bài giảng công nghệ protein enzyme chương 10 định lượng và đánh giá độ tinh sạch của chế phẩm protein

1 1 Đ Đ ị ị nh lư nh lư ợ ợ ng v ng v à à đ đ á á nh gi nh gi á á đ đ ộ ộ tinh tinh s s ạ ạ ch c ch c ủ ủ a ch a ch ế ế ph ph ẩ ẩ m protein m protein 2 2 C C á á c phương ph c phương ph á á p x p x á á c đ c đ ị ị nh nh h h à à m lư m lư ợ ợ ng protein ng protein Protein sau khi đã đư Protein sau khi đã đư ợ ợ c t c t á á ch chi ch chi ế ế t v t v à à l l à à m s m s ạ ạ ch c ch c ó ó th th ể ể đ đ ị ị nh lư nh lư ợ ợ ng đư ng đư ợ ợ c. N c. N ế ế u protein nghiên c u protein nghiên c ứ ứ u l u l à à enzyme th enzyme th ì ì vi vi ệ ệ c đ c đ ị ị nh lư nh lư ợ ợ ng thông qua x ng thông qua x á á c đ c đ ị ị nh nh ho ho ạ ạ t đ t đ ộ ộ c c ủ ủ a enzyme a enzyme (theo (theo quy ư quy ư ớ ớ c qu c qu ố ố c t c t ế ế : : 1 1 đơn v đơn v ị ị ho ho ạ ạ t đ t đ ộ ộ enzyme l enzyme l à à lư lư ợ ợ ng enzyme l ng enzyme l à à m chuy m chuy ể ể n ho n ho á á 1 1 mol cơ ch mol cơ ch ấ ấ t t trong 1 ph trong 1 ph ú ú t t ở ở c c á á c đi c đi ề ề u ki u ki ệ ệ n tiêu chu n tiêu chu ẩ ẩ n n ). ). 3 3 C C á á c phương ph c phương ph á á p x p x á á c đ c đ ị ị nh nh h h à à m lư m lư ợ ợ ng protein ng protein Như v Như v ậ ậ y c y c ứ ứ sau c sau c á á c bư c bư ớ ớ c t c t á á ch chi ch chi ế ế t v t v à à l l à à m s m s ạ ạ ch ch protein ngư protein ngư ờ ờ i ta th i ta th ấ ấ y t y t ổ ổ ng lư ng lư ợ ợ ng protein gi ng protein gi ả ả m m nhưng ho nhưng ho ạ ạ t đ t đ ộ ộ enzyme tăng ngh enzyme tăng ngh ĩ ĩ a l a l à à ho ho ạ ạ t đ t đ ộ ộ riêng riêng tăng r tăng r ấ ấ t cao. t cao. Protein đư Protein đư ợ ợ c coi l c coi l à à s s ạ ạ ch n ch n ế ế u nh u nh ữ ữ ng bư ng bư ớ ớ c t c t á á ch chi ch chi ế ế t t v v à à l l à à m s m s ạ ạ ch sau ch sau không l không l à à m tăng m tăng ho ho ạ ạ t đ t đ ộ ộ riêng c riêng c ủ ủ a a ch ch ú ú ng n ng n ữ ữ a, v a, v à à ch ch ỉ ỉ khi đ khi đ ó ó ta m ta m ớ ớ i ho i ho à à n th n th à à nh vi nh vi ệ ệ c c t t á á ch chi ch chi ế ế t v t v à à l l à à m s m s ạ ạ ch protein ch protein 4 4 C C á á c phương ph c phương ph á á p x p x á á c đ c đ ị ị nh nh h h à à m lư m lư ợ ợ ng protein ng protein   N N ế ế u protein không ph u protein không ph ả ả i l i l à à enzyme th enzyme th ì ì ta c ta c ó ó th th ể ể đ đ ị ị nh nh lư lư ợ ợ ng ch ng ch ú ú ng b ng b ằ ằ ng c ng c á á c phương ph c phương ph á á p kh p kh á á c. c.   N N ế ế u protein ta nghiên c u protein ta nghiên c ứ ứ u l u l à à hormon ho hormon ho ặ ặ c c c c á á c đ c đ ộ ộ c t c t ố ố th th ì ì ch ch ú ú ng đư ng đư ợ ợ c x c x á á c đ c đ ị ị nh qua hi nh qua hi ệ ệ u u ứ ứ ng sinh h ng sinh h ọ ọ c m c m à à ch ch ú ú ng gây ra; v ng gây ra; v í í d d ụ ụ như hormon sinh trư như hormon sinh trư ở ở ng (growth ng (growth hormone) s hormone) s ẽ ẽ k k í í ch th ch th í í ch s ch s ự ự sinh trư sinh trư ở ở ng c ng c ủ ủ a c a c á á c t c t ế ế b b à à o o đ đ í í ch nuôi c ch nuôi c ấ ấ y. y.   N N ế ế u l u l à à protein v protein v ậ ậ n chuy n chuy ể ể n th n th ì ì c c ó ó th th ể ể x x á á c đ c đ ị ị nh ch nh ch ú ú ng ng thông qua n thông qua n ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ ch ch ấ ấ t m t m à à ch ch ú ú ng v ng v ậ ậ n chuy n chuy ể ể n n 5 5 Đ Đ ị ị nh lư nh lư ợ ợ ng nitrogen theo ng nitrogen theo phương ph phương ph á á p Kjeldahl p Kjeldahl   Ph Ph ầ ầ n l n l ớ ớ n c n c á á c phương ph c phương ph á á p gi p gi á á n ti n ti ế ế p x p x á á c đ c đ ị ị nh protein nh protein đ đ ề ề u d u d ự ự a trên cơ s a trên cơ s ở ở x x á á c đ c đ ị ị nh lư nh lư ợ ợ ng nitrogen. ng nitrogen.   Lư Lư ợ ợ ng nitrogen c ng nitrogen c ó ó trong c trong c á á c protein l c protein l à à g g ầ ầ n gi n gi ố ố ng ng nhau không ph nhau không ph ụ ụ thu thu ộ ộ c v c v à à o ch o ch ấ ấ t lư t lư ợ ợ ng v ng v à à ngu ngu ồ ồ n n protein. protein. Đương nhiên trên cơ s Đương nhiên trên cơ s ở ở lư lư ợ ợ ng nitrogen c ng nitrogen c ó ó th th ể ể x x á á c đ c đ ị ị nh ch nh ch ỉ ỉ c c á á c protein đã đư c protein đã đư ợ ợ c tinh s c tinh s ạ ạ ch ho ch ho ặ ặ c lư c lư ợ ợ ng ng protein c protein c ủ ủ a c a c á á c m c m ẫ ẫ u nghiên c u nghiên c ứ ứ u m u m à à ngo ngo à à i protein ra i protein ra không ch không ch ứ ứ a nh a nh ữ ữ ng ch ng ch ấ ấ t ch t ch ứ ứ a nitrogen kh a nitrogen kh á á c. c. 6 6 Đ Đ ị ị nh lư nh lư ợ ợ ng nitrogen theo ng nitrogen theo phương ph phương ph á á p Kjeldahl p Kjeldahl Trong nông nghi Trong nông nghi ệ ệ p v p v à à công nghi công nghi ệ ệ p th p th ự ự c ph c ph ẩ ẩ m, m, protein thô đư protein thô đư ợ ợ c đ c đ ị ị nh lư nh lư ợ ợ ng b ng b ằ ằ ng c ng c á á ch x ch x á á c c đ đ ị ị nh lư nh lư ợ ợ ng nitrogen to ng nitrogen to à à n ph n ph ầ ầ n v n v à à k k ế ế t qu t qu ả ả nhân nhân v v ớ ớ i i 6,25 6,25 , , ngh ngh ĩ ĩ a l a l à à coi protein luôn luôn ch coi protein luôn luôn ch ứ ứ a a 16% nitrgen. 16% nitrgen. 7 7 Đ Đ ị ị nh lư nh lư ợ ợ ng nitrogen theo ng nitrogen theo phương ph phương ph á á p Kjeldahl p Kjeldahl   Th Th ự ự c t c t ế ế , trong th , trong th ự ự c ph c ph ẩ ẩ m, bên c m, bên c ạ ạ nh protein nh protein còn c còn c ó ó nh nh ữ ữ ng ch ng ch ấ ấ t h t h ữ ữ u cơ kh u cơ kh á á c c c c ó ó ch ch ứ ứ a a nitrogen như amid nitrogen như amid , alcaloid, ammonia (v , alcaloid, ammonia (v í í d d ụ ụ như trong th như trong th ự ự c ph c ph ẩ ẩ m lên men) m lên men) acid nitric acid nitric do do đ đ ó ó h h à à m lư m lư ợ ợ ng nitrogen to ng nitrogen to à à n ph n ph ầ ầ n ch n ch í í nh th nh th ứ ứ c c cao hơn cao hơn 16% (16 16% (16 - - 17%) 17%) nhưng nhưng ở ở protein th protein th ự ự c c v v ậ ậ t th t th ì ì h h à à m lư m lư ợ ợ ng n ng n à à y l y l ạ ạ i th i th ấ ấ p hơn p hơn 16%. H 16%. H ệ ệ s s ố ố 6,25 l 6,25 l à à h h ệ ệ s s ố ố trung b trung b ì ì nh thô. nh thô. 8 8 Đ Đ ị ị nh lư nh lư ợ ợ ng nitrogen theo ng nitrogen theo phương ph phương ph á á p Kjeldahl p Kjeldahl   Nguyên lý c Nguyên lý c ủ ủ a phương ph a phương ph á á p n p n à à y l y l à à vô cơ ho vô cơ ho á á m m ẫ ẫ u b u b ằ ằ ng H ng H 2 2 SO SO 4 4 đ đ ậ ậ m đ m đ ặ ặ c v c v à à ch ch ấ ấ t x t x ú ú c t c t á á c. c. D D ù ù ng m ng m ộ ộ t ki t ki ề ề m m m m ạ ạ nh (NaOH ho nh (NaOH ho ặ ặ c KOH) c KOH) đ đ ẩ ẩ y y NH NH 3 3 t t ừ ừ mu mu ố ố i (NH i (NH 4 4 ) ) 2 2 SO SO 4 4 . S . S au đ au đ ó ó h h ứ ứ ng NH ng NH 3 3 v v à à o dung d o dung d ị ị ch acid c ch acid c ó ó n n ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ x x á á c đ c đ ị ị nh. S nh. S au au đ đ ó ó d d ù ù ng ki ng ki ề ề m c m c ó ó n n ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ x x á á c đ c đ ị ị nh đ nh đ ể ể chu chu ẩ ẩ n đ n đ ộ ộ acid dư acid dư . T . T ừ ừ đ đ ó ó t t í í nh đư nh đư ợ ợ c lư c lư ợ ợ ng nitrogen c ng nitrogen c ó ó trong nguyên li trong nguyên li ệ ệ u u 9 9 Đ Đ ị ị nh lư nh lư ợ ợ ng protein theo ng protein theo phương ph phương ph á á p Lowry p Lowry Phương ph Phương ph á á p n p n à à y d y d ự ự a trên cơ s a trên cơ s ở ở d d ù ù ng m ng m á á y đo m y đo m à à u đ u đ ể ể x x á á c đ c đ ị ị nh m nh m à à u s u s ả ả n ph n ph ẩ ẩ m kh m kh ử ử c c ủ ủ a phosphomolipden a phosphomolipden - - phosphowolframate ( phosphowolframate ( thu thu ố ố c th c th ử ử Folin Folin - - Ciocalteau Ciocalteau ) ) v v ớ ớ i ph i ph ứ ứ c h c h ợ ợ p đ p đ ồ ồ ng ng - - protein. Ph protein. Ph ứ ứ c m c m à à u xanh t u xanh t ạ ạ o th o th à à nh nh c c ó ó th th ể ể đo đo ở ở bư bư ớ ớ c s c s ó ó ng 67 ng 67 5nm. 5nm. Cư Cư ờ ờ ng đ ng đ ộ ộ m m à à u c u c ủ ủ a h a h ỗ ỗ n n h h ợ ợ p ph p ph ả ả n n ứ ứ ng t ng t ỷ ỷ l l ệ ệ thu thu ậ ậ n v n v ớ ớ i n i n ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ protein. D protein. D ự ự a v a v à à o o đ đ ồ ồ th th ị ị chu chu ẩ ẩ n protein ( n protein ( thông thư thông thư ờ ờ ng d ng d ù ù ng tinh th ng tinh th ể ể albumin huy albumin huy ế ế t thanh bò) ta c t thanh bò) ta c ó ó th th ể ể t t í í nh đư nh đư ợ ợ c h c h à à m lư m lư ợ ợ ng ng protein trong m protein trong m ẫ ẫ u nghiên c u nghiên c ứ ứ u. u. 10 10 Đ Đ ị ị nh lư nh lư ợ ợ ng protein theo ng protein theo phương ph phương ph á á p Lowry p Lowry Phương ph Phương ph á á p Lowry đư p Lowry đư ợ ợ c d c d ù ù ng r ng r ộ ộ ng rãi đ ng rãi đ ể ể x x á á c đ c đ ị ị nh nhi nh nhi ề ề u lo u lo ạ ạ i i protein kh protein kh á á c nhau. c nhau. Phương ph Phương ph á á p n p n à à y c y c ó ó đ đ ộ ộ nh nh ạ ạ y cao, cho ph y cao, cho ph é é p p ph ph á á t hi t hi ệ ệ n đư n đư ợ ợ c protein trong dung d c protein trong dung d ị ị ch ch ở ở n n ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ 1 1 g/ml. g/ml. Tuy Tuy nhiên cư nhiên cư ờ ờ ng đ ng đ ộ ộ m m à à u còn tu u còn tu ỳ ỳ thu thu ộ ộ c nhi c nhi ề ề u v u v à à o lo o lo ạ ạ i protein. i protein. V V í í d d ụ ụ , , ở ở c c ù ù ng m ng m ộ ộ t n t n ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ , dung d , dung d ị ị ch trypsin cho cư ch trypsin cho cư ờ ờ ng đ ng đ ộ ộ m m à à u u cao g cao g ấ ấ p 3 l p 3 l ầ ầ n gelatin, n gelatin, hemoglobin cho cư hemoglobin cho cư ờ ờ ng đ ng đ ộ ộ m m à à u th u th ấ ấ p hơn p hơn trypsin nhưng cao hơn gelatin trypsin nhưng cao hơn gelatin . . Ngo Ngo à à i ra, nhi i ra, nhi ề ề u ch u ch ấ ấ t kh t kh á á c c c c ó ó th th ể ể l l à à m tăng hay gi m tăng hay gi ả ả m cư m cư ờ ờ ng đ ng đ ộ ộ m m à à u u ph ph ả ả n n ứ ứ ng, v ng, v ì ì v v ậ ậ y phương ph y phương ph á á p n p n à à y cho k y cho k ế ế t qu t qu ả ả ch ch í í nh x nh x á á c khi x c khi x á á c c đ đ ị ị nh protein đã đư nh protein đã đư ợ ợ c tinh s c tinh s ạ ạ ch. ch. [...].. .Định lượng protein bằng phương pháp quang phổ Phương pháp đơn giản nhất để đo nồng độ protein trong dung dịch là độ hấp thụ tia cực tím của nó Nếu protein tinh sạch thì nồng độ tuyệt đối của nó được tính theo giá trị đo được Nếu protein không tinh sạch (ví dụ, dịch chiết từ một sắc ký) thì nồng độ của protein tổng được 11 tính tương đối từ độ hấp thụ Định lượng protein bằng phương... quang phổ Nguyên tắc của phương pháp này là các protein hấp thụ tia cực tím cực đại ở bước sóng 280nm do các acid amin thơm như tryptophan, tyrosine và phenylalanine Độ hấp thụ ở 280nm thay đổi tuỳ loại protein nhưng hệ số tắt đo được (nghĩa là độ hấp thụ của dung dịch protein 1% với đường sóng truyền qua 1cm) cho mỗi protein cho phép tính nồng độ của protein tinh sạch 12 Định lượng protein bằng phương... của protein Khi đã nhận được một protein enzyme ở trạng thái kết tinh, người ta phải thử lại mức độ tinh khiết hay tính đồng thể của nó Độ đồng thể của chế phẩm protein enzyme phải được kiểm tra bằng một số phương pháp dựa trên những nguyên lý khác nhau Trong một số trường hợp protein enzyme được coi là đồng thể khi ly tâm, nhưng lại có thể phân chia thành một số isoenzyme bằng phương pháp điện di trên... quang phổ Với một hỗn hợp các protein hoặc với bất cứ một loai protein nào mà không biết hệ số tắt thì nồng độ protein được tính như sau: Nồng độ protein (mg/ml)=1,55xA280-0,77xA260 Trong đó: A280: độ hấp thụ ở bước sóng 280nm A260: độ hấp thụ ở bước sóng 260nm 13 Định lượng protein bằng phương pháp quang phổ Phương pháp này không dùng được cho các dung dịch có nồng độ protein thấp hơn 0,1mg/ml hoặc... acid nucleic và một số chất béo), hoặc khi protein ở trong dịch truyền phù chứ không phải trong dung dịch (Ví dụ, trong màng hoặc các phức hợp có trọng lượng phân tử lớn) Cũng cần chú ý là nếu tỷ lệ A280/A260 thấp hơn 0,6 nghĩa là dung dịch protein chưa sạch, bị lẫn các chất khác, đặc biệt với acid nucleic thì nên sử dụng phương pháp Lowry để đo nồng độ protein 14 Đánh giá tính đồng thể của protein Khi... bằng phương pháp điện di trên gel Chính vì vậy, nếu dùng nhiều loại phương pháp khác nhau để kiểm tra độ sạch của protein mà kết quả đều cho là đồng thể thì protein đó có thể được công nhận là tinh khiết Những phương pháp để kiểm tra tính đồng thể hay dùng là xây 15 dựng đồ thị về độ hoà tan, điện di và siêu ly tâm . m m ỗ ỗ i protein cho ph i protein cho ph é é p t p t í í nh n nh n ồ ồ ng đ ng đ ộ ộ c c ủ ủ a protein a protein tinh s tinh s ạ ạ ch. ch. 13 13 Đ Đ ị ị nh lư nh lư ợ ợ ng protein b ng protein. đ ộ ộ protein. protein. 15 15 Đ Đ á á nh gi nh gi á á t t í í nh đ nh đ ồ ồ ng th ng th ể ể c c ủ ủ a protein a protein Khi đã nh Khi đã nh ậ ậ n đư n đư ợ ợ c m c m ộ ộ t protein enzyme t protein. s m s ạ ạ ch protein ch protein 4 4 C C á á c phương ph c phương ph á á p x p x á á c đ c đ ị ị nh nh h h à à m lư m lư ợ ợ ng protein ng protein   N N ế ế u protein không ph u protein không