatographic techniques)-HPLC Hệ thống HPLC 39 Siêu lọc Siêu lọc trở thành kỹ thuật tiêu chuẩn phịng thí nghiệm để đặc dung dịch protein điều kiện ôn hòa Phương pháp sử dụng trường hợp thẩm tách lọc gel để khử muối trao đổi đệm Bằng cách dùng chất kết tủa lực để tăng khối lượng phân tử protein mong muốn, phương pháp dùng kỹ thuật tinh 40 Siêu lọc Hệ siêu lọc thường sử dụng màng lọc có bề mặt nhẵn màng lọc hệ sợi rỗng Các sợi có đặc điểm tương tự với bề mặt nhẵn, q trình quy mơ lớn tạo diện tích bề mặt lớn thể tích cho Ở trường hợp hoạt động quy mơ pilot, hệ siêu lọc thích hợp với diện tích màng lên tới 6,4 m2, cho tốc độ siêu lọc lên tới 200 L/giờ, tùy thuộc vào nồng độ protein Các hệ lớn thích hợp với tốc độ siêu lọc hàng trăm lít/giờ Sử dụng phương pháp ứng dụng cho hầu hết quy mô hoạt động 41 Kết tinh protein Đây phương pháp đặc hiệu tốt để tách phần protein enzyme giai đoạn tinh chế cuối Khi protein enzyme làm tinh khiết hoàn toàn, trường hợp riêng biệt, người ta tiến hành kết tinh chúng Một điều cần ý protein enzyme trạng thái tinh thể chưa thể coi tinh khiết Các tinh thể protein enzyme kết tinh lần đầu đơi có độ khơng vượt q 50% chứa protein enzyme khác Người ta thường tiến hành kết tinh protein enzyme dung dịch (NH4)2SO4 42 Kết tinh protein Quá trình kết tinh tiến hành từ từ kéo dài vài ngày chí hàng tuần muốn nhận tinh thể tốt Thông thường thêm muối (NH4)2SO4 vào dung dịch protein enzyme đậm đặc làm đục nhẹ nhàng dung dịch Sau đặt dung dịch vào nơi, đồng thời tăng từ từ nồng độ muối dung dịch Có thể tiến hành tăng nồng độ muối theo nhiều cách, thêm dung dịch muối đậm đặc vào dung dịch protein enzyme theo giọt, thêm muối qua màng bán thấm cho bay chậm chạp dung dịch protein enzyme Trong q trình kết tinh thay đổi số pH nhiệt độ Để kết tinh protein enzyme dễ dàng, giai đoạn trước đó, người ta thường tách phần protein enzyme dung mơi hữu Điều có lẽ liên quan đến việc chất bản, chất lipid bị loại khỏi dung dịch protein enzyme tạo điều kiện tốt cho trình kết tinh 43 Làm khơ bảo quản chế phẩm protein Tính cố định cấu trúc protein bảo đảm nhờ khả liên kết nước chúng Nếu dung dịch protein enzyme bị khơ độ nhiệt phịng đa số protein enzyme bị biến tính Protein enzyme giữ dang khô trường hợp việc sấy khô tiến hành vô nhanh nhiệt độ thấp Nhiều protein biết, độ nhiệt thấp kết tủa rượu acetone Nếu kết tủa thu cách đem xử lý rượu tuyệt đối, acetone ether sau làm khơ thật nhanh protein khơng bị biến tính Ở dạng khơ, bột protein giữ thời gian lâu, hịa tan nước thể tính chất ban đầu 44 Làm khơ bảo quản chế phẩm protein Tuy nhiên, nhiều protein không chịu cách xử lý Vì vậy, người ta sử dụng phương pháp làm đông khô phương pháp làm khơ protein thận trọng nhất, phương pháp sử dụng cho hầu hết protein 45 Làm khô bảo quản chế phẩm protein Dung dịch protein thẩm tích làm đóng băng làm thăng hoa băng áp suất 0,01-0,001 mm thuỷ ngân (được tạo nhờ máy hút chân không mạnh) Nơi nước tạo đóng băng bầu dự trữ độ nhiệt thấp (-70, -80oC) Sau vài cịn lại bột protein Sau bột (trong chân khơng) giữ độ nhiệt cao Protein làm đông khô cách hoà tan nước cất cho dung dịch protein (nguyên thể) sau vài năm Người ta bảo quản huyết máu phương pháp thế, huyết khơ sử dụng mục đích truyền máu 46 ... Các tinh thể protein enzyme kết tinh lần đầu đơi có độ khơng vượt q 50% chứa protein enzyme khác Người ta thường tiến hành kết tinh protein enzyme dung dịch (NH4)2SO4 42 Kết tinh protein Q trình... protein Tính cố định cấu trúc protein bảo đảm nhờ khả liên kết nước chúng Nếu dung dịch protein enzyme bị khô độ nhiệt phịng đa số protein enzyme bị biến tính Protein enzyme giữ dang khơ trường... hình dạng phân tử lượng protein enzyme có hỗn hợp để tách chúng Để đảm bảo cho việc tách protein enzyme tốt, chất rây phân tử phải chất trơ, không phản ứng với protein enzyme Chất khơng hịa tan